KR20210070976A - 가와사키병을 갖는 대상체를 확인하는 방법 - Google Patents

가와사키병을 갖는 대상체를 확인하는 방법 Download PDF

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제스로 허버그
빅토리아 제인 라이트
마이클 레빈
클라이브 호가트
미르시니 카포로
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임피리얼 컬리지 이노베이션스 리미티드
제인 씨. 번즈
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Abstract

가와사키 질환(KD)을 갖는 대상체를 확인하는 방법으로서, 상기 방법은 다른 병태, 예를 들어, 다른 감염성 병태 및 염증성 병태, 예컨대 KD와 유사한 증상을 제시하는 것을 갖는 대상체로부터 상기 대상체를 구별하는 단계를 포함하는 방법. 상기 방법에 사용된 최소 유전자 서명, 및 상기 방법에 사용하기 위한 프라이머, 프로브 및 유전자 칩이 또한 제공된다.

Description

가와사키병을 갖는 대상체를 확인하는 방법
본 개시내용은 가와사키병(KD)을 갖는 대상체를 확인하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 다른 병태, 예를 들어, KD와 유사한 증상을 제시하는 것과 같은 다른 감염성 병태 및 염증성 병태를 갖는 대상체로부터 상기 대상체를 구별하는 단계를 포함한다. 본 개시내용은 또한 상기 방법에 사용된 최소 유전자 서명 및 상기 방법에 사용하기 위한 맞춤 유전자 칩(bespoke gene chip)에 관한 것이다. 본 개시내용은 추가로 본 개시내용의 서명에서 유전자에 특이적인 프로브 및/또는 프라이머로 확장된다. 본 개시내용은 추가로 본 개시내용의 방법에서의 공지된 유전자 칩 및 상기 방법을 수행하는 데 필요한 요소를 포함하는 키트의 용도에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 낮은 자원 환경에서 사용하기에 특히 적합한 바이러스 감염 또는 염증성 질환으로부터의 박테리아 감염의 구별에 사용될 수 있는 복합 발현 점수를 제공하는 방법의 용도에 관한 것이다.
가와사키병(KD)은 어린 아동에 주로 영향을 미치는 급성 염증성 장애이다. 일본에서의 이의 초기 설명[1] 이후로, 그 질환은 5세보다 어린 아동에서 각각 일본[2]에서 265/100,000, 다른 아시아 나라[3-5]에서 51-194/100,000 및 유럽[6] 및 미국[7]에서 8 내지 20/100,000의 범위의 이환률로 획득된 심장 질환의 가장 흔한 원인으로 나타났다. 이러한 우려의 KD를 만든 것은 혈관염과의 이의 연관이고, 이는 주로 관상 동맥에 영향을 미쳐서, 비치료된 아동의 최대 25%에서 관상 동맥 동맥류(CAA: coronary artery aneurysm)를 형성시켰다[8]. 심근 경색으로부터의 사망은 동맥류의 혈전증성 폐색으로 인해 또는 손상된 동맥에서의 혈관 개형으로 인한 차후의 협착성 병변 발생으로부터 생길 수 있다. 거대 CAA를 갖는 아동의 장기간 결과 연구는 50% 초과가 혈관재형성을 필요로 하거나 30년 기간 내에 심근 경색을 겪으며 걱정되는 예후를 나타낸다[9, 10].
정맥내 면역글로불린(IVIG)에 의한 치료 및 추가의 IVIG[11] 또는 다른 소염제, 예컨대 스테로이드 및 인플릭시맙의 투여에 반응하지 않는 사람에 대한 치료는 염증성 과정을 폐지하는 데 효과적이고, CAA의 위험을 5% 내지 10%로 감소시킨다[12]. KD가 다른 흔한 열성 병태와 구별하기 어려우므로, KD를 갖는 많은 아동은 CAA의 발생을 예방하도록 병의 과정에서 충분히 조기에 진단되고 치료되지 않는다[13]. 게다가, KD(소위 "불완전 KD")를 진단하기 위한 임상 기준을 충족하지 않은 환자는 그럼에도 불구하고 CAA를 겪을 수 있다. 진단의 지연은 CAA의 발생에 대한 그리고 심지어 KD에 의한 상당한 경험을 갖는 센터에서 한결같은 위험 인자이고, 오직 심장초음파에서 이미 관상동맥 팽창이 나타날 때 치료가 대개 시작하였다. CAA 발생은 임상적으로 침묵이고, 급사 또는 심근 경색의 시기에 오직 나중 해에 인식될 수 있다.
KD의 증상은 진단학적 어려움 및 따라서 진단 및 치료의 지연으로 이어지는 스타필로코커스 및 스트렙토코커스 독성 쇼크 증후군, 홍역 및 다른 바이러스 병, 예컨대 아데노바이러스 감염, 록키산 홍반열 및 아동 염증성 질환을 포함하는 여러 다른 아동 열성 병의 것과 유사하다. 임상 징후 및 증상, 심장초음파 및 실험실 매개변수에 기초한 임상 진단을 수월하게 하도록 가이드라인이 개발되었다[14]. 그러나, 질환에 대한 한정적 진단 시험이 없다. KD의 전반적 이환률이 증가하면서, 아동에서 장기간의 발열을 일으키는 다른 병태로부터 KD를 구별하기 위한 정확한 시험에 대한 긴급한 필요성이 있다.
정밀 의료의 시대에, 이전에 임상 특징에 기초한 많은 병태의 진단은 단독으로 분자 병리학에 기초한 진단에 의해 대체되고 있다. 숙주 혈액 유전자 발현 서명은 폐결핵[15], 박테리아 및 바이러스 감염[16] 및 전신 홍반 루푸스[17]를 포함하는 다수의 특정 감염성 및 염증성 질환을 구별하는 것으로 나타났다. 기존의 연구는 비교자 환자 그룹의 범위에 의해 또는 엑소좀으로부터 RNA를 추출할 필요성에 의해 제한되긴 하지만, 유전자 발현 서명에 기초한 KD에 대한 진단학적 접근법의 지지는 KD에서의 마이크로RNA 바이오마커의 확인에서 온다[18, 19].
따라서, 본 발명자들은 다른 아동 감염성 병태 및 염증성 병태로부터 KD를 구별하기 위해 전혈 유전자 발현 패턴의 사용을 탐구하였다. 본 개시내용은 일련의 박테리아, 바이러스 및 염증성 병으로부터 KD를 구별하는 독립적인 환자 그룹에서 발견되고 검증된 유전자 발현 서명을 제공한다.
본 개시내용은 하기 문단에 요약되어 있다:
1. 대상체 유래된 RNA 샘플에서 하기 유전자: CACNA1E, DDIAS, KLHL2, PYROXD2, SMOX, ZNF185, LINC02035, CLIC3, S100P, IFI27, HS.553068, CD163 및 RTN1 중 적어도 5개를 포함하는 유전자 서명의 유전자 발현 수준의 조절을 검출하는 단계를 포함하는, 가와사키병(KD)을 갖는 대상체를 확인하는 방법.
2. 문단 1에 있어서, 유전자 서명은 유전자 중 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개 또는 13개를 포함하는, 방법.
3. 문단 1 또는 2에 있어서, 유전자 서명은 하기 유전자: PYROXD2, SMOX, CACNA1E, CD163, DDIAS, CLIC3, KLHL2 및 HS.553068 중 적어도 하나, 특히 PYROXD2, SMOX, CACNA1E 및 CD163의 적어도 하나를 포함하는, 방법.
4. 문단 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 유전자 서명은 PYROXD2를 포함하는, 방법.
5. 문단 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 유전자 서명은 CACNA1E을 포함하는, 방법.
6. 문단 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 유전자 서명은 SMOX를 포함하는, 방법
7. 문단 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 유전자 서명은 CD163을 포함하는, 방법
8. 문단 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 유전자 서명은,
(i) PYROXD2 및 CACNA1E;
(ii)PYROXD2 및 SMOX; 또는
(iii) PYROXD2, CACNA1E 및 SMOX를 포함하는, 방법.
9. 문단 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 유전자 서명은 예를 들어
(i) PYROXD2, CACNA1E, CD163, KLHL2 및 SMOX;
(ii) PYROXD2, CACNA1E, IFI27, KLHL2 및 SMOX;
(iii) PYROXD2, CACNA1E, HS.553068, IFI27 및 SMOX;
(iv) PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, IFI27 및 SMOX;(v) PYROXD2, CACNA1E, CD163, KLHL2 및 ZNF185; 또는
(vi) PYROXD2, DDIAS, CD163, KLHL2 및 SMOX로부터 선택된 유전자 중 적어도 5개를 포함하거나 이들로 이루어지는, 방법.
10. 문단 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 유전자 서명은 예를 들어
(i) PYROXD2, CACNA1E, CD163, IFI27, KLHL2 및 SMOX;
(ii) PYROXD2, CACNA1E, CD163, KLHL2, LINC02035 및 SMOX;
(iii) PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, IFI27 및 SMOX;
(iv) PYROXD2, CACNA1E, CD163, HS.553068, IFI27 및 SMOX;
(v) PYROXD2, CACNA1E, CD163, KLHL2, SMOX 및 ZNF185;
(vi) PYROXD2, CACNA1E, IFI27, KLHL2, RTN1 및 SMOX;
(vii) PYROXD2, CACNA1E, CD163, CLIC3, KLHL2 및 SMOX;
(viii) PYROXD2, CACNA1E, CLIC3, IFI27, KLHL2 및 SMOX;
(ix) PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, IFI27, RTN1 및 SMOX; 또는
(x) PYROXD2, DDIAS, CD163, IFI27, KLHL2 및 SMOX로부터 선택된 유전자 중 적어도 6개를 포함하거나 이들로 이루어지는, 방법.
11. 문단 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 유전자 서명은 예를 들어
(i) PYROXD2, CACNA1E, CD163, HS.553068, IFI27, KLHL2 및 SMOX;
(ii) PYROXD2, CACNA1E, CD163, CLIC3, IFI27, KLHL2 및 SMOX;
(iii) PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, IFI27, KLHL2 및 SMOX;
(iv) PYROXD2, CACNA1E, CD163, IFI27, KLHL2, RTN1 및 SMOX; 또는
(v) PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, HS.553068, IFI27 및 SMOX로부터 선택된 유전자 중 적어도 7개를 포함하거나 이들로 이루어지는, 방법.
12. 문단 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 유전자 서명은 예를 들어
(i) PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, IFI27, KLHL2 및 SMOX;
(ii) PYROXD2, CACNA1E, CD163, CLIC3, HS.553068, IFI27, KLHL2 및 SMOX;
(iii) PYROXD2, CACNA1E, CD163, CLIC3, IFI27, KLHL2, RTN1 및 SMOX; 또는
(iv) PYROXD2, CACNA1E, CD163, HS.553068, IFI27, KLHL2, S100P 및 SMOX로부터 선택된 유전자 중 적어도 8개를 포함하거나 이들로 이루어지는, 방법.
13. 문단 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 유전자 서명은 예를 들어
(i) PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, HS.553068, IFI27, KLHL2 및 SMOX;
(ii) PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, IFI27, KLHL2, RTN1 및 SMOX; 또는
(iii) PYROXD2, CACNA1E, CD163, CLIC3, HS.553068, IFI27, KLHL2, RTN1 및 SMOX로부터 선택된 유전자 중 적어도 9개를 포함하거나 이들로 이루어지는, 방법.
14. 문단 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 유전자 서명은 예를 들어
(i) PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, IFI27, KLHL2, RTN1, S100P 및 SMOX; 또는
(ii) PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, HS.553068, IFI27, KLHL2, RTN1 및 SMOX로부터 선택된 유전자 중 적어도 10개를 포함하거나 이들로 이루어지는, 방법.
15. 문단 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 유전자 서명은 예를 들어
(i) PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, HS.553068, IFI27, KLHL2, RTN1, S100P 및 SMOX;
(ii) PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, IFI27, KLHL2, LINC02035, RTN1, S100P 및 SMOX; 또는
(iii) PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, IFI27, KLHL2, RTN1, S100P, SMOX 및 ZNF185로부터 선택된 유전자 중 적어도 11개를 포함하거나 이들로 이루어지는, 방법.
16. 문단 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 유전자 서명은 예를 들어
(i) PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, HS.553068, IFI27, KLHL2, RTN1, S100P, SMOX 및 ZNF185;
(ii) PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, HS.553068, IFI27, KLHL2, LINC02035, RTN1, S100P 및 SMOX; 또는
(iii) PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, IFI27, KLHL2, LINC02035, RTN1, S100P, SMOX 및 ZNF185로부터 선택된 유전자 중 적어도 12개를 포함하거나 이들로 이루어지는, 방법.
17. 문단 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 유전자 서명은 CACNA1E, DDIAS, KLHL2, PYROXD2, SMOX, ZNF185, LINC02035, CLIC3, S100P, IFI27, HS.553068, CD163 및 RTN1을 포함하거나 이들로 이루어지는, 방법.
18. 문단 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 예를 들어, 액틴, GAPDH, 유비퀴틴, 18s rRNA, RPII (POLR2A), TBP, PPIA, GUSB, HSPCB, YWHAZ, SDHA, RPS13, HPRT1 및 B4GALT6으로부터 선택된 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 하우스키핑 유전자와 같은 하나 이상의 하우스키핑 유전자의 발현 수준의 검출을 추가로 도입하는, 방법.
19. 문단 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, KD를 갖는 대상체는 박테리아 감염, 바이러스 감염 및 염증성 병태 중 하나 이상의 존재에서 확인될 수 있는, 방법
20. 문단 1 내지 19 중 어느 하나에 있어서, KD를 갖는 대상체는 박테리아 감염, 바이러스 감염 및 염증성 병태 중 하나 이상을 갖는 환자로부터 구별될 수 있는, 방법.
21. 문단 19 또는 20에 있어서, 박테리아 감염은 클라미디아 뉴모니아에(Chlamydia pneumoniae), 클라미디아 트라초마티스(Chlamydia trachomatis), 클라미도필라 시타시(Chlamydophila psittaci), 마이코플라스마 뉴모니아(Mycoplasma pneumonia), 코리네박테륨 디프테리아에(Corynebacterium diphtheriae), 클로스트리듐 보툴리늄(Clostridium botulinum), 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile), 클로스트리듐 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코커스 페시움(Enterococcus faecium), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 에피데르미디스(Staphylococcus epidermidis), 스타필로코커스 사프로피티쿠스(Staphylococcus saprophyticus), 그룹 B 스트렙토코커스(Group B streptococcus), 스트렙토코커스 아갈락티아에(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes), 또는 항산성 박테리아, 예컨대 마이코박테륨 레프라에(Mycobacterium leprae), 마이코박테륨 투베르쿨로시스(Mycobaterium tuberculosis), 마이코박테륨 울세란스(Mycobacterium ulcerans), 마이코박테륨 아비움 인테르셀룰랄라에(mycobacterium avium intercellularae), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus), 브루셀라 카니스(Brucella canis), 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis), 브루셀라 수이스(Brucella suis), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 에스체리치아 콜라이(Escherichia coli), 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 렙토스피라 인터로간스(Leptospira interrogans), 나이세리아 고노레아에(Neisseria gonorrhoeae), 나이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis), 슈도모나스 아에루시노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 종(Pseudomonas spp), 리케치아 리케치(Rickettsia rickettsii), 살모넬라 티피(Salmonella typhi), 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhi), 시겔라 손네이(Shigella sonnei), 트레포네마 팔리듐(Treponema pallidum), 비브리오 콜레라에(Vibrio cholerae), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 킨겔라 킨가에(Kingella kingae), 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas), 클레브시엘라(Klebsiella), 그람 양성 코커스, 그람 음성 바실루스, 마이코플라스마, 페르투시스, 마이코박테륨테리아 및 스타필로코커스 및 스트렙토코커스 독성 쇼크 증후군, 예를 들어, 그람 양성 코커스, 그람 음성 바실루스, 마이코플라스마 또는 페르투시스, 및 마이코박테리아로 이루어진 군으로부터 선택되는, 특히 S. 뉴모니아에, S. 아우레우스, S. 피요게네스, 그룹 B 스트렙토코커스, 이. 콜라이, N. 메닝기티디스, 엔테로코커스, 킨겔라, H. 인플루엔자에, 슈도모나스 종, 스테노트로포모나스, 클레브시엘라, 스타필로코커스 및 스트렙토코커스 독성 쇼크 증후군, 특히 스타필로코커스 또는 스트렙토코커스 독성 쇼크 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
22. 문단 19 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 감염은 인플루엔자, 예컨대 비제한적인 예로서 H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H7N7, H1N2, H9N2, H7N2, H7N3, H10N7을 포함하는 인플루엔자 A, 인플루엔자 B 및 인플루엔자 C, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV: Respiratory Syncytial Virus), 리노바이러스(rhinovirus), 엔테로바이러스(enterovirus), 보카바이러스(bocavirus), 파라인플루엔자(parainfluenza)(예컨대, 파라인플루엔자 1-4), 아데노바이러스(adenovirus), 메타뉴모바이러스(metapneumovirus), 단순 포진 바이러스(herpes simplex virus), 수두 바이러스(Chickenpox virus), 인간 파필로마바이러스(Human papillomavirus), 간염, 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus), 바리셀라-조스터 바이러스(Varicella-zoster virus), 인간 사이토메갈로바이러스(Human cytomegalovirus), 인간 헤르페스바이러스(Human herpesvirus), 타입 8 BK 바이러스, JC 바이러스, 두창(Smallpox), 파르보바이러스(Parvovirus) B19, 인간 아스트로바이러스(Human astrovirus), 노르워크 바이러스(Norwalk virus), 콕사키바이러스(coxsackievirus), 폴리오바이러스(poliovirus), 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스(Severe acute respiratory syndrome virus), 황열 바이러스(yellow fever virus), 뎅기 바이러스(dengue virus), 웨스트 나일 바이러스(West Nile virus), 루벨라 바이러스(Rubella virus), 인간 면역결핍 바이러스, 구아나리토 바이러스(Guanarito virus), 주닌 바이러스(Junin virus), 라사 바이러스(Lassa virus), 마추포 바이러스(Machupo virus), 사비아 바이러스(Sabia virus), 콩고-크림 출혈 열 바이러스(Crimean-Congo haemorrhagic fever virus), 에볼라 바이러스(Ebola virus), 마르부르그 바이러스(Marburg virus), 홍역 바이러스(Measles virus), 볼거리 바이러스(Mumps virus), 광견병 바이러스(Rabies virus), 로타바이러스(Rotavirus) 및 록키산 홍반열로 이루어진 군으로부터 선택되는, 예를 들어, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 아데노바이러스, 파라인플루엔자 바이러스(예컨대, 파라인플루엔자 1-4), 인플루엔자(예컨대, 인플루엔자 A, B 또는 A+B), 보카바이러스, 메타뉴모바이러스, 리노바이러스 및 엔테로바이러스, 특히 RSV, 인플루엔자 A/B 및 아데노바이러스, 특히 홍역, 아데노바이러스 감염 및 록키산 홍반열로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
23. 문단 19 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 염증성 병태는 천식, 위궤양, 폐결핵, 치주염, 궤양성 대장염, 크론병, 부비강염, 간염, 다발성 경화증, 죽상동맥경화증, 쇼그렌 질환, 염증성 장 질환, 홍반성 낭창(전신 홍반 루푸스 포함), 섬유성 질환, 예컨대 폐 섬유증, 헤노흐 쉔라인 자반증(HSP: Henoch-Schonlein Purpura) 및 청소년 특발성 관절염(JIA: Juvenile Idiopathic Arthritis), 특히 헤노흐 쉔라인 자반증(HSP) 또는 청소년 특발성 관절염(JIA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
24. 단락 1 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 아동이고, 예를 들어, 아동은 2개월 내지 59개월의 연령인, 방법.
25. 단락 1 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 0일 내지 59일의 범위의 연령의 유아인, 방법.
26. 단락 1 내지 25 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 발열이 있는, 방법.
27. 단락 1 내지 26 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 발현 조절의 분석은 마이크로어레이 또는 유전자 칩을 사용하는, 방법.
28. 단락 1 내지 27 중 어느 한 항에 있어서, 분석 유전자 발현 조절은 PCR, 예컨대 RT-PCR, 특히 멀티플렉스 PCR을 사용하는, 방법.
29. 문단 14 또는 15에 있어서, PCR은 정량적인, 방법.
30. 단락 28 내지 29 중 어느 한 항에 있어서, PCR에 사용된 프라이머는 라벨 또는 라벨의 조합을 포함하고, 예를 들어, 라벨은 형광 또는 유색, 예를 들어, 유색 비드인, 방법.
31. 단락 1 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 서명의 분석의 결과에 기초하여 대상체에게 가와사키병(KD)에 대한 치료를 처방하거나 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
32. 대상체에게 KD에 대한 치료를 투여하는 단계를 포함하는 가와사키병(KD)을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체는 대상체 유래된 RNA 샘플에서 하기 유전자: CACNA1E, DDIAS, KLHL2, PYROXD2, SMOX, ZNF185, LINC02035, CLIC3, S100P, IFI27, HS.553068, CD163 및 RTN1 중 적어도 5개를 포함하는 유전자 서명의 유전자 발현 수준의 조절을 검출하여 가와사키병을 갖는 것으로서 이전에 확인된, 방법
33. 문단 31 또는 32에 있어서, 치료는 감마 글로불린(IVIg), 아스프리린(aspririn), 또는 다른 소염제, 예컨대 스테로이드 및 인플릭시맙, 또는 이들의 조합인, 방법.
34. 하기 유전자: CACNA1E, DDIAS, KLHL2, PYROXD2, SMOX, ZNF185, LINC02035, CLIC3, S100P, IFI27, HS.553068, CD163 및 RTN1 중 적어도 5개로부터의 폴리뉴클레오타이드 유전자 전사체에 특이적인 프라이머를 포함하는 가와사키병(KD)을 갖는 대상체를 확인하는 방법에 사용하기 위한 프라이머의 세트.
35. 문단 34에 있어서, 하기 유전자: CACNA1E, DDIAS, KLHL2, PYROXD2, SMOX, ZNF185, LINC02035, CLIC3, S100P, IFI27, HS.553068, CD163, 및 RTN1에 오직 특이적인 프로브로 이루어지는, 프라이머의 세트.
36. 하기 유전자: CACNA1E, DDIAS, KLHL2, PYROXD2, SMOX, ZNF185, LINC02035, CLIC3, S100P, IFI27, HS.553068, CD163 및 RTN1 중 적어도 5개에 특이적인 프로브로 이루어진 유전자 칩.
37. 하기 유전자: CACNA1E, DDIAS, KLHL2, PYROXD2, SMOX, ZNF185, LINC02035, CLIC3, S100P, IFI27, HS.553068, CD163 및 RTN1 중 적어도 5개에 특이적인 프로브; 및 하나 이상의 대조 프로브(control probe)로 이루어진 유전자 칩.
38. 문단 37에 있어서, 하나 이상의 대조 프로브는 GAPDH, 유비퀴틴, 18s rRNA, RPII (POLR2A), TBP, PPIA, GUSB, HSPCB, YWHAZ, SDHA, RPS13, HPRT1 및 B4GALT6으로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자에 특이적인, 유전자 칩.
39. 문단 34 또는 35에 정의된 프라이머의 세트 또는 문단 36 내지 38 중 어느 하나에 따른 유전자 칩을 포함하는 가와사키병(KD)을 갖는 대상체를 확인하기 위한 현장 시험.
40. 샘플, 예를 들어, 혈액 샘플에서 가와사키병(KD)을 치료하기 위한 검정에서의 문단 34 또는 35에 정의된 프라이머의 세트 또는 문단 36 내지 38 중 어느 하나에 따른 유전자 칩의 용도.
본 개시내용은 하기 유전자: CACNA1E, DDIAS (C11ORF82), KLHL2, PYROXD2 (C10ORF33), SMOX, ZNF185, LINC02035 (LOC100129550), CLIC3, S100P, IFI27, HS.553068, CD163, 및 RTN1 중 적어도 5개의 발현 수준을 검출하는 단계를 포함하는 가와사키병(KD)을 갖는 대상체를 확인하는 방법을 제공한다.
따라서, 일 양태에서, 대상체 유래된 RNA 샘플에서 하기 유전자: CACNA1E, DDIAS(C11ORF82), KLHL2, PYROXD2(C10ORF33), SMOX, ZNF185, LINC02035(LOC100129550), CLIC3, S100P, IFI27, HS.553068, CD163 및 RTN1 중 적어도 5개를 포함하는 유전자 서명의 유전자 발현 수준의 조절을 검출하는 단계를 포함하는 가와사키병(KD)을 갖는 대상체를 확인하는 방법이 있다.
유리하게는, 본 개시내용에 따른 방법에서의 유전자 서명의 사용은 KD를 갖는 대상체의 강력하고 정확한 확인을 허용한다. 중요하게는, 상기 방법은 유사한 증상을 나타내지만 다른 박테리아 감염, 바이러스 감염 및/또는 염증성 병태를 갖는 환자로부터의 KD를 갖는 환자 사이의 정확한 구별을 허용한다. 바꾸어 말하면, 상기 방법은 임상 기준 및/또는 실험실 시험, 예컨대 심장초음파에 의존함이 없이 박테리아, 바이러스 감염 및/또는 염증성 병태의 존재 또는 부재에서 KD의 정확한 검출을 허용한다.
유전자 서명은 대개 많은 수의 유전자를 포함하는데, 이들은 오직 조합되어 생물학적 중요성의 패턴 또는 마커를 보여준다. 본 개시내용의 유전자 서명이 13개만큼 적은 유전자에 기초할 수 있고, KD의 존재를 여전히 신뢰 가능하게 확인할 수 있다는 것이 매우 놀랍다. 상기 언급된 13개의 유전자 중 적어도 5개를 포함하는 본 개시내용의 유전자 서명은 양호한 예측력을 제공한다. 그러나, 추가의 유전자는 유전자 서명의 분별력을 추가로 증강시키고 증가시키기 위해 서명에 포함되었다. 따라서, 일 실시형태에서, 서명은 유전자 중 적어도 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개 또는 13개를 포함한다.
따라서, 일 실시형태에서, 서명은 적어도 PYROXD2를 포함한다. 일 실시형태에서, 서명은 적어도 SMOX를 포함한다. 일 실시형태에서, 서명은 적어도 CACNA1E를 포함한다. 일 실시형태에서, 서명은 적어도 CD163을 포함한다. 일 실시형태에서, 서명은 적어도 DDIAS를 포함한다. 일 실시형태에서, 서명은 적어도 CLIC3을 포함한다. 일 실시형태에서, 서명은 적어도 KLHL2를 포함한다. 다른 실시형태에서, 서명은 적어도 HS.553068을 포함한다. 다른 실시형태에서, 서명은 적어도 RTN1을 포함한다. 다른 실시형태에서, 서명은 적어도 ZNF185를 포함한다. 다른 실시형태에서, 서명은 적어도 IFI27을 포함한다. 다른 실시형태에서, 서명은 적어도 S100P를 포함한다. 다른 실시형태에서, 서명은 적어도 LINC02035를 포함한다.
일 실시형태에서, 유전자 서명은 하기 유전자: PYROXD2, SMOX, CACNA1E, CD163, DDIAS, CLIC3, KLHL2 및 HS.553068 중 적어도 하나를 포함한다. 다른 실시형태에서, 유전자 서명은 하기 유전자: PYROXD2, SMOX, CACNA1E 및 CD163 중 적어도 하나를 포함한다. 본 발명자들은 이들 특정 유전자가 더 높은 분별력을 갖고, 따라서 최고의 예측 능력으로 서명에 존재할 가능성이 더 크다는 것을 발견하였다.
예를 들어, 유전자 서명은 하기 유전자: PYROXD2, SMOX, CACNA1E 및 CD163; PYROXD2, SMOX 및 CACNA1E; PYROXD2, SMOX 및 CD163; SMOX, CACNA1E 및 CD163; PYROXD2, CACNA1E 및 CD163; PYROXD2 및 SMOX; PYROXD2 및 CACNA1E; PYROXD2 및 CD163; SMOX 및 CACNA1E; SMOX 및 CD163; 또는 CACNA1E 및 CD163의 임의의 조합; 또는 임의의 다른 조합을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 서명은 PYROXD2 및 CACNA1E 및 SMOX의 적어도 하나를 포함한다. 따라서, 일 실시형태에서, 서명은 PYROXD2 및 CACNA1E를 포함한다. 다른 실시형태에서, 서명은 PYROXD2 및 SMOX를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 서명은 PYROXD2, CACNA1E 및 SMOX를 포함한다.
일 실시형태에서, 서명은 13개의 유전자 중 적어도 5개를 포함한다. 따라서, 일 실시형태에서, 서명은 PYROXD2, CACNA1E, CD163, KLHL2 및 SMOX를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 서명은 PYROXD2, CACNA1E, IFI27, KLHL2 및 SMOX를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 서명은 PYROXD2, CACNA1E, HS.553068, IFI27 및 SMOX를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 서명은 PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, IFI27 및 SMOX를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 서명은 PYROXD2, CACNA1E, CD163, KLHL2 및 ZNF185를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 서명은 PYROXD2, DDIAS, CD163, KLHL2 및 SMOX를 포함하거나 이들로 이루어진다.
일 실시형태에서, 서명은 13개의 유전자 중 적어도 6개를 포함한다. 따라서, 일 실시형태에서, 서명은 PYROXD2, CACNA1E, CD163, IFI27, KLHL2 및 SMOX를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 서명은 PYROXD2, CACNA1E, CD163, KLHL2, LINC02035 및 SMOX를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 서명은 PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, IFI27 및 SMOX를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 서명은 PYROXD2, CACNA1E, CD163, HS.553068, IFI27 및 SMOX를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 서명은 PYROXD2, CACNA1E, CD163, KLHL2, SMOX 및 ZNF185를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 서명은 PYROXD2, CACNA1E, IFI27, KLHL2, RTN1 및 SMOX를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 서명은 PYROXD2, CACNA1E, CD163, CLIC3, KLHL2 및 SMOX를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 서명은 PYROXD2, CACNA1E, CLIC3, IFI27, KLHL2 및 SMOX를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 서명은 PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, IFI27, RTN1 및 SMOX를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 서명은 PYROXD2, DDIAS, CD163, IFI27, KLHL2 및 SMOX를 포함하거나 이들로 이루어진다.
일 실시형태에서, 서명은 13개의 유전자 중 적어도 7개를 포함한다. 따라서, 일 실시형태에서, 서명은 PYROXD2, CACNA1E, CD163, HS.553068, IFI27, KLHL2 및 SMOX를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 서명은 PYROXD2, CACNA1E, CD163, CLIC3, IFI27, KLHL2 및 SMOX를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 서명은 PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, IFI27, KLHL2 및 SMOX를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 서명은 PYROXD2, CACNA1E, CD163, IFI27, KLHL2, RTN1 및 SMOX를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 서명은 PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, HS.553068, IFI27 및 SMOX를 포함하거나 이들로 이루어진다.
다른 실시형태에서, 서명은 13개의 유전자 중 적어도 8개를 포함한다. 따라서, 일 실시형태에서, 서명은 PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, IFI27, KLHL2 및 SMOX를 포함하거나 이들로 이루어진다. 다른 실시형태에서, 서명은 PYROXD2, CACNA1E, CD163, CLIC3, HS.553068, IFI27, KLHL2 및 SMOX를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 서명은 PYROXD2, CACNA1E, CD163, CLIC3, IFI27, KLHL2, RTN1 및 SMOX를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 서명은 PYROXD2, CACNA1E, CD163, HS.553068, IFI27, KLHL2, S100P 및 SMOX를 포함하거나 이들로 이루어진다.
다른 실시형태에서, 서명은 13개의 유전자 중 적어도 9개를 포함한다. 따라서, 일 실시형태에서, 서명은 PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, HS.553068, IFI27, KLHL2 및 SMOX를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 서명은 PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, IFI27, KLHL2, RTN1 및 SMOX를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 서명은 PYROXD2, CACNA1E, CD163, CLIC3, HS.553068, IFI27, KLHL2, RTN1 및 SMOX를 포함하거나 이들로 이루어진다.
다른 실시형태에서, 서명은 13개의 유전자 중 적어도 10개를 포함한다. 따라서, 일 실시형태에서, 서명은 PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, IFI27, KLHL2, RTN1, S100P 및 SMOX를 포함하거나 이들로 이루어진다. 다른 실시형태에서, 서명은 PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, HS.553068, IFI27, KLHL2, RTN1 및 SMOX를 포함하거나 이들로 이루어진다.
다른 실시형태에서, 서명은 13개의 유전자 중 적어도 11개를 포함한다. 따라서, 일 실시형태에서, 서명은 PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, HS.553068, IFI27, KLHL2, RTN1, S100P 및 SMOX를 포함하거나 이들로 이루어진다. 다른 실시형태에서, 서명은 PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, IFI27, KLHL2, LINC02035, RTN1, S100P 및 SMOX를 포함하거나 이들로 이루어진다. 다른 실시형태에서, 서명은 PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, IFI27, KLHL2, RTN1, S100P, SMOX 및 ZNF185를 포함하거나 이들로 이루어진다.
일 실시형태에서, 서명은 13개의 유전자 중 적어도 12개를 포함한다. 따라서, 일 실시형태에서, 서명은 PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, HS.553068, IFI27, KLHL2, RTN1, S100P, SMOX 및 ZNF185를 포함하거나 이들로 이루어진다. 다른 실시형태에서, 서명은 PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, HS.553068, IFI27, KLHL2, LINC02035, RTN1, S100P 및 SMOX를 포함하거나 이들로 이루어진다. 다른 실시형태에서, 서명은 PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, IFI27, KLHL2, LINC02035, RTN1, S100P, SMOX 및 ZNF185를 포함하거나 이들로 이루어진다.
일 실시형태에서, 서명은 모든 13개의 유전자를 포함한다. 따라서, 일 실시형태에서, 유전자 서명은 CACNA1E, DDIAS, KLHL2, PYROXD2, SMOX, ZNF185, LINC02035, CLIC3, S100P, IFI27, HS.553068, CD163 및 RTN1을 포함하거나 이들로 이루어진다. 유리하게는, 모든 13개의 유전자를 포함하는 서명은 가장 높은 분별력을 갖고, KD가 가장 높은 정도의 민감도 및 특이성으로 확인되게 한다.
KD의 확인은 혈관염과의 이의 연관 때문에 특히 중요할 수 있고, 이는 관상 동맥 동맥류(CCA)를 형성시킬 수 있다. 심근 경색으로부터의 사망은 동맥류의 혈전증성 폐색으로 인해 또는 손상된 동맥에서의 혈관 개형으로 인한 차후의 협착성 병변 발생으로부터 생길 수 있다. 그러므로, KD의 적절하고 신뢰성 있는 확인에 대한 상당히 충족되지 않은 임상 필요가 있다. 본 개시내용의 유전자 서명은 정확하고 신속한 진단을 허용하여 결국 환자가 적절하게 및 시기 적절하게 치료되게 하므로 열성 환자와 같은 환자를 치료하는 중에 앞으로의 거대한 단계이다.
게다가, 본원에 개시된 방법에 사용된 성분은 단일 형식으로 제공될 수 있고, 이 포맷은 비용 효율적이고, 신속하고, 비용 효과적이고, 저자원 및/또는 지방 환경에서 사용될 수 있다.
본 발명자들은 CACNA1E, DDIAS, KLHL2, PYROXD2, SMOX, ZNF185, LINC02035 및 CLIC3의 전사체 발현 수준이 KD를 갖지 않는 대상체와 비교하여 KD를 갖는 대상체에서 증가하고, S100P, IFI27, HS.553068, CD163 및 RTN1의 발현 수준이 KD를 갖지 않는 대상체와 비교하여 KD를 갖는 대상체에서 감소한다는 것을 발견하였다.
유리하게는, 본 발명자들은 상기 기재된 13개의 유전자의 유전자 발현 수준에서 조절을 검출하는 유전자 서명을 사용하여 약 96.2%의 높은 AUC, 및 높은 정도의 민감도(약 81.7%) 및 특이성(약 92.1%)으로 KD를 갖지 않는 대상체로부터 KD를 갖는 대상체를 구별할 수 있었다.
유리하게는, 유전자 서명은 일련의 민족을 포함하는 훈련 세트로부터 개발되었다. 이는 본 개시내용의 유전자 서명 및 방법이 상이한 민족의 대상체에서 유래된 샘플에 적용될 수 있다는 것을 의미한다. 추가로 유리하게는, 유전자 서명은 이의 병으로 7일 이하인 KD 환자를 사용하여 개발되었다. 이것은 서명이 KD 환자의 조기의 확인을 도울 수 있는 발열의 5일 전에 KD의 조기 진단을 수월하게 하고, 조기의 적절한 치료가 주어질 수 있다는 것을 의미한다.
따라서, 본 발명자들은 상기 방법이 넓은 범위의 상이한 샘플 및 환자 그룹에 걸쳐 적용 가능하다는 것을 입증하였고, 이는 상기 방법이 건강하고 신뢰성 있다는 것을 제시한다.
그러므로, 일 양태에서, 본 개시내용은 대상체 유래된 RNA 샘플에서 하기 유전자: CACNA1E, DDIAS (C11ORF82), KLHL2, PYROXD2 (C10ORF33), SMOX, ZNF185, LINC02035 (LOC100129550), CLIC3, S100P, IFI27, HS.553068, CD163 및 RTN1 중 적어도 5개를 포함하는 유전자 서명의 유전자 발현 수준의 조절을 검출하는 단계를 포함하는 가와사키병을 갖는 대상체를 진단하는 방법을 제공한다.
일 실시형태에서, 진단 방법은 시험관내 수행된다.
일 실시형태에서, 상기 방법은 추가로 하나 이상의 하우스키핑 유전자, 예컨대 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 하우스키핑 유전자를 사용한다. 하우스키핑 유전자는 본 명세서의 맥락에서 서명의 일부로 고려되지 않는다. 일 실시형태에서, 하우스키핑 유전자는 액틴, GAPDH, 유비퀴틴, 18s rRNA, RPII (POLR2A), TBP, PPIA, GUSB, HSPCB, YWHAZ, SDHA, RPS13, HPRT1 및 B4GALT6으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 박테리아 감염, 바이러스 감염 및/또는 염증성 병태의 존재 하에 KD를 갖는 대상체를 확인할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 박테리아 감염, 바이러스 감염 및/또는 염증성 병태를 갖는 환자로부터 KD를 갖는 대상체를 구별할 수 있다.
일 실시형태에서, 박테리아 감염은 클라미디아 뉴모니아에, 클라미디아 트라초마티스, 클라미도필라 시타시, 마이코플라스마 뉴모니아, 코리네박테륨 디프테리아에, 클로스트리듐 보툴리늄, 클로스트리듐 디피실, 클로스트리듐 페르프린겐스, 클로스트리듐 테타니, 엔테로코커스 페칼리스, 엔테로코커스 페시움, 리스테리아 모노사이토게네스, 스타필로코커스 아우레우스, 스타필로코커스 에피데르미디스, 스타필로코커스 사프로피티쿠스, 그룹 B 스트렙토코커스, 스트렙토코커스 아갈락티아에, 스트렙토코커스 뉴모니아에, 스트렙토코커스 피요게네스, 또는 항산성 박테리아 예컨대 마이코박테륨 레프라에, 마이코박테륨 투베르쿨로시스, 마이코박테륨 울세란스, 마이코박테륨 아비움 인테르셀룰랄라에, 보르데텔라 페르투시스, 보렐리아 부르그도르페리, 브루셀라 아보르투스, 브루셀라 카니스, 브루셀라 멜리텐시스, 브루셀라 수이스, 캄필로박터 제주니, 에스체리치아 콜라이, 프란시셀라 툴라렌시스, 헤모필루스 인플루엔자에, 헬리코박터 파일로리, 레지오넬라 뉴모필라, 렙토스피라 인터로간스, 나이세리아 고노레아에, 나이세리아 메닝기티디스, 슈도모나스 아에루시노사, 슈도모나스 종, 리케치아 리케치, 살모넬라 티피, 살모넬라 티피무륨, 시겔라 손네이, 트레포네마 팔리듐, 비브리오 콜레라에, 예르시니아 페스티스, 킨겔라 킨가에, 스테노트로포모나스, 클레브시엘라, 그람 양성 코커스, 그람 음성 바실루스, 마이코플라스마, 페르투시스, 마이코박테리아 및 스타필로코커스 및 스트렙토코커스 독성 쇼크 증후군, 예를 들어, 그람 양성 코커스, 그람 음성 바실루스, 마이코플라스마 또는 페르투시스 및 마이코박테리아로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 박테리아 감염은 S. 뉴모니아에, S.아우레우스, S. 피요게네스, 그룹 B 스트렙토코커스, 이. 콜라이, N. 메닝기티디스, 엔테로코커스, 킨겔라, H.인플루엔자에, 슈도모나스 종, 스테노트로포모나스 및 클레브시엘라로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 박테리아 감염은 스타필로코커스 또는 스트렙토코커스 독성 쇼크 증후군이다.
일 실시형태에서, 바이러스 감염은 인플루엔자, 예컨대 비제한적인 예로서 H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H7N7, H1N2, H9N2, H7N2, H7N3, H10N7을 포함하는 인플루엔자 A, 인플루엔자 B 및 인플루엔자 C, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 리노바이러스, 엔테로바이러스, 보카바이러스, 파라인플루엔자, 아데노바이러스, 메타뉴모바이러스, 단순 포진 바이러스, 수두 바이러스, 인간 파필로마바이러스, 간염, 엡스타인-바 바이러스, 바리셀라-조스터 바이러스, 인간 사이토메갈로바이러스, 인간 헤르페스바이러스, 타입 8 BK 바이러스, JC 바이러스, 두창, 파르보바이러스 B19, 인간 아스트로바이러스, 노르워크 바이러스, 콕사키바이러스, 폴리오바이러스, 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스, 황열 바이러스, 뎅기 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 루벨라 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 구아나리토 바이러스, 주닌 바이러스, 라사 바이러스, 마추포 바이러스, 사비아 바이러스, 콩고-크림 출혈 열 바이러스, 에볼라 바이러스, 마르부르그 바이러스, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 광견병 바이러스, 로타바이러스 및 록키산 홍반열을 포함하거나 이들로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 바이러스 감염은 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 아데노바이러스, 파라인플루엔자 바이러스(예컨대, 파라인플루엔자 1-4), 인플루엔자(예컨대, 인플루엔자 A, B 또는 A+B), 보카바이러스, 메타뉴모바이러스, 리노바이러스 및 엔테로바이러스, 특히 RSV, 인플루엔자 A/B 및 아데노바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 바이러스 감염은 홍역, 아데노바이러스 감염 및 록키산 홍반열로 이루어진 군으로부터 선택된다.
문단 4 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 염증성 병태는 천식, 위궤양, 폐결핵, 치주염, 궤양성 대장염, 크론병, 부비강염, 간염, 다발성 경화증, 죽상동맥경화증, 쇼그렌 질환, 염증성 장 질환, 홍반성 낭창(전신 홍반 루푸스 포함), 섬유성 질환, 예컨대 폐 섬유증, 헤노흐 쉔라인 자반증(HSP) 및 청소년 특발성 관절염(JIA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
일 실시형태에서, 염증성 질환은 청소년 특발성 관절염(JIA), 헤노흐 쉔라인 자반증(HSP)이다.
추가의 양태에서, 본 개시내용은 본원에서의 방법을 사용하여 진단 후 KD를 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
일 실시형태에서, 대상체는 예를 들어, 17세 아래의, 예컨대 2개월 내지 59개월의 아동이다.
일 실시형태에서, 대상체는 예를 들어, 0일 내지 59일의 범위의 연령의 유아이다.
일 실시형태에서, 대상체는 발열이 있고, 예를 들어, 열성 환자이다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 환자 유래 샘플, 예를 들어, 혈액 샘플에 사용된다.
일 실시형태에서, 유전자 발현 조절의 분석은 마이크로어레이를 사용한다.
일 실시형태에서, 유전자 발현 조절의 분석은 PCR, 예컨대 RT-PCR을 사용한다.
일 실시형태에서, PCR은 멀티플렉스 PCR이다.
일 실시형태에서, PCR은 정량적이다.
일 실시형태에서, PCR에 사용된 프라이머는 라벨 또는 라벨의 조합을 포함한다.
일 실시형태에서, 라벨은 형광 또는 유색이고, 예를 들어, 라벨은 유색 비드이다.
일 실시형태에서, 유전자 발현 조절의 분석은 이중 색상 역전사효소 멀티플렉스 결찰 의존적 프로브 증폭을 이용한다.
일 실시형태에서, 유전자 발현 조절은 형광 분광법을 이용하여 검출된다.
일 실시형태에서, 유전자 발현 조절은 비색 분석을 이용하여 검출된다.
일 실시형태에서, 유전자 발현 조절은 임피던스 분광법을 이용하여 검출된다.
일 실시형태에서, 상기 방법은 유전자 서명의 분석의 결과에 기초하여 KD를 갖는 대상체에 대한 치료를 처방하거나 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
따라서, 일 양태에서, 치료제, 예컨대 감마 글로불린(IVIg), 아스피린, 또는 다른 소염제, 예컨대 스테로이드 및 인플릭시맙을 투여하여 KD 환자를 치료하는 방법이 제공되고, 여기서 환자는 환자가 본원에 개시된 방법에 의해 KD에 대해 양성인 것으로 확인된다는 것을 특징으로 한다. 그러므로, 일 양태에서, 대상체에게 KD에 대한 치료를 투여하는 단계를 포함하는 가와사키병(KD)을 갖는 대상체를 치료하는 방법이 제공되고, 여기서 대상체는 대상체 유래된 RNA 샘플에서 하기 유전자: CACNA1E, DDIAS, KLHL2, PYROXD2, SMOX, ZNF185, LINC02035, CLIC3, S100P, IFI27, HS.553068, CD163 및 RTN1 중 적어도 5개를 포함하는 유전자 서명의 유전자 발현 수준의 조절을 검출하여 가와사키병을 갖는 것으로서 이전에 확인되었다. 비제한적인 예로서 감마 글로불린(IVIg), 아스피린 또는 다른 소염제, 예컨대 스테로이드 및 인플릭시맙, 또는 이들의 조합을 포함하는 KD에 적합한 치료는 당업자에게 공지될 것이다.
일 양태에서, 본 개시내용에 따른 방법을 수행하는 단계, 및 상기 방법이 대상체가 KD를 갖는다는 것을 나타내면 대상체에게 KD를 투여하는 단계를 포함하는, KD에 대한 치료제, 예컨대 감마 글로불린(IVIg), 아스피린, 또는 다른 소염제, 예컨대 스테로이드 및 인플릭시맙을 투여할지를 결정하는 방법이 제공된다.
그러므로, 현재 개시된 방법은 열성 환자와 같은 환자의 적절한 치료를 도울 수 있고, 예를 들어, 여기서 발열이 가와사키병으로 인하거나 박테리아 감염, 바이러스 감염, 염증성 병태 또는 이들의 조합으로 인하는지는 명확하지 않다. 이는 실험실 시험 결과에 기다릴 필요 없이 신속하고 적절한 치료의 보장의 이점을 갖는다.
본 개시내용의 일 양태에서, 멀티플렉스 PCR에 사용하기 위한 프라이머의 세트가 제공되고, 프라이머의 세트는 하기 유전자: CACNA1E, DDIAS, KLHL2, PYROXD2, SMOX, ZNF185, LINC02035, CLIC3, S100P, IFI27, HS.553068, CD163, 및 RTN1 중 적어도 5개로부터의 폴리뉴클레오타이드 유전자 전사체에 특이적인 핵산 서열을 포함한다. 따라서, 일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 적어도 PYROXD2로부터의 전사체에 특이적이다. 일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 적어도 SMOX로부터의 전사체에 특이적이다. 일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 적어도 CACNA1E로부터의 전사체에 특이적이다. 일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 적어도 CD163으로부터의 전사체에 특이적이다. 일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 적어도 DDIAS로부터의 전사체에 특이적이다. 일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 적어도 CLIC3으로부터의 전사체에 특이적이다. 일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 적어도 KLHL2로부터의 전사체에 특이적이다. 일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 적어도 HS.553068로부터의 전사체에 특이적이다. 일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 적어도 RTN1로부터의 전사체에 특이적이다. 일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 적어도 ZNF185로부터의 전사체에 특이적이다. 일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 적어도 IFI27로부터의 전사체에 특이적이다. 일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 적어도 S100P로부터의 전사체에 특이적이다. 일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 적어도 LINC02035로부터의 전사체에 특이적이다.
일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 하기 유전자: PYROXD2, SMOX, CACNA1E, CD163, DDIAS, CLIC3, KLHL2 및 HS.553068 중 적어도 하나로부터의 전사체에 특이적이다. 다른 실시형태에서, 프라이머의 세트는 하기 유전자: PYROXD2, SMOX, CACNA1E 및 CD163 중 적어도 하나로부터의 전사체에 특이적이다.
예를 들어, 프라이머의 세트는 하기 유전자: PYROXD2, SMOX, CACNA1E 및 CD163; PYROXD2, SMOX 및 CACNA1E; PYROXD2, SMOX 및 CD163; SMOX, CACNA1E 및 CD163; PYROXD2, CACNA1E 및 CD163; PYROXD2 및 SMOX; PYROXD2 및 CACNA1E; PYROXD2 및 CD163; SMOX 및 CACNA1E; SMOX 및 CD163; 또는 CACNA1E 및 CD163의 임의의 조합; 또는 임의의 다른 조합으로부터의 전사체에 특이적이다.
일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 PYROXD2 및 CACNA1E 및 SMOX의 적어도 하나로부터의 전사체에 특이적이다. 따라서, 일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 PYROXD2 및 CACNA1E에 특이적이다. 다른 실시형태에서, 프라이머의 세트는 PYROXD2 및 SMOX에 특이적이다. 또 다른 실시형태에서, 프라이머의 세트는 PYROXD2, CACNA1E 및 SMOX에 특이적이다.
일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 13개의 유전자 중 적어도 5개로부터의 전사체에 특이적이다. 따라서, 일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 PYROXD2, CACNA1E, CD163, KLHL2 및 SMOX에 특이적이다. 일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 PYROXD2, CACNA1E, IFI27, KLHL2 및 SMOX에 특이적이다. 일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 PYROXD2, CACNA1E, HS.553068, IFI27 및 SMOX에 특이적이다. 일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, IFI27 및 SMOX에 특이적이다. 일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 PYROXD2, CACNA1E, CD163, KLHL2 및 ZNF185에 특이적이다. 일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 PYROXD2, DDIAS, CD163, KLHL2 및 SMOX에 특이적이다.
일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 13개의 유전자 중 적어도 6개에 특이적이다. 따라서, 일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 PYROXD2, CACNA1E, CD163, IFI27, KLHL2 및 SMOX에 특이적이다. 일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 PYROXD2, CACNA1E, CD163, KLHL2, LINC02035 및 SMOX에 특이적이다. 일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, IFI27 및 SMOX에 특이적이다. 일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 PYROXD2, CACNA1E, CD163, HS.553068, IFI27 및 SMOX에 특이적이다. 일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 PYROXD2, CACNA1E, CD163, KLHL2, SMOX 및 ZNF185에 특이적이다. 일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 PYROXD2, CACNA1E, IFI27, KLHL2, RTN1 및 SMOX에 특이적이다. 일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 PYROXD2, CACNA1E, CD163, CLIC3, KLHL2 및 SMOX에 특이적이다. 일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 PYROXD2, CACNA1E, CLIC3, IFI27, KLHL2 및 SMOX에 특이적이다. 일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, IFI27, RTN1 및 SMOX에 특이적이다. 일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 PYROXD2, DDIAS, CD163, IFI27, KLHL2 및 SMOX에 특이적이다.
일 실시형태에서, 서명은 13개의 유전자 중 적어도 7개를 포함한다. 따라서, 일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 PYROXD2, CACNA1E, CD163, HS.553068, IFI27, KLHL2 및 SMOX에 특이적이다. 일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 PYROXD2, CACNA1E, CD163, CLIC3, IFI27, KLHL2 및 SMOX에 특이적이다. 일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, IFI27, KLHL2 및 SMOX에 특이적이다. 일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 PYROXD2, CACNA1E, CD163, IFI27, KLHL2, RTN1 및 SMOX에 특이적이다. 일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, HS.553068, IFI27 및 SMOX에 특이적이다.
다른 실시형태에서, 프라이머의 세트는 13개의 유전자 중 적어도 8개에 특이적이다. 따라서, 일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, IFI27, KLHL2 및 SMOX에 특이적이다. 다른 실시형태에서, 프라이머의 세트는 PYROXD2, CACNA1E, CD163, CLIC3, HS.553068, IFI27, KLHL2 및 SMOX에 특이적이다. 일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 PYROXD2, CACNA1E, CD163, CLIC3, IFI27, KLHL2, RTN1 및 SMOX에 특이적이다. 일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 PYROXD2, CACNA1E, CD163, HS.553068, IFI27, KLHL2, S100P 및 SMOX에 특이적이다.
다른 실시형태에서, 프라이머의 세트는 13개의 유전자 중 적어도 9개에 특이적이다. 따라서, 일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, HS.553068, IFI27, KLHL2 및 SMOX에 특이적이다. 일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, IFI27, KLHL2, RTN1 및 SMOX에 특이적이다. 일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 PYROXD2, CACNA1E, CD163, CLIC3, HS.553068, IFI27, KLHL2, RTN1 및 SMOX에 특이적이다.
다른 실시형태에서, 프라이머의 세트는 13개의 유전자 중 적어도 10개에 특이적이다. 따라서, 일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, IFI27, KLHL2, RTN1, S100P 및 SMOX에 특이적이다. 다른 실시형태에서, 프라이머의 세트는 PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, HS.553068, IFI27, KLHL2, RTN1 및 SMOX에 특이적이다.
다른 실시형태에서, 프라이머의 세트는 13개의 유전자 중 적어도 11개에 특이적이다. 따라서, 일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, HS.553068, IFI27, KLHL2, RTN1, S100P 및 SMOX에 특이적이다. 다른 실시형태에서, 프라이머의 세트는 PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, IFI27, KLHL2, LINC02035, RTN1, S100P 및 SMOX에 특이적이다. 다른 실시형태에서, 프라이머의 세트는 PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, IFI27, KLHL2, RTN1, S100P, SMOX 및 ZNF185에 특이적이다.
일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 13개의 유전자 중 적어도 12개에 특이적이다. 따라서, 일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, HS.553068, IFI27, KLHL2, RTN1, S100P, SMOX 및 ZNF185에 특이적이다. 다른 실시형태에서, 프라이머의 세트는 PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, HS.553068, IFI27, KLHL2, LINC02035, RTN1, S100P 및 SMOX에 특이적이다. 다른 실시형태에서, 프라이머의 세트는 PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, IFI27, KLHL2, LINC02035, RTN1, S100P, SMOX 및 ZNF185에 특이적이다.
일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 모든 13개의 유전자에 특이적이다. 따라서, 일 실시형태에서, 프라이머의 세트는 CACNA1E, DDIAS, KLHL2, PYROXD2, SMOX, ZNF185, LINC02035, CLIC3, S100P, IFI27, HS.553068, CD163 및 RTN1에 특이적이다.
일 실시형태에서, 유전자 전사체는 RNA, 예를 들어, mRNA 또는 cRNA이다. 따라서, 일 실시형태에서,
일 실시형태에서, 각각의 유전자에 대한 프라이머는 적어도 한 쌍의 핵산 프라이머 서열이다.
일 실시형태에서 프라이머 길이는 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개, 51개, 52개, 53개, 54개, 55개, 56개, 57개, 58개, 59개, 60개, 61개, 62개, 63개, 64개, 65개, 66개, 67개, 68개, 69개, 70개, 71개, 72개, 73개, 74개, 75개, 76개, 77개, 78개, 79개, 80개, 81개, 82개, 83개, 84개, 85개, 86개, 87개, 88개, 89개, 90개, 91개, 92개, 93개, 94개, 95개, 96개, 97개, 98개, 99개 또는 100개의 염기 길이이다.
일 실시형태에서, 각각의 유전자에 대한 적어도 하나의 프라이머는 라벨을 포함한다.
일 실시형태에서, 프라이머에서의 라벨은 형광 라벨, 유색 라벨, 및 항체, 단계 태그(step tag), 히스 태그로부터 독립적으로 선택된다.
일 실시형태에서, 주어진 쌍의 프라이머에서의 각각의 프라이머는 표지되고, 예를 들어, 여기서 상기 라벨이 서로에 근접 내에 있을 때 하나의 라벨은 다른 라벨의 형광을 켄칭한다.
본 개시내용의 다른 양태에서, 하기 유전자: CACNA1E, DDIAS, KLHL2, PYROXD2, SMOX, ZNF185, LINC02035, CLIC3, S100P, IFI27, HS.553068, CD163 및 RTN1 중 적어도 5개의 유전자 발현 수준의 조절을 검출하기 위한 프로브로 이루어진 유전자 칩이 제공된다.
일 실시형태에서, 13개의 유전자에 대한 Illumina 프로브 ID는 표 2에 기재되어 있다. 대안적으로, 훈련된 수신인은 13개의 유전자의 각각의 핵산 서열에 기초하여 맞춤 프로브를 설계할 수 있다.
일 실시형태에서, 유전자 칩은 대조 프로브를 추가로 포함한다. 본 개시내용의 맥락에서, 대조 프로브는 유전자 서명의 일부로서 여겨지지 않는다. 그러므로, 일 실시형태에서, 유전자 칩은 하기 유전자: CACNA1E, DDIAS, KLHL2, PYROXD2, SMOX, ZNF185, LINC02035, CLIC3, S100P, IFI27, HS.553068, CD163, 및 RTN1 중 적어도 5개에 대한 프로브; 및 하나 이상의 대조 프로브로 이루어진다. 일 실시형태에서, 대조 프로브는 하기 유전자: 액틴, GAPDH, 유비퀴틴, 18s rRNA, RPII (POLR2A), TBP, PPIA, GUSB, HSPCB, YWHAZ, SDHA, RPS13, HPRT1 및 B4GALT6 중 하나 이상으로부터의 전사체에 특이적이다.
유리하게는, 13개의 유전자 중 적어도 5개에 대한 프로브를 갖는 칩은 샘플, 예를 들어, 박테리아/바이러스 감염 및/또는 염증성 병태를 갖는 대상체에서 유래된 샘플로부터 KD를 갖는 대상체에서 유래된 전혈 사이를 정확하게 및 신뢰성 있게 구별할 수 있다. 적은 수의 프로브를 갖는 이러한 칩은 저렴하게 제조될 수 있어서, 그 칩이 자원 부족 환경에서 사용하기에 특히 적합하게 한다.
따라서, 일 실시형태에서, 유전자 칩은 적어도 PYROXD2에 대한 프로브를 포함한다. 일 실시형태에서, 유전자 칩은 적어도 SMOX에 대한 프로브를 포함한다. 일 실시형태에서, 유전자 칩은 적어도 CACNA1E에 대한 프로브를 포함한다. 일 실시형태에서, 유전자 칩은 적어도 CD163에 대한 프로브를 포함한다. 일 실시형태에서, 유전자 칩은 적어도 DDIAS에 대한 프로브를 포함한다. 일 실시형태에서, 유전자 칩은 적어도 CLIC3에 대한 프로브를 포함한다. 일 실시형태에서, 유전자 칩은 적어도 KLHL2에 대한 프로브를 포함한다. 일 실시형태에서, 유전자 칩은 적어도 HS.553068에 대한 프로브를 포함한다. 일 실시형태에서, 유전자 칩은 적어도 RTN1에 대한 프로브를 포함한다. 일 실시형태에서, 유전자 칩은 적어도 ZNF185에 대한 프로브를 포함한다. 일 실시형태에서, 유전자 칩은 적어도 IFI27에 대한 프로브를 포함한다. 일 실시형태에서, 유전자 칩은 적어도 S100P에 대한 프로브를 포함한다. 일 실시형태에서, 유전자 칩은 적어도 LINC02035에 대한 프로브를 포함한다.
일 실시형태에서, 유전자 칩은 하기 유전자: PYROXD2, SMOX, CACNA1E, CD163, DDIAS, CLIC3, KLHL2 및 HS.553068 중 적어도 하나에 대한 프로브를 포함한다. 다른 실시형태에서, 유전자 칩은 하기 유전자: PYROXD2, SMOX, CACNA1E 및 CD163 중 적어도 하나에 대한 프로브를 포함한다.
예를 들어, 유전자 칩은 하기 유전자: PYROXD2, SMOX, CACNA1E 및 CD163; PYROXD2, SMOX 및 CACNA1E; PYROXD2, SMOX 및 CD163; SMOX, CACNA1E 및 CD163; PYROXD2, CACNA1E 및 CD163; PYROXD2 및 SMOX; PYROXD2 및 CACNA1E; PYROXD2 및 CD163; SMOX 및 CACNA1E; SMOX 및 CD163; 또는 CACNA1E 및 CD163의 임의의 조합; 또는 임의의 다른 조합에 대한 프로브를 포함한다.
일 실시형태에서, 유전자 칩은 PYROXD2 및 CACNA1E 및 SMOX의 적어도 하나에 대한 프로브를 포함한다. 따라서, 일 실시형태에서, 유전자 칩은 PYROXD2 및 CACNA1E에 대한 프로브를 포함한다. 다른 실시형태에서, 유전자 칩은 PYROXD2 및 SMOX에 대한 프로브를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 유전자 칩은 PYROXD2, CACNA1E 및 SMOX에 대한 프로브를 포함한다.
일 실시형태에서, 유전자 칩은 13개의 유전자 중 적어도 5개에 대한 프로브를 포함하거나 이들로 이루어진다. 따라서, 일 실시형태에서, 유전자 칩은 PYROXD2, CACNA1E, CD163, KLHL2 및 SMOX에 대한 프로브를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 유전자 칩은 PYROXD2, CACNA1E, IFI27, KLHL2 및 SMOX에 대한 프로브를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 유전자 칩은 PYROXD2, CACNA1E, HS.553068, IFI27 및 SMOX에 대한 프로브를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 유전자 칩은 PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, IFI27 및 SMOX에 대한 프로브를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 유전자 칩은 PYROXD2, CACNA1E, CD163, KLHL2 및 ZNF185에 대한 프로브를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 유전자 칩은 PYROXD2, DDIAS, CD163, KLHL2 및 SMOX에 대한 프로브를 포함하거나 이들로 이루어진다.
일 실시형태에서, 유전자 칩은 13개의 유전자 중 적어도 6개에 대한 프로브를 포함하거나 이들로 이루어진다. 따라서, 일 실시형태에서, 유전자 칩은 PYROXD2, CACNA1E, CD163, IFI27, KLHL2 및 SMOX에 대한 프로브를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 유전자 칩은 PYROXD2, CACNA1E, CD163, KLHL2, LINC02035 및 SMOX에 대한 프로브를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 유전자 칩은 PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, IFI27 및 SMOX에 대한 프로브를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 유전자 칩은 PYROXD2, CACNA1E, CD163, HS.553068, IFI27 및 SMOX에 대한 프로브를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 유전자 칩은 PYROXD2, CACNA1E, CD163, KLHL2, SMOX 및 ZNF185에 대한 프로브를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 유전자 칩은 PYROXD2, CACNA1E, IFI27, KLHL2, RTN1 및 SMOX에 대한 프로브를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 유전자 칩은 PYROXD2, CACNA1E, CD163, CLIC3, KLHL2 및 SMOX에 대한 프로브를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 유전자 칩은 PYROXD2, CACNA1E, CLIC3, IFI27, KLHL2 및 SMOX에 대한 프로브를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 유전자 칩은 PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, IFI27, RTN1 및 SMOX에 대한 프로브를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 유전자 칩은 PYROXD2, DDIAS, CD163, IFI27, KLHL2 및 SMOX에 대한 프로브를 포함하거나 이들로 이루어진다.
일 실시형태에서, 유전자 칩은 13개의 유전자 중 적어도 7개에 대한 프로브를 포함하거나 이들로 이루어진다. 따라서, 일 실시형태에서, 유전자 칩은 PYROXD2, CACNA1E, CD163, HS.553068, IFI27, KLHL2 및 SMOX에 대한 프로브를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 유전자 칩은 PYROXD2, CACNA1E, CD163, CLIC3, IFI27, KLHL2 및 SMOX에 대한 프로브를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 유전자 칩은 PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, IFI27, KLHL2 및 SMOX에 대한 프로브를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 유전자 칩은 PYROXD2, CACNA1E, CD163, IFI27, KLHL2, RTN1 및 SMOX에 대한 프로브를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 유전자 칩은 PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, HS.553068, IFI27 및 SMOX에 대한 프로브를 포함하거나 이들로 이루어진다.
다른 실시형태에서, 유전자 칩은 13개의 유전자 중 적어도 8개에 대한 프로브를 포함하거나 이들로 이루어진다. 따라서, 일 실시형태에서, 유전자 칩은 PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, IFI27, KLHL2 및 SMOX에 대한 프로브를 포함하거나 이들로 이루어진다. 다른 실시형태에서, 유전자 칩은 PYROXD2, CACNA1E, CD163, CLIC3, HS.553068, IFI27, KLHL2 및 SMOX에 대한 프로브를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 유전자 칩은 PYROXD2, CACNA1E, CD163, CLIC3, IFI27, KLHL2, RTN1 및 SMOX에 대한 프로브를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 유전자 칩은 PYROXD2, CACNA1E, CD163, HS.553068, IFI27, KLHL2, S100P 및 SMOX에 대한 프로브를 포함하거나 이들로 이루어진다.
다른 실시형태에서, 유전자 칩은 13개의 유전자 중 적어도 9개에 대한 프로브를 포함하거나 이들로 이루어진다. 따라서, 일 실시형태에서, 유전자 칩은 PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, HS.553068, IFI27, KLHL2 및 SMOX에 대한 프로브를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 유전자 칩은 PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, IFI27, KLHL2, RTN1 및 SMOX에 대한 프로브를 포함하거나 이들로 이루어진다. 일 실시형태에서, 유전자 칩은 PYROXD2, CACNA1E, CD163, CLIC3, HS.553068, IFI27, KLHL2, RTN1 및 SMOX에 대한 프로브를 포함하거나 이들로 이루어진다.
다른 실시형태에서, 유전자 칩은 13개의 유전자 중 적어도 10개에 대한 프로브를 포함하거나 이들로 이루어진다. 따라서, 일 실시형태에서, 유전자 칩은 PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, IFI27, KLHL2, RTN1, S100P 및 SMOX에 대한 프로브를 포함하거나 이들로 이루어진다. 다른 실시형태에서, 유전자 칩은 PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, HS.553068, IFI27, KLHL2, RTN1 및 SMOX에 대한 프로브를 포함하거나 이들로 이루어진다.
다른 실시형태에서, 유전자 칩은 13개의 유전자 중 적어도 11개에 대한 프로브를 포함하거나 이들로 이루어진다. 따라서, 일 실시형태에서, 유전자 칩은 PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, HS.553068, IFI27, KLHL2, RTN1, S100P 및 SMOX에 대한 프로브를 포함하거나 이들로 이루어진다. 다른 실시형태에서, 유전자 칩은 PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, IFI27, KLHL2, LINC02035, RTN1, S100P 및 SMOX에 대한 프로브를 포함하거나 이들로 이루어진다. 다른 실시형태에서, 유전자 칩은 PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, IFI27, KLHL2, RTN1, S100P, SMOX 및 ZNF185에 대한 프로브를 포함하거나 이들로 이루어진다.
일 실시형태에서, 유전자 칩은 13개의 유전자 중 적어도 12개에 대한 프로브를 포함하거나 이들로 이루어진다. 따라서, 일 실시형태에서, 유전자 칩은 PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, HS.553068, IFI27, KLHL2, RTN1, S100P, SMOX 및 ZNF185에 대한 프로브를 포함하거나 이들로 이루어진다. 다른 실시형태에서, 유전자 칩은 PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, HS.553068, IFI27, KLHL2, LINC02035, RTN1, S100P 및 SMOX에 대한 프로브를 포함하거나 이들로 이루어진다. 다른 실시형태에서, 유전자 칩은 PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, IFI27, KLHL2, LINC02035, RTN1, S100P, SMOX 및 ZNF185에 대한 프로브를 포함하거나 이들로 이루어진다.
일 실시형태에서, 유전자 칩은 모든 13개의 유전자에 대한 프로브를 포함하거나 이들로 이루어진다. 따라서, 일 실시형태에서, 유전자 칩은 CACNA1E, DDIAS, KLHL2, PYROXD2, SMOX, ZNF185, LINC02035, CLIC3, S100P, IFI27, HS.553068, CD163, 및 RTN1에 대한 프로브를 포함하거나 이들로 이루어진다.
추가의 실시형태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 방법에서 공지된 또는 상업적으로 이용 가능한 유전자 칩의 사용을 포함한다.
일 양태에서, 상기 정의된 바와 같은 프라이머의 세트 또는 유전자 칩을 포함하는 KD를 갖는 대상체를 확인하기 위한 현장 시험이 제공된다. 유리하게는, 현재 개시된 시험은 복잡한 진단학적 또는 실험실 설비의 필요 없이 두어 시간만큼 적게 신속하게 수행될 수 있다. 따라서, 현재 개시된 방법은 병원 환경 및 보다 자원이 부족한 환경, 예컨대 벽촌에서 기존의 환자 관리 프로그램의 일부로서 용이하게 실행될 수 있다.
일 양태에서, 샘플, 예를 들어, 혈액 샘플에서 KD를 검출하기 위해 검정에서 상기 정의된 바와 같은 프라이머의 세트 또는 유전자 칩의 용도가 제공된다.
표 2에 기재된 13개의 유전자/유전자 전사체는 KD를 갖는 환자를 확인하거나 박테리아 감염으로부터 KD를 구별하는 데 유용하다. 일 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 상이한 병태/질환 또는 감염, 예컨대 유사한 임상 증상을 갖는 박테리아/바이러스 감염 또는 염증성 병태에서 KD를 갖는 대상체를 구별할 수 있다. 다른 실시형태에서, 13개의 유전자/유전자 전사체는 바이러스 감염으로부터 구별하기에 유용하다. 또 다른 실시형태에서, 13 유전자/유전자 전사체는 염증성 질환, 예컨대 청소년 특발성 관절염(JIA), 헤노흐 쉔라인 자반증(HSP) 또는 전신 홍반 루푸스(SLE)로부터 KD를 갖는 환자를 구별하는 데 유용하다.
일 실시형태에서, 하나의 프로브는, 예를 들어, 표 2에 기재된 프로브의 목록으로부터 선택된, 각각의 유전자의 유전자 발현의 조절을 검출하기 위해 사용된다.
다른 실시형태에서, 2개 이상의 프로브는 각각의 유전자의 조절을 검출하기 위해 사용된다. 본 개시내용의 일 실시형태에서, 유전자 서명은 예를 들어, 박테리아/바이러스 감염 사이에 및/또는 염증성 질환 사이에 감염을 최적으로 검출하거나 질환을 구별하는 데 필요한 유전자의 최소 세트이다.
최적으로는 검출하거나 구별하는 서명의 능력의 특이성 및/또는 민감도의 상당한 소실 없이 KD와 박테리아/바이러스 감염 및/또는 염증성 병태 사이를 구별하는 데 필요한 유전자의 가장 작은 세트를 의미하도록 의도된다.
본원에 사용된 바와 같은 검출 또는 검출하는은 특히 서명에서 관련 유전자의 조절의 검출을 통해 샘플에서 KD를 확인하는 과정을 지칭하도록 의도된다. 일 실시형태에서, 대상체는 오직 Kd를 갖는 것으로 검출될 수 있다. 다른 실시형태에서, 대상체는 KD를 가질 수 있고, 또한 박테리아 감염, 바이러스 감염, 염증성 병태, 또는 이들의 조합을 갖는다.
구별은 상이한 질환 상태, 예를 들어, KD 대 바이러스/박테리아 감염 또는 염증성 질환 사이를 구별하는 서명의 능력을 지칭한다. 검출 및 구별은 유전자 서명의 맥락에서 상호 교환가능하다.
본원에 사용된 바와 같은 대상체는 KD를 갖는 것으로 의심되는 인간 또는 샘플이 유래되는 발열이 있는 인간이다. 용어 환자는 일 실시형태에서 환자가 이환율을 갖지만 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 KD를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체에서 유래된 샘플에서 수행되고, 예를 들어, 대상체는 KD와 보통 연관된 증상을 나타낸다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 박테리아/바이러스 감염 또는 염증성 병태를 갖거나 갖는 것으로 의심되지만 KD를 갖는 것으로 의심되지 않는 대상체에서 유래된 샘플에서 수행되고, 예를 들어, 대상체는 KD와 보통 연관되지 않은 증상을 나타낸다. 이러한 대상체로부터의 샘플의 시험은 보통 정확히 진단되지 않는 KD를 갖는 개체를 확인하는 것을 도울 수 있다.
일 실시형태에서, 대상체는 바이러스 감염의 증상을 나타낸다. 다른 실시형태에서, 대상체는 박테리아 감염의 증상을 나타낸다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 박테리아 감염 및 바이러스 감염 둘 다의 증상을 나타낸다. 일 실시형태에서, 대상체는 염증성 병태의 증상을 나타낸다.
추가의 실시형태에서, 샘플은 열성 대상체; 다시 말해서 온도가 37.5℃의 정상 체온보다 대상체에서 유래된 샘플이다.
다른 추가의 실시형태에서, 분석은 발열이 KD와 연관되는지를 확립하도록 수행된다. 발열/감염의 소소의 확립은 유리하게는 적절한 약제의 처방 및/또는 투여를 허용하고, 예를 들어, KD를 갖는 것으로 확인된 환자는 감마 글로불린(IVIg), 아스피린과 같은 적절한 치료가 주어질 수 있는 반면, 박테리아 감염을 갖는 환자는 항생제가 주어질 것이고, 바이러스 감염을 갖는 환자는 해열제가 주어질 것이다.
효과적인 치료는 병원 체류를 최소화하고, 특히 환자가 유아 또는 아동일 때 환자가 생명을 구할 수 있는 적절한 치료를 얻도록 보장하고, 또한 자원이 적절히 사용되는 것을 보장하므로 유리하다.
근년에, 항생제의 과사용이 박테리아 발생 내성으로 이어지므로 피해져야 한다는 것이 명백해졌다. 따라서, 박테리아 감염을 갖지 않는 환자에 대한 항생제의 투여는 피해져야 한다.
일 실시형태에서, 대상체는 성인이다. 성인은 본원에서 18세 이상의 사람으로 정의된다.
일 실시형태에서, 대상체는 아동이다. 본원에 사용된 바와 같은 아동은 5세 내지 17세와 같은 18세 아래의 사람을 지칭한다.
일 실시형태에서, 대상체는 유아이다. 본원에 사용된 바와 같은 유아는 0세 내지 59세의 범위의 연령의 사람을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 유전자 발현의 조절은 유전자 또는 유전자들의 상향조절 또는 하향조절을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 상향조절된은 예를 들어, 적절한 바대로 관련 질환 또는 감염이 없는 대조군 샘플에 대해 이환된 또는 감염된 환자 샘플에서 또는 잠복 질환 또는 감염 또는 상이한 병기의 질환 또는 감염을 갖는 샘플에서 더 높은 수준으로 발현되는 유전자 전사체를 지칭하도록 의도된다.
본원에 사용된 바와 같은 하향조절된은 예를 들어, 관련 질환 또는 감염이 없는 대조군 샘플에 대해 이환된 또는 감염된 환자 샘플에서 또는 잠복 질환 또는 감염 또는 상이한 병기의 질환 또는 감염을 갖는 샘플에서 더 낮은 수준으로 발현되는 유전자 전사체를 지칭하도록 의도된다. 따라서, 상향조절된 유전자는 KD를 갖지 않는 대상체와 비교하여 KD를 갖는 대상체에서 더 높은 수준으로 발현되는 것이다. 마찬가지로, 하향조절된 유전자는 KD를 갖지 않는 대상체와 비교하여 KD를 갖는 대상체에서 더 낮은 수준으로 발현된다.
조절은 적절한 기법에 의해 유전자 발현의 수준을 측정하여 측정된다.
본원에 사용된 바와 같은 유전자 발현은 유전자로부터의 정보가 기능적 유전자 산물의 합성에 사용되는 과정이다. 이 산물은 대개 단백질이지만, 비단백질 암호화 유전자, 예컨대 리보솜 RNA(rRNA), 운반 RNA(tRNA) 또는 소핵 RNA(snRNA) 유전자에서, 그 산물은 기능적 RNA, 다시 말해서, 기능을 갖는 RNA이다. 본 개시내용의 맥락에서, 유전자의 발현 수준의 측정은 그 유전자와 연관된 전사체의 수준의 측정을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 유전자 발현 데이터는 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개 또는 50개와 같은 2개 이상의 유전자의 발현을 나타내는 환자 샘플로부터 생성된 임의의 데이터를 지칭하도록 의도된다.
일 실시형태에서, 1개 이상, 예를 들어, 1개 내지 21개, 예컨대 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개의 유전자는 동등한 기능을 갖는 유전자에 의해 대체되고, 단 서명은 특이성 및/또는 민감도의 상당한 손실 없이 관련 임상 상태를 검출/구별하는 능력을 보유한다.
일 실시형태에서, 사용된 유전자는 표 2에 기재된 13개의 유전자와 동일성을 갖는다.
일 실시형태에서, 13개의 유전자 서명에서의 유전자 중 1개 이상은 KD를 갖지 않는 대상체에서 유래된 샘플과 비교하여 KD를 갖는 대상체에서 유래된 샘플에서 상당히 차등적으로 발현된다.
본원에 사용된 바와 같은 유전자 서명은 함께 시험될 때 관련 임상 상태를 검출/구별할 수 있는 2개 이상의 유전자를 지칭하도록 의도된다. 그러므로, 유전자 서명은 KD를 갖는 대상체를 확인하기 위해 또는 박테리아/바이러스 감염 또는 염증성 질환을 갖는 대상체로부터 KD를 갖는 대상체를 구별하기 위해 충분한 분별력을 갖는 유전자의 최소 세트를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은 상당히 차등적으로 발현된은 유전자가 KD를 갖지 않는, 예를 들어, 박테리아/바이러스 감염 및/또는 염증성 병태를 갖는 대상체에서 유래된 샘플과 비교하여 KD를 갖는 대상체에서 유래된 샘플에서 log2 배수 변화(fold change) >0.5 또는 <-0.5를 나타낸다는 것을 의미한다.
일 실시형태에서, 본원에 사용된 바와 같은 상향조절된은 유전자가 log2 배수 변화 >0.5를 나타낸다는 것을 의미한다.
일 실시형태에서, 본원에 사용된 바와 같은 하향조절된은 유전자가 log2 배수 변화 <-0.5를 나타낸다는 것을 의미한다.
일 실시형태에서, S100P, IFI27, HS.553068, CD163 및 RTN1의 유전자 중 하나 이상은 KD를 갖는 대상체에서 하향조절된다.
일 실시형태에서, CACNA1E, DDIAS, KLHL2, PYROXD2, SMOX, ZNF185, LINC02035, CLIC3의 유전자 중 하나 이상은 KD를 갖는 대상체에서 상향조절된다.
본원에 사용된 바와 같은 형태로 제시된은 마이크로어레이에 프로브의 형태의 서명 중 하나 이상으로부터의 유전자를 두는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 정확하게 및 강력하게는 상기 방법이 실제적 환경 또는 아프리카와 같은 저자원 환경에서 사용될 수 있다는 시실 및 상기 방법의 수행의 결과가 진정한 결과가 얻어지는 신뢰도의 높은 수준을 적절히 제공한다는 사실을 지칭한다.
높은 신뢰도는 위양성(예를 들어, 결과는 대상체가 박테리아 감염이 아닐 때 그 감염을 갖는다는 것을 제시)이고 또한 약간의 위음성(예를 들어, 결과는 대상체가 박테리아 감염일 때 그 감염을 갖지 않는다는 것을 제시)을 가지는 약간의 결과를 제공할 때 상기 방법에 의해 제공된다.
높은 신뢰도는 적절한 통계 시험이 이용될 때 90% 이상의 신뢰도, 예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 신뢰도를 포함할 것이다.
일 실시형태에서, 상기 방법은 예를 들어, 민감도가 하기와 같이 계산되는 경우 80% 이상, 예컨대 90% 이상, 특히 95% 이상의 민감도를 제공한다:
Figure pct00001
일 실시형태에서, 상기 방법은 예를 들어, 특이성이 하기와 같이 계산되는 경우 80% 이상, 예컨대 90% 이상, 특히 95% 이상과 같은 높은 수준의 특이성을 제공한다:
Figure pct00002
일 실시형태에서, 유전자 서명의 방법의 민감도는 90% 내지 100%, 예컨대 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이다.
일 실시형태에서, 유전자 서명의 방법의 특이성은 85% 내지 100%, 예컨대 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이다.
일 실시형태에서, 유전자 서명의 방법의 민감도는 85% 내지 100%, 예컨대 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이다.
일 실시형태에서, 유전자 서명의 방법의 특이성은 85% 내지 100%, 예컨대 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이다.
마이크로어레이, 타일링 어레이(tiling array), 예를 들어, 유전자 칩에서의 DNA 또는 RNA 어레이, RNA-seq 및 유전자 발현의 연속 분석을 포함하는 유전자 발현이 측정될 수 있는 다수의 방식이 있다.
유전자 조절의 측정의 임의의 적합한 방법은 본 개시내용의 방법에 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 측정된 유전자 발현은 숙주(예를 들어, 인간), 예를 들어, 숙주 염증성 반응의 것이고, 즉 감염성 제제 또는 질환의 것이 아니다.
일 실시형태에서, 대상체 샘플로부터의 DNA 또는 RNA가 분석된다.
일 실시형태에서, 대상체 샘플로부터의 RNA가 분석된다.
일 실시형태에서, 대상체 샘플로부터의 mRNA가 분석된다.
일 실시형태에서, 대상체 샘플로부터의 cRNA가 분석된다.
일 실시형태에서, 샘플은 고체 또는 유체, 예를 들어, 혈액 또는 혈청 또는 이들의 임의의 하나의 가공된 형태이다.
본원에 사용된 바와 같은 유체 샘플은 살아 있는 사람의 신체 내부에서 기원하는 액체를 지칭한다. 이들은 신체로부터 배설되거나 분비되는 유체 및 보통은 있지 않는 신체 물을 포함한다. 양수, 수양액 및 유리체액, 쓸개즙, 혈액 혈청, 모유, 뇌척수액, 이구(귀지), 유미, 내림프 및 외림프, 위액, 점액(비루 및 가래 포함), 담, 복막액, 흉수, 타액, 피지(피부 유분), 정액, 땀, 눈물, 질 분비물, 토사물, 뇨를 포함한다. 특히 혈액 및 혈청.
본원에 사용된 바와 같은 혈액은 혈청, 혈액 세포 및 응고 인자인 전혈, 전형적으로 말초 전혈을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 혈청은 혈액 세포 또는 응고 인자가 아닌 전혈의 성분을 지칭한다. 이것은 피브리노겐이 제거된 혈장이다.
일 실시형태에서, 대상체 유래된 샘플은 혈액 샘플이다.
일 실시형태에서, 샘플은 백혈구이다. 그러므로, 일 실시형태에서, RNA 샘플은 백혈구에서 유래된다.
RNA 샘플은 분석에 이용 가능한 출발 RNA 주형의 양을 증가시키기 위해 PCR, 예컨대 전장 게놈 증폭에 의해 추가의 증폭으로 처리될 수 있다. 대안적으로, RNA 샘플은 역전사효소, 예컨대 HIV-1 역전사효소, 몰로니 쥣과 백혈병 바이러스(M-MLV: moloney murine leukaemia virus) 역전사효소, AMV 역전사효소 및 텔로머라아제 역전사효소에 의해 cDNA로 전환될 수 있다. 이러한 증폭 단계는 더 작은 샘플 부피, 예컨대 아동에서 얻은 혈액 샘플에 필요할 수 있다.
하나 이상의 실시형태에서, 분석은 생체외이다.
본원에 사용된 바와 같은 생체외는 신체 외에 발생함을 의미한다.
일 실시형태에서, 유전자 발현 데이터는 유전자 칩과 같은 마이크로어레이로부터 생성된다.
본원에 사용된 바와 같은 마이크로어레이는 RNA 또는 DNA 어레이, 예컨대 RNA 어레이를 포함한다. 비제한적인 예로서 고상 어레이 및 비드 어레이를 포함하는 다양한 상이한 형태의 마이크로어레이가 당업자에게 공지될 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 중합효소 연쇄 반응(PCR)은 표적 DNA 서열의 다수의 카피를 만들기 위해 널리 사용된 분자 기법을 지칭한다. 상기 방법은 DNA 용융 및 DNA의 효소 복제에 대한 반응의 반복된 가열 및 냉각의 사이클로 이루어지는 열 사이클링에 의존한다. DNA 중합효소(상기 방법은 이의 이름을 따서 명명됨)와 함께 표적 영역에 상보성인 서열을 함유하는 프라이머는 선택적이고 반복된 증폭이 가능하게 하는 중요 성분이다. PCR이 진행하면서, 생성된 DNA는 자체가 복제를 위한 주형으로 사용되어, DNA 주형이 기하급수적으로 증폭되는 연쇄 반응을 이동으로 설정한다.
본원에 사용된 바와 같은 멀티플렉스 PCR은 동시에 2개 이상의 상이한 DNA 서열을 증폭시키도록, 즉 하나의 반응에서 많은 별개의 PCR 반응을 함께 실행하는 것과 같이 중합효소 연쇄 반응(PCR)의 사용을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 프라이머는 DNA 합성 반응에 대한 출발점으로 작용하는 핵산 서열의 짧은 가닥, 보통 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오타이드를 지칭하도록 의도된다.
프라이머는 전형적으로 약 15개의 염기 쌍 길이이지만, 5개 내지 100개의 염기 쌍 길이로 변할 수 있다. DNA 중합효소가 DNA의 기존의 가닥에 오직 새로운 뉴클레오타이드 또는 염기 쌍을 부가할 수 있으므로, 이는 PCR과 같은 공정에 필요하다. PCR 반응 동안, 프라이머는 DNA 샘플에서 이의 상보성 서열에 혼성화한다. 다음에, DNA 중합효소는 프라이머의 3' 말단에서 복제를 시작하고, 반대의 DNA 가닥의 서열을 카피하여 프라이머를 연장시킨다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 프라이머는 mRNA와 같은 RNA에 특이적이고, 즉 이것은 RNA 서열에 상보성이다. 다른 실시형태에서, 프라이머는 cDNA에 특이적이고, 즉 이것은 cDNA 서열에 상보성이다.
일 실시형태에서, 본 개시내용의 프라이머는 프라이머가 검출되거나 단리되게 하는 라벨을 포함한다. 라벨의 예는 형광 라벨, 유색 라벨 및 항체, 단계 태그, 히스 태그를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
다른 실시형태에서, 주어진 쌍의 프라이머에서의 각각의 프라이머는 표지되고, 예를 들어, 여기서 상기 라벨이 서로의 근접 내에 있을 때 하나의 라벨(켄쳐로도 공지됨)은 다른 라벨의 형광을 켄칭한다. 이러한 라벨은 예를 들어, 실시간 PCR 반응에 특히 유용하다. 이러한 라벨 쌍의 예는 6-카복시플루오로세인(FAM) 및 테트라클로로플루오로세인 또는 테트라메틸로다민 및 테트라클로로플루오로세인을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 현장 시험 또는 베드사이드 시험은 현장에서 또는 근처에서, 즉 환자 관리의 시간 및 장소에서 수행되는 의학적 진단 시험을 지칭하도록 의도된다. 이는 전형적으로 의학 실험실에 국한되고 시험을 위해 현장으로부터 실험실로 멀리 시편을 보내는 것을 수반하는 종래의 진단 시험과 대조적이다. 이러한 진단 시험은 시험의 결과가 수신될 수 있기 전에 대개 많은 시간 또는 일을 요한다. 한편, 시험 결과의 지식 없이 환자 관리는 계속해야 한다. 비교하면, 현장 시험은 전형적으로 신속히 수행될 수 있는 단순한 의학 시험이다.
유전자 칩은 본질적으로 마이크로어레이, 즉 별개의 영역의 어레이, 전형적으로 서로 별개이고, 예를 들어, 약 100/cm2 내지 1000/cm2의 밀도로 배열되지만, 10000/cm2와 같은 더 큰 밀도로 배열될 수 있는 핵산이다.
마이크로어레이 실험의 원칙은 소정의 세포주 또는 조직으로부터의 mRNA가 '표적'이라 불리는 표지된 샘플, 전형적으로 표지된 cDNA 또는 cRNA를 생성하도록 사용된다는 것이고, 이 표적은 정돈된 어레이에서 고체 표면에 부동화된 많은 수의 핵산 서열, 전형적으로 DNA 또는 RNA 서열에 병렬로 혼성화된다. 수만개의 전사체 종은 동시에 검출되고 정량화될 수 있다. 많은 상이한 마이크로어레이 시스템이 개발되었지만, 가장 흔히 사용되는 시스템은 오늘날 2개의 그룹으로 나눠질 수 있다.
이 기법을 이용하여, 30,000개 초과의 cDNA로 이루어진 어레이는 종래의 현미경 슬라이드의 표면에 적합화될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 어레이에 대해, 짧은 20-25합체는 실리콘 웨이퍼(Affymetrix로부터의 고밀도-올리고뉴클레오타이드 어레이)로의 포토리소그래피에 의해 또는 잉크젯 기술(Rosetta Inpharmatics에 의해 개발되고 Agilent Technologies에 허가됨)에 의해 인시츄 합성된다.
대안적으로, 예비합성된 올리고뉴클레오타이드는 유리 슬라이드에 인쇄될 수 있다. 합성 올리고뉴클레오타이드에 기초한 방법은, 서열 정보 단독이 어레이되는 DNA를 생성하기에 충분하므로, cDNA 자원의 시간 소모 취급이 필요하지 않는다는 이점을 제공한다. 또한, 프로브는 주어진 전사체의 가장 고유한 부분을 나타내어, 밀접히 관련된 유전자 또는 스플라이스 변이체의 검출이 가능하게 하도록 설계될 수 있다. 짧은 올리고뉴클레오타이드가 혼성화가 덜 특이적이게 하고 민감도를 감소시킬 수 있지만, 미리 합성된 더 긴 올리고뉴클레오타이드(50-100합체)의 배열은 이 단점에 대응하도록 최근에 개발되었다.
일 실시형태에서, 유전자 칩은 기성 제품, 상업적으로 이용 가능한 칩, 예를 들어, Illumina로부터 입수 가능한 HumanHT-12 v4 Expression BeadChip Kit, Roche, Agilent, Eppendorf로부터 입수 가능한 NimbleGen 마이크로어레이 및 HU-Ul 33.Plus 2.0 유전자 칩과 같은 Affymetrix로부터의 Genechips이다.
대안적인 실시형태에서, 본 발명에 사용되는 유전자 칩은 맞춤 유전자 칩이고, 다시 말해서 칩은 원하는 프로필과 관련된 표적 유전자를 오직 함유한다. 맞춤 제조 칩은 Roche, Affymetrix 및 기타와 같은 회사로부터 구입될 수 있다. 다른 추가의 실시형태에서, 맞춤 유전자 칩은 최소 질환 특이적 전사체 세트를 포함한다.
일 실시형태에서, 칩은 표 2에 기재된 13개의 유전자의 발현을 검출하기 위한 프로브로 이루어진다.
일 실시형태에서, 하기 Illumina 프로브 ID 번호는 유전자 발현 수준의 조절을 검출하기 위해 사용된다: CACNA1E에 대해 7510647, DDIAS에 대해 2570019, KLHL2에 대해 1070593, PYROXD2에 대해 1684497, SMOX에 대해 270068 또는 3710553, ZNF185에 대해 6840674, LINC02035에 대해 3236239, CLIC3에 대해 5870136, S100P에 대해 1510424, IFI27에 대해 3990170, HS.553068에 대해 1470450, CD163에 대해 2680092 및 RTN1에 대해 6860193.
하나 이상의 상기 실시형태에서, 칩은 1개 이상, 예컨대 1개 내지 10개의 대조 프로브, 예컨대 하우스키핑 유전자를 추가로 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 유전자 발현 데이터는 관련 유전자에 대한 적절한 프로브를 사용하여 용액 중에 생성된다.
본원에 사용된 바와 같은 프로브는 프로브에서의 서열에 상보성인 뉴클레오타이드 서열(DNA 표적)의 존재를 검출하기 위해 DNA 또는 RNA 샘플에 사용된 가변 길이(보통 100-1000개의 염기 길이)의 DNA 또는 RNA의 단편인 혼성화 프로브를 지칭하도록 의도된다. 프로브는 이로써 염기 서열이 프로브와 표적 사이의 상보성으로 인해 프로브-표적 염기 페어링을 허용하는 단일 가닥 핵산(DNA 또는 RNA)에 혼성화한다.
일 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 방법 및 예를 들어, 여기에 사용된 칩은 하나 이상의 하우스키핑 유전자를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 하우스키핑 유전자는 질환 또는 감염을 확인하기 위한 프로필과 직접 관련되지 않지만, 통계 목적 및/또는 품질 제어 목적에 유용한 유전자를 지칭하도록 의도되고, 예를 들어, 이들은 데이터의 정규화를 도울 수 있고, 특히 하우스키핑 유전자는 구성적 유전자, 즉 비교적 일정한 수준에서 전사되는 것이다. 하우스키핑 유전자의 산물은 전형적으로 세포의 유지에 필요하다.
하우스키핑 유전자의 예는 액틴, GAPDH, 유비퀴틴, 18s rRNA, RPII (POLR2A), TBP, PPIA, GUSB, HSPCB, YWHAZ, SDHA, RPS13, HPRT1 및 B4GALT6을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
일 실시형태에서, 본원에 사용된 바와 같은 최소 질환 특이적 전사체 세트는 최소 수의 유전자가 표적 질환 상태를 강력하게 확인할 필요가 있다는 것을 의미한다.
최소 구별 유전자 세트는 최소 질환 특이적 전사체 세트 또는 최소 유전자 서명과 상호 교환가능하다.
본원에 사용된 바와 같은 정규화는 하우스키핑 유전자의 형광의 수준과 같은 대조군 데이터에 대한 데이터의 비교에 의한 배경 노이즈의 통계적인 설명을 지칭하도록 의도되고, 예를 들어, 형광 스캐닝된 데이터는 개별 칩 사이의 비교를 허용하도록 RMA를 사용하여 정규화될 수 있다. Irizarry 등의 2003 문헌은 이 방법을 기재한다.
본원에 사용된 바와 같은 계수화는 진단학적 서명에 대한 이의 기여가 증가하도록 낮은 수준에서 발현되거나 높은 배수 변화, 그러나 훨씬 비교적 낮은 형광을 갖는 특이적 유전자의 부스팅 기여를 지칭한다.
배수 변화는 대개 유전자의 발현 수준의 변화를 측정하기 위한 마이크로어레이 및 RNA-Seq 실험에서의 유전자 발현 데이터의 분석에 사용되고, 단순히 최종 값 대 초기 값의 비율로 계산되고, 즉 초기 값이 A이고 최종 값이 B이면, 배수 변화는 B/A이다. Tusher 등의 2001 문헌.
Arrayminer와 같은 프로그램에서, 유전자 발현의 배수 변화가 계산될 수 있다. 배수 변화에 부여된 통계 값이 계산되고, 발현의 수준이 상이한 그룹에서 대상체 사이에 덜 가변적인 경우 및 예를 들어, 그룹 사이의 차이가 더 큰 경우 유전자에서 더 유의미하다.
대상체로부터의 적합한 샘플을 수득하는 단계는 혈액 샘플의 수취를 수반하는 일상적인 기법이다. 이 과정은 공여자에게 적은 위험을 제시하고, 의사에 의해 수행될 필요가 없고, 적절히 훈련된 보조원에 의해 수행될 수 있다. 일 실시형태에서, 대상체에서 유래된 샘플은 대략 2.5 ml의 혈액이지만, 더 적은 부피, 예를 들어, 0.5 내지 1 ml가 사용될 수 있다.
혈액 또는 다른 조직 유체는 예컨대 Pax 유전자 관 또는 Tempus 관에 포함된 RNA 안정화 완충액에 바로 배치된다.
저장이 필요하면, 이것은 보통 -80℃에서의 수집 3시간 내에 동결되어야 한다.
일 실시형태에서, 유전자 발현 데이터는 샘플에서의 RNA 수준으로부터 생성된다.
마이크로어레이 분석을 위해, 혈액은 적합한 산물, 예컨대 PAX 유전자 혈액 RNA 추출 키트(Qiagen)를 사용하여 가공될 수 있다.
총 RNA는 Tripure 방법 - Tripure 추출(Roche 카탈로그 1 667 165호)을 이용하여 또한 정제될 수 있다. 제조사의 프로토콜이 따라갈 수 있다. 이 정제는 이후 DNAse 치료(Qiagen 카탈로그 74106호)에 의해 RNeasy Mini 키트 - 클린업 프로토콜의 사용이 따라갈 수 있다.
RNA의 정량화는 260 nm에서의 광학 밀도 및 Quant-IT RiboGreen RNA 검정 키트(Invitrogen - Molecular 프로브 Rl 1490)를 사용하여 완료될 수 있다. 28s 및 18s 리보솜 RNA 피크의 품질은 Agilent 바이오분석기를 사용하여 평가될 수 있다.
다른 실시형태에서, 상기 방법은 RNA를 증폭시키는 단계를 추가로 포함한다. 증폭은 적합한 키트, 예를 들어, TotalPrep RNA Amplification 키트(Applied Biosystems)를 사용하여 수행될 수 있다.
일 실시형태에서, 증폭 방법은 마이크로어레이 분석을 위해 RNA의 표지와 함께 사용될 수 있다. Nugen 3' 오베이션 비오틴 키트(카탈로그: 2300-12, 2300-60).
대상체 샘플에서 유래된 RNA는 이후 관련 프로브에 혼성화되고, 예를 들어, 이것은 칩에 배치될 수 있다. 혼성화 및 세척 후, 적절한 경우, 적절한 기기에 의한 분석이 수행된다.
대상체가 본 개시내용에 따른 질환 또는 감염을 나타내는 유전자 서명을 제시하는지를 확인하기 위해 분석을 수행 시, 하기 단계가 수행된다: 샘플로부터 mRNA를 수득하는 단계 및 핵산 표적을 제조하는 단계, 어레이에 상응하는 프로브를 결합시키도록 전형적으로 마이크로어레이의 제조에 의해 제시된 것처럼 적절한 조건(적합하게 엄격한 혼성화 조건, 예컨대 3X SSC, 0.1% SDS, 50<0>C에서) 하에 어레이에 혼성화하는 단계 및 필요한 경우 비결합된 핵산 표적을 제거하도록 세척하고 결과를 분석하는 단계.
일 실시형태에서, 분석으로부터의 판독은 형광이다.
일 실시형태에서, 분석으로부터의 판독은 비색이다.
일 실시형태에서, 물리적 검출 방법, 예컨대 전기 임피던스의 변화, 나노와이어 기술 또는 마이크로유체학을 이용할 수 있다.
일 실시형태에서, 대상체 샘플로부터 RNA를 정량화하는 단계를 추가로 포함하는 방법이 제공된다.
품질 제어 단계가 원해지면, Genome Studio 소프트웨어와 같은 소프트웨어가 이용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 수치 값은 유전자 발현의 분석 또는 판독, 예를 들어, 형광 또는 비색 분석으로부터 각각의 관련 유전자에 대해 얻은 수를 지칭하도록 의도된다. 초기 분석으로부터 얻은 수치 값은 조작되고 보정될 수 있고, 처리의 결과가 여전히 숫자이면 이것은 계속해서 수치 값일 것이다.
변환에 의해 양 부호의 음 부호로의 간단한 전환 또는 그 반대에 의해 음수 값을 양의 값으로 만들기 위한 음수 값의 처리 또는 양수 값을 음의 값으로 만들기 위한 양수 값의 처리를 의미한다.
대상체 유래된 샘플의 분석은 분석되는 유전자에 수치 값의 범위를 제공할 것이고, 이들 중 일부는 양수이고(+가 선행하고, 수학 용어에서 0 초과로 여겨짐), 이들 중 일부가 음수이다(-가 선행하고, 엄격한 수학 용어에서 0 미만으로 여겨짐). 유전자 발현 분석의 맥락에서 양성 및 음성은 상향조절된 유전자 및 하향조절된 유전자를 나타내기 위한 편리한 기전이다.
본 개시내용의 방법에서, 음수에 의해 하향조절되거나 표시되는 유전자의 모든 수치 값 중 어느 하나는 상응하는 양수(즉, 단순히 부호를 변화시켜)로 변환되고, 예를 들어, -1은 1로 변환될 것이거나, 상향조절된 유전자에 대한 모든 양의 수치 값은 상응하는 음수로 변환된다.
본 발명자들은 유전자 발현에 대한 수치 값이 양 또는 대안적으로 모두 음이 되게 하는 이 단계가 질환 또는 감염의 존재 또는 이의 부재를 나타내는 단일 값을 얻기 위해 값의 합계를 허용한다는 것을 확립하였다.
이는 유전자 발현 데이터의 처리의 거대한 단순화이고, 앞으로의 실질적 단계를 나타내어 상기 방법이 클리닉에서의 일상적인 사용에 적합하게 한다.
분별력에 의해 KD 샘플과 박테리아 감염된, 바이러스 감염된 샘플/대상체 사이 및/또는 염증성 질환, 예컨대 SLE, JIA 및 HSP 사이를 구별하는 능력을 의미한다.
본 개시내용에 따른 방법의 분별력은 유전자들이 낮은 또는 더 낮은 절대 수준에서 표시되더라도 예를 들어, 서명에서 더 중요한 유전자에 더 높은 가중을 두어 증가될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 원시 수치 값은 예를 들어, 절대 형광에 대해 또는 하우스키핑 유전자 또는 유전자들에 비해 유전자 칩으로부터의 비처리된 형광 값을 지칭하도록 의도된다.
본원에 사용된 바와 같은 합계는 수치 값을 더하는 행동 또는 과정을 지칭하도록 의도된다.
본원에 사용된 바와 같은 복합 발현 점수는 분석에 의해 관련 유전자에 대해 생성된 모든 개별 수치 값의 합(총액 수), 예를 들어, 모든 관련 상향조절된 유전자 및 하향조절된 유전자에 대한 형광 데이터의 합을 의미한다. 점수는 정규화되고/되거나 계수화되고/되거나 가중될 수 있거나 그렇지 않을 수 있다.
일 실시형태에서, 복합 발현 점수가 정규화된다.
일 실시형태에서, 복합 발현 점수가 계수화된다.
일 실시형태에서, 복합 발현 점수가 가중된다.
본원에 사용된 바와 같은 가중된 또는 통계적으로 가중된은 서명에 대한 이의 기여를 보다 적절히 반영하도록 조정되는 관련 값을 지칭하도록 의도된다.
일 실시형태에서, 상기 방법은 본원에서의 실시예에 사용된 바와 같은 단순화된 위험 점수를 사용한다.
단순화된 위험 점수는 또한 질환 위험 점수(DRS: disease risk score)로 공지되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은 대조군은 예를 들어, 대상체 샘플을 비교하도록 사용된 양성(대조군) 샘플 및/또는 음성(대조군) 샘플, 및/또는 대상체 샘플이 기준에 의해 질환/감염에 대해 양성 또는 음성으로 지정되게 하도록 정의된 수치 값 또는 수치 범위를 지칭하도록 의도된다.
본원에 사용된 바와 같은 양성 대조군 샘플은 분석이 수행되는 것과 관련하여 병원균 또는 질환, 예컨대 박테리아 감염에 양성인 것으로 공지된 샘플이다.
본원에 사용된 바와 같은 음성 대조군 샘플은 분석이 수행되는 것과 관련하여 병원균 또는 질환에 음성인 것으로 공지된 샘플을 지칭하도록 의도된다.
일 실시형태에서, 대조군은 샘플, 예를 들어, 양성 대조군 샘플 또는 음성 대조군 샘플, 예컨대 음성 대조군 샘플이다.
일 실시형태에서, 대조군은 수치 값, 예컨대 수치 범위, 예를 들어, 대조군으로부터 질환 사례의 정확한 차이에 대한 컷오프를 한정하는 적절한 샘플 크기로부터 얻어진 통계적으로 결정된 범위이다.
단독 숫자 질환 점수로의 다중 유전자 전사체 질환 서명의 변환
질환의 RNA 발현 서명이 가변 선택에 의해 확인되면, 전사체는 비교자 그룹에 대해 이의 상향조절 또는 하향조절에 기초하여 분리된다. 전사체의 2개의 그룹은 별개로 선택되고 수집된다.
상향조절된 및 하향조절된 RNA 전사체의 요약
임의의 개별 환자에 대한 단일 질환 위험 점수를 확인하기 위해, 질환과 연관된 모든 상향조절된 RNA 전사체의 원시 강도, 예를 들어, 형광 강도(절대 또는 하우스키핑 표준품에 대해)가 합계된다. 유사하게 각각의 개체에 대한 모든 하향조절된 전사체의 합계는 비변경된 하우스키핑 유전자 표준품에 비해 각각의 전사체에 대해 원시 값(예를 들어, 형광)을 조합하여 달성된다. 전사체가 다양한 발현 수준을 갖고 각각 이의 배수 변화가 또한 변하므로, 원시 발현 값의 합계 대신에, 이들은 0,1 사이에 계수화되고 정규화될 수 있다. 대안적으로, 이들은 더 높은 효과를 전달하도록 중요한 유전자를 허용하도록 가중될 수 있다. 이후, 모든 샘플에 대해 서명의 전사체의 발현 값은 상향조절된 전사체 및 하향조절된 전사체에 대해 별개로 합산된다.
상향조절된 유전자 및 하향조절된 유전자의 합계된 형광을 도입한 총 질환 점수는 단일 숫자 복합 발현 점수를 주도록 상향조절된 전사체의 합계된 점수에 (양수로의 변환 후) 하향조절된 전사체의 합계된 점수를 합하여 계산된다. 이 점수는 사례 및 대조군을 최대로 구별하고, 이 차이에 대한 상향조절된 전사체 및 하향조절된 전사체의 기여를 반영한다.
사례 및 대조군에서의 질환 위험 점수의 비교
환자 및 비교자 그룹에 대한 복합 발현 점수는 통계 컷오프가 대조군으로부터의 사례의 정확한 차이에 대해 정의되는 그룹의 평균 및 분산을 유도하도록 비교될 수 있다. 질환 대상체 및 비교자 집단을 이용하여, 질환 위험 점수에 대한 민감도 및 특이성은 예를 들어, 서포트 벡터 머신(Support Vector Machine) 및 내부 엘라스틱 네트 분류(internal elastic net classification)를 이용하여 계산될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 질환 위험 점수는 환자가 이의 복합 발현 점수를 비교자 그룹의 복합 발현 점수와 비교할 때 박테리아 감염을 가질 가능성의 표시자이다.
질환 중증도 또는 질환 위험 예측을 위한 샘플 임상 시험으로의 질환 위험 점수의 개발
질환 또는 질환 과정의 복잡한 RNA 발현 서명이 질환 위험을 예측하는 단일 점수로 변환되는 상기 개략된 접근법은 질환 진단 또는 위험 예측을 위해 단순하고 저렴하고 임상적으로 이용 가능한 시험을 개발하도록 사용될 수 있다.
절차는 하기와 같다: 사례와 대조군 사이에(또는 중증도와 같은 사례의 상이한 카테고리 사이에) 차등적인 유전자 발현에 기초한 시험에 대해, 관련된 것으로 확인된 상향조절된 전사체 및 하향조절된 전사체는 적합한 고체 표면, 예컨대 마이크로어레이 슬라이드, 비드, 관 또는 웰로 인쇄될 수 있다.
상향조절된 전사체는 별개의 웰 또는 별개의 관에서 하향조절된 전사체로부터 별개로 동시배치할 수 있다. 변하지 않은 하우스키핑 유전자의 패널은 또한 결과의 정규화를 위해 별개로 인쇄될 수 있다.
표준품 회수 및 정량화 방법(증폭과 함께 또는 증폭 없이)을 이용하여 개별 환자로부터 회수된 RNA는 상향조절된 전사체 및 하향조절된 전사체 및 비변경된 하우스키핑 전사체의 풀로 혼성화된다.
대조군 RNA는 상향조절된 전사체 또는 하향조절된 전사체의 동일한 풀에 동시에 혼성화된다.
대상체 샘플 및 선택적으로 대조군 샘플에 대한 형광과 같은 총 값은 이후 상향조절된 전사체 및 하향조절된 전사체 및 환자 및 대조군에 대한 복합 발현 점수를 주도록 조합된 결과에 대해 판독되고, 이 결과는 이후 적합한 수의 건강한 대조군 또는 비교자 대상체의 기준 범위와 비교된다.
대상체 샘플에서의 RNA 종의 상대 풍부도를 위해 검출된 신호의 보정
상기 상세내용은 많은 전사체의 복잡한 서명이 어떻게 환자와 다른 표현형 사이를 최대로 구별할 수 있는 최소 세트로 감소될 수 있는지를 설명한다. 예를 들어, 상향조절된 전사체 세트 내에, 다른 것보다 몇배 더 낮은 총 발현 수준을 갖는 일부 전사체가 있을 것이다. 그러나, 이 전사체는 이의 전체 낮은 발현 수준에도 불구하고 고도로 구별적일 수 있다. 엘라스틱 네트 계수로부터 유래된 가중은 다수의 상이한 방식으로 시험에 포함될 수 있다. 처음에, 검정에 포함된 개별 전사체의 카피의 수가 변할 수 있다. 둘째로, 희귀한 중요한 전사체로부터의 신호가 더 높은 수준에서 발현되는 전사체로부터의 것에 의해 덮이지 않도록 보장하기 위해, 다수의 프로브의 기여가 최대화되도록 하나의 옵션은 너무 강하게 발현되지도 너무 약하게 발현되지도 않는 시험에 대한 프로브를 선택하는 것일 것이다. 대안적으로, 계수 인자에 의해 저풍부도(low-abundance) 전사체로부터 신호를 조정할 수 있다.
각각의 신호가 별개로 측정되면서 이것이 현재의 전사체학 기술을 이용하여 분석 단계에서 수행될 수 있지만, 단순한 비색 시험에서 오직 총 색상 변화가 측정될 것이고, 따라서 선택된 전사체로부터 신호를 계수화할 수 없을 것이다. 이 문제는 보통 어레이와 연관된 화학을 역전시켜 일주될 수 있다. 종래의 어레이 화학에서, 프로브는 고체 표면에 커플링되고, 결합하는 비오틴 표지된 환자 유래된 표적의 양이 측정된다. 대신에, 본 발명자들은 환자로부터 유래된 비오틴 표지된 cRNA의 아비딘 코팅된 표면에 대한 커플링, 및 이후 어댑터 시스템을 통해 색소생산성 효소에 커플링된 DNA 프로브의 첨가를 제시한다. 설계 및 제조 단계에서, 저풍부도 그러나 중요한 전사체에 대한 프로브는 색소생산성 효소의 더 큰 수 또는 보다 강력한 형태와 커플링되어서, 이들 전사체에 대한 신호가 최종 단일 채널 비색 판독 내에 '확대'되게 한다. 각각의 프로브가 가변 선택 방법의 가중에 의해 제시된 이의 분별력을 고려할 수 있는 최종 판독에 대한 적절히 가중된 기여를 만들도록, 이 접근법은 키트의 상향조절된 채널, 하향조절된 채널 및 하우스키핑 채널에서 각각의 프로브로부터의 입력에 비해 정규화하도록 사용될 것이다.
다수의 상향조절된 유전자 또는 하향조절된 유전자를 측정하기 위한 검출 시스템은 상향조절된 전사체 및 하향조절된 전사체에 대한 별개의 풀링된 값의 합계, 또는 물리적 검출 방법, 예컨대 전기 임피던스의 변화에 의해 진단학적 서명을 포함하는 전사체를 검출하기 위해 rTPCR을 사용하도록 또한 적응될 수 있다. 이 접근법에서, 당해 전사체는 나노와이어 표면에서 또는 마이크로유체 카트리지 내에 인쇄되고, 각각의 전사체에 대한 상응하는 리간드의 결합은 임피던스의 변화 또는 다른 물리적 검출 시스템에 의해 검출된다.
일 실시형태에서, 유전자 칩은 형광 유전자 칩이고, 다시 말해서 판독은 형광이다.
본원에 사용된 바와 같은 형광은 흡수된 광 또는 다른 전자기 방사선을 갖는 물질에 의한 광의 방출을 지칭한다.
따라서, 대안적인 실시형태에서, 유전자 칩은 비색 유전자 칩이고, 예를 들어, 비색 유전자 칩은 마이크로어레이 기술을 사용하고, 여기서 아비딘은 형광 마커를 DNA에 부착하기 위해 현재 사용된 비오틴 프로브에 효소, 예컨대 과산화효소 또는 다른 색소생산성 기질을 부착하도록 사용된다. 본 개시내용은 비색 분석에 의한 판독되도록 적응되고 바이러스 감염 또는 염증성 질환을 갖는 대상체로부터 박테리아 감염을 갖는 대상체를 구별하기 위해 적응된 마이크로어레이 칩으로 확장된다. 본 개시내용은 또한 바이러스 감염 또는 염증성 질환을 갖는 대상체로부터 박테리아 감염을 갖는 대상체를 구별하기 위해 대상체 샘플을 분석하기 위해 비색 칩의 사용으로 확장된다.
본원에 사용된 바와 같은 비색은 출력이 인간 가시적 스펙트럼에 있는 검정을 지칭한다.
대안적인 실시형태에서, 바이러스 감염 또는 염증성 질환을 갖는 대상체로부터 박테리아 감염을 갖는 대상체를 구별하기 위한 유전자 세트 또는 프로브 세트는 나노와이어 기술, 전기 임피던스의 변화 또는 마이크로유체학을 포함하는 물리적 검출 방법에 의해 검출될 수 있다.
검정에 대한 판독은 최소 설비로 판독될 수 있는 임피던스의 변화와 같은 물리적 검출 방법을 이용하여 현재의 마이크로어레이 기술에 사용된 바와 같은 형광 판독으로부터 단순한 비색 형식으로 전환될 수 있다. 예를 들어, 이는 형광 마커를 DNA에 부착시키기 위해 현재 사용된 비오틴을 이용하여 달성된다. 비오틴은 퍼옥시다제와 같은 효소 또는 다른 색소생산성 기질에 부착하기 위해 사용될 수 있는 아비딘에 대한 높은 친화도를 갖는다. 이 공정은 표적 전사체에 결합하는 cRNA의 분량이 형광보다는 색소생산성 공정을 사용하여 정량화되게 할 것이다. 질환 상태의 예/아니오 표시를 제공하는 단순화된 검정은 이후 전사체의 상향조절된 풀 및 하향조절된 풀의 색상 강도와 대조군 색상 표준품의 비교에 의해 개발될 수 있다. 유사한 접근법은 물리적 방법, 예컨대 전기 임피던스의 변화를 이용하여 다수의 유전자 서명의 검출이 가능하게 할 수 있다.
본 발명의 이 양태는 아마도 원격 또는 자원이 부족한 환경에서 또는 "환자 근처" 시험에서 신속한 진단을 위해 사용하기에 특히 유리할 것이다. 예를 들어, 칩을 판독하는 데 필요한 설비가 아마 단순할 것이므로 아프리카에 위치한다.
본원에 사용된 바와 같은 멀티플렉스 검정은 검정의 사이클당 단일 실행에서 여러 분석물질(대개 십여 개 이상)을 동시에 측정하는 검정의 유형을 지칭한다. 이것은 한번에 하나의 분석물질을 측정하는 절차로부터 구별된다.
일 실시형태에서, 특히 본원에 기재된 바와 같은 방법에서 사용하기 위한 맞춤 유전자 칩이 제공된다.
일 실시형태에서, 특히 본원에 기재된 하나 이상의 유전자 서명을 확인하기 위해 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 공지된 유전자 칩의 용도가 제공된다.
일 양태에서, 본원에 기재된 방법을 이용하고, 상기 방법이 대상체가 KD를 갖는다는 것을 나타내면 대상체에게 치료를 투여하여, 대상체, 예컨대 KD를 갖는 것으로 의심되는 대상체, 예를 들어, KD를 갖는 증상을 나타내는 대상체에게 KD에 대한 치료를 투여할지를 결정하는 방법이 제공된다. KD에 적합한 치료의 예는 감마 글로불린(IVIg), 아스피린, 또는 다른 소염제, 예컨대 스테로이드 및 인플릭시맙 및 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
유전자 서명, 유전자 전사체 서명, 유전자 세트, 질환 서명, 진단학적 서명 및 유전자 프로필은 도처에 상호 교환적으로 사용되고, 유전자 서명을 의미하는 것으로 해석되어야 한다.
본 명세서의 맥락에서, "포함하는"은 "함유하는"으로서 해석되어야 한다.
소정의 요소를 포함하는 본 발명의 양태는 또한 대안적인 실시형태를 "이루어진" 또는 "본질적으로 이루어진"으로 확장하는 것으로 의도된다.
기술적으로 적절한 경우에, 본 발명의 실시형태가 조합될 수 있다.
실시형태는 소정의 특징/요소를 포함하는 것으로 본원에 설명된다. 또한, 본 개시내용은 상기 특징/요소로 이루어지거나 본질적으로 이루어지는 별도의 실시양태로 확장된다.
특허 및 출원과 같은 기술적 참고문헌은 본원에 인용되어 포함된다.
본원에 구체적이고 명확하게 인용되는 임의의 실시형태는 단독으로 또는 하나 이상의 추가적인 실시형태와 조합하여 권리포기의 기초를 형성할 수 있다.
[도면의 간단한 설명]
도 1은 진단 그룹에 환자를 배정하기 위한 진단 알고리즘을 보여준다. KD = 가와사키병; AHA = 미국 심장 협회; CAA = 관상 동맥 동맥류; JIA = 청소년 특발성 관절염; HSP = 헤노흐 쉔라인 자반증; CRP= C-반응성 단백질.
도 2는 샘플 취급, 시험 데이터세트 및 훈련 데이터세트의 도출, 데이터 처리 및 분석 파이프라인을 보여주는 전체 연구 파이프라인을 보여준다.
a 방법(실시예 1) 참조; b 건강한 대조군은 모델 빌딩에 사용되었지만, 모델 정확성의 예상치로부터 배제되었다; c 72명의 환자에서 평가된 진단학적 수행(병의 2-7일). 약어: KD = 가와사키병; DB = 확정 박테리아; DV = 확정 바이러스; U = 미상의 박테리아 또는 바이러스 병인의 감염; JIA = 청소년 특발성 관절염; HSP = 헤노흐 쉔라인 자반증; HC = 건강한 대조군; PDMS = 병행 결정론적 모델 조사; SDE = 유의미하게 차등적으로 발현된; FC = 배수 변화.
도 3은 발견 시험 및 검증 세트에서 13-전사체 서명의 수행을 보여준다. 질환 위험 점수(DRS) 값을 사용하여 가와사키병(KD)을 갖는 환자 및 다른 질환을 갖는 환자를 포함하는 발견 시험 세트에서의 13-전사체 서명의 분류(A) 및 수신자 조작 특징(ROC) 곡선(B). 상이한 진단학적 확실성의 3개의 KD 임상 하위그룹 및 다른 질환을 갖는 환자를 포함하는 검증 세트에서의 13-전사체 서명의 분류(C) 및 ROC 곡선(D). 박스 도표에서, 수평 선은 중앙치를 나타내고; 하부 에지 및 상부 에지는 사분 범위를 나타내고; 휘스커는 범위, 또는 1.5x 사분 범위(어떤 것이 더 적든)를 나타낸다. 그래프에 걸친 수평 선은 발견 훈련 그룹에서 민감도 및 특이성을 최대화하는 ROC 곡선에서의 점에 의해 결정된 바대로 KD(선 위)로 또는 비-KD(아래)로 예측된 환자를 분리하는 DRS 한계점을 나타낸다. KD = 가와사키병; DB = 확정 박테리아; DV = 확정 바이러스; U = 미상의 박테리아 또는 바이러스 병인의 감염; JIA = 청소년 특발성 관절염; HSP = 헤노흐 쉔라인 자반증; KD = def 확정 KD; KD-HP = 고도로 개연성이 있는 KD; KD-P = 가능한 KD.
도 4는 검증 세트에서 샘플 수집에서 병 일자에 의한 13-전사체 서명의 수행을 보여준다. X 선은 병의 제1 일과 관련하여 샘플의 수집 일을 보여준다(즉, 발열의 개시). 검정 점 = 확정 KD, 회색 점 = 고도로 개연성이 있는 KD, 화살표를 갖는 검정 점 = 검증 세트에서의 가능한 KD 임상 하위그룹.
도 5는 배경 조정 및 정규화 후 발견 코호트에서 PC1 및 PC2의 주성분 분석(PCA) 도표를 보여준다. KD 환자로부터의 샘플은 후속하는 분석으로부터 제거되었다(화살표). 각각의 점은 어레이로부터의 데이터이다. KD = 가와사키병, DB = 확정 박테리아, DV = 확정 바이러스, HC = 건강한 대조군, U = 미상의 박테리아 또는 바이러스 병인의 감염, JIA = 청소년 특발성 관절염, HSP = 헤노흐 쉔라인 자반증.
도 6은 (A) 검증 코호트의 미처리 병합 및 (B) ComBat를 사용한 병합의 PCA 도표를 보여준다. 각각의 점은 어레이로부터의 데이터를 나타낸다; KD-급성 = 급성 가와사키병, KD-conv = 회복 가와사키병, DB = 확정 박테리아, DV = 확정 바이러스, U = 미상의 박테리아 또는 바이러스 병인의 감염, HC 건강한 대조군. 패널 (B)는 발열의 제7일 후 샘플을 갖는 30 KD 환자로부터의 데이터를 포함하고, 이들은 진단학적 수행 계산에 포함되지 않았다.
도 7은 13-전사체 서명으로부터 유래된 유전자 네트워크를 보여준다. 네트워크는 Ingenuity Pathways Analysis을 이용하여 생성되었다. 13개의 전사체 중 12개는 데이터베이스로 맵핑되었다. 7개의 포커스 분자를 함유하는 이 네트워크는 분석에서 상부 네트워크였다. 각각의 분자는 KD에서 발현의 방향에 따라 색상표시된다. 깨지지 않은 선은 직접적인 상호작용을 나타내고, 파선은 간접적인 상호작용을 나타낸다. 네트워크의 범례는 http://ingenuity.force.com/ipa/articles/Feature_Description/Legend에 위치한다.
실시예 1 - 13개의 전사체 유전자 서명의 확인
환자 연구 그룹
KD에 대한 차등적 진단은 다수의 감염성 병태 및 염증성 병태를 포함하고, 본 발명자들은 따라서 KD를 갖는 아동의 사례-대조군 발견 연구 그룹 및 KD와 중첩하는 임상 징후를 갖는 다른 감염성 질환 및 염증성 질환의 범위를 확립하였다. 환자가 열성 병을 갖고, Immunopathology of Respiratory, Inflammatory and Infectious Disease Study[20], 스페인 GENDRES 연구, USA 기반 Kawasaki Disease Research Center Program 또는 네덜란드 가와사키 연구의 일부로서 임상 중재에 대한 혈액 시험을 요하면, 환자는 영국, 네덜란드, 스페인 및 미국에서 소아 센터에 장래에 동원되었다.
KD로 동원된 아동은 직접 연구 센터 응급실에 있는 환자와 리저널 센터(regional centre)에 있는 환자의 조합을 나타냈다. 그러나, 본 발명자들의 연구는 KD의 치료를 위한 IVIG의 개시 전에 및 처음 병의 7일에 혈액 샘플링이 취해지는 환자만을 포함하였다. 열성 대조군은 진단 시험이 극도로 관련된 진정한 집단을 나타낸 지역사회에서의 의사에 의해 가능한 KD의 평가에 있는 환자를 포함하여 가능한 한 제시에 가까운 샘플을 얻기 위해 임상 진단이 확인되기 전에 일찍 수집된 혈액 샘플로 동원되었다.
모든 조사의 결과가 이용 가능하면(보충 부록 및 도 1), 열성 대조군은 사전 정의된 기준을 이용하여 진단 그룹으로 배정되었다. 면역억제 치료 또는 골수 이식과 같은 유전자 발현에 영향을 미칠 것 같은 동반이환을 갖는 아동이 배제되었다. 본 발명자들은 헤노흐 쉔라인 자반증(HSP) 및 청소년 특발성 관절염(JIA)의 염증성 병을 제시하는 아동의 비교자 그룹을 포함하였다.
검증 연구 그룹에서의 환자는 이전에 [21, 22] 기재된 것처럼 병원에 있고 혈액 시험을 요하는 열성 아동의 바이오마커 연구의 일부로서 유사하게 동원되었다. 열성 병의 발생의 10일 내에 병원에 있는 환자가 동원되고, 유전자 발현 분석을 위한 혈액 샘플은 아동의 병의 원인을 평가하기 위해 일상적인 진단학적 연구와 동일한 시간에 수집되었다. 발열 또는 면역화의 최근(2주) 병력을 갖지 않는 건강한 대조군 아동은 발견 연구 및 검증 연구의 일부로서 KD 및 열성 대조군 환자와 함께 동원되었다. 건강한 대조군으로부터의 데이터는 상이한 마이크로어레이 실험에서 얻은 데이터를 표준화하도록 사용되었지만, 서명의 수행을 평가하도록 사용되지 않았다.
KD 사례 정의
KD는 미국 심장 협회(AHA) 기준에 기초하여 진단되었다[14]. KD로 진단된 환자는 제시 바로 후에 및 발생 후 2주 및 6주에 2D 심장초음파를 겪었다. 좌전 하관상동맥 또는 우관상동맥에 대한 병 동안 임의의 시점에 최대 관상 동맥 Z 점수(Zmax)(체표면적에 정규화된 평균 내부 직경으로부터의 표준 편차 단위)가 2·5 이상이면, 또는 이들이 AHA 가이드라인에서 불완전 KD에 대한 알고리즘을 만족하면 전통적인 기준의 4개보다 적은 것을 갖는 환자는 불완전 KD로 포함되었다. 환자는 정상(Zmax < 2·5) 또는 확대된 관상 동맥(Zmax ≥ 2·5 < 5·0) 또는 CAA(Zmax ≥ 5·0)를 갖는 것으로 분류되었다. 정확한 관상 동맥 치수에서의 조작자간 변동 때문에, 본 발명자들은 분류오류를 감소시키기 위해 동맥류를 갖는 환자를 정의하기 위해 높은(Zmax ≥ 5.0) 역치를 설정하였다.
진단학적 확실성에 의한 KD의 추가의 분류
KD의 진단에 대한 "금본" 표준이 없으므로, 일부 환자는 KD에 대한 기준을 충족하지 않을 수 있지만, 스타필로코커스 또는 스트렙토코커스 감염, 바이러스 감염 또는 염증성 질환과 같은 다른 병태를 갖는다. 따라서, 본 발명자들은 임상 진단의 확실성에 기초하여 검증 연구 그룹에서 KD 환자를 추가로 분류하였다. 모든 임상 기록, 실험실 결과, 심초음파검사 보고, 치료에 대한 반응 및 추적관찰 임상 노트는 KD에 대한 독립 소아 감염성 질환 전문가 및 전문의에 의해 검토되었다(저자 MPG - 분석에 맹검). CAA로 이어지는 아동에서 다른 자가 해결 염증성 병이 없으므로, 발생 후 6주 지속하는 보고된 CAA(Zmax ≥ 5·0)를 갖는 환자는 확정 KD를 갖는 것으로 여겨졌다. 남은 환자(이들은 모두 의심되는 KD에 대한 임상 팀에 의해 IVIG로 치료되었음)는 전문의 검토자에 의해 고도로 개연성 있는, 가능한 또는 가능하지 않는 것 같은 KD로 분류되었다. 이 검토는 "가능하지 않는 것 같은 KD" 사례를 확인하지 못했다.
감염 또는 다른 염증성 증후군을 갖는 열성 대조군 아동
열성 병을 제시한 아동은 도 1에 도시되고 보충 부록에 기재된 기준을 이용하여 확정 박테리아 감염, 확정 바이러스 감염, 의심된 박테리아 또는 바이러스 감염, HSP 또는 JIA를 갖는 것으로 배정되었다.
윤리적 허가 및 동의
환자는 UCSD(Human Research Protection Program #140220), 스페인(Ethical Committee of Clinical Investigation of Galicia, CEIC ref 2010/015), 암스테르담(NL41023.018.12 및 NL34230.018.10) 및 영국(St Mary's Hospital 09/H0712/58, 13/LO/0026)의 조사 윤리 위원회에 의해 허가 하에 동원되었다.
연구의 감독 및 수행
환자는 환자의 관리에 포함되지 않은 적어도 2의 독립 임상의에 의해 모든 결과의 평가 후 질환 그룹(도 1)으로 분류되었다(저자 JAH, JCB, JK, MPG, AMB). 모든 샘플은 익명처리되었다. 전사체학 데이터세트는 임상 배정이 마무리되고 독립 검증에 보내진 경우에만 분석되었다(보충 부록).
유전자 발현 서명의 발견 및 검증
전체 연구 설계 및 서명 발견 파이프라인은 도 2에 도시되어 있다. 전혈은 (KD 사례에 대해 IVIG 치료 전에) PAXgene 혈액 RNA 관(PreAnalytiX, Germany)으로 동원 시 수집되고, 동결되고, 추출되고, 인간 HT-12 v.4 BeadChip 어레이(Illumina)에서 분석되었다. 크게 중접하는 프로브를 갖는 이전의 Illumina BeadChip 어레이(HT-12 v.3)는 검증 연구 그룹의 하위집단에 사용되었다. 실험실 방법의 상세내용은 보충적 부록에 제공된다.
통계 분석
전사체 서명 발견
전사체학 데이터의 분석은 'R' Language and Environment for Statistical Computing (R) 3.2.2(보충 방법)으로 수행되었다. 도 2에 도시된 것처럼, 발견 연구 그룹은 80% '훈련' 세트 및 20% '시험 세트'로 무작위로 분할되었다. 서명은 훈련 세트에서 확인되고, 시험 세트에서 그리고 본 발명자들의 이전에 보고된 급성 및 회복 KD 환자[21] 및 급성 박테리아 및 바이러스 환자[22](보충 방법)를 사용하여 확립된 제2 연구 그룹(검증 연구 그룹)에서 검증되었다. 품질 제어 및 여과(보충 방법) 후, 모든 다른 질환과 비교된 KD 환자에서의 상당히 상이하게 발현된 (SDE) 전사체는 훈련 세트에서 확인되었다.
병렬의 결정론적 모델 조사(PDMS)를 사용한 작은 서명 발견
가장 적은 수의 전사체 및 구별에서의 가장 높은 정확성에 기초하여 전사체 서명을 확인하고 순위화하는 신규의 방법, PDMS는 다른 질환으로부터 KD를 최적으로 구별하는 가장 적은 수의 전사체를 포함하는 인색한 유전자 발현 서명을 확인하도록 사용되었다. 상기 방법은 처음에 모든 SDE 전사체에 기초하여 비교자 질환으로부터 KD를 구별하는 모든 가능한 1-유전자 및 2-유전자 모델을 평가하고, 추가의 유전자가 모델에 부가되고, 모든 조합이 다시 평가될 때 2-유전자 모델의 다음의 회차로의 100 베스트-피팅을 취한다. 상기 공정은 한번에 베스트 100 모델에 하나의 추가의 유전자의 증분적 부가로 지속한다. 주어진 수의 전사체(모델 크기)에 대한 최적 서명은 샘플 밖의 오류의 베이지안 추정치인 이의 Watanabe-Akaike Information Criterion에 의해 각각의 모델을 순위화한 후 선택되었다[23]. 최적 모델 크기는 교차 검증에 의해 결정되었다. 추가의 상세내용은 보충적 통계 방법에 있다.
질환 위험 점수 및 모델 정확성의 평가
본 발명자들은 진단학적 서명에 포함된 전사체에 기초하여 개별 질환 위험을 배정하는 본 발명자들의 이전에 보고된 질환 위험 점수(DRS) 방법을 적용하였다[15]. DRS는 상향조절된 전사체의 형광 강도를 조합하고, 하향조절된 전사체의 조합된 형광 강도를 공제하고[15], 복잡한 서명으로부터 시험의 개발을 수월하게 할 것이다. 건강한 대조군은 모델 빌딩에 사용되었지만, 수신자 조작자 곡선 하 면적(AUC), 민감도 및 특이성에 의해 평가된 모델 정확성의 측정치로부터 배제되었다.
보충 방법
RNA 샘플 추출 및 처리
전혈(2.5ml)을 PAXgene 혈액 RNA 관(PreAnalytiX, 독일)에 수집하고, 2시간 동안 항온처리하고, -80℃에서의 저장 전에 수집의 6시간 내에 -20℃에서 동결시켰다. RNA는 제조사의 지시에 따라 PAXgene 혈액 RNA 키트(PreAnalytiX, 독일)를 사용하여 추출되었다. 총 RNA의 무결성 및 수율은 Agilent 2100 바이오분석기 및 NanoDrop 1000 분광기를 사용하여 평가되었다. 발견 코호트에 사용된 샘플은 미국(UCSD), 스페인, 네덜란드 및 UK에서 나왔다. 모든 샘플은 미국으로부터의 샘플을 제외하고 영국에서 추출되었다. 정량화 및 품질 제어 후, 비오틴 표지된 cRNA는 500 ng의 RNA로부터 Illumina TotalPrep RNA 증폭 키트(Applied Biosystems)를 사용하여 제조되었다. 표지된 cRNA를 인간 HT-12 v.4 Expression BeadChip 어레이(Illumina)로 밤새 혼성화하였다. 세척, 차단 및 염색 후, 어레이는 제조사의 지시에 따라 Illumina BeadArray Reader를 사용하여 스캐닝되었다. Genome Studio 소프트웨어를 사용하여 마이크로어레이 이미지는 인공물에 검사되고, QC 매개변수가 평가되었다. 이 단계에서 어레이가 배제되지 않았다.
병원균 진단
바이러스 진단학은 면역형광(RSV, 아데노바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 인플루엔자 A+B) 및 네스팅된 PCR(RSV, 아데노바이러스, 파라인플루엔자 1-4, 인플루엔자 A+B, 보카바이러스, 메타뉴모바이러스, 리노바이러스/엔테로바이러스)을 이용하여 코인두 흡인액에서 수행되었다. 박테리아 배양물은 혈액, CSF, 뇨 및 조직 부위를 포함하였다. 뉴모코커스 항원은 혈액 및 뇨에서 측정되고, 박테리아 DNA는 수막구균성 및 폐렴구균성 PCR에 의해 검출되었다.
열성 대조군에서의 진단학적 과정
환자는 혈액수, 혈액 화학, C-반응성 단백질(CRP), 혈액 뇨 및 인두 면봉법 배양을 포함하여 임상 팀에 의해 지시된 바대로 진단학적 후처리를 갖고; 뇌척수액 분석 및 흉부단순촬영은 적절한 경우 수행되었다. 멀티플렉스 PCR은 코인두 흡인액 또는 인두 면봉법에서 흔한 호흡기 바이러스를 검출하고, 혈액에서의 흔한 바이러스를 검출하도록 사용되었다. 모든 조사의 결과가 이용 가능하면, 환자는 하기와 같이 미리 결정된 기준을 이용하여 진단학적 그룹에 배정되었다(도 1).
박테리아 감염:
박테리아 병원균 그룹에 배정된 환자는 배양에 의해 또는 소독 부위(혈액, CSF, 흉막강, 관절, 뇨)로부터 확인된 샘플에서 분자 기법에 의해 확인된 박테리아 병원균(그람 양성 코커스 또는 그람 음성 바실루스) 및 확인된 박테리아 종과 따라가는 임상 증후군을 가졌다. 이 그룹은 바이러스 동시감염을 갖거나 갖지 않는 환자를 포함하였다. 다른 박테리아 감염(예를 들어, 마이코플라스마, 페르투시스, 마이코박테리아)이 진단된 아동은 이 그룹에 포함되지 않았다. 소독 부위 샘플에서의 박테리아의 확인이 확인된 박테리아 감염에 대한 확실한 증거로 취해지면서, 염증성 마커에 대한 역치는 이 그룹에 대해 설정되지 않았다.
바이러스 감염:
바이러스 감염 그룹에서의 환자는 확인된 바이러스, 박테리아 종과 따라가는 임상 증후군, 및 박테리아 질환의 무 미생물학적 또는 임상학적 특징을 가졌다. 바이러스 그룹에서의 잠재성 박테리아 감염을 갖는 아동의 포함을 피하기 위해, 염증성 마커가 상승된 아동이 배제되었다. 최대 역치는 60mg/L의 CRP 및 12 x 109/L의 호중구 계수치로 설정되었다. 94명의 아동 중에서, 가장 흔한 병원균은 RSV(27명의 아동), 인플루엔자 A/B 및 아데노바이러스(각각 23명의 아동)였다.
미상의 박테리아 또는 바이러스 감염:
급성 열성 병 및 감염의 특징을 갖는 아동이 확신을 갖고 상기 그룹들 중 하나에 배정되지 않을 때, 이들은 '미상의 박테리아 또는 바이러스'로 표지되었다. 이 그룹에서의 아동은 박테리아 또는 바이러스 감염의 결정적이 아닌 특징, 부정적인 미생물학적 발견 또는 부재한 바이러스학적 조사, 이의 미생물학적 발견과 불일치한 증후군, 이의 병의 다른 임상 특징과 불일치한 염증성 마커 또는 다른 그룹에서의 확실한 코딩에 대해 불충분한 임상 데이터를 가졌다. 이 그룹에서의 환자는 소독 부위에서 검출된 박테리아 감염을 갖지 않았고, 일부 환자는 검출 가능한 바이러스를 가졌다.
다른 염증성 증후군:
a) 헤노흐 쉔라인 자반증(HSP)은 복부 통증, 관절통 또는 신장 비정상(혈뇨 및 단백뇨)과 연관되어 전형적으로 궁둥이 및 외부 표면에 걸쳐 촉지 자색반을 제시하는 아동에서 진단되었고; b) 청소년 특발성 관절염(JIA)은 국제 류마티스 학회(International League of Associations for Rheumatology)[37]에 따라 정의되었다. JIA를 갖는 환자는 i) 치료 미경험 및 ii) 활성-악화/무증상(smouldering)을 포함하였다.
통계 방법
마이크로어레이 예비처리 - 발견 데이터세트
배경 공제 및 강력한 스플라인 정규화(RSN)는 R 패키지 루미[38]를 사용하여 원시 발현 데이터에 적용되었다. 샘플 이상점은 주성분 분석(PCA: Principal Component Analysis)에 의해 평가되었다. 가와사키 환자로부터의 하나의 샘플은 PC 1에서 분명한 이상점이고, 분석으로부터 제거되었다(도 5).
발견 데이터세트에서의 샘플은 동일한 수의 각각의 비교자 그룹에 대해 조건부인 10의 상이한 배수로 무작위로 배정되었다(KD 가와사키병, DB 확정 박테리아, DV 확정 바이러스, U 미상의 박테리아 또는 바이러스 병인의 감염, JIA 청소년 특발성 관절염, HSP 헤노흐 쉔라인 자반증, HC 건강한 대조군). 2의 배수(20%)는 시험 세트로 보존되었고, 남은 8의 배수는 훈련 세트를 구성하였다. KD에 대한 진단 시험이 병의 과정에서 초기에 최대 값을 가지므로, 본 발명자들은 발견 코호트에서 발열의 7일 이하에 환자로부터의 샘플만을 사용하여 본 발명자들의 서명을 개발하였다.
마이크로어레이 예비처리 - 검증 데이터세트
검증 데이터세트는 2개의 유전자-발현 데이터세트를 통합하여 구성되었고: 하나는 급성 및 회복 가와사키 샘플[39]을 갖고, 하나는 박테리아 및 바이러스 감염[40]을 가졌다. 모든 회복 샘플은 40 mm/hr 미만의 ESR(적혈구 침강 속도) 수준을 갖고, 병의 발생의 10일 내에 모든 급성 샘플을 취했다. 배경 공제 및 RSN 정규화는 R 패키지 루미[38]에서 별개로 2개의 데이터세트에 적용되었다. 이 단계에서, 코호트 사이에 차이가 없었다. 이는 PC1이 배치(batch)에 의해 샘플을 명확히 구별한다는 것을 보여주는 PCA 도표로부터 명확하다(도 6a). 본 발명자들은 따라서 배치 효과를 제거하기 위해 ComBat [41] 방법을 이용하였다. 2의 이진 공변량은 샘플을 건강한, KD 및 다른 질환의 3개의 그룹으로 배정하는 ComBat로 통과하였다. 가와사키 회복 샘플은 건강한 것으로 배정되었다. ComBat 후 PCA는 유의미한 배치 효과 없이 PC2에 대해 PC1의 도표에서 배치 오버랩 둘 다로부터의 샘플을 보여준다(도 6b).
모델 추정
모델 추정 전에 프로브는 관련 질환 그룹들 사이에 log2 배수 변화 ≥1로 강력하게 발현된 전사체를 확인하도록 예비여과되었다. 이것은 훈련 데이터에서 하기 기준의 모두를 충족하는 프로브를 선택하여 실행되었다:
1. 프로브는 V3 및 V4 Illumina Beadchip 둘 다에서 측정되었다.
2. 전사체를 강력하게 발현시켰다: 각각의 프로브에 대해, 본 발명자들은 검출 역치 p-값<0.01인 각각의 비교자 그룹에서 샘플의 비율을 계산하였고, 적어도 하나의 질환 그룹에서 이 비율이 80% 초과인 프로브를 선택하였다.
3. 대부분의 가와사키 환자는 UCSD에 동원되었다. 프로브 선택이 UCSD로부터 나온 배치 효과에 의해 바이어싱되지 않는다는 것을 보장하기 위해, 본 발명자들은 개월의 연령에 조건적인 선형 모델에서 p<0.05에서의 UCSD에서 동원과의 연관을 나타낸 프로브 및 UCSD(DV, U, KD 및 HSP)로부터 동원된 비-KD 환자를 또한 포함하는 모든 질환 그룹을 배제하였다.
4. log2 배수 변화(연령에 조건적)는 가와사키와 각각의 다른 비교자 그룹 사이에 계산되었고; 본 발명자들은 이들 비교의 적어도 하나에 대해 |log2 fold change|>1을 갖는 프로브를 앞으로 취했다.
R 패키지 limma[42]에서의 함수 lmFit 및 eBayes는 상기 단계 (3) 및 (4)에서 사용된 프로브 연관 통계를 계산하기 위해 사용되었다.
병렬의 결정론적 모델 조사(PDMS)를 사용한 발견
본 발명자들은 정확한 구별로 작은 전사체 수를 균형화시키는 인색한 유전자-발현 서명을 추론하도록 인하우스 방법, PDMS를 사용하였다. 상기 방법은 유전자-발현 수준(공변량)의 선택된 하위집단에서 로지스틱 회귀 계수를 반복하여 예측한다. 회귀 계수는 계수의 축소를 0으로 유도하기 위해 정확성 매개변수 τ(여기서, τ=1/분산이고, 패널티에 동등)로 0-중심 가우스 사전 분포(zero-centred Gaussian prior distribution)가 배정되었다. 상기 방법은 가능한 많은 모델을 조사하고, "최고의" 것을 선택하고, 각각의 모델은 선택된 분산의 고유한 하위집단을 이의 각각의 로지스틱 회귀 계수와 비교한다.
최고의 이전의 확률 분포 축소 매개변수를 발견하기 위해, 본 발명자들은 발견 데이터의 다중 분할의 LASSO 교차 검증을 사용하여 각각의 모델의 정확성을 평가하였다. R 패키지 glmnet는 최소 샘플 밖의 교차 검증된 편차값으로 LASSO 패널티를 결정하도록 사용되었다. 본 발명자들은 이후 LASSO에 의해 유도된 패널티를 최적 LASSO 적합화의 최대 회귀 계수(βMax)로 가우스 사전에 의해 유도된 패널티와 동일시하여 τ를 설정하였다. λ에 의한 LASSO 패널티 매개변수의 표시:
LASSO 패널티 = 가우스 패널티
Figure pct00003
PDMS 방법은 하기와 같이 진행하였다: 그룹들 사이에 log2 배수 변화 ≥1로 강력하게 표현된 예비 여과된 프로브를 사용하여, 모든 가능한 1-전사체 및 2-전사체 모델은 이의 log 가능성(얼마나 잘 모델이 데이터에 적합화하는지의 측정치)에 기초하여 평가되고 순위화되고, 상위 100 2-전사체 모델이 채용되었다. 다음의 단계에서 알고리즘은 3-유전자 모델의 고유한 세트를 결정하였고, 이 모델은 상위 100 2-유전자 모델의 각각에 1개의 유전자를 첨가하여 구성될 수 있었다. 이 모델의 log-가능성은 계산되고, 그 과정은 하나의 유전자가 더 큰 모델을 구성하도록 상위 100 모델을 앞으로 계속 취했다.
주어진 크기(전사체의 수)의 모델에 대해, 모델은 Watanabe-Akaike Information 기준(WAIC)[43]에 의해 순위화된다. WAIC는 샘플 밖의 예상된 오류를 예측하기 위한 베이지안 정보 기준인데, 이는 이의 매개변수의 유효 수에 따라 모델을 패널티화하고, 사후 분포로부터 추론이 이루어진다고 추정한다. PDMS는 사후 평균으로부터의 추론을 만들고, 따라서 WAIC는 본 발명자들의 적용에 적절하다. WAIC가 어떻게 추정되는지의 상세내용은 Gelman 등의 문헌[44]에서 발견될 수 있다. WAIC가 매개변수의 유효 수에 대한 보정을 부가하여 과적합화에 대해 조정하지만, 이는 많은 모델에 대한 조사에 의해 유도된 위양성율의 증가를 설명하지 않는다. PDMS는 조사된 모든 모델에 걸쳐 가장 낮은 WAIC를 갖는 모델을 단순히 선택하지 않고, 대신에 하기를 최소화하는 추가의 패널티를 도입한다:
보정된 기준 = WAIC + αk
여기서, k는 모델 크기이고, 본 발명자들은 α=1을 취한다.
모델 정확성의 계산
ROC 곡선 하 면적 및 시험 데이터세트 및 검증 데이터세트에 대한 모델의 적용의 상응하는 신뢰 간격은 R 패키지 pROC[45]를 이용하여 계산되었다.
각각의 환자에 대한 결과는 13-전사체 서명에 의한 분류의 정확성 및 훈련 세트 데이터에 기초하여 Kd로서의 또는 비-KD로서의 분류를 위해 최적 역치-컷오프를 결정하기 위한 질환 위험 점수(DRS)로서 합계되고, 아이덴티티 선에 거리를 최대화하는 ROC 곡선에서의 점에 의해 Youden의 J 통계에 따라 결정되었다((민감도 + 특이성)의 최대)[46]. 동일한 역치는 검증 데이터를 위한 정확성 계산에 사용되었다.
민감도 및 특이성에 대한 신뢰 간격(CI)은 Jeffrey 방법을 이용하여 계산되었다. Jeffrey의 방법은 관심 있는 기초 비율이 비정보제공 Jeffrey의 참고 이전 -- 베타( ½, ½ )가 배정된 베이지안 관점에서 유래된다[47]. 따라서, 민감도 95% CI는 베타(p+½, q+½) 분포의 2.5% 및 97.5% 변위치로부터 유래되고, 여기서 p는 진양성의 수이고, q는 위음성의 수이다.
결과
각각의 진단학적 카테고리에서의 환자의 수는 도 2에 기재되어 있다. KD 환자의 임상학적 특징 및 인구학적 특징은 표 1에 기재되어 있고, 다른 염증성 증후군 및 감염을 갖는 환자의 특징은 표 3 내지 표 6에 기재되어 있다. 정규화된 유전자 발현 프로필의 주성분 분석은 발견 그룹(훈련 및 시험) 및 검증 그룹에서 별개로 수행되었고; 도 5 및 도 6은 이들 2의 분석의 PC2에 대한 PC1을 작도한다. 연구 그룹은 ComBat 알고리즘[24](상기 보충 통계 방법 참조)을 이용하여 KD 및 사례-대조군 데이터를 조합한 후 발견 그룹 및 검증 그룹에서 함께 클러스터링되었다.
Figure pct00004
최소 전사체 서명의 확인
(비교자 그룹의 적어도 하나에 대해 KD에서 |log2 배수 변화| >1로 정의된) KD와 모든 다른 질환 및 건강한 대조군 사이에 유의미하게 차등적으로 발현된 QC를 통과한 1600개의 전사체가 있었다. 시험으로 발달시키기에 적합한 최소 서명을 확인하기 위해, 본 발명자들은 다음에 PDMS를 이용하여 가변적인 선택을 이해하였다. 이 접근법은 DRS로서 실행될 때 하기와 같이 진단학적 성능을 갖는 13-전사체 서명(표 2)을 확인하였다: 시험 세트에서의 AUC는 각각 민감도/특이성 81.7%(95% CI, 60.0%, 94.8%), 92.1%(95% CI, 84.0%, 97.0%)로 96.2%(95% CI, 92.5%, 99.9%)였다(도 3a, 도 3b).
Figure pct00005
검증 세트에서의 서명 수행
서명이 검증 세트에서 72개의 KD 세트에 적용될 때, AUC는 90.8%(95% CI, 82.5%, 96.2%)의 민감도 및 89.1%(95% CI, 83.0%, 93.7%)의 특이성으로 96.5%(95%CI, 93.7%, 99.3%)였다. KD의 임상 특징이 다른 병태와 중첩하고, 임의의 KD 연구 그룹이 KD가 없는 환자를 포함할 것이므로, 본 발명자들은 임상 진단의 확실성이 KD DRS 예측 점수의 강도에 상응하는지를 평가하였다. 검증 세트(방법 참조)의 확정, 고도로 개연성이 있는 또는 가능한 KD 환자에서의 13-전사체 서명의 수행, 이어서 진단의 임상 확실성. 별개로 분석될 때, 확정, 고도로 개연성이 있는 또는 가능한 KD 그룹에서의 13-전사체 PDMS 서명의 수행은 각각 98.1%(95% CI, 94.5%, 100%), 96.3%(95% CI, 93.3%, 99.4%) 및 70.0%(95% CI, 53.4%, 86.6%)의 ROC AUC로 진단의 임상 확실성을 따랐다(도 3c, 3d).
병 일자에 서명의 수행
발견 그룹은 이들의 병의 7일까지(1일이 발열의 제1 일로서) KD 환자를 포함하였고, 서명은 병의 7일까지(7일 포함) 환자에서 검증되었다. 서명의 수행은 이들의 병의 8일 내지 10일에 30명의 환자에 적용될 때 감소하였다(도 4).
토의
본 발명자들은 박테리아, 바이러스 및 염증성 질환을 갖는 환자로부터 KD를 구별하는 13-전사체 서명을 확인하였다. KD의 조기 진단에 대한 이 서명의 높은 민감도 및 특이성은 이것이 진단 시험의 기초를 형성한다는 것을 제시한다. 본 발명자들의 발견은 KD에서 이전의 유전자 발현 연구를 확장하고, 이는 면역병인에 집중하였다[21, 25-29]. 서명에서 13개의 전사체 중 5개에 대해, 발현은 비-KD 그룹과 비교하여 KD 환자에서 더 낮았다(표 2). 이들 5개 중에서, S100 칼슘 결합 단백질 P(S100P)는 회복[30]과 비교하여 또는 바이러스 감염[29, 30]에 의해 급성기 동안 KD에서 발현의 증가를 나타내는 것으로 이전에 보고되었다. S100P 발현은 박테리아 환자에서 가장 높았고, PDMS 모델에서 이 전사체의 선택은 KD-박테리아 구별에 의해 유도되었다. 인터페론 유도성 유전자, 아폽토시스를 조절하는 인터페론 알파 유도성 단백질 27(IFI27)은 급성 박테리아 감염[31] 및 자가면역 질환[32, 33]을 갖는 아동과 비교하여 바이러스 감염을 갖는 열성 아동에서 상향조절되는 것으로 보고되었다. 타입 1 인터페론에 의해 유도된 유전자의 패밀리의 낮은 전사체 풍부도는 아데노바이러스 감염에 비해 급성 KD에서 전혈 유전자 발현의 비교에서 이전에 보고되었고[29], 이는 KD의 음성 예측자로서 모델에서 IFI27의 포함과 일치한다. CD163은 감염 급성기 동안 박테리아 제거율에 관여된 대식세포 및 단핵구에서 발현되는 막관통 수용체이다[34]. Ingenuity Pathways Analysis을 이용한 서명의 네트워크 분석은 서명에서의 13개의 전사체 중 7개가 TNF 및 IL6의 중앙 허브 주위에 네트워크에서 연결되었다는 것을 밝혀낸다(도 7).
KD의 진단은 현재 5개의 특징적인 임상 기준 중 4개의 존재에 의존한다. 관상 동맥 비정상(확대 또는 동맥류)이 심장초음파에 의해 결정되면 더 적은 기준이 진단으로 인정된다. 전통적인 진단학적 기준을 충족하지 않고, 장기간의 발열 및 염증을 갖는 "불완전 KD"를 갖는 아동은 CAA를 야기할 위험의 증가에 있다[35]. 불완전 KD에서의 CAA의 더 높은 위험에 대한 하나의 이유는 지연된 진단인데, 이는 모든 임상 특징이 결여된 환자에서 대개 발생한다. KD의 임상 특징이 스타필로코커스 및 스트렙토코커스 독소 질환, 바이러스 발진, 스티브 존슨 증후군, 전신 청소년 특발성 관절염 및 약물 반응과 같은 많은 다른 흔한 아동 병태의 것과 중첩하므로[36], IVIG에 의한 치료는 다른 병태의 배제를 기다리지 않으면서 지연될 수 있다. 정반대로, KD의 진단이 많은 아동 열성 병의 차이로 여겨지고 지연된 치료의 결과가 중증일 수 있으므로, IVIG 또는 면역억제제 2선 치료에 의한 과잉치료가 발생할 수 있다. 다른 감염성 및 염증성 과정으로부터 KD를 정확히 구별하는 진단 시험은 장애의 관리에서 상당한 진전이고, 불필요한 조사 및 부적절한 치료를 감소시키고, IVIG 및 다른 소염제에 의한 이전의 치료가 가능하게 할 것이다.
본 발명자들의 발견 및 검증 연구 그룹을 확립하는 데 있어서, 본 발명자들은 감염성 질환 및 염증성 질환 둘 다를 포함하는 KD와 중첩하는 특징을 갖는 넓은 범위의 장애를 포함하도록 목표하였다. 본 발명자들이 확인한 서명은 넓은 범위의 다른 병태로부터 KD를 구별하였다. KD가 임상 특징의 무리에 기초하여 진단되고, 진단에 대한 금본 표준이 없으므로, 바이오마커 또는 시험의 평가는 어렵다. 추정된 KD에 대해 IVIG로 치료된 아동의 임의의 코호트에서, 아마도 중첩하는 임상 특성을 갖는 비-KD 병을 갖는 일부 환자가 포함될 것이다. 진단학적 확실성의 수준을 갖는 KD DRS의 관련성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 모든 임상 데이터의 독립 검토에 기초하여 확정, 개연성이 있는 또는 가능한 KD로서 검증 세트에서의 모든 환자를 분류하였다. 본 발명자들은 가능한 그룹에서 확정 그룹 및 고도로 개연성이 있는 그룹에서 본 발명자들의 서명의 더 높은 민감도 및 특이성을 관찰하였다. KD 특이적 서명의 진단학적 정확성은 후향적 연구에서 시험에 준비된다.
본 발명자들은 연구에서 강도 및 제한 둘 다를 인식한다. 처음에, KD의 전염병학은 전체적으로 민족에 의해 변하는데, 동아시아에서 높은 비율이고 유럽에서 낮은 비율이다. KD에서 유전자 발현에서의 민족학적 변동 및 지리학적 변동이 있는지를 조사하는 데 추가의 연구가 필요하다. 본 발명자들의 연구의 강도는 서명이 일련의 민족을 포함하는 훈련 세트로부터 개발되었다는 것이다. 발견 세트에서의 열성 대조군 샘플은 모든 센터로부터 추출되지만, 다중-민족 KD 샘플은 UCSD로부터 생겼다. 둘째로, 검증 실험에서, 상이한 Illumina 마이크로어레이 버전으로부터의 KD 및 사례-대조군 데이터는 ComBat 알고리즘[24]을 적용하고, 각각의 플랫폼으로부터 건강한 대조군 데이터에 관해 정규화하여 조합될 수 있다. 이 정규화는 데이터세트 사이의 가변성의 실험적 소스와 생물학적 소스 둘 다를 감소시킬 수 있고, 결과적으로 진단학적 서명의 정확성(AUC 결과)은 검증 세트에 적용될 때 단일 마이크로어레이 실험으로부터 도출된 검증 데이터세트로부터 얻은 것과 비교하여 과소평가될 수 있다. 셋째로, 13-전사체 서명은 이의 병으로 7일 이하인 KD 환자를 사용하여 개발되었다. 본 발명자들의 서명의 이점은 이것이 발열의 5일 전에 KD의 조기 진단을 수월하게 할 것이라는 점이다. 그러나, 추가의 작업은 늦은, '놓친' KD 환자에서의 진단을 위한 최적 서명을 확립하는 데 필요하다.
병원 진단학적 실험실에서의 사용을 위한 신속한 임상 시험으로의 멀티-전사체 서명의 번역은 도전적이지만, 본 발명자들의 서명에서의 비교적 적은 수의 전사체 그리고 핵산을 검출하기 위한 신속히 진화하는 기술로 인해 보다 달성 가능하게 된다. 게다가, DRS는 복잡한 분석에 대한 필요 없이 개별 질환 위험 배정에 대한 새로운 접근법을 제공하고, KD 서명을 포함하는 상향조절된 전사체 또는 하향조절된 전사체가 동시배치되고 이의 조합된 신호가 검출되는 시험으로서 개발에 대한 플랫폼을 제공한다.
본 발명자들의 연구는 KD가 혈액에서의 적은 수의 전사체를 사용하여 대개 임상적으로 혼란스러운 감염성 병태 및 염증성 병태의 범위로부터 구별될 수 있다는 것을 제시한다. 이 유전자 발현 서명에 기초한 신속한 시험의 개발은 더 조기의 치료를 허용하고, 따라서 이 심각한 아동 질환의 심장 합병증의 예방을 허용하는 주요 진전일 것이다. 본 발명자들의 발견은 임상 기준보다는 분자 서명에 기초하여 질환의 더 양호한 진단을 향한 단계를 나타내고, 따라서 많은 다른 임상 증후군과 관련된다.
데이터 저장소
상기 기술된 데이터는 NCBI의 Gene Expression Omnibus(Edgar et al., 2002)에 기탁되었고, GEO Series 수탁 번호 GSE73464(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)를 통해 접근 가능하다.
보충 표
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
실시예 2 - 더 적은 전사체를 갖는 유전자 서명의 확인
PReMS 소프트웨어(Hoggart, 2018)는 원래의 13 전사체의 하위집단에 기초하여 대안적인 더 작은 서명(더 적은 전사체)을 생성하기 위해 사용되었다.
많은 로지스틱 회귀 모델에 걸친 PReMS 조사는 바이오마커의 최적 하위집단으로 구성되어서, 모델 크기를 반복적으로 증가시킨다. 0 중심 가우스 사전 분포는 축소를 유도하도록 모든 회귀 계수에 배정되었다. 상기 방법은 최적 축소 매개변수, 각각의 모델 크기에 대한 최적 모델 및 최적 모델 크기를 추정한다.
하기 표 8은 원래의 13개의 전사체로부터의 전사체의 조합에 기초하여 더 작은 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개 및 12개의 전사체 서명의 예를 보여준다. 시험 데이터 세트 및 검증 데이터 세트에 대한 AUC 값(실시예 1 참조)은 각각의 서명에 대해 나타난다. 여기 기재된 유전자 서명의 샘플 목록이 간결성을 위해 철저하고 순전히 예시적임에 유의한다.
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
따라서, 이 실시예는 원래의 13개의 전사체의 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개 또는 12개의 하위집단에 기초한 더 작은 유전자 서명이 양호한 분별력을 갖고 KD를 갖지 않는 개체에 대해 KD를 갖는 개체를 신뢰성 있게 확인할 수 있다는 것을 입증한다.
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Claims (23)

  1. 가와사키병(KD: Kawasaki disease)을 갖는 대상체를 확인하는 방법으로서,
    대상체 유래된 RNA 샘플에서 하기 유전자: CACNA1E, DDIAS, KLHL2, PYROXD2, SMOX, ZNF185, LINC02035, CLIC3, S100P, IFI27, HS.553068, CD163 및 RTN1 중 적어도 5개를 포함하는 유전자 서명의 유전자 발현 수준의 조절을 검출하는 단계를 포함하는, 가와사키병(KD)을 갖는 대상체를 확인하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 유전자 서명은 상기 유전자 중 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개 또는 13개를 포함하는, 가와사키병(KD)을 갖는 대상체를 확인하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 유전자 서명은 하기 유전자: PYROXD2, SMOX, CACNA1E, CD163, DDIAS, CLIC3, KLHL2 및 HS.553068 중 적어도 하나, 특히 PYROXD2, SMOX, CACNA1E 및 CD163의 적어도 하나를 포함하는, 가와사키병(KD)을 갖는 대상체를 확인하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 서명은 PYROXD2를 포함하는, 가와사키병(KD)을 갖는 대상체를 확인하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 서명은 CACNA1E를 포함하는, 가와사키병(KD)을 갖는 대상체를 확인하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 서명은 SMOX를 포함하는, 가와사키병(KD)을 갖는 대상체를 확인하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 서명은 CD163을 포함하는, 가와사키병(KD)을 갖는 대상체를 확인하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 서명은,
    (i) PYROXD2 및 CACNA1E;
    (ii) PYROXD2 및 SMOX; 또는
    (iii) PYROXD2, CACNA1E 및 SMOX를 포함하는, 가와사키병(KD)을 갖는 대상체를 확인하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 서명은 하기 유전자:
    (i) PYROXD2, CACNA1E, CD163, KLHL2 및 SMOX;
    (ii) PYROXD2, CACNA1E, IFI27, KLHL2 및 SMOX;
    (iii) PYROXD2, CACNA1E, HS.553068, IFI27 및 SMOX;
    (iv) PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, IFI27 및 SMOX;
    (v) PYROXD2, CACNA1E, CD163, KLHL2 및 ZNF185;
    (vi) PYROXD2, DDIAS, CD163, KLHL2 및 SMOX;
    (vii) PYROXD2, CACNA1E, CD163, IFI27, KLHL2 및 SMOX;
    (viii) PYROXD2, CACNA1E, CD163, KLHL2, LINC02035 및 SMOX;
    (ix) PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, IFI27 및 SMOX;
    (x) PYROXD2, CACNA1E, CD163, HS.553068, IFI27 및 SMOX;
    (xi) PYROXD2, CACNA1E, CD163, KLHL2, SMOX 및 ZNF185;
    (xii) PYROXD2, CACNA1E, IFI27, KLHL2, RTN1 및 SMOX;
    (xiii) PYROXD2, CACNA1E, CD163, CLIC3, KLHL2 및 SMOX;
    (xiv) PYROXD2, CACNA1E, CLIC3, IFI27, KLHL2 및 SMOX;
    (xv) PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, IFI27, RTN1 및 SMOX;
    (xvi) PYROXD2, DDIAS, CD163, IFI27, KLHL2 및 SMOX;
    (xvii) PYROXD2, CACNA1E, CD163, HS.553068, IFI27, KLHL2 및 SMOX;
    (xviii) PYROXD2, CACNA1E, CD163, CLIC3, IFI27, KLHL2 및 SMOX;
    (xix) PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, IFI27, KLHL2 및 SMOX;
    (xx) PYROXD2, CACNA1E, CD163, IFI27, KLHL2, RTN1 및 SMOX;
    (xxi) PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, HS.553068, IFI27 및 SMOX'
    (xxii) PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, IFI27, KLHL2 및 SMOX;
    (xxiii) PYROXD2, CACNA1E, CD163, CLIC3, HS.553068, IFI27, KLHL2 및 SMOX;
    (xxiv) PYROXD2, CACNA1E, CD163, CLIC3, IFI27, KLHL2, RTN1 및 SMOX;
    (xxv) PYROXD2, CACNA1E, CD163, HS.553068, IFI27, KLHL2, S100P 및 SMOX;
    (xxvi) PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, HS.553068, IFI27, KLHL2 및 SMOX;
    (xxvii) PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, IFI27, KLHL2, RTN1 및 SMOX;
    (xxviii) PYROXD2, CACNA1E, CD163, CLIC3, HS.553068, IFI27, KLHL2, RTN1 및 SMOX;
    (xxix) PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, IFI27, KLHL2, RTN1, S100P 및 SMOX;
    (xxx) PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, HS.553068, IFI27, KLHL2, RTN1 및 SMOX;
    (xxxi) PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, HS.553068, IFI27, KLHL2, RTN1, S100P 및 SMOX;
    (xxxii) PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, IFI27, KLHL2, LINC02035, RTN1, S100P 및 SMOX;
    (xxxiii) PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, IFI27, KLHL2, RTN1, S100P, SMOX 및 ZNF185.
    (xxxiv) PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, HS.553068, IFI27, KLHL2, RTN1, S100P, SMOX 및 ZNF185;
    (xxxv) PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, HS.553068, IFI27, KLHL2, LINC02035, RTN1, S100P 및 SMOX; 또는
    (xxxvi) PYROXD2, DDIAS, CACNA1E, CD163, CLIC3, IFI27, KLHL2, LINC02035, RTN1, S100P, SMOX 및 ZNF185의 조합 중 어느 하나를 포함하거나 이들로 이루어지는, 가와사키병(KD)을 갖는 대상체를 확인하는 방법.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 서명은 CACNA1E, DDIAS, KLHL2, PYROXD2, SMOX, ZNF185, LINC02035, CLIC3, S100P, IFI27, HS.553068, CD163 및 RTN1을 포함하거나 이들로 이루어지는, 가와사키병(KD)을 갖는 대상체를 확인하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 예를 들어, 액틴, GAPDH, 유비퀴틴, 18s rRNA, RPII (POLR2A), TBP, PPIA, GUSB, HSPCB, YWHAZ, SDHA, RPS13, HPRT1 및 B4GALT6으로부터 선택된 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 하우스키핑 유전자와 같은 하나 이상의 하우스키핑 유전자의 발현 수준의 검출을 추가로 도입하는, 가와사키병(KD)을 갖는 대상체를 확인하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 하나에 있어서, KD를 갖는 대상체는 박테리아 감염, 바이러스 감염 및 염증성 병태 중 하나 이상의 존재에서 확인되거나 이들을 갖는 환자로부터 구별될 수 있는, 가와사키병(KD)을 갖는 대상체를 확인하는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 아동이고, 예를 들어, 아동은 2개월 내지 59개월의 연령인, 가와사키병(KD)을 갖는 대상체를 확인하는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 발열이 있는, 가와사키병(KD)을 갖는 대상체를 확인하는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 발현 조절의 분석은 마이크로어레이, 유전자 칩 또는 PCR, 예컨대 RT-PCR, 특히 멀티플렉스 PCR을 사용하는, 가와사키병(KD)을 갖는 대상체를 확인하는 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 서명의 분석의 결과에 기초하여 대상체에게 가와사키병(KD)에 대한 치료를 처방하거나 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 가와사키병(KD)을 갖는 대상체를 확인하는 방법.
  17. 대상체에게 KD에 대한 치료를 투여하는 단계를 포함하는 가와사키병(KD)을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 대상체는 예를 들어, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 방법을 이용하여 대상체 유래된 RNA 샘플에서 하기 유전자: CACNA1E, DDIAS, KLHL2, PYROXD2, SMOX, ZNF185, LINC02035, CLIC3, S100P, IFI27, HS.553068, CD163 및 RTN1 중 적어도 5개를 포함하는 유전자 서명의 유전자 발현 수준의 조절을 검출하여 가와사키병을 갖는 것으로서 이전에 확인된, 가와사키병(KD)을 갖는 대상체를 확인하는 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 치료는 감마 글로불린(IVIg), 아스피린, 또는 다른 소염제, 예컨대 스테로이드 및 인플릭시맙, 또는 이들의 조합인, 가와사키병(KD)을 갖는 대상체를 확인하는 방법.
  19. 하기 유전자: CACNA1E, DDIAS, KLHL2, PYROXD2, SMOX, ZNF185, LINC02035, CLIC3, S100P, IFI27, HS.553068, CD163 및 RTN1 중 적어도 5개로부터의 폴리뉴클레오타이드 유전자 전사체에 특이적인 프라이머를 포함하는, 가와사키병(KD)을 갖는 대상체를 확인하는 방법에 사용하기 위한 프라이머의 세트.
  20. 하기 유전자: CACNA1E, DDIAS, KLHL2, PYROXD2, SMOX, ZNF185, LINC02035, CLIC3, S100P, IFI27, HS.553068, CD163 및 RTN1 중 적어도 5개에 특이적인 프로브로 이루어진 유전자 칩.
  21. 하기 유전자: CACNA1E, DDIAS, KLHL2, PYROXD2, SMOX, ZNF185, LINC02035, CLIC3, S100P, IFI27, HS.553068, CD163, 및 RTN1 중 적어도 5개에 특이적인 프로브; 및 예를 들어, 액틴, GAPDH, 유비퀴틴, 18s rRNA, RPII(POLR2A), TBP, PPIA, GUSB, HSPCB, YWHAZ, SDHA, RPS13, HPRT1 및 B4GALT6으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 대조 프로브(control probe)로 이루어진 유전자 칩.
  22. 제19항에 따른 프라이머의 세트 또는 제20항 또는 제21항에 따른 유전자 칩을 포함하는, 가와사키병(KD)을 갖는 대상체를 확인하기 위한 현장 시험(point of care test).
  23. 샘플, 예를 들어, 혈액 샘플에서 가와사키병(KD)을 검출하기 위한 검정에서의 19항에 따른 프라이머의 세트 또는 제20항 또는 제21항에 따른 유전자 칩의 용도.
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