DE69927691T2

DE69927691T2 - Verfahren zur eiweissanalyse

Info

Publication number: DE69927691T2
Application number: DE69927691T
Authority: DE
Inventors: Elizabeth Sophie Welwyn WILDSMITH; Rhiannon Welwyn YALLOP; John Peter Welwyn BUGELSKI; Gwyn David MORGAN
Original assignee: SmithKline Beecham Ltd
Current assignee: SmithKline Beecham Ltd
Priority date: 1998-07-29
Filing date: 1999-07-29
Publication date: 2006-07-13
Anticipated expiration: 2019-07-30
Also published as: EP1101114B1; GB9816514D0; WO2000007024A3; WO2000007024A2; EP1101114A2; ES2251210T3; DE69927691D1; ATE306666T1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren, das Gebrauch von der schnellen Analyse der Protein- oder Peptidzusammensetzung einer Mischung macht, insbesondere der Analyse eines Extrakts, der aus Geweben oder Zellen stammt, um die differentielle Expression oder Fülle von Proteinen zu messen. Die Erfindung kann in der Analyse der zeitlichen und räumlichen Veränderungen der Proteinexpression als Reaktion auf Wirkstoffbehandlungen verwendet werden, wenn die durch einen Wirkstoff induzierte Toxizität untersucht wird.
Proteine und Peptide spielen eine zentrale Rolle in vielen zellulären Prozessen in allen zellulären Biosystemen. Beispiele für solche Funktionen schließen strukturelle und katalytische Rollen ein. Das "Proteom", das heißt das Proteinexpressionsmuster in einem gegebenen Gewebe oder Zelltyp, ist eine gedankliche Darstellung der dynamischen Natur dieser zellulären Systeme. Gene werden konstant induziert oder abgeschaltet, um die Spiegel unterschiedlicher Proteine innerhalb der Zelle zu modulieren, und diese Proteine werden manchmal modifiziert oder aus der Zelle sezerniert, um als Signale für andere Zellen zu wirken. Diese Signale wiederum verändern das Genexpressionsmuster der aufnehmenden Zelle. Diese dynamischen Systeme sind jedoch trotz ihrer sehr engen Kontrolle inhärent anfällig für Störung. Eine bakterielle oder virale Infektion zum Beispiel führt zu einer Veränderung dieses Gleichgewichts, da das System versucht, die eindringenden Mikroorganismen abzustoßen und das System zum Normalzustand wiederherzustellen. Das empfindliche Gleichgewicht zellulärer Prozesse kann auch als Ergebnis genetischer Abnormalitäten gestört werden. In ähnlicher Weise können Umwelteinflüsse wie physiologisches Trauma und Kontakt mit Chemikalien das Proteom betroffener Gewebe und Zellen verändern. Eine solche Störung der qualitativen, quantitativen, zeitlichen und räumlichen Verteilung von Proteinen und Peptiden ist häufig mit einer ernsthaften zellulären Dysfunktion verbunden und kann zu Gewebeschädigung und in manchen Fällen Tod führen.
Die Störungen zellulärer Prozesse, wie sie im Proteom in der Zelle oder des Gewebes reflektiert werden, sind von besonderem Gewicht in der pharmazeutischen Industrie in der Sicherheitsbewertung neuer Wirkstoffe. Zum Beispiel ist die Einnahme einer neuen chemischen Verbindung ein Umwelteingriff. Viele neue Wirkstoffe werden durch Durchmustern großer Sammlungen chemischer Verbindungen auf eine Verbindung identifiziert, die eine Fähigkeit zur Blockierung der Wechselwirkung zwischen zwei Komponenten eines zellulären Prozesses zeigt. Bei einem Patienten, der an einem Zustand leidet, bei dem diese Wechselwirkung ungewollt oder übermäßig ist, aufgrund abnormal erhöhter Mengen einer der Komponenten, wird die Reduzierung der Stärken dieser Wechselwirkung durch Behandlung des Patienten mit einem blockierenden Wirkstoff das System zum Gleichgewicht wiederherstellen. Deshalb werden viele Wirkstoffe durch ihre eigene Natur das Gleichgewicht von Proteinen in der Zelle oder im Gewebe beeinflussen. Jedoch haben viele Wirkstoffe zusätzlich zum Bewirken der gewünschten Aktivität auf einen zellulären Prozeß auch ungewollte Wirkungen auf andere zelluläre Prozesse (sogenannte "Nebenwirkungen"), und dies wird in der Veränderung im Proteom reflektiert. Bei der Bestimmung der Sicherheit neuer Verbindungen ist es notwendig, die Proteome aus behandelten und unbehandelten Tieren, Geweben oder Zellen zu untersuchen und zu vergleichen und etwaige Veränderungen zu identifizieren, die als Ergebnis der Verabreichung des neuen Wirkstoffs stattgefunden haben. Es wäre auch ein Vorteil, die besonderen Proteine identifizieren zu können, deren Expression durch die Behandlung beeinflußt wird.
Die Detektion proteomischer Veränderungen ist keine triviale Aufgabe trotz der Existenz mehrere Proteinanalysetechniken. Die existierenden Techniken fallen in die folgenden Kategorien:

(1) Quantitativ, unspezifisch, Gesamtproteine: Lowry-, Bradford-, Coomassie-, BCA-Assays zur Quantifizierung von Proteinen in Lösung.
(2) Qualitativ (kann quantitativ durchgeführt werden): Anfärbung von Gelen mit Silberanfärbung, Coomassie-Anfärbung, Radioaktivitäts- und Fluoreszenzanfärbung.
(3) Quantitativ und spezifisch: z.B. immunologische Verfahren wie Detektion von Antigenen durch ELISA, Immunopräzipitation und Western Blots.
(4) Qualitativ und quantitativ (unspezifisch): Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC), schnelle Proteinchromatographie (FPC), Kapillarzonenelektrophorese (CZE).
(5) Qualitativ, hohe Genauigkeit: massenspektrometrische Verfahren, z.B. MALLDITOF.

Eine Technik, die derzeit verwendet wird, ist die zweidimensionale (2-D) Gelelektrophorese. Jedoch ist diese Technik aufwendig, erfordert geschultes Personal, ist nicht leicht reproduzierbar, und die Analyse der Daten ist komplex. Proteine, die aus einem Gewebe oder Zellen extrahiert werden, werden in einem Gel in einer Dimension auf Basis ihres isoelektrischen Punktes getrennt. Sie werden weiter durch Elektrophorese in einer zweiten Dimension auf Basis ihres Molekulargewichts getrennt. Die Gele werden unter Verwendung entweder herkömmlicher Proteinanfärbungen wie Coomassie-Blue oder Silber-Anfärbung oder durch empfindlichere Fluoreszenzanfärbungen angefärbt. Das Ergebnis ist ein Gelblock von gewöhnlich ca. 20 cm × 30 cm mit einer Mehrzahl von "Flecken". Dieser wird unter Verwendung von Licht mit geeigneter Wellenlänge abgetastet (siehe zum Beispiel Anderson et al., Tox. Path. 1996, 24, 72–76). Komplexe Software ist erforderlich, um Flecken zu lokalisieren, zwischen diskreten Flecken und Artefakten zu unterscheiden und die interessierenden Proteine zu identifizieren. Gele aus unterschiedlichen Proben können verglichen werden, zum Beispiel aus behandelten und unbehandelten Geweben, aber Probleme können bei der Lokalisierung identischer Flecken aufgrund der Verzerrung des Gels und anderer Reproduzierbarkeitsprobleme auftreten. Nicht jedes Protein in einer Probe wird unter Verwendung dieser Technik identifiziert werden – nur ein bestimmter pH-Bereich kann auf einmal untersucht werden, und es wird keine Beschränkung für den Größenbereich geben, der in einem Gel betrachtet werden kann. Außerdem werden manche Proteine mit bestimmten Farbstoffen nicht angefärbt.
In EP-A2-0167335 wird ein Verfahren zum Detektieren einer Bindungsreaktion zwischen einem Antigen und einem Antikörper offenbart. Der Antikörper ist auf einer zweidimensionalen Oberfläche immobilisiert, um eine räumliche Anordnung zu bilden. Die Bindungsreaktion wird unter Verwendung optischer Mittel detektiert.
Keines der derzeit verfügbaren Verfahren ermöglicht eine qualitative und quantitative Analyse von proteomischen Veränderungen mit hohem Durchsatz. Die vorliegende Erfindung macht Gebrauch von einem Verfahren zur Analyse des Protein- oder Polypeptidgehalts einer Mischung, das eine qualitative und quantitative Analyse von proteomischen Veränderungen mit hohem Durchsatz ermöglicht.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Vorhersage der toxischen Wirkung einer ausgewählten Testverbindung auf ein Säugetier bereitgestellt, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Bereitstellen einer Mehrzahl identischer räumlicher Felder von Proteinerkennungseinheiten;
(b) Inkontaktbringen eines räumlichen Feldes aus Schritt (a) mit einer protein- oder peptidhaltigen Mischung, die aus einer Zielzelle, einem Zielgewebe oder einem biologischen Zielorganismus extrahiert und isoliert wurde, die/das/der einem bekannten toxischen Stoff ausgesetzt wurde, und Detektieren der Bindung von Proteinen oder Peptiden an die Proteinerkennungseinheiten;
(c) Inkontaktbringen eines räumlichen Feldes aus Schritt (a) mit einer protein- oder peptidhaltigen Mischung, die aus einer Zielzelle, einem Zielgewebe oder einem biologischen Zielorganismus extrahiert und isoliert wurde, die/das/der nicht dem bekannten toxischen Stoff aus Schritt (b) ausgesetzt wurde, und Detektieren der Bindung von Proteinen oder Peptiden an die Proteinerkennungseinheiten;
(d) Vergleichen des Bindungsmusters aus Schritt (b) und Schritt (c) zur Identifizierung eines etwaigen Bindungsunterschieds zwischen dem Ziel, das dem bekannten toxischen Stoff ausgesetzt wurde, und dem nichtausgesetzten Ziel, wobei der Unterschied indikativ für eine Wirkung auf die Proteinexpression in dem Ziel ist, das dem bekannten toxischen Stoff ausgesetzt wurde;
(e) Wiederholen der Schritte (b) und (d) und gegebenenfalls von Schritt (c) mit einem anderen bekannten und strukturell unterschiedlichen toxischen Stoff mit einer gemeinsamen toxischen Wirkung auf Säugetiere wie der bekannte toxische Stoff aus Schritt (b), um ein "Fingerabdruck"-Bindungsmuster zu erzeugen, das charakteristisch für die gemeinsame toxische Wirkung ist;
(f) Wiederholen der Schritte (b) und (d) und gegebenenfalls von Schritt (c) mit der ausgewählten Testverbindung, um ein Testbindungsmuster zu erzeugen, worin eine substantielle Identität zwischen dem Fingerabdruck aus Schritt (e) und dem Testbindungsmuster anzeigt, daß die Testverbindung die gemeinsame toxische Wirkung teilt.

1 zeigt eine diagrammartige Darstellung des Verfahrens der Erfindung. Proteinerkennungseinheiten (PRUs, "Protein recognition units") werden auf einem Gittersystem immobilisiert oder synthetisiert. Vier PRUs sind gezeigt, aber die Anzahl von PRUs kann in Abhängigkeit von der Anwendung, zum Beispiel niedrige Dichte (< 100 PRU/cm²) oder hohe Dichte (> 100 PRU/cm²), variieren. Proteine werden durch die PRUs erkannt und binden daran. Die Proteine werden vor- oder nachmarkiert, so daß ein Signal aus einer gegebenen Gitterkoordinate anzeigt, daß das Protein, das der PRU entspricht, vorhanden ist.
Das räumliche Feld von PRUs umfaßt bevorzugt eine Mehrzahl unterschiedlicher PRUs. Die PRUs sind bevorzugt auf einem festen oder halbfesten Träger immobilisiert. Die PRUs sind bevorzugt in einem spezifischen, koordinierten Muster angeordnet, zum Beispiel in einem Gitterformat, so daß der Ort jeder PRU bekannt ist. Die PRUs können minimale Erkennungseinheiten (MRUs), Antikörper oder Antikörperfragmente, hochaffine Peptide oder komplementaritätsbestimmende Regionen (CDRs) sein. Die PRUs können einen bekannten oder unbekannten Sequenzgehalt haben, d.h. die Identität der PRU oder des gebundenen Proteins kann nach Wunsch rückblickend bestimmend werden, indem die PRU aus der festen Oberfläche freigesetzt, das gebundene Protein getrennt und beide sequenziert werden.
Die PRUs sind bevorzugt CDRs. In nativen IgG-Antikörpern tragen die variablen schweren und leichten Ketten jeweils drei Regionen bei, die als CDRs bezeichnet werden und verantwortlich für das Binden an Antigen sind. Jede Region ist typischerweise 7–20 Aminosäuren lang, z.B. 15–17 Aminosäuren, und ihre Sequenz definiert die Spezifität und Affinität des CDR für das Antigen. Es gibt zunehmende Hinweise, daß diese Regionen von CDR-Peptiden autonom spezifisch an Antigene binden können, siehe z.B. J. Steinbergs, K. Kilchewska, U. Lazdina, A. Dishlers, V. Ose, M. Sallberg, A. Tsimanis, Hum. Antibod. Hybridomas, 1996, 7, 3; W. V. William. T. Kieber-Emmons, J. VonFeldt, M. I. Greene, D. B. Weiner, J. Biol. Chem. 1991, 266, 5182; H. U. Saragovi, D. Fitzpatrick, A. Raktabutr, H. Nakanishi, M. Kahn, M. Greene, Science 1991, 253, 792, W. G. Welling, J. van Gorkum, R. A. Damhof, J. W. Drijhout, W. Bloemhoff, S. Welling-Wester, J. Chromatogr. 1991, 548, 235 und M. Levi, M. Sallberg, U. Ruden, D. Herlyn, H. Maruyama, H. Wigzell, J. Marks, B. Wahren, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 4373; und daher wurden sie als eine neue Generation von Antikörperfragmenten mit reduzierter Immunogenität und als antivirale Moleküle vorgeschlagen, siehe G. B. Sivolapenko, V. Douli, D. Pectasides, D. Skarlos, G. Sirmalis, R. Hussain, J. Cook, N. S. Courtney-Luck, E. Merkouri, K. Konstantinides, A. A. Epenetos, Lancet 1995, 346, 1662; und S. Rossenu, D. Dewitte, J. Vandekerckhove, C. Ampe, Journal of Protein Chemistry, 1997, 16, Nr. 5.
Antikörperfragmente können zum Beispiel unter Verwendung von Phagen-Display-Technologien erzeugt werden. CDRs können durch rekombinante Mittel erzeugt oder chemisch synthetisiert werden. CDRs können gemäß bekannten CDR-Sequenzen unter Verwendung von entweder Standardproteinsynthese oder unter Verwendung eines Ansatzes der kombinatorischen Synthese chemisch synthetisiert werden.
CDR-Sequenzen können durch Analyse verschiedener Numerierungssysteme, wie zum Beispiel der Kabat-, Chothia-, AbM- und Contact-Numerierungsschemata, bestimmt werden. Die Kabat-Definiton beruht auf Sequenzvariabilität und wird am häufigsten verwendet. Die Chothia-Definition beruht auf dem Ort der strukturellen Loop-Regionen. Die AbM-Definition ist ein Kompromiß zwischen den zweien, die von der AbM-Antikörpermodelierungs-Software von Oxford Molecular verwendet werden. Die Contact-Definition wird vom University Collage London spezifiziert und beruht auf einer Analyse der verfügbaren komplexen Kristallstrukturen. Mittlere Kontaktdaten werden durch eine Analyse der Kontakte zwischen Antikörper und Antigen in den komplexen Strukturen erzeugt, die in der Protein Databank erhältlich sind (R. M. MacCallum, A. C. R. Martin und J. T. Thornton, J. Mol. Biol., 262, 732–745), kurz gesagt, die Anzahl von Kontakten, die in jeder Position gemacht werden, wobei Kontakt als Einbettung um > 1 Å² Veränderung in Lösungsmittelzugänglichkeit ist. Diese Daten liefern ein einfaches Maß dafür, wie wahrscheinlich ein Rest an einem Antigenkontakt beteiligt ist.
H3 und L3 machen die meisten Kontakte mit ihrem Antigen, weil sie zentral im Kombinationsort sind. H1, L1 und H2 machen relativ ähnliche Anzahlen von Kontakten, wobei sie eher peripher bei L2 sind, das insgesamt die wenigsten Kontakte macht. Topographisch ist es eine äquivalente Position zu H2 (die leichten und schweren Ketten haben eine Rotationsachse mit Pseudosymmetrie), aber es ist viel kürzer und hat somit viel weniger Möglichkeiten, das Antigen zu erreichen. L3 macht viele Kontakte aber sie neigen dazu, allgemein "klebrig" anstelle von spezifisch zu sein. Die folgende Tabelle führt die Positionen der CDRs gemäß jedem Numerierungssystem auf. "L" bezeichnet die "leichte Kette" und "H" die "schwere Kette", und die Zahlen entsprechen Aminosäuresequenzen.
Tabelle von CDR-Definitonen
CDR-Sequenzen können unter Verwendung eines oder einer Kombination der oben genannten Verfahren gefunden werden. Einige Aminosäuren auf einer beliebigen Seite der CDR-Sequenz können auch verwendet werden, da diese auch die Bindung verstärken können. Die Verfahren können auf Proteinsequenzen der leichten und schweren Kette des Antikörpers aus beliebigen Protein-Rechercheorten angewendet werden, z.B. Entrez, Swiss-Prot. Falls die Proteinsequenz für einen gewünschten Antikörper nicht verfügbar ist, kann die Nukleotidsequenz zu einer Peptidsequenz unter Verwendung eines Pakets wie zum Beispiel Lasergene (Dnastar – www.Dnastar.com) übersetzt werden.
Beim Betrieb wird das räumliche Feld von PRUs mit der protein- oder peptidhaltigen Mischung, z.B. als Gewebe- oder Zellextrakt, unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die die Proteinbindung begünstigen. Proteine oder Peptide in einem Extrakt oder einer Mischung werden anschließend an das Gitter in einer spezifischen Weise gebunden. Die Bindung von Proteinen oder Peptiden an die PRUs kann durch Visualisierung der Proteine oder Peptide bewirkt werden, z.B. durch Anfärbung oder andere Verfahren wie Radiomarkierung oder chemische Markierung, entweder vor oder nach dem Bindungsschritt. Biotinylierungs-, Fluoreszenz-, Chemilumineszenz- oder andere Markierungstechniken können auch verwendet werden. Die Analyse des resultierenden Bindungsmusters kann unter Verwendung eines geeigneten Detektionssystems wie optische oder Laser-Abtasttechnologie vorgenommen werden, und ein Vergleich der Ergebnisse zwischen zum Beispiel wirkstoffbehandelten- und unbehandelten Kontrollgeweben kann unter Verwendung geeigneter Computersoftware vorgenommen werden.
Die protein- oder peptidhaltige Mischung, die gemäß dem Verfahren der Erfindung analysiert wird, ist bevorzugt ein Zellextrakt, der aus einem biologischen Organismus (z.B. aus Säugetiergewebe) isoliert wird. Der Zellextrakt ist besonders bevorzugt aus einem mit einer chemischen Verbindung besonderen therapeutischen Potentials behandelten Säugetier.
Das Verfahren der Erfindung liefert eine schnelle, reproduzierbare und robuste Alternative zur den Verfahren, die derzeit zur Bestimmung des Proteinexpressionsmusters von Geweben oder Zelltypen verwendet werden, d.h. Proteinbiochemie, angewendet auf die Toxikologie. Das Verfahren ist verwandt mit Verfahren, die zur Analyse der räumlichen und zeitlichen Veränderungen der Expression von Proteinen in Säugetiergeweben und -zelltypen verwendet werden können, wenn sie mit Umweltreizen wie pharmazeutischen Reagenzien sowie anderen Umweltreizen oder -faktoren in Kontakt gebracht werden. Das Verfahren ist verwandt mit Verfahren, die den Vergleich von Zielen, die mit therapeutischen Wirkstoffen behandelt sind, und unbehandelten Kontrollen erlauben, um eine quantitative und/oder halbquantitative Analyse des Proteoms der behandelten und unbehandelten (Kontroll-) Zielsysteme, zum Beispiel Zellen, Gewebe oder biologische Organismen, bereitzustellen. Das Verfahren ist ebenfalls verwandt mit Verfahren, die zur Verwendung z.B. in der Wirkstoffherstellung, Reinheitsanalyse (z.B. in Lebensmitteln und in der Landwirtschaft) und für Diagnostika, z.B. zum Nachweis on Proteinen in Urin oder Blut, angepaßt werden können.
Somit ist die Erfindung auch verwandt mit einem Verfahren zur Bestimmung der Wirkung eines Umweltfaktors auf die Proteinexpression in einer Zielzelle, einem Zielgewebe oder einem Zielorganismus, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Bereitstellen einer Mehrzahl identischer räumlicher Felder von Proteinerkennungseinheiten;
(b) Inkontaktbringen eines räumlichen Feldes von Proteinerkennungseinheiten mit einer protein- oder peptidhaltigen Mischung, die aus einem Ziel extrahiert und isoliert wurde, das einem Umweltfaktor für eine ausreichende Zeit ausgesetzt wurde, um die Proteinexpression in dem Ziel zu beeinflussen, und Detektieren der Bindung von Proteinen oder Peptiden an die Proteinerkennungseinheiten;
(c) Inkontaktbringen eines räumlichen Feldes von Proteinerkennungseinheiten mit einer kontrollprotein- oder -peptidhaltigen Mischung, die aus einem Ziel extrahiert und isoliert wurde, das nicht dem Umweltfaktor ausgesetzt wurde, und Detektieren der Bindung von Proteinen oder Peptiden an die Proteinerkennungseinheiten; und
(d) Vergleichen der in Schritt (b) und Schritt (c) detektierten ersten und zweiten Bindungsmuster zur Identifizierung einer etwaigen Veränderung des ersten Musters vom Kontrollmuster, indikativ für eine Wirkung auf die Proteinexpression in dem Ziel, das dem bekannten Umweltfaktor ausgesetzt wurde.

Der Begriff "Umweltfaktor" wie hier verwendet beschreibt eine weite Vielzahl von physikalischen, chemischen oder biologischen Faktoren, die Veränderungen der Proteinexpression in einem Ziel, z.B. Zelle, Gewebe oder biologischer Organismus, bei Kontakt mit dem Faktor verursachen können. Zum Beispiel können physikalische Umweltreize ohne Beschränkung Ernährung, eine Zunahme oder Abnahme der Temperatur, eine Zunahme oder Abnahme des Kontakts mit ionisierender oder UV-Strahlung und dgl. einschließen. Biologische/chemische Reize können ohne Beschränkung die Verabreichung eines Transgens an das Ziel oder die Eliminierung eines Gens aus dem Ziel; die Verabreichung einer exogenen synthetischen Verbindung oder eines exogenen Mittels oder einer endogenen Verbindung, eines endogenen Mittels oder eines Analogons davon an das Ziel einschließen.
Als ein Beispiel kann eine exogene synthetische Verbindung zum Beispiel eine pharmazeutische Verbindung, eine toxische Verbindung, ein Protein, ein Peptid oder eine chemische Zusammensetzung sein. Ein exogenes Mittel kann natürliche Pathogene wie mikrobielle Mittel einschließen, die die Proteinexpression verändern können. Beispiele für Pathogene schließen Bakterien, Viren und niedere eukaryontische Zellen wie Pilze, Hefe, Schimmel und einfache mehrzellige Organismen ein, die ein Ziel infizieren und ihre Nukleinsäuresequenzen z.B. in den Zellen oder dem Gewebe des Ziels vermehren können. Ein solches Pathogen ist allgemein mit einem Krankheitszustand im infizierten Säugetier verbunden.
Eine endogene Verbindung ist eine Verbindung, die natürlich im Körper vorkommt. Beispiele schließen Hormone, Enzyme, Rezeptoren, Liganden und dgl. ein. Ein Analogon ist eine endogene Verbindung, die vorzugsweise durch rekombinante Techniken erzeugt wird und sich von der natürlich vorkommenden endogenen Verbindung in einer gewissen Weise unterscheidet.
Die Erfindung und Verfahren in bezug auf die Erfindung werden jetzt durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.
Beispiel 1: Proteinfeld ("Array") mit CDRs als Proteinerkennungseinheiten und Fluoreszenzfarbstoff-Detektion
1.1. Herstellung von räumlichen Feldern
CDRs werden gemäß bekannten Peptidsynthesetechniken synthetisiert, z.B. M. Sällberg et al., Immunol. Lett., 1991, 30, 59. Peptide können analysiert und gereinigt werden, zum Beispiel durch Umkehrphasen-HPLC wie von Steinbergs et al. beschrieben, Hum. Antibod. Hybridomas, 1996, 7(3), 106–112. CDRs können entweder gemäß bekannten Sequenzen aus der Literatur oder aus einem Experiment synthetisiert werden, oder sie können als Unbekannte synthetisiert werden. Dies kann entweder eine zufällige Synthese oder eine kombinatorische Synthese sein. Für eine CDR mit 16 Aminosäuren übersteigt die theoretische Anzahl aller möglichen Permutationen das, was in der Praxis handhabbar wäre (1,8 × 10⁹ Möglichkeiten). Diese Anzahl kann durch Berücksichtigung des Wissens um CDR-Strukturen, gemeinsame Motive und Wahrscheinlichkeiten von Sequenzen im Entscheidungsprozeß reduziert werden. Beispiele für unterschiedliche Ansätze sind a) das Entfernen von Sequenzen, die die gleiche Aminosäure mehr als eine gewisse Anzahl von Malen (oder nacheinander) darstellen, oder b) das Beschränken der Aminosäureverwendung auf das, was ähnlich dem natürlichen oder bekannten Auftreten in CDRs ist. Eine Alternative zu diesem informierten oder "intelligenten" kombinatorischen Ansatz ist ein vordurchmusterter kombinatorische Ansatz. In diesem Fall werden bekannte Proteine von Interesse verwendet, um entsprechende CDRs aus einer zufälligen Synthese heranzuziehen, und deshalb braucht die CDR-Sequenz nicht bekannt zu sein.
Die CDRs, sobald sie synthetisiert sind, können durch Auftragen auf einen Träger in einem beliebigen Format, worin die CDRs in einer räumlichen Weise als Feld angeordnet sind, als Feld angeordnet werden. Die CDRs werden bevorzugt als Gitter angeordnet. Der Träger kann ein Gel, Kunststoff, Nylon, Nitrocellulose, Glas, Kieselerde, Kohlenstoff, Perfluorkohlenstoffe, Aluminiumoxid, Keramik, Polymere, Cellulose, vernetzte Polysaccharide, Metalle oder jedes andere Material umfassen, auf dem die CDRs immobilisiert werden können. Standardverfahren zur Immobilisierung sind gut dokumentiert (z.B. Mosbach, Methods in Enzmology, 1976, 44; Immobilized biochemicals and affinity chromatography, advances in experimental medicine and biology, Hrsg. R. Dunlap, Plenum Press, N.Y., 1974, 42; und Chemistry of protein conjugation and cross linking, Wong, CRC Press, 1993) und nutzen gewöhnlich die reaktiven Gruppe an Aminosäuren wie die Amin- und Thiol-Gruppen für Disulfidbindungen, Thioetherbindungen, gehinderte Disulfidbindungen und kovalente Bindungen. Andere Bindungsverfahren schließen das Einführen von inerten Aminosäuren und das Nutzen der Photoaktivierung, Metallionenbindungen und anderen verbindenden/verankernden Molekülen ein. Bevorzugte Immobilisierungstechniken unterbrechen nicht die CDR-Eigenschaften und wechselwirken nicht mit den Proteinerkennungseigenschaften der CDRs.
1.2. Auftragung der Testlösung
Sobald sie konstruiert und hergestellt sind, können die Felder zur Detektion von Proteinen in einer Mischung verwendet werden. Die Felder werden mit einer Proteinmischung überspült, die aus beliebiger Quelle stammt, z.B. Gewebehomogenat, zellfreie Suspension, Überstände. Die Proteinmischung kann zur Erleichterung der Bindung verändert werden. Zum Beispiel können die Proteine in einen Puffer oder eine Lösung mit einem pH und einer ionischen Zusammensetzung zur Ermöglichung der Bindung dialysiert werden. Während des Bindungsprozesses können die Bedingungen verändert werden, um die Stringenz der Bindung zu beeinflussen. Ein geeigneter Hybridisierungspuffer ist 0,5 M phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH 7. In diesem Fall kann die Stringenz durch Absenken des pH der Lösung während des Bindungsprozesses verringert werden. Das Bindungsverfahren kann man über einen Zeitraum von mehreren Stunden stattfinden lassen. Die Proteinfelder können dann unter Verwendung von Puffer wie oben gewaschen werden.
1.3 Detektion von Proteinbindung
Die Proteine werden mit einem Fluoreszenzfarbstoff wie Alexa, BODIPY, SYPRO^TM Orange oder SYPRO^TM Red als Anfärbungen von Molecular Probes vorkonjugiert. Alle anderen Fluoreszenzfarbstoffe, die an Proteine binden, können verwendet werden. Die bevorzugte Ausführungsform ist ein kovalentes Anbindungsverfahren, wie z.B. die Bindung der primären Amin-Gruppen (z.B. die Farbstoffe Alexa, BODIPY). Bilder der Felder können unter Verwendung eines Laserabtasters und CCD-Aufnahmesystems erhalten werden, zum Beispiel mit dem STORM^TM-System von Molecular Dynamics.
Eine alternative Markierungsmethodik beinhaltet die radioaktive Markierung, die zum Beispiel durch Zugeben von S³⁵ zum Wachstumsmedium erreicht werden kann, indem die Proteine synthetisiert werden. Auf diese Weise werden entstehende Proteine radiomarkiert werden. Wenn radiomarkierte Proteine an das Feld gebunden werden, können sie unter Verwendung von standardmäßigen Autoradiographietechniken visualisiert werden.
Bilder der Felder können verwendet werden, um die vorhandenen Proteine und die Mengen von in den Proben vorhandenen Proteinen zu analysieren. Falls die CDRs bekannt sind, dann ist die Position der CDRs auf dem Feld bekannt, und die relativen Konzentrationen dieser Proteine können bestimmt werden. Kontrollen bekannter Konzentration können für Quantifizierungszwecke verwendet werden. Falls die CDRs unbekannt sind (erzeugt unter Verwendung eines kombinatorischen Ansatzes), dann können die Expressionsmuster von Proteinen überwacht werden. Falls sich bestimmte Proteine als interessant erweisen, zum Beispiel falls sich die Expressionsstärke zu unterschiedlichen Stadien eines Zellcyclus verändert, dann können diese Proteine isoliert und identifiziert werden.
Beispiel 2: Proteinfeld mit Bakteriophagen-Display-Proteinen als Proteinerkennungseinheiten
In diesem Verfahren werden Bakteriophagen (nachfolgend "Phagen"), die heterologe Proteinfragmente oder Peptide, einschließlich zufälliger Peptide, auf ihren Oberflächen exprimieren, auf einem Träger immobilisiert. Die heterologen Proteinfragmente sind bevorzugt variable Regionen eines Antikörpers. Die dargestellten Proteinfragmente oder Peptide können dadurch als PRUs im Verfahren der Erfindung fungieren. Das Phagen-Antikörper-Display-System erlaubt vorzugsweise die Expression von ScFv oder Fabs auf der Oberfläche eines Bakteriophagen. Gene der variablen Region eines Antikörpers werden in die Gene kloniert, die ein Hüllprotein, zum Beispiel ein kleineres Hüllprotein, des filamentösen Bakteriophagen codieren, wodurch ein Fusionsprotein geschaffen wird. Die Antikörpergene werden aus einem Gen-Repertoire ausgewählt, z.B. aus B-Zellen extrahierte mRNA, und in der Phagenbibliothek exprimiert.
Die so erzeugte Phagen-Display-Bibliothek kann zur Durchmusterung auf Proteine in Mischungen verwendet werden. Die Bindung von Proteinen an vom Phagen dargestellte Antikörper kann unter Verwendung von Bedingungen erreicht werden, die ähnlich denjenigen sind, die von Palmer et al. beschrieben wurden, Vox Sanguinis, 1997, 72, 148–161.
Beispiel 3: Anwendung von Proteinfeldern zur Überwachung dynamischer Veränderungen der durch pharmazeutische Verbindungen induzierten Proteinexpression
Die Erfindung ermöglicht die Untersuchung von Veränderungen der Proteinexpression in einem Gewebe oder Zelltyp von Interesse als Reaktion auf Kontakt mit einer therapeutischen Verbindung. Dieser Aspekt der Erfindung wird durch Vorbereiten einer Reihe von Versuchstierproben, Gewebeproben oder Zellkulturen, Einführen der Verbindung und Ernten der Zellen zu ausgewählten Zeitpunkten erleichtert. Ein zellulärer Extrakt kann dann aus den geernteten Zellen unter Verwendung von Standardtechniken des Zellaufschlusses in Gegenwart von geeigneten Proteaseinhibitoren hergestellt und die extrahierten Proteine mit Fluoreszenzfarbstoff angefärbt werden. Das räumliche Feld von PRUs wird mit dem Proteinextrakt unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die die Bindung der Proteine im Extrakt an die PRUs im Feld erlauben. Das Feld kann dann unter Verwendung von Anregung der spezifischen Wellenlänge für den Fluorophor visualisiert werden.
Das "Muster" der Fluoreszenz wird in den behandelten und unbehandelten Zellen verglichen. Proteine von Interesse, die auf einem Feld auftreten, aber nicht auf einem anderen, können isoliert und identifiziert werden. Nach einer gewissen Zeit werden die Proteine, die die PRUs erkennen, bekannt werden und eine Datenbank kann konstruiert werden, die die Expression von Proteinen als Reaktion auf Wirkstoffe in Beziehung setzt. Diese Datenbank kann zur Vorhersage der wahrscheinlichen Wirkung und Toxizität einer Verbindung und möglicherweise ihrer Pharmakologie verwendet werden. Sie wird ebenfalls zum Verständnis von Ereigniskaskaden beitragen, die mit bestimmten Wirkstoffen verbunden sind.
Beispiel 4: Proteinbiochemiefeld zur Differenzierung von Proteinexpression als Reaktion auf klassische Lebertoxine
Beispielgewebe
Die Proteinexpression als Reaktion auf fünf klassische Lebertoxine wird unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung untersucht. Antikörper gegen Proteine werden verwendet, wenn sich die Proteinexpression von der Kontrolle unterscheiden kann, und ein spezifisches Expressionsmuster kann für eine gegebene Verbindung identifiziert werden. Die verwendeten Lebertoxine sind Natriumvalproat, Erythromycinestolat, Methotrexat, Acetominophen und Cumarin.
Exemplarische PRUs
Eine Anzahl von Antikörpern, Fragmenten oder CDRs werden auf einem festen Träger immobilisiert. In der Praxis können mehrere Tausend PRUs abgelegt werden. Im einfachsten Fall werden neun Antikörper an ein Blatt aus weißem Polystyrol gebunden. Die Antikörper sind aus einer Auswahl von handelsüblichen Antikörpern, wie zum Beispiel denjenigen gegen alkalische Phosphatase, GST-Glutathiontransferase, TNF, p53, Bcl-2, Leberzellwachstumsfaktor, insulinartiger Wachstumsfaktor, Folsäure (alle erhältlich von Sigma). Zusätzlich können Ratten-Vollserumantikörper für Kontrollflecken verwendet werden.
Exemplarisches Verfahren der Immobilisierung
Die Antikörper im Beschichtungspuffer (z.B. 0,05 M Carbonatpuffer, pH 9,6) werden auf das Polystyrolblatt (PVDF, Nitrocellulose oder Glas könnte verwendet werden) in dreifacher Ausführung und in drei unterschiedlichen Konzentrationen getüpfelt. Sie werden über Nacht bei 4°C in einer Feuchtigkeitskammer inkubiert, um die Bindung zu erlauben. Das Blatt wird gespült und dann für eine Stunde mit Blockierungspuffer inkubiert, um unspezifische Absorption zu verhindern (0,05 M Carbonatpuffer, pH 9,6, 0,5% Casein). Das Blatt wird dann mit Waschpuffer (Natriumphosphatpuffer) gewaschen, und die Probe wird aufgetragen, verdünnt in phosphatgepufferter Kochsalzlösung auf eine Konzentration von 1 mg/ml.
Exemplarische Probenvorbereitung
Die Proben sine Zelllysate, die aus der Leber von mit den obigen Lebertoxinen behandelten Ratten hergestellt und gemäß dem RiboLyser-Protokoll (Hybaid) vorbereitet wurden. Die Zelllysate werden in einem Probenpuffer hergestellt, der eine Mischung aus Proteaseinhibitoren aus 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 2 μg/ml Aprotinin, 2 mM Natriumorthovanadat, 10 mM Natriumfluorid, 10 mM Natriumfluorid, 10 mM Natriumpyrophosphat, 10 mM Natriummolybdat und 2 mg/ml Leupeptin enthält. Die Lysate werden unter Verwendung einer Pierce KwikSpin-Ultrafiltrationseinheit mit einer 5 kDa-Kante auf konzentriert, bevor die Gesamtproteinkonzentration unter Verwendung eines Coomassie Plus-Proteintests (Pierce) bestimmt wird. Die halbgereinigten Proteine werden mit Texas Red-X (Molecular Probes, Produkt Nr. F-6162) gemäß dem Hersteller bereitgestellten Protokoll konjugiert. Texas Red absorbiert bei 595 nm und emittiert bei 625 nm, und somit können die resultierenden Blätter auf einem Molecular Dynamics Storm-System abgetastet werden.
Exemplarische Ergebnisse
2 ist ein Diagrammbeispiel für das resultierende abgetastete Blatt, worin A bis H die in drei Konzentrationen von links nach rechts getüpfelten PRUs sind und die Flecken das in der Probe aus dem Gewebe vorhandene Protein anzeigen.
Exemplarische Schlußfolgerungen
Diese Ergebnisse zeigen, daß kein Protein D in der Probe detektiert wird, aber daß es eine hohe Expression von Protein H gibt. Dieses Muster kann die Unterscheidung dieser Verbindung von der unbehandelten Probe und den vier anderen mit Lebertoxin behandelten Lebern ermöglichen. Diese Ergebnisse können als Musterübereinstimmungsübung verwendet werden, und Veränderungen der Expression können für die Entwicklung von Hypothesen in Bezug auf Toxizitätsmechanismen verwendet werden. Wenn eine große Anzahl von PRUs verwendet wird, zum Beispiel unter Verwendung synthetischer CDRs, können besonders stark oder schwach exprimierende Proteine identifiziert und ihre Bedeutung erstmals erkannt werden.
Beispiel 5: Proteinbiochemiefeld zur Differenzierung der Proteinexpression in der Leber nach Verabreichung von Azathioprin im Vergleich mit Positivkontrolle
5.1. PRU-Immobilisierung/Gitterkonstruktion
Beschichte Silan-beschichtete Glasobjektträger (Sigma) mit Glutaraldehyd 2% (Agar Scientific) und belasse sie für 1 Stunde. Zeichne eine Fläche auf den Objektträger mit PAP-Stift (Sigma), dies erzeugt eine hydrophobe Sperre um die mit Antikörpern oder Proteinerkennungseinheiten zu tüpfelnde Fläche. Tüpfel eine Lösung, die Antikörper/Proteinerkennungseinheiten enthält, direkt auf den Objektträger in 0,5 μl Volumina, verdünnt in Beschichtungspuffer (0,2 M Natriumcarbonatpuffer, pH 9,6 oder KPL-Beschichtungspuffer (Kirkegaard and Perry Laboratories)). Belasse bei 4°C über Nacht in einem befeuchteten Behälter.
PVDF- oder Nitrocellulose-Objektträger – Oncyte-Objektträger (Grace Biolabs) können auch als Oberfläche verwendet werden, diese werden anders als die obigen wie folgt hergestellt: Vorbenetze PVDF-Membran durch Auflegen von Membran in 100%iges Methanol (ROMIL) und kurzes Eintauchen. Übertrage die Membran in einen Behälter mit TBS (kein Tween 20) und tauche für 2 Minuten ein. Zur Verhinderung der Austrocknung der Membran während des Tüpfelns, lege die Membran auf 2 Blätter aus Tüpfelpapier, das mit TBS angefeuchtet ist. Tüpfel eine Lösung, die Antigen/Proteinerkennungseinheit enthält, direkt auf angefeuchtete PVDF-Membran in 0,5 μl Volumina, verdünnt in Beschichtungspuffer. Belasse für 1 Stunde bei Raumtemperatur in befeuchtetem Behälter.
Nitrocellulose-Objektträger – Oncyte-Objektträger (Grace Biolabs) werden durch Tüpfeln einer Lösung, die Antigen/Proteinerkennungseinheiten enthält, direkt auf den Objektträger in 0,5 μl Volumina hergestellt, verdünnt in Beschichtungspuffer. Belasse für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
Maßgeschneiderte Objektträger mit verschiedenen Beschichtungen und Vertiefungen für die Tüpfel aus Antikörper/Proteinerkennungseinheit, die in das Glas geschnitten sind, können auch verwendet werden.
5.2 Proteinlysatvorbereitung aus Gewebe
Aus drei Behandlungen von Mäuseleber hergestellte Lysate:

1. Mit Azathioprin 100 mg/kg für 5 Tage behandelte Leber.
2. Chlorambucil i.p. 15 mg/kg für 5 Tage, dies ist die Positivkontrolle, da es eine beobachtete Leberschädigung in diesen Geweben gibt, die durch klinische Pathologie ersichtlich ist.
3. Unbehandelte Leber.

Aus all diesen Geweben wird am Tag 6 eine Probe entnommen.
Gewebe hergestellt durch Zugabe von 1 ml Lysepuffer (100 mM Kaliumphosphat pH 7,80, 0,2% und 1% Triton X-100, 1 mM DTT, 0,2 mM PMSF und 5 μg/ml Leupeptin)zu 100–150 mg zerkleinertem Gewebe. Ribolysiere in Hybaid Ribolyser für 2 × 10 Sekunden bei Geschwindigkeit 6, mikrozentrifugiere für 5 min mit 13 000 U/min. Entferne Überstand aus Röhrchen, unterteile in Teilmengen und führe Proteinquantifizierungstest durch. Die Abschätzung des Proteingehalts erfolgt durch das Mikrotiterplattenverfahren für den Bicinchoninic Acid Assay (BCA). BCA wird verwendet, da Triton mit anderen Proteintests wie dem Bradford Protein-Test wechselwirkt.
5.5 Test (I)
Die Proteinmischung von Interesse wird mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert (z.B. Molecular Probes Alexa 488 Proteinmarkierungskit). Die Reaktion wird unter Verwendung von Hydroxylamin angehalten, und überschüssiger Farbstoff wird durch Säulentrennung entfernt. Das fluoreszent markierte Protein wird dann zu den auf einer Oberfläche angebrachten PRUs gegeben. Die Position der Bindung und somit die Identität des Proteins kann dann identifiziert werden. Die Proteinmischung kann mit einem Protein "geimpft" werden, das ein Antigen für eine PRU auf dem Gitter ist; dieses wirkt dann als Positivkontrolle um sicherzustellen, daß die Bindung aufgetreten ist.
Herstellung von Proteinmischung
Stelle Proteinmischungen hergestellt, typischerweise in Lysat mit einer Positivkontrolle ("Impfung"), z.B. ein Protein, das das Antigen für einen auf das Gitter getüpfelten Antikörper ist. Zur Markierung der Proteinmischung mit den meisten Farbstoffen von Molecular Probes muß die Gesamtkonzentration der Mischung ca. 2 mg/ml sein. Markiere Proteinmischung und Kontrollen (Impfungen) mit Farbstoffen (Molecular Probes) unter Verwendung des Alexa^TM Protein Labeling Kit-Protokolls oder des F1uoReporter BODIPY FL Protein Labeling Kit – dieses Protokoll wurde für BODIPY 630/650 und BODIPY 650/665 wie folgt angepaßt:
Gebe 20 μl Farbstoff zur 200 μl Lysat, Konzentration ca. 1 mg.
Belasse im Dunkeln für 1 Stunde, wobei gelegentlich vorsichtig umgedreht wird. Gebe 7 μl von vorbereitetem Hydroxylamin, pH 8,5 hinzu und belasse für 30 min. Stelle in eine Spin-Säule, die 30 000 MG Größenausschlußharz in PBS (BIORAD) enthält, für 3 min bei 11000 g. Falls Präzipitat, rotiere für 5 Minuten und nehme nur Überstand.
Bindung von Proteinen an ein PRU-Feld
Alle Puffer mit 20 ml pro Objektträger hinzugegeben.
Wasche Objektträger mit 0,05% Tween/PBS-Puffer für 5 Minuten.
Zur Sättigung von unspezifischen Proteinbindungsstellen blockiere mit Blockierungspuffer für 1 Stunde.
Wasche in 0,05% Tween/PBS-Puffer.
Abtastung mit Scanner Array (Molecular Dynamics) – bewahre die Objektträger vor dem Austrocknen, diese werden als Hintergrundkontrolle verwendet. Aufgrund des Austrocknens müssen getrennte Objektträger als Kontrollen für die auf PVDF oder Nitrocellulose hergestellten Gitter hergestellt werden.
Gebe 100 μl Farbstoff + Proteinmischung zu den Objektträgern und belasse im Dunkeln für 1 Stunde, bewahre im Dunkeln soweit wie möglich ab diesem Punkt auf.
Wasche 2-mal für 5 min in TBST-Waschpuffer.
Wasche 1-mal in TBS-Waschpuffer, entferne Tween.
Gebe einige Tropfen Vectashield (Vector Laboratories) zu Nitro cellulose-Objektträgern (Grace Biolabs); dies ist zum Erhalt eines Brechungsindex nahe demjenigen von Glas.
Plaziere die Membran auf einen Glasobjektträger und bedecke sie mit einem Deckglas, falls PVDF-Membran verwendet wird.
Taste mit Scanner Array (MD) ab.
Puffer: Carbonatpuffer pH 9,5, 0,2 M pro Liter:
Oder Carbonat-Bicarbonat-Pufferkapseln 0,05 M-Puffer, pH 9,6 (Sigma) TBS-Waschpuffer pH 8,0 pro Liter:
Löse die Komponenten in 800 ml entionisiertem Wasser auf. Stelle auf pH 8,0 und bringe auf ein Endvolumen von 1 l.
TBST-Waschpuffer pH 8,0 pro Liter:
Blockierungspuffer – frisch herstellen auf:
1 × PBS (Sigma)
0,2% (G/V) Marvel – Magermilchpulver
0,1% (G/V) Tween 20 (Sigma)
Lysepuffer: Dieser Puffer enthält keine Tris (Tris enthält ein primäres Amin, und die meisten der Farbstoffe von Molecular Probes reagieren mit jedem primären Amin).
100 mM Kaliumphosphat pH 7,8 (Sigma)
0,2% Triton X-1008 (Sigma)
1 mM DTT (Sigma) kurz vor der Verwendung zugeben
0,2 mM PMSF (Sigma), hergestellt in Isopropanol (Sigma), kurz vor Verwendung hinzugeben.
5 μg/ml Leupeptin (Sigma), kurz vor Verwendung hinzugeben.
Die Objektträger werden in dieser ersten Stufe abgetastet, um die Hintergrundfluoreszenz der Oberfläche (Silan/Glutaraldehyd, Nitrocellulose oder PVDF) und der Proteinerkennungseinheiten zu bestimmen. Hintergrundfluoreszenz kann durch Optimieren der Konzentration der Proteinerkennungseinheiten und auch durch Auswahl eines Farbstoffs begrenzt werden, der in einem Bereich ist, in dem die geringste Fluoreszenz der Proteinerkennungseinheiten ist.
Farbstoffe wurden unter Berücksichtigung ihrer Bindungsstärke an eine Proteinmischung und Betrachten bei ihren * Absorptions-(Abs)- und Fluoreszenzemissions-(Em)-Maxima ausgewählt. Die Spektren sind ausführlich in der Literatur von Molecular Probes angegeben.
Farbstoffe werden ausgewählt, um eine minimale Hintergrundfluoreszenz zu ergeben, und mit einem Emissionsspektrum, das geeignet für die gewählte Detektionsvorrichtung ist.
Ein Array-Scanner Generation III (Molecular Dynamics) wurde verwendet:
Auch ein Storm (Molecular Dynamics) kann allein für Membranen verwendet werden.
Ergebnisse
3 zeigt die Variation zwischen unterschiedlichen CDRs (H2 oder H3). Collagen CDR H3 bindet an Collagen im Lysat und kann detektiert werden. Collagen CDR H2 zeigt keine Bindung, und NGF CDR H3 bindet so stark an geimpftes Lysat wie NGF-Antikörper (0,01 mg/ml).
4 zeigt Unterschiede der NGF CDR- und Ab-Bindung in Lysaten +/– NGF-Protein-Impfung. Dies zeigt Bindung durch NGF CDRs und Ab in Lysaten mit und ohne eine NGF-Proteinimpfung. Dieses Experiment zeigt die Verwendung von PRU-Feldern in der Detektion von Proteinen in einer Mischung. Das Feld kann mit mehreren PRUs aufgebaut werden, die relevant für das Gewebe oder die Behandlung von Interesse sind, in diesem Fall wird der Test unter Verwendung von Lysaten durchgeführt, die aus behandelten und unbehandelten Tieren hergestellt werden (z.B. Mäusen, die mit Azathioprin behandelt werden und Kontrollmäusen), um Proteinveränderungen zu bestimmen, die auftreten, wenn das Tier einer Behandlung unterworfen wird.
5.4 Test (II)
Biotin/Avidin-Verfahren: Ein Verfahren der nicht-kovalenten Konjugation soll Gebrauch von der natürlichen starken Bindung von Avidin für das kleine Biotinmolekül machen. Jedes Avidinmolekül enthält maximal 4 Biotin-Bindungsorte, die Wechselwirkung kann verwendet werden, um die Signalstärke im System von Test (II) zu steigern.
Das Roche-Biotin-Markierungskit enthält Modifikationsreagens, das eine funktionelle Biotin-Gruppe an Proteine addieren kann. Biotin-markierte Reagentien sind normalerweise an Proteine durch freie Amino-Gruppen gekoppelt. Biotin-markierte Reagentien werden durch Verwendung von Avidin oder Streptavidin detektiert und quantifiziert. Diese Proteine binden eng an Biotin unter Bildung eines im wesentlichen irreversiblen Komplexes (K_a 10¹⁴ mol^–1). NeutrAvidin-Biotin-bindendes Protein ist ein Protein, das verarbeitet wurde, um das Kohlehydrat zu entfernen und seinen isoelektrischen Punkt zu verringern – dies kann manchmal Hintergrundanfärbung reduzieren.
Verfahren: Markiere die Proteinmischung von Interesse mit Biotin unter Verwendung des Biotin-Proteinmarkierungskits (Roche) und leite sie durch eine Säule zur Entfernung von überschüssigem Biotin. Binde die Proteinmischung-Biotin an die PRU-Objektträger für 1 Stunde bei Raumtemperatur (RT). Spüle Überschuß ab. Wasche den Objektträger mit Streptavidin-Farbstoff (z.B. NeutrAvidin^TM-Alexa 488-Konjugat (Molecular Probes) oder Streptavidin-Alexa 546-Konjugat (Molecular Probes)) für 1 Stunde bei RT.
Wasche und taste ab.

Claims

Verfahren zur Vorhersage der toxischen Wirkung einer ausgewählten Testverbindung auf ein Säugetier, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: (a) Bereitstellen einer Mehrzahl identischer räumlicher Felder von Proteinerkennungseinheiten; (b) Inkontaktbringen eines räumlichen Feldes aus Schritt (a) mit einer protein- oder peptidhaltigen Mischung, die aus einer Zielzelle, einem Zielgewebe oder einem biologischen Zielorganismus extrahiert und isoliert wurde, die/das/der einem bekannten toxischen Stoff ausgesetzt wurde, und Detektieren der Bindung von Proteinen oder Peptiden an die Proteinerkennungseinheiten; (c) Inkontaktbringen eines räumlichen Feldes aus Schritt (a) mit einer protein- oder peptidhaltigen Mischung, die aus einer Zielzelle, einem Zielgewebe oder einem biologischen Zielorganismus extrahiert und isoliert wurde, die/das/der nicht dem bekannten toxischen Stoff aus Schritt (b) ausgesetzt wurde, und Detektieren der Bindung von Proteinen oder Peptiden an die Proteinerkennungseinheiten; (d) Vergleichen des Bindungsmusters aus Schritt (b) und Schritt (c) zur Identifizierung eines etwaigen Bindungsunterschieds zwischen dem Ziel, das dem bekannten toxischen Stoff ausgesetzt wurde, und dem nichtausgesetzten Ziel, wobei der Unterschied indikativ für eine Wirkung auf die Proteinexpression in dem Ziel ist, das dem bekannten toxischen Stoff ausgesetzt wurde; (e) Wiederholen der Schritte (b) und (d) und gegebenenfalls von Schritt (c) mit einem anderen bekannten und strukturell unterschiedlichen toxischen Stoff mit einer gemeinsamen toxischen Wirkung auf Säugetiere wie der bekannte toxische Stoff aus Schritt (b), um ein "Fingerabdruck"-Bindungsmuster zu erzeugen, das charakteristisch für die gemeinsame toxische Wirkung ist; (f) wiederholen der Schritte (b) und (d) und gegebenenfalls von Schritt (c) mit der ausgewählten Testverbindung, um ein Testbindungsmuster zu erzeugen, worin eine substantielle Identität zwischen dem Fingerabdruck aus Schritt (e) und dem Testbindungsmuster anzeigt, daß die Testverbindung die gemeinsame toxische Wirkung teilt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das räumliche Feld Proteinerkennungseinheiten umfaßt, die auf einem festen oder halbfesten Träger immobilisiert sind.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, worin die Proteinerkennungseinheiten aus minimalen Erkennungseinheiten, Antikörpern oder Antikörperfragmenten, hochaffinen Peptiden und komplementaritätsbestimmenden Regionen ausgewählt sind.
Verfahren gemäß Anspruch 3, worin die Proteinerkennungseinheiten komplementaritätsbestimmende Regionen sind.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Detektion der Bindung unter Verwendung eines Anfärbungsverfahrens oder unter Verwendung von Radiomarkierung oder chemischer Markierung erreicht wird, wobei die Markierung entweder vor oder nach dem Bindungsschritt durchgeführt wird.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Detektion der Bindung das Durchmustern des räumlichen Feldes unter Verwendung eines optischen oder Laser-Scanners und das Bestimmen der Koordinaten der Bindungsaktivität mit einer Berechnungseinrichtung umfaßt.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die protein- oder peptidhaltige Mischung ein aus einem biologischen Organismus isolierter Zellextrakt ist.