JP2010505431A - 過敏性腸症候群の処置および予防のための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
過敏性腸症候群(IBS)および炎症性腸疾患(IBD)は、腹痛、不快感(切迫と鼓脹)および排便習慣の変化が慢性的に繰返される症状を特徴とする状態の代表的な2つである。しかしながら、これらの腸疾患は病態と生理病理学が有意に異なり、したがって、異なる診断方法および処置方法が関与する。IBDが小腸および/または大腸における炎症または潰瘍化を特徴とする場合、かかる明白な構造上の変化はIBSと関連していない。IBSは、病態が未知の機能性(器質性と反対)の腸障害に分類される。機能性障害は、主な異常が、特定可能な構造的または生化学的原因ではなく、生理学的機能の変化である障害または疾患をいう。現在、IBSの診断は、検出可能な構造的異常の非存在下での特徴的な症状群に基づくもの(Drossman DA,Camilleri M,Mayer EA,Whitehead WE.AGA technical review
on irritable bowel syndrome.Gastroenterology.2002;123:2108−31)、例えば、検出可能な進行中の器質性疾患の非存在下で起こる断続的な腹痛および不快感ならびに排便習慣の変化、例えば、弛緩性または高頻度の排便、下痢および/または便秘に基づくものである。腹痛または腹部の不快感の主症状の特異性が欠如しているため、IBSの現行の診断は、不均一な患者群にあてはまり、主な排便習慣(下痢が主、便秘が主、交代性の下痢と便秘、正常)に基づいて亜群を規定する試みの後になってあてはまる。
略の設計に重要である。さらに、当該技術分野において、IBSおよび他のCVH関連障害をスクリーニング、診断および処置するための改善された方法の必要性が存在する。
本発明は、IBS患者の結腸に構造的異常がないにもかかわらず、正常組織と比べて差次的に発現される遺伝子だけでなく、その差次的発現が、IBSと関連し、診断上、予測上のおよび/または治療上の価値を有する遺伝子を同定することも可能であるという驚くべき所見に基づく。
、特にIBSの処置に使用され得る化合物をスクリーニング、すなわち同定するための方法に使用され得る。
2およびMUC20からなる群より選択される遺伝子の遺伝子転写レベルの増大、またはCOP1、PSME2、F13A1、NCF4、CSF1R、M160、KCNS3、LYZ、MS4A4A、HELLS、RFC4、MCM5、TAP2、LRAP、DTLおよびVSIG4からなる群より選択される遺伝子の遺伝子転写レベルの減少は、前記被験体におけるIBSの存在の表示である、被験体においてIBSを確認または判定するための方法を提供する。したがって、遺伝子転写レベルの差、より詳細には、IBS1、VSIG2およびMUC20からなる群より選択される遺伝子の遺伝子転写レベルの増大、またはCOP1、PSME2、F13A1、NCF4、CSF1R、M160、KCNS3、LYZ、MS4A4A、HELLS、RFC4、MCM5、TAP2、LRAP、DTLおよびVSIG4からなる群より選択される遺伝子の遺伝子転写レベルの減少は、前記被験体におけるIBSの存在の表示である。
レベルは、タンパク質レベルで測定される。典型的には、このような方法では、タンパク質レベルは、IBS−MSGタンパク質に結合する抗体を用いて測定される。具体的なある実施形態において、該抗体は、IBS1、COP1、PSME2、F13A1、NCF4、CSFR1、M160、KCNS3、LYZ、MS4A4A、HELLS、FRC4、MCM5、TAP2、LRAP、DTL、VSIG2、VSIG4およびMUC20から選択されるIBS−MSGにコードされたポリペプチドまたはタンパク質に対する抗体である。最も特別な実施形態において、IBS1タンパク質のタンパク質レベルは、IBS1の遺伝子産物に特異的な抗体を用いて測定される。
P1、FCGR2AおよびCKBからなる群より選択されるマーカと組み合わせる。
クリーニング方法に使用されるIBS−MSGは、IBS1からなる。特別な実施形態では、IBS1、COP1、PSME2、F13A1、NCF4、CSF1R、M160、KCNS3、VSIG2からなる群に対応するIBS−MSG、より詳細には、IBS1、PSME2、F13A1、NCF4、CSFR1およびVSIG2からなる群に対応するIBS−MSG、あるいはまた、MUC20、VSIG2およびVSIG4からなる群に対応するIBS−MSGに対応するプローブが使用される。
の範囲を限定することなく、単なる例示の目的で示す。以下に示す図面の記載事項は、添付の図面をさす。
本発明の好ましい実施形態を以下に記載する。特に記載のない限り、本明細書および特許請求の範囲における単語および語句は、これが適用される技術分野の当業者にとって、通常の慣用的な意味で示されているものとする。なんらかの他の意味が意図される場合、本明細書において、単語および語句に特別な意味が適用される旨を具体的に記載する。
。
〜30個のアミノ酸、好ましくは5〜15個のアミノ酸)が除去されたバリアントが挙げられる。
手法としては、とりわけ、Hewlett−Packard、Perkin−ElmerおよびGene Logicによって製造販売されている研究用製品が挙げられる。
h.,48,1073に記載されたものが挙げられる。
Analysis Package,バージョン9.1(Devreux J.ら、Nucleic Acid Res.,12,387−395,1984)において入手可能なプログラム、例えば、プログラムBESTFITおよびGAPを用いて、2つのポリヌクレオチド間の同一性%、ならびに2つのペプチド間またはポリペプチド配列間の同一性%および類似性%が測定され得る。BESTFITでは、SmithおよびWatermanの「局所相同性」アルゴリズム(J.Mol.Biol.,147,195−197、1981)が使用され、2つの配列間に最良の単一の類似性領域が見出される。BESTFITは、長さが異なる2つのポリヌクレオチドまたは2つのペプチドもしくはポリペプチド配列を比較するのにより適しており、該プログラムでは、短い方の配列が長い方の一部であると仮定される。比較において、GAPでは、2つの配列をアラインメントし、NeedlemanおよびWunschのアルゴリズム(J.Mol.Biol,48,443−453,1970)に従って「最大類似性」が見い出される。GAPは、ほぼ同じ長さの配列を比較するのにより適しており、アラインメントは全長にわたって予測される。好ましくは、各プログラムで使用されるパラメータ「ギャップウェイト」および「長さウェイト」は、それぞれ、ポリヌクレオチド配列で50と3、およびポリペプチド配列では12と4である。好ましくは、同一性および類似性の%は、比較される2つの配列を最適にアラインメントして測定する。また、配列間の同一性および/または類似性を測定するための他のプログラムも当該技術分野において知られている(例えば、BLASTファミリのプログラム(Altschul S Fら、Nucleic Acids Res.,25:3389−3402,1997))。
サーは、コード配列の転写に影響するならば、該配列に作動可能に連結されている;またはリボソーム結合部位は、翻訳を助長するような位置に存在するならば、コード配列に作動可能に連結されている。一般的に、「作動可能に連結された」とは、連結されたDNA配列が隣接していること、および、分泌性リーダーの場合は、隣接し、かつリーディングフェーズ(reading phase)にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、隣接していなくてもよい。連結は、簡便な制限部位でのライゲーションによって達成される。かかる部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、慣用的実務に従って使用される。
本発明は、CVH、特にIBSの処置用の治療剤としての使用のための化合物を同定するためのスクリーニングアッセイに使用され得る核酸分子および遺伝子産物(タンパク質)を提供する。
の活性を作動もしくは拮抗するものであり得る。かかる化合物は、例えば、IBSにおいて調節されることがわかっている遺伝子の発現を阻害または刺激するのに有用である。該遺伝子の1つ以上の発現プロフィールをモジュレートする化合物は、当該技術分野において知られた数多くのスクリーニング方法を用いて容易に同定され得る。本明細書で用いる場合、遺伝子の発現は、標準的な手法を用いてmRNAのレベル、タンパク質レベルまたはタンパク質の活性を測定することにより測定され得る。
a)少なくとも1種類のIBS−MSGを発現する細胞を試験対象の化合物と接触させること;
b)前記IBS−MSGの発現レベルを測定すること;ならびに
c)前記化合物の非存在下での前記IBS−MSGの発現レベルと比較すること
を含み、
これにより、IBSにおいて観察されるIBS−MSGの発現レベルの変化を妨害することができる化合物が、CVHの処置、特にIBSの処置のための候補化合物として同定される、CVHの処置、特にIBSの処置のための候補化合物を同定するための方法を提供することである。
特定の一実施形態によれば、本発明の方法は、工程(b)において、少なくとも2つの異なる遺伝子の発現の測定であって、該遺伝子の1つが、IBS1、COP1、PSME2、F13A1、NCF4、CSFR1、M160、KCNS3、LYZ、MS4A4A、HELLS、FRC4、MCM5、TAP2、LRAP、DTL、VSIG2、VSIG4、MUC20からなる群より選択され、1つ以上の他の遺伝子が、IBS1、COP1、PSME2、F13A1、NCF4、CSFR1、M160、KCNS3、LYZ、MS4A4A、HELLS、FRC4、MCM5、TAP2、LRAP、DTL、VSIG2、VSIG4、MUC20、CASP1、FCGR2AおよびCKBからなる群より選択される測定を含み、特に、IBS1、COP1、PSME2、F13A1、NCF4、CSFR1、M160、KCNS3、LYZ、MS4A4A、HELLS、FRC4、MCM5、TAP2、LRAP、DTL、VSIG2、VSIG4およびMUC20からなる群より選択される少なくとも2つの遺伝子、特に、IBS1、COP1、PSME2、F13A1、NCF4、CSF1R、M160、KCNS3、VSIG2からなる群より選択される少なくとも2つの遺伝子、より詳細には、IBS1、PSME2、F13A1、NCF4、CSFR1およびVSIG2からなる群の少なくとも2つの遺伝子、さらにより詳細には、MUC20、VSIG2およびVSIG4からなる群の少なくとも2つの遺伝子の発現の測定を含む。本発明のさらなる実施形態は、工程(b)において、少なくとも2つの遺伝子の発現の測定であって、該遺伝子の1つがIBS1であり、その他が、COP1、PSME2、F13A1、NCF4、CSFR1、M160、KCNS3、LYZ、MS4A4A、HELLS、FRC4、MCM5、TAP2、LRAP、DTL、VSIG2、VSIG4、MUC20、CASP1、FCGR2AおよびCKBからな
る群より選択される測定を含む。
a)少なくとも1種類のIBS−MSGを発現する細胞を試験対象の化合物と接触させること;
b)前記IBS−MSGのタンパク質レベルを測定すること;ならびに
c)前記化合物の非存在下での前記IBS−MSGのタンパク質レベルと比較することを含み、
これにより、IBSにおいて観察されるIBS−MSGのタンパク質レベルの変化を妨害することができる化合物が、CVHの処置、特にIBSの処置のための候補化合物として同定される、CVHの処置、特にIBSの処置のための候補化合物を同定するための方法を提供する。
チドに結合する抗体が使用され、最も詳細には、本発明のスクリーニング方法において使用されるIBS−MSGは、IBS1からなる。
determine)であって、該遺伝子の1つが、IBS1、COP1、PSME2、F13A1、NCF4、CSFR1、M160、KCNS3、LYZ、MS4A4A、HELLS、FRC4、MCM5、TAP2、LRAP、DTL、VSIG2、VSIG4、MUC20からなる群より選択され、1つ以上の他の遺伝子が、IBS1、COP1、PSME2、F13A1、NCF4、CSFR1、M160、KCNS3、LYZ、MS4A4A、HELLS、FRC4、MCM5、TAP2、LRAP、DTL、VSIG2、VSIG4、MUC20、CASP1、FCGR2AおよびCKBからなる群より選択される測定を含み、特に、IBS1、COP1、PSME2、F13A1、NCF4、CSFR1、M160、KCNS3、LYZ、MS4A4A、HELLS、FRC4、MCM5、TAP2、LRAP、DTL、VSIG2、VSIG4およびMUC20からなる群より選択される少なくとも2つの遺伝子の遺伝子産物のタンパク質レベルの測定、特にIBS1、COP1、PSME2、F13A1、NCF4、CSF1R、M160、KCNS3、VSIG2からなる群より選択される少なくとも2つの遺伝子、より詳細には、IBS1、PSME2、F13A1、NCF4、CSFR1およびVSIG2からなる群の少なくとも2つの遺伝子、さらにより詳細には、MUC20、VSIG2およびVSIG4からなる群の少なくとも2つの遺伝子の遺伝子産物のタンパク質レベルの測定を含む。本発明のさらなる実施形態は、工程(b)において、少なくとも2種類の遺伝子産物の(of of)タンパク質レベルの測定であって、該遺伝子の1つがIBS1遺伝子産物であり、その他が、COP1、PSME2、F13A1、NCF4、CSFR1、M160、KCNS3、LYZ、MS4A4A、HELLS、FRC4、MCM5、TAP2、LRAP、DTL、VSIG2、VSIG4、MUC20、CASP1、FCGR2AおよびCKBの遺伝子産物からなる群より選択される測定を含む。
a)IBS−MSG産物を試験対象の化合物とともにインキュベートすること;および
b)前記化合物がIBS−MSG産物と結合できる能力を測定すること、ここで、IBS−MSG産物に対して結合できる化合物は、IBSの処置のための候補化合物である、を含む、CVHの処置、特にIBSの処置のための候補化合物を同定および取得するためのスクリーニング方法を提供することである。
Protocols in Molecular Biology,Wiley Interscience,New York,2001)に記載のものなどを用いて測定される。代替的な実施形態において、IBS−MSG産物は、IBS−MSG遺伝子またはその断片から転写されたポリヌクレオチドである。
ラフィ系の手法を用いて同定され得る。例えば、本発明の組換えポリペプチドは、該ポリペプチド(例えば、上記のもの)を発現するように操作された細胞から、標準的な手法によって精製され得、カラム上に固定化され得る。次いで、候補化合物の溶液をカラムに通し、固定化された本発明のポリペプチドに特異的な化合物が、該ポリペプチドに結合する能力に基づいて同定され、カラム上に固定化される。該化合物を単離するため、カラムを洗浄して非特異的結合分子を除去し、次いで、目的の化合物をカラムから放出させ、収集する。同様の方法が、ポリペプチドマイクロアレイに結合した化合物の単離に使用され得る。この方法(または任意の他の適切な方法)によって単離された化合物は、所望によりさらに精製され得る(例えば、高速液体クロマトグラフィによって)。また、このような候補化合物は、本発明のポリペプチドの活性を改変する(例えば、増大または低下させる)能力について試験され得る。このアプローチによって単離された化合物はまた、例えば、ヒト被験体においてIBSを処置するための治療剤として使用され得る。本発明のポリペプチドに10μM以下の親和性定数で結合すると確認された化合物は、本発明に特に有用であるとみなし、本明細書において以下、特異的結合剤とも称する。
抗ヒトCASP1抗体
(Abnova Corporation,Calbiochem,Novus Biologicals)
抗ヒトNCF4抗体
(Abnova Corporation,Abeam,GeneTex,Novus
Biologicals)
抗ヒトリゾチーム抗体
(BIODESIGN International)
抗ヒトPSME2抗体
(Abnova Corporation,Novus Biologicals)
抗ヒトHELLS抗体
(Abnova Corporation,Bethyl Laboratories,GeneTex,Novus Biologicals)
抗ヒトCOP1抗体
(Abnova Corporation,IMGENEX,Novus Biologicals)
抗ヒトMCM5抗体
(Abeam,AbD Serotec,BD Biosciences Pharmingen,Bethyl Laboratories,BioLegend,GeneTex,Lab Vision,Novus Biologicals,Spring Bioscience)
抗ヒトTAP2抗体
(Abgent,BD Biosciences Pharmingen)
抗VSIG2抗体
(Abeam:マウスモノクローナル皮質胸腺細胞抗体,ab24235−ヒト系と反応)
表1に示した遺伝子にコードされたタンパク質に対するアゴニストの例:
リゾチーム活性化(アゴニスト):
−シクロスポリンA(リゾチーム放出の誘導)
−1−エチル−ベンズイミダゾリノン(1−EBIO)
−カルバコール
−タプシガルジン
−フェニレフリン
NADPHオキシダーゼ活性化:
−アンギオテンシンII[Ang II]
−PMA
−TNF−α
−増殖因子
−トロンビン
−酢酸ミリスチン酸ホルボール(PMA)
PSME2およびTAP2活性化:
−インターフェロン−γ
前述のスクリーニングアッセイを用いた目的遺伝子への結合能を有する分子の検出では、目的遺伝子に特異的に結合する分子(例えば、抗体、アゴニストまたはポリヌクレオチドプローブ)は、原子(例えば、放射性核種)、分子(例えば、フルオレセイン)、または物理的もしくは化学的特性により該分子の存在を示す複合体を含有しているので、検出可能に標識され得る。また、分子は、検出可能な原子、分子または他の複合体をもたらす基体に対して作用する「レポーター」分子(例えば、酵素などの生体分子)に共有結合されている場合、あるいはこれと会合している場合、検出可能に標識され得る。本発明における使用に適した検出可能な標識としては、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段によって検出可能な任意の組成物が挙げられる。本発明に有用な標識としては、標識アビジンまたはストレプトアビジンコンジュゲートでの染色のためのビオチン、磁気ビーズ(例えば、Dynabeads)、蛍光色素(例えば、フルオレセイン、フルオレセイン−イソチオシアネート(FITC)、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、増強緑色蛍光タンパク質、リサミン、フィコエリトリン、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、FluorX[Amersham]、SyBR Green IおよびII[Molecular Probes]など)、放射性標識(例えば、3H、125I、35S、14Cもしくは32P)、酵素(例えば、ヒドロラーゼ、特にホスファターゼ、例えばアルカリホスファターゼ、エステラーゼおよびグリコシダーゼ、またはオキシドレダクターゼ、特にペルオキシダーゼ、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、など)、基質、補因子、インヒビター、化学発光基、色素形成剤、ならびに比色的標識、例えば、金コロイドまたは着色ガラスまたはプラスチック(例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど)ビーズが挙げられる。かかる標識の使用を教示する特許としては、米国特許第3,817,837号;同第3,850,752号;同第3,939,350号;同第3,996,345号;同第4,277,437号;同第4,275,149号;および同第4,366,241号が挙げられる。
が挙げられる。標識が蛍光標識である場合、これは、蛍光色素を適切な波長の光で励起し、生じた蛍光を検出することにより検出され得る。蛍光は、写真フィルムによって、電荷結合素子(CCD)もしくは光電子増倍管などの電子検知器などの使用によって、可視的に検出され得る。同様に、酵素標識は、適切な基質を該酵素に提供し、得られた反応生成物を検出することにより検出され得る。また、単純な比色的標識は、該標識に伴う発色を観察することにより検出され得る。蛍光共鳴エネルギー転移は、非標識リガンドの結合に適合されており、アレイにおいて有用であり得る。
Protein Res.1991,37:487−493;米国特許第4,631,211号;米国特許第5,010,175号;Needelsら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993,90:10700−4;Ohlmeyerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993,90:10922−10926;PCT公開公報番号WO92/00252;およびPCT公開公報番号WO 94/28028)由来の化学物質;ならびにさまざまな供給元、例えば、Maybridge
Chemical Co.(Trevillet,Cornwall,UK)、Comgenex(Princeton,NJ)、Brandon Associates(Merrimack,NH)、Microsource(New Milford,CT)、Aldrich(Milwaukee,WI)、Pan Laboratories(Bothell,WA)、およびMycoSearch(NC)から入手可能な合成または天然化合物の大型ライブラリ(例えば、Blondelleら、TIBTech 19
96,14:60参照)が挙げられ得る。
本発明は、さらに、診断用試薬としての本発明のポリヌクレオチドの使用に関する。IBS1、COP1、PSME2、F13A1、NCF4、CSFR1、M160、KCNS3、LYZ、MS4A4A、HELLS、FRC4、MCM5、TAP2、LRAP、DTL、VSIG2、VSIG4およびMUC20からなる群より選択されるIBS−MSGの変異型形態の検出、特に、IBS1、COP1、PSME2、F13A1、NCF4、CSF1R、M160、KCNS3、VSIG2からなる群、より詳細には、IBS1、PSME2、F13A1、NCF4、CSFR1およびVSIG2からなる群、さらにより詳細には、MUC20、VSIG2およびVSIG4からなる群、最も詳細には、IBS1からなる本発明の診断方法に使用されるIBS−MSGの変異型形態の検出により、該遺伝子の不充分な発現、過剰発現または空間的改変または一時的発現に起因する疾患の診断もしくは疾患に対する感受性に付加されるか、またはこれらが明示され得る診断用ツールが提供される。該遺伝子に変異を有する個体は、さまざまな手法によってDNAレベルで検出され得る。
(a)本発明によるポリヌクレオチドにおける変異の存在または非存在を測定すること;および
(b)前記変異の存在または非存在に基づいて、病的状態または病的状態に対する感受性診断すること
を含む、被験体におけるCVH、特にIBSと関連する病的状態または病的状態に対する感受性の診断方法が提供されることが認識されよう。
USA(1985)85:4397−4401参照)によっても示され得る。別の実施形態では、IBS−MSGに特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築して、例えば、遺伝子変異の効率的なスクリーニングが行なわれ得る。アレイ手法・方法は周知であり、一般適用性を有し、分子遺伝学、例えば、遺伝子発現、遺伝子連鎖および遺伝子変異性におけるさまざまな問題に取り組むために使用され得る(例えば、M.Cheeら、Science,Vol274,pp610〜613(1996)を参照)。
(a)被験体の生物学的試料において、IBS−MSGの遺伝子転写レベルを測定すること;
(b)該遺伝子転写レベルを正常対照試料における遺伝子転写レベルと比較すること;ならびに
(c)工程b)の結果に基づいて診断を得ること
を含む、被験体においてIBSを検出および/またはモニタリングするための方法を提供する。
(a)被験体の生物学的試料において、IBS1、COP1、PSME2、F13A1、NCF4、CSFR1、M160、KCNS3、LYZ、MS4A4A、HELLS、FRC4、MCM5、TAP2、LRAP、DTL、VSIG2、VSIG4およびMUC20からなる群、特に、IBS1、COP1、PSME2、F13A1、NCF4、CSF1R、M160、KCNS3およびVSIG2からなる群、より詳細には、IBS1、PSME2、F13A1、NCF4、CSFR1およびVSIG2からなる群、さらにより詳細には、MUC20、VSIG2およびVSIG4からなる群より選択されるIBS−MSGの遺伝子転写レベルを測定すること、
(b)該遺伝子転写レベルを正常対照試料における遺伝子転写レベルと比較すること;ならびに
(c)工程b)の結果に基づいて、診断を得ることおよび/または試料が(特定の型の)IBSを示すか否かを判定すること
を含む、被験体においてIBSを検出および/またはモニタリングするための方法を提供
することである。
したがって、本発明の目的は、
(a)被験体の生物学的試料において、IBS1、COP1、PSME2、F13A1、NCF4、CSFR1、M160、KCNS3、LYZ、MS4A4A、HELLS、FRC4、MCM5、TAP2、LRAP、DTL、VSIG2、VSIG4およびMUC20からなる群、特に、IBS1、COP1、PSME2、F13A1、NCF4、CSF1R、M160、KCNS3およびVSIG2からなる群、より詳細には、IBS1、PSME2、F13A1、NCF4、CSFR1およびVSIG2からなる群、さらにより詳細には、MUC20、VSIG2およびVSIG4からなる群より選択されるIBS−MSGの遺伝子転写レベルを測定すること、ならびに
(b)該遺伝子転写レベルを正常対照試料における遺伝子転写レベルと比較すること
を含み、
ここで、IBS1、VSIG2およびMUC20からなる群より選択される遺伝子の遺伝子転写レベルの増大、またはCOP1、PSME2、F13A1、NCF4、CSF1R、M160、KCNS3、LYZ、MS4A4A、HELLS、RFC4、MCM5、TAP2、LRAP、DTLおよびVSIG4からなる群より選択される遺伝子の遺伝子転写レベルの減少は、前記被験体におけるIBSの存在の表示である、被験体においてIBSを確認するための方法を提供することである。
(a)被験体の生物学的試料において、少なくとも1種類のIBS−MSGタンパク質のタンパク質レベルを測定すること;
(b)該タンパク質レベルを正常対照試料におけるタンパク質レベルと比較すること;および
(c)工程b)の結果に基づいて診断を得ること
を含む、被験体においてIBSを確認および/またはモニタリングするための方法を提供する。
a)被験体の生物学的試料を、IBS−MSGポリペプチドと特異的に結合する少なくとも1種類の薬剤と接触させること;
b)該ポリペプチドに対する該薬剤の結合レベルを測定すること;
c)前記生物学的試料中の該薬剤の結合レベルを、正常対照試料中の該薬剤の結合レベルと比較すること;ならびに
d)工程c)の結果に基づいて、診断を得ること、または試料がIBSおよび/または
IBSの特定の状態を示すか否かを判定すること
を含む、被験体においてIBSを検出および/またはモニタリングするための方法を提供することである。
本発明はまた、生物学的試料中のIBS−MSG産物の存在を検出するためのキットを包含し、該キットは、上記の任意の診断アッセイ行なうのに必要とされる成分と、生物学的試料におけるIBS−MSGの発現の評価および被験体におけるIBSの診断に該成分を使用するための使用説明書とを備える。
(a)IBS−MSGに特異的に結合する少なくとも1種類のプローブ、特に、IBS1、COP1、PSME2、F13A1、NCF4、CSFR1、M160、KCNS3、LYZ、MS4A4A、HELLS、FRC4、MCM5、TAP2、LRAP、DTL、VSIG2、VSIG4およびMUC20からなる群より選択されるIBS−MSG、より詳細には、IBS1、COP1、PSME2、F13A1、NCF4、CSF1R、M160、KCNS3およびVSIG2からなる群より選択されるIBS−MSG、さらにより詳細には、IBS1、PSME2、F13A1、NCF4、CSFR1およびVSIG2からなる群より選択されるIBS−MSG、最も詳細には、MUC20、VSIG2およびVSIG4からなる群より選択されるIBS−MSGに特異的に結合する少なくとも1種類のプローブ;または
(b)IBS−MSGポリペプチドまたはその断片に特異的に結合する少なくとも1種類の薬剤;特に、IBS1、COP1、PSME2、F13A1、NCF4、CSFR1、M160、KCNS3、LYZ、MS4A4A、HELLS、FRC4、MCM5、TAP2、LRAP、DTL、VSIG2、VSIG4およびMUC20からなる群より選択されるIBS−MSGのポリペプチド、より詳細には、IBS1、COP1、PSME2、F13A1、NCF4、CSF1R、M160、KCNS3およびVSIG2からなる群より選択されるIBS−MSGのポリペプチド、さらにより詳細には、IBS1、PSME2、F13A1、NCF4、CSFR1およびVSIG2からなる群より選択されるIBS−MSGのポリペプチド、最も詳細には、MUC20、VSIG2およびVSIG4からなる群より選択されるIBS−MSGのポリペプチドまたはその断片に特異的に結合する少なくとも1種類の薬剤、
を備える診断用キットを提供することである。
なる実施形態は、少なくとも2つの遺伝子の発現を測定するための2種類以上のプローブおよび/または結合剤を備え、該遺伝子の1つはIBS1であり、その他が、COP1、PSME2、F13A1、NCF4、CSFR1、M160、KCNS3、LYZ、MS4A4A、HELLS、FRC4、MCM5、TAP2、LRAP、DTL、VSIG2、VSIG4、MUC20、CASP1、FCGR2AおよびCKBからなる群より選択される。
本発明は、被験体においてCVHを処置または予防するため、特にIBSを処置または予防するための方法および組成物を特徴とする。IBS1、VSIG2およびMUC20のレベルは、IBSを有する被験体において増大していることが見出された。したがって、本発明は、これらのポリペプチドまたは核酸分子の任意の1種以上の発現レベルまたは生物学的活性を減少させる方法および薬剤を包含する。かかる薬剤(より詳細に後述)としては、上記のポリペプチドの任意の1種以上の生物学的活性を下方調節または阻害する化合物;免疫学的/ワクチン製剤;上記のポリペプチドの任意の1種類に特異的に結合する精製抗体または抗原結合断片;アンチセンス核酸塩基オリゴマー;および上記のポリペプチドのいずれかを標的化するdsRNAが挙げられる。
Antisense Inhibitors of Gene Expression,CRC Press,Boca Raton,FL(1988)を参照)。あるいはまた、該遺伝子と三重らせん(「三重鎖」)を形成するオリゴヌクレオチドが供給され得る(例えば、Leeら、Nucleic Acids Res(1979)6:3073;Cooneyら、Science(1988)241:456;Dervanら、Science(1991)251:1360を参照)。このようなオリゴマーは、それ自体を投与してもよく、関連オリゴマーをインビボで発現させてもよい。合成アンチセンスまたは三重鎖オリゴヌクレオチドは、修飾塩基または修飾主鎖を含むものであってもよい。後者の例としては、メチルホスホネート、ホスホロチオエートまたはペプチド核酸主鎖が挙げられる。かかる主鎖は、ヌクレアーゼによる分解からの保護をもたらすため、アンチセンスまたは三重鎖オリゴヌクレオチド内に組み込まれ、当該技術分野で周知である。これらおよび/または他の修飾主鎖とともに合成されるアンチセンスおよび三重鎖分子もまた、本発明の一部を構成する。
Nら、Curr.Opin.Struct.Biol(1996)6(4),527−33を参照)。合成リボザイムは、前述のmRNAを選択した位置で特異的に切断し、それにより前記mRNAの機能性ポリペプチドへの翻訳が抑制されるように設計され得る。リボザイムは、RNA分子に通常見られるような天然リボースのリン酸主鎖と天然塩基を用いて合成され得る。あるいはまた、リボザイムは、リボヌクレアーゼ分解からの保護をもたらす非天然主鎖(例えば、2‘−O−メチルRNA)を用いて合成され得、修飾塩基を含んでいてもよい。
非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体である(例えば、米国特許第4,816,567号を参照)。実際、ヒト化抗体は、典型的には、一部のCDR残基と場合によっては一部のFR残基が、齧歯類の抗体内の類似部位に由来する残基で置換されたヒト抗体である(Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593−596,1992)。
プチドを、適当な医薬用担体との組み合わせで投与することである。
本発明の目的は、IBSの病因の分子的機序をさらに理解することであり、常套的な臨床実務と同様にして採取した生検材料を使用し、S状結腸粘膜のマイクロアレイ発現プロファイリング研究を行なった。
IBS患者(21例のIBS−Dおよび15例のIBS−C)ならびに25例の健常対照被験体を含めた。患者はすべて、IBS診断(Thompsonら、1999)のRome II基準を満たしており、臨床検査を受けており、他の胃腸管の障害は除外した。患者は、標準的なアンケートによって研究時に確認された主な腸機能障害に基づいて選択した。S状結腸鏡検査時、各参加者から2つのS状結腸生検材料を採取した。健常およびIBSにおける分子署名の安定性を評価するため、10例の被験体(5例のIBS患者および5例の健常対照)から、2〜3ヶ月後にさらなる第3の結腸生検材料を採取した。
被験体の募集および結腸生検試料の採取
IBS参加者は、Rochester(Minnesota,USA)から半径150マイル以内に居住している752例のIBS患者の管理データベースから選択し、郵送で募集した。IBS患者はすべて、胃腸科専門医スタッフにより、内視鏡検査、生検材料および直腸排出試験を含む臨床表示試験によって既に評価済みであった。患者は、標準的なアンケート(Talleyら、1990)によって研究時に確認された主な腸機能障害に基づいて選択した。健常志願者は、Rochester,MNで一般広告によって募集した。参加の案内状に応募した参加者はすべて、研究のインフォームドコンセント(Mayo Clinic Institutional Review Boardによって承認済)に署名した。各参加者は、有効腸疾患アンケート(Talleyら、1990)(Rome II基準(Thompsonら、1999)に対応する質問を含む)に記入した。また、腸疾患アンケートには、非潰瘍性消化不良の特徴である身体化障害および症状を確認することを意図した心身症状のチェックリストを含め、疫学的研究に拡張して使用した。
採取時、結腸生検試料は、直ちに5容量のRNAlater溶液(Ambion,Austin,TX)中に浸漬させ、さらなる解析まで−20℃で保存した。組織をミキサーミル501(Qiagen,Venlo,The Netherlands)にて、RLT細胞溶解バッファー(Qiagen)中で均質化した後、RNeasyミニキット(Qiagen)を用いてカラム上でのDNアーゼ処理により、破砕細胞からRNA抽出を行なった。1μgの全RNAをビオチン標識し、Human Genome U133 Plus 2.0 GeneChipマイクロアレイ上で、供給元(Affymetrix,Santa Clara,CA)の使用説明書に従ってハイブリダイズさせた。試料数が大きいため(n=132)、実験室でのこの処理は、4つの異なるバッチで行ない、各々には、IBSと健常被験体の両方の試料を含めた。未処理のAffymetrix G
eneChipデータの遺伝子発現サマリー値を、gcRMAアルゴリズム(Wuら 2004)(これは、GC親和性を考慮して、バックグラウンド調整、分位標準化および要約を行なう)を用いてコンピュータ処理した。PANP(Warrenら、2006)を、遺伝子の非存在または存在の呼び出し検出に使用し、1つの処置群の試料の少なくとも50%において存在が呼び出された場合は、遺伝子をフィルター処理した(McClintickおよびEdenberg,2006)。種々の試料処理バッチの効果は、標準化後の明白なままであった。この技術的変動源を、元のバッチの関数として(in function of)一元配置ANOVAにおいて、発現レベルをモデル設計することにより補正し、このモデルの残差を、その後のすべての解析に使用した。最後に、擬似複製(Hurlbert 1984)により誤った結果が得られるのを回避するため、SAMおよびPAM解析について、複製試料の発現値を患者ごとに平均した(下記参照)。
同じ患者での経時的および組織空間の試料の再現性を定量するため、1000個の最も可変的な遺伝子プローブ、ならびにPAM解析においてIBS疾患状態を予測することがわかった32遺伝子プローブの組について、一致係数(Lin 1989)を算出した。
マイクロアレイの有意性解析(SAM)を、IBS疾患者対健常者において差次的に発現される遺伝子の特定に適用した(0.05のDを使用)(Tusherら、2001)。また、代替法として、混合型ANOVAの適用(バッチおよび疾患状態は固定、患者は変量効果、FDR補正あり(Storeyら、2003))によって、より厳密な統計学的モデルを、未処理データ(すなわち、バッチ補正前のすべての生検試料処理前データ)に適用した。
疾患状態の予測のため、マイクロアレイ予測解析(Predictive Analysis of Microarray)(PAM)を適用した。これは、収縮重心法(Tibshiraniら、2002)を用いた最短重心分類の向上型変法である。8例のIBS患者および8例の健常被験体由来の試料を、モデル構築工程とは独立して維持し、起こり得る過剰適合がチェックされるようにモデルの予測力を評価した。
分子署名の基礎構造を特定するため、階層的クラスタリング(Spotfire DecisionSite 8.2 ソフトウェア)を、PAMおよびSAM解析の両方で選択された16遺伝子プローブの組に適用した。
SAMソフトウェアは、http://www−stat.stanford.edu/〜tibs/SAM/で入手可能である。
試料解析
各結腸生検試料から調製したビオチン標識全RNAを、Human Genome U133 Plus 2.0 GeneChip マイクロアレイ(Affymetrix)においてハイブリダイズさせた。得られた未処理データファイル(バックグラウンド調整、データの標準化および変換、ならびに技術的バッチ変動に対する補正を含む)の前処
理により、各試料の遺伝子発現サマリー値のプロフィールが示された。これを、すべてのさらなる解析に使用した。
IBS患者の結腸粘膜において有意に低い発現レベルを有する少なくとも3つの遺伝子は、主要組織適合性I複合体:PSME2(プロテアソームアクチベータサブユニット2、PA28β)、TAP2(輸送体2、ATP結合カセット、サブファミリB)、およびLRAP(白血球由来アルギニンアミノペプチダーゼ)による抗原のプロセッシングおよび提示の経路に不可欠な役割を果たしている。PA28は、クラスI主要組織適合性複合体(MHC)ペプチド(Preckelら、1999)の抗原プロセシングを担う細胞質ゾル免疫プロテアソーム複合体の合成に不可欠である。TAP2は、TAP1とともに、小胞体(ER)膜内でヘテロ二量体膜貫通ATP結合カセット(ABC)輸送体を形成しており、これは、細胞質ゾルからERへの抗原性ペプチドの送達に不可欠であり、ERでは、このペプチドがMHCクラスI分子上に負荷される。TAP2は、TAP1とは異なり、単離において非常に不安定であり、機能性TAPの生合成は、新たに合成されたTAP2による既存のTAP1の合成に依存するが、逆はそうではなく、これは、主に、TAP2発現によって活性輸送体分子の数が調節されることを示す(Keusekottenら、2006)。ERでは、MHCクラスI分子は、前駆体を抗原性ペプチドにトリミングするアミノペプチダーゼに依存している。LRAP(ERアミノペプチダーゼ2(ERAP2)とも称される)は、タンパク質またはペプチド基質のN末端アミノ酸の加水分解を担う重要な酵素の1つである(Saveanuら、2005)。総合すると、IBS患
者の結腸粘膜におけるPSME2、TAP2およびLRAPの有意に低い発現レベルは、MHCクラスI抗原提示における機能的活性が、これらの患者においてモジュレートされていることを強く示す。
また、本発明者らの研究において、他の6個の有意に改変された遺伝子:VSIG2、VSIG4、FCGR2A、MS4A4A、M160およびMUC20が免疫応答に関与している(それぞれのq値については表1を参照)。Vセットおよび免疫グロブリンドメイン含有タンパク質ファミリ(VSIG)の構成員であるVS1G4の発現は減少しているが、別の近縁ファミリ構成員であるVSIG2の発現は、これらの被験体の結腸粘膜において高くなっている。IBS患者におけるVSIG4およびVSIG2の遺伝子発現の同時に起こるが反対の改変の意義は、これらの遺伝子の機能に関する最近の知見を考慮すると非常に興味深い。VSIGファミリの構成員すべての機能的役割は、まだ充分研究されていないが、VSIG4は、食作用および/または抗原提示によって媒介される免疫応答の調節に重要と思われる(Kimら、2005)。別の有意な遺伝子改変は、IBS患者の結腸においてモジュレートされた免疫応答システムのさらなる証拠が、FCGR2A(CD32)であることを示し、これは、免疫グロブリンFc受容体をコードしている。この受容体は、循環系から抗原抗体複合体を除去することによる外来抗原に対する生物体の防御に不可欠である。Fc受容体は、単球、マクロファージ、好中球、ナチュラルキラー(NK)細胞、ならびにTおよびBリンパ球上に存在しており、免疫複合体の食作用およびB細胞による抗体産生のモジュレーションに関与している(Unkeless JC,1989)。また、MS4A4AおよびCD163分子様1(M160)の発現もIBS患者において低い。MS4A4Aは、別の免疫グロブリン受容体のβサブユニットホモログであり、CD163分子様1(M160)は、スカベンジャー受容体システイン高含有スーパーファミリの膜アンカー型構成員であり、主に、免疫系と関連する細胞において発現される。
他方において、細胞表面結合ムチン20タンパク質(MUC20にコードされている)の発現は、IBS患者において上昇している。この遺伝子は、主に腎臓で発現されることが知られており、発現の上昇は、IgA腎症患者ならびに数例の腎臓障害モデルの近位尿細管由来の上皮細胞において報告されている(Higuchiら、2004)。さらに、炎症誘発性物質、例えば、リポ多糖(LPS)、13−酢酸12−ミリスチン酸ホルボール(PMA)または腫瘍壊死因子αなどで尿細管上皮細胞株を刺激すると、MUC20 mRNA発現が有意に増大する。IBS患者の結腸粘膜に見られるMUC20発現の上昇は、局部の損傷または炎症に対する応答を反映しているかもしれない。
少なくとも4個の差次的に発現された遺伝子(LYZ、CASP1、COP1、NCF4)(表1)は、結腸において病原体に対する宿主の防御応答に関与している。抗菌因子リゾチーム(LYZ)(その天然基質は、細菌細胞壁のペプチドグリカンである)の発現レベルはIBS患者において有意に低く、これは、IBS患者の結腸における先天性免疫の障害の生物学的根拠が存在し得ることを示す。この機能は、さらなる研究を必要とする。パネート細胞は、小腸粘膜の分泌性上皮細胞であり、リゾチームを含む抗菌性のペプチドの主な供給源である。また、この抗菌性防御物質は、ほとんどの場合は粘膜の先天性免疫応答機構として、パネート細胞の化生によって結腸内の炎症部位に漸増され得る(Wehkampら、2006)。結腸の粘膜の先天性免疫システムがIBS患者において冒されているか否かには、さらなる研究が必要とされる。炎症誘発性サイトカイン、例えば、インターロイキン−1β(IL−1β)およびγインターフェロン(IFN−γ)などは、抗菌的防御システムの重要な成分である。IL−18は、IFN−γ刺激因子であり、
さまざまなグラム陽性およびグラム陰性菌病原体に対する防御に重要な役割を果たしている。IL−1βおよびIL−18の合成は、システインプロテアーゼカスパーゼ1(CASP1)(インターロイキン−1β(IL−1β)変換酵素としても知られる)によるその前駆体タンパク質(プロ−IL−1βおよびプロ−IL−18)のタンパク質分解的切断に依存する。実際、カスパーゼ−1欠損マウスは、IL−18およびIL−1βのインビボ産生に大きな欠陥を有し、これは、致死用量の内毒素/LPSに対する抵抗性によって行なわれる(Liら、1995)。このマウスはまた、先天性の宿主防御機構の機能不全のため、野生型マウスよりも致死的大腸菌感染に対する感受性が2〜3倍高い(Joshiら、2002)。カスパーゼ−1ドミナントネガティブ阻害薬(COP1)(偽ICEとしても知られる)は、カスパーゼ−1と物理的に相互作用してその活性化をブロックし、したがってIL−1βおよびIL−18の分泌をブロックする。
起こすことが知られており、これはまた、モルモットの胃粘膜細胞においてNOX1とNOXO1のmRNA発現を刺激した後、スーパーオキシドの生成を上方調節する(Kusumotoら、2005)。NOX/DUOXオキシダーゼ遺伝子ファミリの別の構成員は、デュアルオキシダーゼ(dualoxidase)2(DUOX2)であり、これは、消化管全体において発現され、最大レベルは、盲腸とS状結腸の粘膜表面上皮細胞において見られる(El Hassaniら、2005)。また、DUOX2のmRNA発現レベルは、IBS患者のS状結腸粘膜生検材料において高度に増大していることがわかった (DUOX1はそうではなかった)(219727_at,q=0.15,3.8倍増大、これは、すべての遺伝子で最も大きな変化倍数である)。DUOX2は(DUOX1とは対照的に)、構成的ではなく誘導的に発現されるデュアルオキシダーゼと考えられているため、およびDUOX2は、感染または炎症時に、ロバストな自己限定的な応答をもたらすため(Harperら、2005)、この所見は、いくぶん驚くべきことかもしれない。デュアルオキシダーゼは、NADPHオキシダーゼドメイン(H2O2生成を担う)とヘムペルオキシダーゼドメイン(これは、ミエロペルオキシダーゼおよびラクトペルオキシダーゼなどのいくつかのペルオキシダーゼと近縁種である)の両方を含む。これらのオキシダーゼは、宿主の防御機構に不可欠な役割を有するスーパーオキシドおよびH2O2などの反応性酸素種(ROS)の上皮での供給源を提供する(Geisztら、2003;El Hassaniら、2005)。IFN−γなどの炎症誘発性刺激はDUOX2の発現を誘導し、H2O2生成の上昇をもたらす(Harperら、2005)。腸免疫性におけるデュアルオキシダーゼの直接的な役割は、ショウジョウバエにおいて示された。デュアルオキシダーゼ発現がサイレント化された成虫のハエは、微生物汚染食物の摂取による軽微な感染後であっても、死亡率の著しい増大を示した。この効果はデュアルオキシダーゼの再導入によって逆転され得、これは、該酵素によって、腸内での微生物の増殖を制限する上皮での特殊な酸化的バーストが生じることを示す(Haら、2005)。DUOX2発現の上昇は、IBS患者の結腸における軽度だが慢性的な炎症状態の存在を示すと考えられる。総合すると、IBS患者の結腸における多サブユニットNADPHオキシダーゼ/デュアルオキシダーゼ酵素複合体のいくつかの構成員の発現の改変は、結腸内への細菌および他の侵入物質に対する宿主の防御応答がIBS患者において撹乱されているという仮説のさらなる裏づけを示す。
最後に、IBS患者の結腸粘膜生検材料において、最も有意に上方調節されたプローブセットの2つ(図5A)は、公の配列データベースにDKFZP564O0823 (NCBI GenelD:25849)とアノテーションされたものと同じ遺伝子を示す。この遺伝子は、本明細書ではIBS1(過敏性腸症候群1)と名称変更している。インシリコ解析では、IBS1の5kbのcDNA配列が、930bpのオープンリーディングフレームを含むことが示されており、これは、シグナルペプチド(20AA)、細胞外領域(238AA)、膜貫通領域(21AA)、および細胞内領域(31AA)を含む310アミノ酸(AA)の予測原形質膜タンパク質をコードしている。
手可能ではないが、Gene Expression Omnibus(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)には、炎症および免疫応答における役割を指摘するヒトDKFZP564O0823遺伝子の発現の有意な改変に関するマイクロアレイ実験データが含まれている。第1の研究では、種々の組織に由来する一次ヒト内皮細胞が、炎症性および免疫サイトカインでチャレンジされた。DKFZP564O0823の発現は、TNFαに曝露すると、IFNγまたはIL−4への曝露と比べて一次結腸内皮細胞において増大した(図6A)。後者の2つは、主にTヘルパー細胞サブセットと関連しているが、TNFαは、炎症性応答と免疫学的応答の両方において重要な機能を有する多面発現性のサイトカインである。結腸内皮細胞に関するこれらのデータは、大規模な研究の一部を構成しているにすぎないため、このような実験に関する刊行物には、DKFZP564O0823に関する結果が含まれておらず、むしろ、周知の遺伝子に重点が置かれている(Sanaら、Cytokine 2005;29:256−269)。
特異性の程度を考慮すると、この2つの適用した統計学的方法論を用いて偶然取り出したとき、これらが偽陽性関係を示すことは、起こりにくいと考えられる。
その臨床的関連性のため、続いて、S状結腸発現プロフィールに基づいたIBSの分子診断の予測力を評価した。したがって、61例の被験体を訓練組と試験組に無作為に分けた。訓練組(n=45)は、17例の健常被験体と28例のIBS患者(16例のIBS−D、12例のIBS−C)で構成し、試験組(n=16)は、残りの8例の健常対照と8例のIBS患者(5例のIBS−D、3例のIBS−C)で構成した。続いて、過剰適合に対してかなりロバストであるため、多くの測定値および比較的少数の試料でのデータセットにおいて良好に実施されることが示された2つの異なる独立した分類解析方法を適用した。まず、有効組に対してマイクロアレイの予測解析(Prediction Analysis for Microarrays)(PAM)(Tibshiraniら、2002)を使用し、32遺伝子プローブセット署名を得(図8)、平均クロスバリテーション誤分類率は22%であった(健常およびIBS被験体について、それぞれ、13/17例および22/28例が正しく分類された)。この分子署名を試験組の独立した試料に対して使用すると、PAMにより参加者の75%の疾患状態が正しく予測され、疾患者と健常者で等しく正確に予測された。誤分類率が訓練組(22%)と試験組(25%)で同様であったため、過剰適合は問題ではないようであった。
これらの分子署名が、IBS患者の大部分に対して特定力を有することは、既に明白である。この知見は、共通の分子署名に基づいてIBS患者の特定のサブグループが規定され、したがってより個別化された医療への道が開かれる可能性を示す。結腸粘膜生検材料における分子署名の評価により、医師が、IBSの診断、および個々の患者に対する最も有益な治療戦略を決定するのを補助するための新たな補足的ツールが提供される。
b.投与薬物と疾患との間に相互作用はなく、これは、該遺伝子発現が疾患状態に応じた投与薬物(すなわち、健常とIBS)に影響されなかったことを示す(投与薬物と疾患状態との間の相互作用の試験では、すべてq>0.1)
c.性別は、これらの署名遺伝子の発現レベル(投与薬物の影響の試験では、すべてq>0.9)または健常者とIBS患者間の差(性別と疾患状態との間の相互作用の試験では、すべてq>0.9)に影響しなかった
独立した手法、逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応(RTQ−PCR)によるマイクロアレイ解析で見られた遺伝子発現の変化の確認データ
マイクロアレイデータ解析で同定された12個の遺伝子を、有効蛍光発生TaqMan遺伝子発現アッセイ−オン−デマンド(Applied Biosystems)による確認解析のために選択した。TaqManアッセイの結果の標準化を対照SART1遺伝子に対して行なった。それは、この遺伝子が、早くに安定であることがわかっていたため、また結腸試料において適度に発現される(Camilleri Mら、Gastroenterology 2007)ためである。全体的に、IBS患者と健常被験体間で発現レベルの変化倍数を比較すると、データは、AffymetrixマイクロアレイとTaqMan間でデータの実質的な一致を示す(図10)。FCGR2A遺伝子を除く、解析した12個の遺伝子のうち11個が、健常被験体と比べて、IBSにおいて発現の上方調節または下方調節という同じ傾向を示した。IBSと健常被験体間の有意差(p<0.05)は、12個の遺伝子のうち6個において確認され、これらは、変化倍数の値が最も大きい遺伝子であった。この有意性レベルは、変化倍数の差がより微妙な遺伝子では得られなかった。これは、TaqMan法では、遺伝子発現データを単一の参照遺伝子(本発明者らのアッセイではSART1)に対してのみ標準化しているが、マイクロアレイ法では、マイクロアレイ上の他のすべての遺伝子に対して個々の各遺伝子の発現レベルを標準化することが可能であることによって、一部説明され得る。これは、SART1遺伝子の遺伝子発現変動が比較的少ない場合であっても、RTQ−PCR手法を使用すると、目的遺伝子の標準化された発現レベルにノイズ(および変動)が導入されることを意味する。したがって、TaqMan手法は、マイクロアレイと比べて感度に関していくつかの利点を有する(すなわち、マイクロアレイ手法では解析が不可能であり得る低発現の遺伝子が、RTQ−PCRを用いて解析され得る)が、TaqManアッセイではマイクロアレイ解析と比べて、比較的大きな群内変動がしばしば見られることは明白である。
ているタンパク質、または差次的に発現される遺伝子にコードされたタンパク質は、IBSのための新規薬物の開発のための潜在標的となり得る。IBS患者において発現が上昇している最も有意な遺伝子は、機能が不明である充分に特徴付けされていない膜タンパク質(DKFZP564O0823)をコードするものであり、これに対して、名称IBS1を提案する。限定的な遺伝子の組に基づいた結腸における遺伝子発現の分子署名により、IBS疾患状態が予測され得る。このような遺伝子発現プロフィールは数ヶ月にわたって安定であり、これは、分子署名によってIBSの診断が改善され、治療有効性がモニタリングされる可能性を示す。少なくとも、IBS患者におけるこのような生物学的な差は、結腸に客観的な差があること、および該疾患が、中枢神経系の知覚の障害のみを示すのではないことを示す。
Claims (24)
- (a)被験体の生物学的試料において、IBS分子署名遺伝子(IBS−MSG)の遺伝子転写レベルを測定すること、ここで、前記IBS−MSGは、IBS1、COP1、PSME2、F13A1、NCF4、CSFR1、M160、KCNS3、LYZ、MS4A4A、HELLS、FRC4、MCM5、TAP2、LRAP、DTL、VSIG2、VSIG4およびMUC20からなる群より選択される、
(b)該遺伝子転写レベルを正常対照試料における遺伝子転写レベルと比較すること;ならびに
(c)工程(b)の結果に基づいてIBSの存在および/またはその状態を調べることを含む、被験体においてIBSを検出および/またはモニタリングするためのインビトロ方法。 - 工程(a)が、該IBS−MSGの少なくとも2種類の測定を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記IBS−MSGが、VSIG2、VSIG4およびMUC20からなる群より選択される、請求項1または2に記載の方法。
- 前記工程(a)が、
− IBS1、COP1、PSME2、F13A1、NCF4、CSF1R、M160、KCNS3およびVSIG2;または
− IBS1、PSME2、F13A1、NCF4、CSFR1およびVSIG2;または
− MUC20、VSIG2およびVSIG4
の遺伝子転写レベルの測定を含む、請求項1または2に記載の方法。 - 工程(a)が、さらに、IBSマーカとして知られる遺伝子、特に、CASP1、FCGR2AおよびCKBからなる群より選択される遺伝子の少なくとも1つ、2つ、3つまたはそれ以上の遺伝子転写レベルの測定を含む、請求項1〜4いずれか1項に記載の方法。
- 被験体においてIBSを測定するための方法であり、工程(c)において、IBS1、VSIG2およびMUC20からなる群より選択される遺伝子の遺伝子転写レベルの増大、またはCOP1、PSME2、F13A1、NCF4、CSF1R、M160、KCNS3、LYZ、MS4A4A、HELLS、RFC4、MCM5、TAP2、LRAP、DTLおよびVSIG4からなる群より選択される遺伝子の遺伝子転写レベルの減少が、前記被験体におけるIBSの存在の表示である、請求項1〜5いずれか1項に記載の方法。
- IBS−MSGの遺伝子転写レベルが、タンパク質レベルで、または遺伝子転写レベルでのいずれかで測定される、請求項1〜6いずれか1項に記載の方法。
- IBS−MSGの遺伝子転写レベルが、アレイ手法を用い、前記IBS−MSGから転写されたオリゴヌクレオチドに特異的に結合するプローブを用いてオリゴヌクレオチドレベルで、IBS−MSGポリペプチドに結合する特異的結合剤を用いてタンパク質レベルでのいずれかで測定される、請求項1〜7いずれか1項に記載の方法。
- 生物学的試料が、血液、尿、唾液、糞便試料、糞便細胞、組織生検材料または剖検材料からなる群より選択される、請求項1〜8いずれか1項に記載の方法。
- 遺伝子の発現レベルが、表1または表2に列挙したプローブから選択されるプローブのアレイを用いて測定される、請求項8に記載の方法。
- 被験体においてIBSを同定および/またはモニタリングするための方法であり、遺伝子転写レベルがタンパク質レベルで測定される、請求項1〜9いずれか1項に記載の方法。
- タンパク質レベルが、IBS−MSGタンパク質に結合する抗体を用いて測定される、請求項11に記載の方法。
- IBS1に特異的な抗体であるIBS−MSGにコードされたポリペプチドに対する抗体の使用を含む、請求項12に記載の方法。
- a)少なくとも1種類のIBS−MSGを発現する細胞を試験対象の化合物と接触させること、ここで、IBS−MSGは、IBS1、COP1、PSME2、F13A1、NCF4、CSFR1、M160、KCNS3、LYZ、MS4A4A、HELLS、FRC4、MCM5、TAP2、LRAP、DTL、VSIG2、VSIG4およびMUC20からなる群より選択される、
b)前記IBS−MSGの発現レベルを測定すること;ならびに
c)前記化合物の非存在下での前記IBS−MSGの発現レベルと比較すること
を含み、
これにより、IBSにおいて観察される前記IBS−MSGの発現レベルの変化を妨害することができる化合物が、CVHの処置、特にIBSの処置のための候補化合物として同定される、CVHの処置、特にIBSの処置のための候補化合物を同定するためのインビトロ方法。 - IBS−MSGがIBS1である、請求項14に記載の方法。
- 発現レベルが、核酸レベルで、またはタンパク質レベルで検出される、請求項14または15に記載の方法。
- 遺伝子の発現レベルが、IBS−MSGに結合するオリゴヌクレオチドプローブのアレイを用いて測定される、請求項14〜16いずれか1項に記載の方法。
- 前記IBS−MSGの発現レベルが、IBS−MSGポリペプチドのタンパク質レベルを測定することにより測定される、請求項14〜16いずれか1項に記載の方法。
- 該タンパク質レベルが抗体を用いて測定される、請求項18に記載の方法。
- (a)IBS−MSG産物を試験対象の化合物とともにインキュベートすること、ここで、IBS−MSGは、IBS1、COP1、PSME2、F13A1、NCF4、CSFR1、M160、KCNS3、LYZ、MS4A4A、HELLS、FRC4、MCM5、TAP2、LRAP、DTL、VSIG2、VSIG4およびMUC20からなる群より選択される、ならびに
(b)前記化合物がIBS−MSG産物と結合できる能力を測定すること、ここで、IBS−MSG産物に対して結合できる化合物は、IBSの処置のための候補化合物である、CVHの処置、特にIBSの処置のための候補化合物を同定および取得するためのスクリーニング方法。 - IBS−MSG産物は、前記遺伝子またはその断片にコードされたポリペプチドからなる、請求項20に記載の方法。
- (a)IBS1、COP1、PSME2、F13A1、NCF4、CSFR1、M160、KCNS3、LYZ、MS4A4A、HELLS、FRC4、MCM5、TAP2、LRAP、DTL、VSIG2、VSIG4およびMUC20からなる群より選択されるIBS−MSGに特異的に結合する少なくとも1種類のプローブ;または
(b)IBS−MSGポリペプチドまたはその断片に特異的に結合する少なくとも1種類の薬剤、ここで、IBS−MSGは、IBS1、COP1、PSME2、F13A1、NCF4、CSFR1、M160、KCNS3、LYZ、MS4A4A、HELLS、FRC4、MCM5、TAP2、LRAP、DTL、VSIG2、VSIG4およびMUC20からなる群より選択される、を備える診断用キット。 - 各々がIBS−MSGに特異的に結合する少なくとも2種類のプローブ、または各々がIBS−MSGポリペプチドに特異的に結合する少なくとも2種類の薬剤を含む、請求項22に記載の診断用キット。
- IBS−MSGの遺伝子転写レベルを特異的に検出することができるプローブまたは薬剤からなり、前記IBS−MSGが、
− IBS1、COP1、PSME2、F13A1、NCF4、CSF1R、M160、KCNS3およびVSIG2;または
− IBS1、PSME2、F13A1、NCF4、CSFR1およびVSIG2;または
− MUC20、VSIG2およびVSIG4
である、請求項21または22に記載の診断用キット。
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