WO2018228622A1 - Verfahren zum nachweis von aggregaten biotherapeutischer substanzen in einer probe - Google Patents

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Definitions

  • the invention relates to a method for detecting aggregates of biotherapeutic substances in a sample.
  • Biopharmaceuticals are used in biologics and their counterfeit biosimilars and are the category of therapeutics that are produced in living organisms. These products include, among others, recombinant proteins and antibodies. These products play a key role in the treatment of various diseases such as diabetes, various cancers and inflammatory diseases.
  • biopharmaceuticals are highly attractive therapeutics because proteins and antibodies have outstanding activities and specificities in terms of their effects.
  • the greatest challenges are physical and chemical stability. Misfolding of such proteins, and subsequently, aggregation, may occur during each and every phase of the product cycle of such a therapeutic agent. These stages include expression, folding, purification, sterilization, shipping, storage and delivery of the product.
  • Homogeneous protein aggregates are defined as any self-associated protein species, where the monomer is the smallest naturally occurring unit or non-self-assembled protein species. represents unit. Aggregates are classified according to the following five characteristics: size, reversibility (dissociation), conformation, chemical modification, and morphology [1].
  • the smallest aggregate unit corresponds to two monomers (dimer), whereby the number of monomers is not limited to the upper limit [1]. Disadvantageously, immune responses have been found even for the smallest aggregate units of biopharmaceutical protein products [2].
  • heterogeneous aggregates in which the protein can associate monomer with one or more other protein species or even organic or inorganic contaminants.
  • the underlying mechanisms that can cause or enhance an immune response by aggregates are different. These include a) increased cross-linking of B-cell receptors, which may cause their activation [3], b) increased antigen uptake, processing and presentation with subsequent triggering of immunostimulatory signals [4]. Such mechanisms can stimulate T cells to produce antibodies.
  • the greatest clinical risk of aggregate-induced immune response depends on the maintenance or degeneration of monomer epitopes in the aggregate. In the case of preservation of the epitopes, antibodies which were originally directed only against the aggregate can also bind monomers and reduce or neutralize their action. In the case of degeneration, the antibodies will target exclusively aggregates while not interfering with the drug activity of the native protein.
  • LO light attenuation
  • DIPA Dynamic Imaging Particle Analysis
  • MFI micro-flow imaging
  • CC electrochemical method of the Coulter counter
  • Aggregates between 0.1 pm and 1 ⁇ In this size range complex systems for the detection of small aggregates are used. These include size-exclusion chromatography (SEC), analytical ultracentrifugation (AUC), and asymmetric field-flow fractionation (AF4). To increase the sensitivity of such devices, they are often coupled to a mass spectrometer. Although these techniques allow the quantification and distribution of aggregates. It is disadvantageous to determine the composition and these processes are only of limited suitability for high-throughput applications.
  • the object of the invention is to provide a highly sensitive method for detecting aggregates of biotherapeutic substances in a sample.
  • Another object of the invention is to provide a kit for carrying out the method.
  • the object is achieved by a method for detecting aggregates of biotherapeutic substances in a sample, comprising the following steps: a. Applying the sample to be examined to a substrate, b. Add probes suitable for detection by
  • step b) Detection of the labeled aggregates of biotherapeutic substances wherein step b) can be carried out before step a).
  • the method for the detection and in particular for the quantitative and / or qualitative determination of homogeneous and heterogeneous aggregates is characterized in that aggregates of and in biopharmaceutical products contain at least one binding site for a probe.
  • the aggregate also comprises at least one binding site for a capture molecule.
  • the method then comprises the steps of: a) immobilizing catcher molecules on a substrate, b) contacting the sample with a biopharmaceutical product
  • Solution with the catcher molecules c) immobilizing monomers and / or aggregates of one or more of themselves d) contacting a probe with the monomers and / or aggregates; e) attaching the probe to the monomers and / or aggregates, wherein the probe is capable of binding to the capture molecules is to generate a defined signal and the steps b) and d) can take place simultaneously or the step d) before the step b) can take place.
  • steps b) and d) take place simultaneously, then steps c) and e) are also carried out simultaneously.
  • step d) is carried out before step b
  • immobilization of monomers and aggregates labeled with probes on the substrate thus takes place in step c). Consequently, step e) also takes place before steps b) and c).
  • the "quantitative determination” initially means the determination of the concentration of the aggregates, and therefore also the determination of their presence and / or absence.
  • the quantitative determination also means the selective quantification of aggregate compositions. Such quantification can be done via the corresponding probes.
  • the "qualitative determination” means the characterization of the aggregate composition.
  • the aggregates are labeled with one or more probes useful for detection.
  • the probes contain an affinity molecule which recognizes and binds to a binding site of the aggregate or its monomer.
  • the probes contain at least one detection molecule or moiety which is bound to the affine molecule or moiety and is detectable or measurable by chemical or physical methods.
  • the probes may in one alternative have identical affine molecules or moieties with different detection molecules (or parts).
  • different affine molecules or parts of molecules may be combined with different detection molecules or parts, or alternatively different affine molecules or parts with identical detection molecules or parts. It is also possible to use mixtures of different probes.
  • a spatially resolved determination of the probe signal ie a spatially resolved detection of the signal emitted by the probe. Accordingly, in this embodiment of the invention, methods based on a non-spatially resolved signal, such as ELISA or sandwich ELISA, are excluded.
  • the spatially resolved determination of the probe signal is based on the examination of a small volume element in the region of Femtolitern below a Femtoliters, or a volume range above the contact surface of the capture molecules with a height of 500 nm, preferably 300 nm, more preferably 250 nm, in particular 200 nm, but also 150 nm and 90 nm.
  • aggregates are either homogeneous aggregates consisting of at least two identical monomer units, or heterogeneous aggregates consisting of at least two different monomer units. In the case of heterogeneous aggregates, both monomers can be identical in their primary sequence, but differ in their conformation.
  • the material of the substrate is selected from the group consisting of or consisting of plastic, silicon and silicon dioxide.
  • glass is used as the substrate.
  • the capture molecules are covalently bound to the substrate.
  • a substrate which has a hydrophilic surface.
  • this is achieved by applying a hydrophilic layer, before step a), to the substrate.
  • the capture molecules covalently bind to the substrate or to the hydrophilic layer with which the substrate is loaded.
  • the hydrophilic layer is a biomolecule-repellent layer so as to minimize nonspecific binding of biomolecules to the substrate.
  • the capture molecules preferably covalently, are optionally immobilized on this layer. These are affinitive to a feature of the monomers or their aggregates.
  • the scavenger molecules may all be identical, or mixtures of different scavenger molecules.
  • the same molecules are used as catcher molecules and probes, preferably the capture molecules do not contain a detection molecule or parts of the molecule.
  • the hydrophilic layer is selected from the group consisting of or consisting of PEG, poly-lysine, preferably poly-D-lysine, and dextran or derivatives thereof, preferably carboxymethyl-dextran (CMD).
  • CMD carboxymethyl-dextran
  • Derivatives in the context of the invention are compounds which differ in some substituents from the parent compounds, the substituents being inert to the process according to the invention.
  • the surface of the substrate is first hydroxylated before application of the hydrophilic layer and then functionalized with suitable chemical groups, preferably amino groups. This functionalization with amino groups takes place in an alternative by contacting the substrate with amino silanes, preferably APTES (3-aminopropyltrietoxysilane), or with ethanolamine.
  • the substrate In an alternative, bringing the substrate into contact with aminosilanes, preferably APTES, in the gas phase; the optionally pretreated substrate is thus vaporized with the aminosilanes.
  • aminosilanes preferably APTES
  • the substrate is treated with an aqueous solution of CMD (in a concentration of 10 mg / ml or 20 mg / ml) and with a catalyst for the covalent coupling, optionally N- Ethyl N- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC), (200mM) and N-hydroxysuccinimide (NHS), (50mM) were incubated, followed by washing.
  • EDC Ethyl N- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • the substrate used may be microtiter plates, preferably with a glass bottom. Because when using polystyrene frames the use of concentrated
  • Covalent, preferably covalent, catcher molecules are immobilized on this hydrophilic layer which are affine towards a characteristic (eg proteins) of the aggregate.
  • the capture molecules may all be identical or mixtures of different capture molecules.
  • the capture molecules preferably antibodies to monomers of the aggregate, optionally after activation of the CMD-coated support by a mixture of EDC / NHS, preferably 200 or 50 mM, are immobilized on the substrate.
  • the substrates or carriers are optionally rinsed with buffer.
  • the substrate is blocked with protein or peptide containing solutions prior to application of the sample and washed with buffer.
  • the sample to be measured is brought into contact with the substrate thus prepared and optionally incubated.
  • Differently formulated solutions of the biopharmaceutical product, of the product in cell supernatants and culture media or endogenous fluids can be used as the sample to be investigated.
  • the sample is selected from CSF, blood, plasma and urine.
  • the samples may undergo different processing steps known to those skilled in the art.
  • the sample is applied directly to the substrate (uncoated substrate), optionally by covalent bonding on the optionally activated surface of the substrate.
  • the sample is pretreated by one or more of the following methods:
  • enzymes for example nuclease, lipases
  • the sample is brought into contact with the substrate immediately and / or without pretreatment.
  • Unspecific bound substances can be removed by washing steps.
  • immobilized aggregates are labeled with one or more probes useful for further detection.
  • the individual steps can also be carried out in a different order according to the invention.
  • Suitable washing steps remove excess probes that are not bound to the aggregates.
  • these excess probes are not removed. This eliminates the last washing steps and there is no equilibrium shift in the direction of the dissociation of the aggregate-probe complexes or Connections take place. Due to the spatially resolved detection, the excess probes are not detected during the evaluation and do not affect the measurement.
  • sample-catcher molecule complexes are chemically fixed.
  • detection probe-probe-capture molecule complexes are chemically fixed and thus also the sample-capture molecule complexes.
  • the binding sites of the aggregate are epitopes and the capture molecules and probes are antibodies.
  • capture molecules and probes may be identical.
  • capture molecules and probes differ. So z. B. different antibodies are used as catcher molecules and as probes.
  • capture molecules and probes are used, which are identical to each other with the exception of the eventual (dye) label.
  • various probes are used which are identical to each other except for the eventual (dye) label.
  • At least two or more different capture molecules and / or probes are used which contain different antibodies and optionally also have different dye labeling.
  • two or more probes are labeled with appropriate dyes such that a FRET, a so-called resonant energy transfer promoter, takes place, one dye being excited and another being emitted nearby, both dyes being different molecules is.
  • the probes are characterized in that they emit an optically detectable signal selected from the group consisting of fluorescence, Phosphorescence, bioluminescence, chemiluminescence and electrochemiluminescence emission, and absorption.
  • the probes are thus labeled with fluorescent dyes.
  • fluorescent dye the dyes known to those skilled in the art can be used.
  • fluorescent biomolecules preferably GFP (green fluorescence protein), conjugates and / or fusion proteins thereof, and also fluorescent nanoparticles, preferably quantum dots.
  • catcher molecules for later quality control of the surface, for example uniformity of the coating with catcher molecules, catcher molecules, labeled with fluorescent dyes, can be used.
  • a dye is preferably used which does not interfere with the detection.
  • the immobilized and labeled aggregates are detected by imaging the surface (eg laser microscopy).
  • the highest possible spatial resolution determines a high number of pixels, whereby the sensitivity and the selectivity of the assay can be increased because structural features can be mapped and analyzed.
  • the specific signal increases in front of the background signal (eg nonspecifically bound probes).
  • the detection is preferably carried out with confocal fluorescence microscopy, fluorescence correlation spectroscopy (FCS), in particular in combination with cross-correlation and laser scanning microscope (LSM).
  • FCS fluorescence correlation spectroscopy
  • LSM laser scanning microscope
  • the detection or detection is carried out in an alternative of the present invention with a confocal laser scanning microscope.
  • a laser focus as z.
  • FCS Fluorescence Correlation Spectroscopy System
  • the detection or the detection by means of spatially resolving fluorescence microscopy, preferably by a TIRF microscope done so like the corresponding super-resolution variants of it, such as STORM, dSTORM.
  • the probes can be selected such that in the case of heterogeneous agregates, the presence of individual components or conformations does not affect the measurement result.
  • the probes can be selected such that homogeneous and heterogeneous aggregates and different heterogeneous aggregates can be determined in one measurement.
  • the spatially resolved information (eg, the fluorescence intensity) of all inserted and detected probes is used to determine e.g. For example, determine the number of aggregates, their size and their characteristics.
  • Other image analysis options include z. For example, the search for local intensity maxima in order to obtain the number of detected aggregates from the image information.
  • standards such as: B. internal and / or external standards are used. These standards may also be used to calibrate the measurement to determine the size distribution, quantity and / or composition of aggregates of biopharmaceutical products.
  • Another object of the present invention is to provide standards which have a narrow size distribution and consist of two or more identical or different polypeptide sequences.
  • the polypeptide sequences may also be the native monomeric form of the biopharmaceutical agent.
  • the standard consists of a mixture of different size distributions.
  • the standard is marked.
  • the standard consists of two or more monomers covalently linked together.
  • the standard consists of a nanoparticle on the surface of which two or more monomers or a polypeptide sequence are covalently bound and the polypeptide sequence is identical in a partial region with the sequence of the monomer of the biotherapeutic substances.
  • the present invention also provides a kit containing one or more of the following components:
  • Substrate if appropriate with hydrophilic surface, catcher molecule, probe, standard, substrate with catcher molecule, solutions, buffer.
  • the compounds and / or components of the kit of the present invention may be packaged in containers, optionally with / in buffers and / or solution. Alternatively, some components may be packaged in the same container. In addition or alternatively, one or more of the components could be attached to a solid support, such as a solid support. As a glass plate, a chip or a nylon membrane or to the well of a microtiter plate, be adsorbed. Further, the kit may include instructions for using the kit for any of the embodiments.
  • the above-described catcher molecules are immobilized on the substrate.
  • the kit may contain solutions and / or buffers.
  • the biomolecule-repellent surface eg dextran surface
  • the catcher molecules immobilized thereon, they can be covered with a solution or a buffer.
  • the solution contains one or more biocides which increase the durability of the surface.
  • Another object of the present invention is the use of the method according to the invention for the detection of homogeneous and heterogeneous aggregates. and of biopharmaceutical products in any sample, for the quantification (titer determination) of homogeneous and heterogeneous aggregates of and in biopharmaceutical products, direct and / or absolute quantification of the number of particles.
  • Another object of the present invention is the use of the method according to the invention for the optimization and monitoring of process steps during the production of biopharmaceutical active ingredients and / or quality determination of end products.
  • Another object of the present invention is the use of the inventive method for the detection of homogeneous and heterogeneous aggregates of biopharmaceutical products in clinical tests, studies and in therapy monitoring.
  • samples are measured according to the method according to the invention and the results compared.
  • Fig. 1 aggregates (hatched bars) and monomers (white bars) of the human IgG antibody as a sample.
  • FIG. 1 shows aggregates (shaded bars) and monomers (white bars) of the human IgG antibody (isotype control, ThermoFisher Scietific, RF237824) in a decadal dilution series.
  • the antibody as it was used was used and diluted in saline phosphate buffer (PBS) at pH 7.4.
  • PBS saline phosphate buffer
  • the sample (5 mg / ml) was heated for 10 min at 70 ° C and diluted after reaching 25 ° C decadent.
  • the surface of the microtiter plate was constructed or functionalized.
  • the plate was placed in a desiccator, in which a bowl with
  • reaction chamber was washed three times with water followed by 20 ⁇ each of an aqueous 200 mM EDC solution (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, Sigma) and 50 mM NHS (N-hydroxysuccinimide, Sigma) for 30 minutes. This gives the hydrophilic coating with PEG functionality for coupling biomolecules.
  • the plate was again washed three times with deionized water. Thereafter, the reaction chamber was coated with clone 8A4 (Thermo-Fischer), a monoclonal antibody as a capture molecule that specifically binds the CH2 domain in the FC portion of human antibodies (20 ⁇ , 10 pg / ml in PBS, 1 hour). Subsequently, the reaction chamber was treated with the wash program consisting of three washes each time and empty eyes with TBS with 0.1% Tween-20 and TBS.
  • clone 8A4 Thermo-Fischer
  • reaction chamber was coated overnight with 50 ⁇ M Smartblock (Candor Bioscience GmbH) at room temperature (RT) and, after the lapse of time, again three times with saline tris (hydroxymethyl) aminomethane (TBS;
  • the samples were sequentially diluted in Tris (hydroxymethyl) aminomethane (TRIS) buffer with Hoechst Stain dye (1 pg ml-1) and incubated for one hour. Thereafter, in a threefold version, 20 ⁇ l of sample were applied to the reaction chamber and incubated at room temperature for 1 hour. After incubation, the reaction chamber was washed three times with TBS and 20 ⁇ detection antibody was added.
  • the detection antibodies were each labeled with a type of fluorescent dye: 8A4 (ThermoFisher Scientific, MA1-81864,) was separately labeled with fluorescent dyes CF488 and with CF633. These probe antibodies or detection antibodies were diluted together in TBS to a final concentration of 1.25 ng / ml for each antibody. They specifically bind epitopes of the monomers and aggregates of the biotherapeutic substance.
  • the maximum laser power (100%), an exposure time of 500 ms and a gain value of 800 were selected.
  • the image data was evaluated afterwards.
  • Intensity thresholds were set for each channel at 0.0001% gray levels of the averaged negative control in the corresponding channel.
  • the intensity threshold value was first applied for each image in each channel, and images of the same position in both values were compared with one another. Only those pixels per image were counted where in both channels the pixel is at the exact same position above the intensity threshold of the channel. Finally, the number of
  • This series of calibrations can then serve as an introduction to more complex detection methods of biotherapeutic substances, in the specific case of IgG, which can be present as a biotherapeutic substance in solution of a pharmaceutical preparation as a sample and should be examined for aggregates.
  • the fluorescent probe antibody can not bind to a capture molecule bound monomer because its binding site is occupied by the capture molecule. Instead, it only binds to the monomer epitopes of the aggregates. This is thus quantifiable in the manner shown.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Aggregaten biotherapeutischer Substanzen in einer Probe, umfassend folgende Schritte: a. Auftragen der zu untersuchenden Probe auf ein Substrat, b. Hinzufügen von für den Nachweis gekennzeichneten Sonden, die durch spezifische Bindung an die Aggregate biotherapeutischer Substanzen diese markieren und c. Nachweis der markierten Aggregate biotherapeutischer Substanzen wobei Schritt a) vor Schritt b) durchgeführt werden kann. Ein Kit zur Durchführung des Verfahrens ist offenbart.

Description

Verfahren zum Nachweis von Aggregaten biotherapeutischer Substanzen
in einer Probe
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Nachweis von Aggregaten biotherapeutischer Substanzen in einer Probe. Stand der Technik
Biopharmazeutische Produkte teilen sich in Biologics und deren Nachahme- Präparate Biosimilars ein und sind jene Kategorie von Therapeutika, die in lebenden Organismen hergestellt werden. Zu diesen Produkten zählen unter anderem rekom- binante Proteine und Antikörper. Diese Produkte spielen eine Schlüsselrolle bei der Behandlung von unterschiedlichen Krankheiten wie Diabetes, verschiedener Krebsarten und Entzündungserkrankungen.
Biopharmazeutische Produkte stellen aus medizinischer Sicht höchst attraktive Therapeutika dar, da Proteine und Antikörper bezüglich ihrer Wirkung herausragende Aktivitäten und Spezifitäten besitzen. Allerdings befinden sich die größten Herausfor- derungen, bedingt durch die strukturelle Komplexität dieser hochmolekularen Stoffe gegenüber klassischen niedermolekularen Pharmazeutika, im Bereich der physikalischen und chemischen Stabilität. Fehlfaltung solcher Proteine, und in weiterer Folge, die Aggregation, kann während jeder einzelnen Phase des Produktzyklus eines solchen Therapeutikums stattfinden. Diese Stufen beinhalten die Expression, Faltung, Aufreinigung, Sterilisation, Versand, Lagerung und die Lieferung des Produkts.
Die Folgen von Protein-Aggregation sind einerseits eine Reduktion an Aktivität und, besonders nachteilig, eine erhöhte Immunogenität des Produktes. Wenn das Immunsystem den Wirkstoff als Antigen erkennt und Antikörper dagegen bildet, führt dies zu dessen Abbau oder sogar zu einer allergischen Reaktion. Dies macht die Therapie unwirksam gegebenenfalls sogar gefährlich.
Als homogene Proteinaggregate werden jegliche selbst-assoziierte Protein Spezies definiert, wobei das Monomer die kleinste natürlich vorkommende Einheit oder Un- tereinheit darstellt. Aggregate werden nach den fünf Charakteristika Größe, Reversibilität (Dissoziation), Konformation, chemische Modifikation, und Morphologie eingeteilt [1].
Die kleinste Aggregate-Einheit entspricht zwei Monomeren (Dimer), wobei der Anzahl an Monomeren im Weiteren nach oben hin keine Grenze gesetzt sind [1]. Nachteilig wurden selbst für die kleinsten Aggregateinheiten von biopharmazeutischen Proteinprodukten bereits Immunantworten gefunden [2].
Zusätzlich zu den homogenen Protein Aggregaten gibt es auch heterogene Aggregate, bei denen das Protein Monomer mit einer oder mehreren anderen Proteinspezies oder auch organischen oder anorganischen Verunreinigungen assoziieren kann.
Die unterliegenden Mechanismen, welche eine Immunantwort durch Aggregate hervorrufen bzw. verstärken können sind unterschiedlich. Zu diesen zählen a) eine erhöhte Vernetzung von B-Zellen Rezeptoren, die deren Aktivierung hervorrufen können [3], b) eine erhöhte Antigenaufnahme, Prozessierung und Präsentation mit da- rauf folgender Auslösung immunstimulierender Signale [4]. Solche Mechanismen können T-Zellen zur Herstellung von Antikörpern anregen. Die größte klinische Gefahr einer durch Aggregate verursachten Immunantwort hängt von der Erhaltung oder Entartung von Monomer Epitopen im Aggregat ab. Im Falle einer Erhaltung der Epitope können Antikörper, welche ursprünglich nur gegen das Aggregat gerichtet waren auch Monomere binden und deren Wirkung vermindern oder neutralisieren. Im Falle einer Entartung richten sich die Antikörper exklusiv gegen Aggregate, während die Wirkstoffaktivität des nativen Proteins nicht beeinträchtigt wird. In beiden Fällen kann die Immunantwort bis hin zur Anaphylaxie führen, die für den Patienten gefährlich sein kann. Gegenwertig gibt es kein standardisiertes Verfahren zur Analyse von Verunreinigungen, des Aggregatanteils und dessen Größe in biopharmazeutischen Präparaten. Aggregate werden der Größe nach in zwei Kategorien eingeteilt und geeignete Messverfahren vorgeschlagen.
Aggregate >1 μιτι: Für die Bestimmung großer Aggregate und Verunreinigungen werden typischerweise optische Methoden angewendet, wie z. B. die Licht Abschwä- chung (LO), Dynamic Imaging Particle Analysis (DIPA) und Micro-flow imaging (MFI) sowie das elektrochemische Verfahren des Coulter Zähler (CC). Mit ausgereiften Formen dieser Verfahren können auch die Anzahl, die Größe und die Form der vorhandenen Aggregate festgestellt werden.
Aggregate zwischen 0,1 pm und 1 μητι: In diesem Größenbereich kommen komplexe Systeme zur Detektion kleiner Aggregate zum Einsatz. Zu diesen zählen Größenauf- schlusschromatographie (SEC), Analytische Ultrazentrifugation (AUC) und asymmetrische Feld-Fluss Fraktionierung (AF4). Um die Sensitivität solcher Geräte zu erhöhen, werden sie oftmals mit einem Massenspektrometer gekoppelt. Diese Techniken erlauben zwar die Quantifizierung und die Verteilung von Aggregaten. Nachteilig ist es die Zusammensetzung zu ermitteln und diese Verfahren eignen sich nur bedingt für Hochdurchsatzanwendungen.
Informationen über den Aggregat-Typ und die Quantität an Aggregaten sind notwendig um festzustellen, ab welchem Aggregatanteil eine Immunantwort auf das therapeutische Protein stattfindet-f8]. Bislang wurde die Immunantwort hauptsächlich gro- ßen Aggregaten und Partikeln zugeschrieben [3], obwohl es denkbar ist, dass die gebildeten Aggregate und Mengen von Produkt zu Produkt variieren und zu verschiedenen klinischen Szenarien führen können.
Die Erkenntnis, dass auch Partikel und Aggregate im Bereich von 0,1-10 pm potentiell immunogen wirken können, setzt sich zwar langsam durch, doch es fehlt den derzeit eingesetzten Methoden an Präzision, um dies festzustellen [5].
Aufgabe der Erfindung
Aufgabe der Erfindung ist es, ein hochsensitives Verfahren zum Nachweis von Aggregaten biotherapeutischer Substanzen in einer Probe bereit zu stellen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Kit zur Durchführung des Verfahrens bereit zu stellen.
Weitere Aufgaben und Lösungsansätze hierzu ergeben sich aus der Beschreibung zur Erfindung sowie den Unteransprüchen. Lösung der Aufgabe
Die Aufgabe wird gelöst mit dem Verfahren nach Patentanspruch 1 und dem Kit nach dem Nebenanspruch. Vorteilhafte Ausgestaltungen hierzu ergeben sich jeweils aus den hierauf rückbezogenen Patentansprüchen. Beschreibung der Erfindung
Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zum Nachweis von Aggregaten biotherapeutischer Substanzen in einer Probe, umfassend folgende Schritte: a. Auftragen der zu untersuchenden Probe auf ein Substrat, b. Hinzufügen von für den Nachweis geeigneten Sonden, die durch
spezifische Bindung an die Aggregate biotherapeutischer Substanzen diese markieren und c. Nachweis der markierten Aggregate biotherapeutischer Substanzen wobei Schritt b) vor Schritt a) durchgeführt werden kann.
Es kann also auch zunächst die Sonde und sodann die Probe zum Substrat hinzuge- fügt werden.
Das Verfahren zum Nachweis und insbesondere zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von homogenen und heterogenen Aggregaten ist dadurch gekennzeichnet, dass Aggregate von und in biopharmazeutischen Produkten mindestens eine Bindungsstelle für eine Sonde enthalten. Optional umfasst das Aggregat auch mindestens eine Bindungsstelle für ein Fängermolekül.
Das Verfahren umfasst dann folgende Schritte: a) Immobilisieren von Fängermolekülen auf einem Substrat, b) In Kontakt bringen der Probe mit einem biopharmazeutischen Produkt in
Lösung mit den Fängermolekülen, c) Immobilisieren von Monomeren und/oder Aggregaten eines oder mehrerer sich in Lösung eines biopharmazeutischen Produktes befindenden Moleküls auf dem Substrat durch Bindung an die Fängermoleküle, d) In Kontakt bringen einer Sonde mit den Monomeren und/oder Aggregaten, e) Binden der Sonde an die Monomere und/oder Aggregate, wobei die Sonde in der Lage ist, ein definiertes Signal zu erzeugen und die Schritte b) und d) gleichzeitig erfolgen können oder der Schritt d) vor dem Schritt b) erfolgen kann.
Sofern die Schritte b) und d) gleichzeitig erfolgen, werden somit auch die Schritte c) und e) gleichzeitig durchgeführt. In der weiteren Variante, in welcher Schritt d) vor Schritt b) durchgeführt wird, erfolgt somit in Schritt c) eine Immobilisierung von mit Sonden markierten Monomere und Aggregate auf dem Substrat. Mithin erfolgt also auch Schritt e) vor den Schritten b) und c).
Im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet die„quantitative Bestimmung" zu- nächst die Bestimmung der Konzentration der Aggregate, mithin also auch die Bestimmung ihrer An- und/oder -Abwesenheit.
Bevorzugt bedeutet die quantitative Bestimmung auch die selektive Quantifizierung von Aggregatzusammensetzungen. Eine solche Quantifizierung kann über die entsprechenden Sonden erfolgen. Im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet die„qualitative Bestimmung" die Charakterisierung der Aggregatzusammensetzung.
Die Aggregate werden mit einer oder mehreren für die Detektion dienlichen Sonden markiert. Die Sonden enthalten ein affines Molekül, welches eine Bindungsstelle des Aggregats oder seines Monomers erkennt und daran bindet. Außerdem enthalten die Sonden mindestens ein Detektionsmolekül oder ein Molekülteil, welches an das affine Molekül oder Molekülteil gebunden ist und mittels chemischer oder physikalischer Verfahren detektierbar bzw. messbar ist. Die Sonden können in einer Alternative identische affine Moleküle oder Molekülteile mit unterschiedlichen Detektionsmolekülen (oder Teile) aufweisen. In einer weiteren Alternative können unterschiedliche affine Moleküle oder Molekülteile mit unterschiedlichen Detektionsmolekülen oder Teilen kombiniert sein, oder alternativ unter- schiedliche affine Moleküle oder Teile mit identischen Detektionsmolekülen oder Teilen. Es können auch Mischungen verschiedener Sonden eingesetzt werden.
Der Einsatz mehrerer unterschiedlicher Sonden, die an unterschiedliche Detektions- moleküle oder Molekülteile gekoppelt sind, erhöht zum einen die Spezifität des Signals (Korrelationssignals), zum anderen ermöglicht dies die Identifikation von Aggre- gaten, die sich in ihrer Zusammensetzung unterscheiden. Dies ermöglicht eine selektive Quantifizierung und Charakterisierung der Aggregate.
In einer Ausführung erfolgt eine ortsaufgelöste Bestimmung des Sondensignals, also eine ortsaufgelöste Detektion des Signals, welches von der Sonde emittiert wird. Demgemäß sind in dieser Ausführung der Erfindung Verfahren, die auf einem nicht- ortsaufgelösten Signal beruhen, wie ELISA oder Sandwich-ELISA, ausgeschlossen.
Bei der Detektion ist eine hohe Ortsauflösung vorteilhaft aber nicht essentiell. In einer Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden dabei so viele Datenpunkte gesammelt, dass die Detektion eines Aggregates vor einem Hintergrundsignal, welches z. B. durch ein gerätespezifisches Rauschen, andere unspezifische Signale oder unspezifisch gebundene Sonden verursacht wird, erlaubt. Auf diese Weise werden so viele Werte ausgelesen (Read-out- Werte), wie ortsaufgelöste Ereignisse, wie z. B. Pixel, vorhanden sind. Durch die Ortsauflösung wird jedes Ereignis vor dem jeweiligen Hintergrund bestimmt und stellt so einen Vorteil gegenüber ELISA- Verfahren ohne ortsaufgelöstes Signal dar. In einer Ausführung beruht die ortsaufgelöste Bestimmung des Sondensignals auf der Untersuchung eines kleinen Volumenelements im Vergleich zum Volumen der Probe, im Bereich von wenigen Femtolitern bis unterhalb eines Femtoliters, oder eines Volumenbereichs oberhalb der Kontaktoberfläche der Fängermoleküle mit einer Höhe von 500 nm, bevorzugt 300 nm, besonders bevorzugt 250 nm, insbeson- dere 200 nm, aber auch 150 nm und 90 nm. Im Sinne der Erfindung handelt es sich bei Aggregaten entweder um homogene Aggregate, bestehend aus mindestens zwei gleichen Monomereinheiten, oder heterogenen Aggregaten bestehend aus mindestens zwei unterschiedlichen Monomereinheiten. Im Falle von heterogenen Aggregaten können auch beide Monomere in ihrer Primärsequenz identisch sein, sich aber in ihrer Konformation unterscheiden.
In einer Ausführung wird das Material des Substrats ausgewählt aus der Gruppe enthaltend oder bestehend aus Kunststoff, Silizium und Siliziumdioxid. In einer bevorzugten Alternative wird als Substrat Glas eingesetzt.
In einer weiteren Ausführung der Erfindung sind die Fängermoleküle kovalent an das Substrat gebunden.
Hierzu wird in einer Alternative ein Substrat eingesetzt, das eine hydrophile Oberfläche aufweist. In einer Alternative wird dies durch das Auftragen einer hydrophilen Schicht, vor Schritt a), auf das Substrat erreicht. Mithin binden die Fängermoleküle kovalent an das Substrat bzw. an die hydrophile Schicht, mit welcher das Substrat beladen ist.
Die hydrophile Schicht ist eine Biomolekül-abweisende Schicht, so dass die unspezifische Bindung von Biomolekülen an das Substrat minimiert wird. Auf diese Schicht werden optional die Fängermoleküle, bevorzugt kovalent, immobilisiert. Diese sind affin gegenüber einem Merkmal der Monomere oder deren Aggregaten. Die Fänger- moleküle können alle identisch sein, oder Mischungen unterschiedlicher Fängermoleküle sein.
In einer Alternative werden als Fängermoleküle und Sonden dieselben Moleküle eingesetzt, bevorzugt enthalten die Fängermoleküle kein Detektionsmolekül bzw. Molekülteile. In einer Ausführung wird die hydrophile Schicht ausgewählt aus der Gruppe enthaltend oder bestehend aus PEG, Poly-Lysin, bevorzugt Poly-D-Lysin, und Dextran oder Derivate davon, bevorzugt Carboxymethyl-Dextran (CMD). Derivate im Sinne der Erfindung sind Verbindungen, die sich in einigen Substituenten von den Stammverbindungen unterscheiden, wobei die Substituenten gegenüber dem erfindungs- gemäßen Verfahren inert sind. In einer Ausführung wird die Oberfläche des Substrats vor Auftrag der hydrophilen Schicht zunächst hydroxyliert und anschließend mit geeigneten chemischen Gruppen, bevorzugt Aminogruppen, funktionalisiert. Diese Funktionalisierung mit Amino- gruppen erfolgt in einer Alternative durch in Kontaktbringen des Substrats mit Amino- silanen, bevorzugt APTES (3-Aminopropyltrietoxysilan), oder mit Ethanolamin.
Zur Vorbereitung des Substrats auf die Beschichtung können ein oder mehrere der folgenden Schritte durchgeführt werden:
• Waschen eines Substrats aus Glas bzw. eines Glasträgers im Ultraschallbad oder Plasma-cleaner, alternativ dazu in 5 M NaOH mindestens 3 Stunden inkubieren,
• Spülen mit Wasser und anschließendem Trocknen unter Stickstoff oder unter Vakuum,
• Eintauchen in eine Lösung aus konzentrierter Schwefelsäure und Wasserstoffperoxid im Verhältnis 3:1 für die Aktivierung der Hydroxylgruppen, · Spülen mit Wasser bis zu einem neutralen pH, anschließend mit Ethanol und
Trocknen unter Stickstoffatmosphäre,
• Eintauchen in eine Lösung mit 3-Aminopropyltrietoxysilan (APTES) (1 - 7 %), bevorzugt in trockenem Toluol, oder einer Lösung von Ethanolamin,
• Spülen mit Aceton oder DMSO und Wasser und Trocknen unter Stickstoffatmosphäre.
In einer Alternative erfolgt das in Kontakt bringen des Substrats mit Aminosilanen, bevorzugt APTES, in der Gasphase; das gegebenenfalls vorbehandelte Substrat wird mithin mit den Aminosilanen bedampft.
Für die Beschichtung mit Dextran, bevorzugt Carboxymethyl-Dextran (CMD), wird das Substrat mit einer wässrigen Lösung von CMD (in einer Konzentration von 10 mg/ml oder 20 mg/ml) und mit einem Katalysator für die Kovalente Kopplung, gegebenenfalls N-Ethyl-N-(3-Dimethylaminpropyl) Carbodiimid (EDC), (200 mM) und N- Hydroxysuccinimid (NHS), (50 mM) inkubiert, und anschließend gewaschen. Das Carboxymethyl-Dextran ist in einer Variante kovalent an die Glasoberfläche gebunden, die zunächst hydroxyliert und anschließend mit Amingruppen funktionali- siert wurde, wie oben beschrieben.
Als Substrat können Mikrotiterplatten, bevorzugt mit Glasboden, eingesetzt werden. Da bei der Verwendung von Polystryrolrahmen der Einsatz von konzentrierter
Schwefelsäure nicht möglich ist, erfolgt die Aktivierung der Glasoberfläche in einer Ausführungsvariante der Erfindung analog.
Auf diese hydrophile Schicht werden, bevorzugt kovalent, Fängermoleküle immobilisiert, welche affin gegenüber einem Merkmal (z. B.: Proteine) des Aggregats sind. Die Fängermoleküle können alle identisch sein oder Mischungen verschiedener Fängermoleküle sein.
In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung werden die Fängermoleküle, bevorzugt Antikörper gegen Monomere des Aggregats, gegebenenfalls nach einer Aktivierung des mit CMD beschichteten Trägers durch eine Mischung aus EDC/NHS, be- vorzugt 200 bzw. 50 mM, auf dem Substrat immobilisiert.
Verbleibende Carboxylat-Endgruppen, an die keine Fängermoleküle gebunden wurden, können deaktiviert werden. Zur Deaktivierung dieser Carboxylat-Endgruppen auf dem CMD-Spacer wird Ethanolamin verwendet. Vor dem Auftrag der Proben werden die Substrate bzw. Träger gegebenenfalls mit Puffer gespült. In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung, wird das Substrat vor dem Auftragen der Probe mit Protein oder Peptid haltigen Lösungen geblockt und mit Puffer gewaschen.
Die zu vermessende Probe wird mit dem so präparierten Substrat in Kontakt gebracht und gegebenenfalls inkubiert. Als zu untersuchende Probe können unter- schiedlich formulierte Lösungen des biopharmazeutischen Produktes, des Produkts in Zellüberständen und Kulturmedien oder körpereigene Flüssigkeiten eingesetzt werden. In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung wird die Probe ausgewählt aus Liquor (CSF), Blut, Plasma und Urin. Die Proben können unterschiedliche, dem Fachmann bekannte, Aufbereitungsschritte durchlaufen. In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung erfolgt das Auftragen der Probe unmittelbar auf dem Substrat (nichtbeschichteten Substrat), gegebenenfalls durch kova- lente Bindung auf der gegebenenfalls aktivierten Oberfläche des Substrats.
In einer Variante der vorliegenden Erfindung erfolgt eine Vorbehandlung der Probe nach einem oder mehreren der folgenden Verfahren:
- Erhitzen der Probe,
- Ein oder mehrere Gefrierauftauzyklen,
- Mechanischer Aufschluss,
- Homogenisierung der Probe, - Verdünnen mit Wasser oder Puffer,
- Behandlung mit Enzymen, zum Beispiel Nuklease, Lipasen,
- Zentrifugieren,
- Kompetition mit Sonden, um eventuell vorhandene Antikörper zu verdrängen.
Bevorzugt wird die Probe unmittelbar und/oder ohne Vorbehandlung mit dem Sub- strat in Kontakt gebracht.
Unspezifisch gebundene Substanzen können durch Waschschritte entfernt werden.
In einem weiteren Schritt werden immobilisierte Aggregate mit einer oder mehreren für die weitere Detektion dienlichen Sonden markiert. Wie oben beschrieben können die einzelnen Schritte auch in einer anderen Reihenfolge erfindungsgemäß durchge- führt werden.
Durch geeignete Waschschritte werden überschüssige Sonden, die nicht an die Aggregate gebunden sind, entfernt.
In einer Alternative werden diese überschüssigen Sonden nicht entfernt. Dadurch entfallen die letzten Waschschritte und es findet auch keine Gleichgewichtsverschie- bung in Richtung der Dissoziation der Aggregat-Sonden-Komplexe oder - Verbindungen statt. Durch die orts-aufgelöste Detektion werden die überschüssigen Sonden bei der Auswertung nicht erfasst und beeinträchtigen die Messung nicht.
In einer Variante werden die Proben-Fängermolekül-Komplexe chemisch fixiert.
In einer Alternative werden Detektionssonden-Proben-Fängermolekül-Komplexe chemisch fixiert und somit auch die Proben-Fängermolekül-Komplexe.
In einer besonderen Ausführung des Verfahrens sind die Bindungsstellen der Aggregat Epitope und die Fängermoleküle und Sonden Antikörper. In einer Variante der vorliegenden Erfindung können Fängermoleküle und Sonden identisch sein.
In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung unterscheiden sich Fängermoleküle und Sonden. So können z. B. unterschiedliche Antikörper als Fängermoleküle und als Sonden eingesetzt werden.
In einer weiteren Ausführung der vorliegenden Erfindung werden Fängermoleküle und Sonden eingesetzt, die mit Ausnahme der eventuellen (Farbstoff-) Markierung identisch zueinander sind. In einer weiteren Alternative der vorliegenden Erfindung werden verschiedene Sonden eingesetzt, die mit Ausnahme der eventuellen (Farbstoff-) Markierung identisch zueinander sind.
In weiteren Alternativen der vorliegenden Erfindung werden mindestens zwei oder mehrere unterschiedliche Fängermoleküle und/oder Sonden eingesetzt, die unter- schiedliche Antikörper enthalten und gegebenenfalls auch unterschiedliche Farb- stoffmarkierung haben.
In einer Alternative des Erfindung werden zwei oder mehrere Sonden mit entsprechenden Farbstoffen markiert, dass ein FRET, ein sogenannter Förster resonanter Energie Transfer, stattfindet wobei ein Farbstoff angeregt wird und ein anderer in der Nähe befindlicher emittiert, wobei es sich bei beiden Farbstoffen um unterschiedliche Moleküle handelt.
Zur Detektion sind die Sonden so gekennzeichnet, dass sie ein optisch detektier- bares Signal aussenden, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fluoreszenz-, Phosphoreszenz, Biolumineszenz-, Chemolumineszenz und Elektrochemolumines- zenz-Emission sowie Absorption.
In einer Alternative sind die Sonden somit mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Als Fluoreszenzfarbstoff können die dem Fachmann bekannten Farbstoffe eingesetzt werden. Alternativ können auch fluoreszente Biomoleküle, bevorzugt GFP (Green Fluorescence Protein), Konjugate und/oder Fusionsproteine davon, sowie fluoreszente Nanopartikel, bevorzugt Quantendots verwendet werden.
Zur späteren Qualitätskontrolle der Oberfläche, zum Beispiel Gleichmäßigkeit der Beschichtung mit Fängermolekülen, können Fängermoleküle, gekennzeichnet mit Fluoreszenzfarbstoffen, eingesetzt werden. Hierzu wird bevorzugt ein Farbstoff verwendet, der nicht mit der Detektion interferiert. Dadurch wird eine nachträgliche Kontrolle des Aufbaus möglich sowie eine Normierung der Messergebnisse.
Die Detektion der immobilisierten und markierten Aggregate erfolgt mittels Abbildung der Oberfläche (z. B. Laser Mikroskopie). Eine möglichst hohe Ortsauflösung ermittelt eine hohe Anzahl an Bildpunkten, wodurch die Sensitivität sowie die Selektivität des Assays erhöht werden können, da strukturelle Merkmale mit abgebildet und analysiert werden können. Somit erhöht sich das spezifische Signal vor dem Hintergrundsignal (z. B. unspezifisch gebundener Sonden).
Die Detektion erfolgt bevorzugt mit konfokaler Fluoreszenzmikroskopie, Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS), insbesondere in Kombination mit Kreuzkorrelation und Laser-Scanning-Mikroskop (LSM).
Die Detektion bzw. der Nachweis wird in einer Alternative der vorliegenden Erfindung mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop durchgeführt.
In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung wird ein Laserfokus, wie er z. B. in der Laser-Scanning-Mikroskopie verwendet wird, oder ein FCS (Fluorescence Corre- lation Spectroscopy System) dazu eingesetzt, sowie die entsprechenden superauflösenden Varianten wie zum Beispiel STED, PALM oder SIM.
In einer weiteren Ausführung kann die Detektion bzw. der Nachweis mittels ortsauflösender Fluoreszenzmikroskopie, bevorzugt durch ein TIRF-Mikroskop erfolgen, so- wie die entsprechenden superauflösenden Varianten davon, wie zum Beispiel STORM, dSTORM.
Im Unterschied zu ELISA entstehen durch diese Verfahren so viele Readout-Werte, wie Orts-aufgelöste Ereignisse (z. B. Pixel) vorhanden sind. Abhängig von der Anzahl 5 an unterschiedlichen Sonden wird diese Information sogar vervielfacht. Diese Vervielfachung gilt für jedes Detektionsereignis und führt zu einem Informationsgewinn, da sie weitere Eigenschaften (z. B. zweites Merkmal) über Aggregate offenbart. Durch so einen Aufbau kann für jedes Ereignis die Spezifität des Signales erhöht werden.
Die Sonden können derart ausgewählt werden, dass im Falle von heterogenen Agi o gregaten die Anwesenheit von einzelnen Bestandteilen oder Konformationen, das Messergebnis nicht beeinflussen. Die Sonden können derart ausgewählt werden, dass homogene und heterogene Aggregate und unterschiedliche heterogene Aggregate in einer Messung bestimmt werden können.
Zur Auswertung werden die ortsaufgelösten Informationen (z. B. die Fluoreszenz- 15 Intensität) aller eingesetzten und detektierten Sonden herangezogen, um z. B. die Anzahl Aggregate, deren Größe und deren Merkmale zu bestimmen. Dabei können z. B. auch Algorithmen der Hintergrundminimierung und/oder auch Intensitäts- Schwellenwerte für die weitere Auswertung sowie der Mustererkennung angewandt werden. Weitere Bildanalyse-Optionen beinhalten z. B. die Suche nach lokalen In- 0 tensitätsmaxima, um aus der Bildinformation die Zahl an detektierten Aggregaten zu erhalten.
Um die Testergebnisse miteinander über Entfernungen, Zeiten und Experimentatoren hinweg vergleichbar zu machen, können Standards z. B. interne und/oder externe Standards eingesetzt werden. Diese Standards können auch zur Kalibration der 5 Messung dienen, um die Größenverteilung, Quantität und/oder Zusammensetzung von Aggregaten biopharmazeutischer Produkte festzustellen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Standards, die eine enge Größenverteilung aufweisen und die aus zwei oder mehreren identischen oder unterschiedlichen Polypeptidsequenzen bestehen. Bei den Po- 30 lypeptidsequenzen kann es sich auch um die native monomere Form des biopharmazeutischen Wirkstoffs handeln. In einer Variante besteht der Standard aus einer Mischung verschiedener Größenverteilungen.
In einer Variante ist der Standard markiert.
In einer Variante besteht der Standard aus zwei oder mehreren Monomeren, die kovalent miteinander verknüpft sind.
In einer Variante besteht der Standard aus einem Nanopartikel, an dessen Oberfläche zwei oder mehrere Monomere oder eine Polypeptidsequenz kovalent gebunden sind und die Polypeptidsequenz identisch in einem Teilbereich mit der Sequenz des Monomers der biotherapeutischen Substanzen ist. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Kit, enthaltend eine oder mehrere der folgenden Komponenten:
Substrat, ggf. mit hydrophiler Oberfläche, Fängermolekül, Sonde, Standard, Substrat mit Fängermolekül, Lösungen, Puffer.
Die Verbindungen und/oder Komponenten des Kits der vorliegenden Erfindung kön- nen in Behältern gegebenenfalls mit/in Puffern und/oder Lösung, verpackt sein. Alternativ können einige Komponenten in demselben Behälter verpackt sein. Zusätzlich dazu oder alternativ dazu könnten eine oder mehrere der Komponenten an einem festen Träger, wie z. B. einer Glasplatte, einem Chip oder einer Nylonmembran oder an die Vertiefung einer Mikrotiterplatte, adsorbiert sein. Ferner kann das Kit Anwei- sungen für den Gebrauch des Kits für eine Beliebige der Ausführungsformen enthalten.
In einer weiteren Variante des Kits sind auf dem Substrat die oben beschriebenen Fängermoleküle immobilisiert. Zusätzlich kann das Kit Lösungen und/oder Puffer enthalten. Zum Schutz der Biomolekül-abstoßenden Oberfläche (z. B. Dextranober- fläche) und/oder der darauf immobilisierten Fängermoleküle können diese mit einer Lösung oder einem Puffer überschichtet werden. In einer Alternative enthält die Lösung ein oder mehrere Biozide, welche die Haltbarkeit der Oberfläche erhöhen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Nachweis von homogene und heterogene Aggrega- te von und in biopharmazeutischen Produkten in beliebigen Proben, zur Quantifizierung (Titerbestimmung) von homogenen und heterogenen Aggregaten von und in biopharmazeutischen Produkten, direkte und/oder absolute Quantifizierung der Partikelzahl. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Optimierung und Überwachung von Prozess- Schritten während der Produktion von biopharmazeutischen Wirkstoffen und/oder Qualitätsbestimmung von End-Produkten.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des erfin- dungsgemäßen Verfahrens zur Detektion von homogenen und heterogenen Aggregaten von biopharmazeutischen Produkten in klinischen Tests, Studien als auch beim Therapie-Monitoring werden. Hierzu werden Proben gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren vermessen und die Ergebnisse verglichen.
Ausführungsbeispiele: Im Weiteren wird die Erfindung an Hand eines Ausführungsbeispiels und der beigefügten Figur erläutert, ohne dass es hierdurch zu einer Einschränkung auf dieses spezielle Ausführungsbeispiel kommt.
Es zeigen:
Fig. 1 Aggregate (schraffierte Balken) und Monomere (weiße Balken) des humanen IgG Antikörper als Probe.
Die Figur 1 zeigt Aggregate (schraffierte Balken) und Monomere (weiße Balken) des humanen IgG Antikörper (Isotypen Kontrolle, ThermoFisher Scietific, RF237824) in einer dekadischen Verdünnungsreihe.
Als Monomer wurde der Antikörper, so wie er vorlag, verwendet und in salinem Phosphat Puffer (PBS) bei pH 7,4 verdünnt. Für die Herstellung von Aggregaten wurde die Probe (5 mg/ml) für 10 min bei 70°C erhitzt und nach Erreichen von 25°C dekadisch verdünnt.
Die Ergebnisse zeigen einen linearen Zusammenhang zwischen der Konzentration und dem Messsignal über 6 Log Stufen. Monomere hingegen zeigen über weite Bereiche weit geringere Messsignale. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass selbst in der Monomer Lösung geringe Aggregatmengen vorhanden waren, welche für Werte bei hohen Konzentrationen verantwortlich waren. Als Negativkontrolle (schwarzer Balken) wurde der Verdünnungspuffer verwendet. Konkrete Ausführung
Für das Experiment wurden kommerzielle Mikrotiter Platten (Greiner Bio-one; Sensopiate Plus) mit 384 Reaktionskammern (RK) und Glasboden als Substrat verwendet.
Zunächst wurde die Oberfläche der Mikrotiterplatte aufgebaut bzw. funktionalisiert. Hierfür wurde die Platte in einen Exsikator platziert, in dem sich eine Schale mit
5%igem APTES in Toluol befand. Der Exsikator wurde mit Argon geflutet und eine Stunde inkubiert. Danach wurde die Schale entfernt und die Platte für 2 Stunden im Vakuum getrocknet. In die Reaktionskammer der trockenen Platte wurden 20 μΙ einer 2 mM Lösung an SC-PEG-CM (MW 3400; Laysan Bio) in deionisiertem H2O zur hydrophilen Beschichtung eingefüllt und für 4 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Reaktionskammer dreimal mit Wasser gewaschen und im Anschluss mit je 20 μΙ einer wässrigen 200 mM EDC-Lösung (1-Ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl)carbodiimide; Sigma) und mit 50 mM NHS (N- Hydroxysuccinimide, Sigma) für 30 Minuten inkubiert. Hierdurch erhält die hydrophile Beschichtung mit PEG eine Funktionalität zur Kopplung von Biomolekülen.
Die Platte wurde wieder dreimal mit deionisertem Waser gewaschen. Danach wurden die Reaktionskammer mit Klon 8A4 (Thermo-Fischer), einem monoklonalen Antikörper als Fängermolekül, der spezifisch die CH2 Domäne im FC Teil von humanen Antikörpern bindet, beschichtet (20μΙ; 10 pg/ml in PBS; 1 Stunde). Anschließend wurde die Reaktionskammer mit dem Waschprogramm bestehend aus jeweils dreimal Waschen und Leersaugen mit TBS mit 0,1 % Tween-20 und TBS behandelt.
Im nächsten Schritt wurden die Reaktionskammer mit 50 μΙ Smartblock (Candor Bioscience GmbH) über Nacht bei Raumtemperatur (RT) beschichtet und nach Ablauf der Zeit wieder dreimal mit salinem tris(hydroxymethyl)aminomethan (TBS;
pH=7,4) gewaschen. Die Proben wurden sequentiell in tris(hydroxymethyl)aminomethan (TRIS) Puffer mit Farbstoff Hoechst Stain (1 pg ml-1 ) verdünnt und für eine Stunde inkubiert. Danach wurde in dreifacher Ausführung je 20 μΙ Probe in die Reaktionskammer aufgetragen und bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Re- aktionskammer dreimal mit TBS gewaschen und mit 20 μΙ Detektionsantikörper versetzt. Die Detektionsantikörper wurden jeweils mit einer Art Fluoreszenzfarbstoff markiert: Separat wurde 8A4 (ThermoFisher Scientific, MA1-81864,) mit Fluores- zensfarbstoffen CF488 und mit CF633 markiert. Diese Sondenantikörper bzw Detektionsantikörper wurden zusammen in TBS zu einer finalen Konzentration 1 ,25 ng/ml für jeden Antikörper verdünnt. Sie binden spezifisch Epitope der Monomere und Aggregate der biotherapeutischen Substanz.
Je Reaktionskammer wurden 20 μΙ Antikörperlösung aufgetragen und für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Ablauf der Zeit wurde die Platte dreimal mit TBS gewaschen und die Platte mit einer Folie versiegelt. Zum Nachweis der Aggregate wurde eine ortsaufgelöste Mikroskopie durchgeführt. Die Messung erfolgte im TIRF Mikroskop (Leica) mit einem 100 fach Öl Immersionsobjektiv. Hierfür wurde der Glasboden der Mikrotiterplatte reichlich mit Immersions-Öl bestrichen und die Platte in die automatisierte Bühne des Mikroskops eingebracht. Danach wurde je Reaktionskammer an 5 x 5 Positionen in zwei Fluoreszenzkänalen (Ex/Em=633/715 nm und 488/525 nm) je ein Bild (1000 x 100 pixel) konsekutiv aufgenommen um so viele Datenpunkte zu erhalten, dass die Detektion einzelner Aggregate vor dem Hintergrundsignal möglich wurde. Es wurde die maximale Laserleistung (100%), eine Belichtungszeit von 500 ms und ein Verstärkungswert von 800 gewählt. Die Bilddaten wurden danach ausgewertet. Intensitätsschwellenwerte wurde für jeden Kanal bei 0,0001 % Graustufen der gemittelten negativ Kontrolle im entsprechenden Kanal gesetzt. Im Auswertungsschritt wurde zunächst für jedes Bild in jedem Kanal der Intensitätsschwellenwert angewandt und anschließen Bilder gleicher Position in beiden Werten miteinander verglichen. Es wurden nur jene Pixel pro Bild gezählt bei denen in beiden Kanälen der Pixel an der exakt gleichen Position über dem Intensitätsschwellenwert des Kanals liegt. Abschließend wird die Anzahl der
Pixel über alle Bilder in jedem RK gemittelt und danach die Mittelwerte der Mittleren Pixelzahlen der Replikatwerte ermittelt und die Standardabweichung angegeben. Die Werte sind in der Figur 1 gezeigt.
Diese Kalibrationsreihe kann dann als Einstieg dienen in komplexere Nachweis- Verfahren biotherapeutischer Substanzen, im konkreten Fall des IgG, welches sich als biotherapeutische Substanz in Lösung eines pharmatzeutischen Präparats als Probe befinden kann und auf Aggregate hin untersucht werden soll. Der fluoreszierende Sonden-Antikörper kann dabei nicht an einem Fängermolekül gebundenes Monomer binden, da dessen Bindungsstelle durch das Fängermolekül belegt ist. Er bindet stattdessen nur an die Monomerepitope der Aggregate. Dieses wird somit auf die gezeigte Weise quantifizierbar.
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Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
Verfahren zum Nachweis von Aggregaten biotherapeutischer Substanzen in einer Probe, umfassend folgende Schritte: a. Auftragen der zu untersuchenden Probe auf ein Substrat, b. Hinzufügen von für den Nachweis geeigneten Sonden, die durch
spezifische Bindung an die Aggregate biotherapeutischer Substanzen diese markieren und c. Nachweis der markierten Aggregate biotherapeutischer Substanzen wobei Schritt b) vor Schritt a) durchgeführt werden kann.
Verfahren nach Anspruch 1 ,
dad urch geken nzeichnet, dass
vor Schritt a) eine Immobilisierung von Fängermolekülen für die Aggregate auf dem Substrat erfolgt.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dad urch gekennzeichnet, dass
eine Vorbehandlung der Probe erfolgt.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dad u rch geken nzeichnet, dass
ein Substrat aus Glas verwendet wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche 1 bis 3
dad urch geken nzeichnet, dass
ein Substrat aus Kunststoff verwendet wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dad urch gekennzeichnet, dass
das Substrat eine hydrophile Beschichtung aufweist.
7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dad u rch geken nzeichnet, dass
das Substrat mit Dextran beschichtet ist.
8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dad urch gekennzeich net, dass
das Substrat mit Polyethylenglycol beschichtet ist.
9. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dadurch geken nzeichnet, dass
die Dextran-Beschichtung eine Funktionalität zur Kopplung von Biomolekülen besitzt.
10. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dad urch geken nzeichnet, dass
die Polyethylenglykol-Beschichtung eine Funktionalität zur Kopplung von Biomolekülen besitzt.
1 1. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dad u rch geken nzeichnet, dass
das Substrat mit einer Funktionalität zur Kopplung von Biomolekülen beschichtet ist.
12. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dad urch gekennzeich net, dass
das die hydrophile Beschichtung mit einer Funktionalität zur Kopplung von Biomolekülen beschichtet ist.
13. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dad u rch geken nzeichnet, dass
die Fängermoleküle an das Substrat oder an die Beschichtung gebunden sind.
14. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dad u rch gekennzeichnet, dass
die Fängermoleküle Antikörper oder Fragmente von Antikörpern sind.
15. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dad u rch gekennzeichnet, dass
die Fängermoleküle Aptamere sind.
16. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dad urch geken nzeich net, dass
die Fängermoleküle spezifisch ein oder mehrere Epitope des Monomers biotherapeutischer Substanzen binden.
17. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dad u rch gekennzeichnet, dass
die Fängermoleküle spezifisch Aggregate biotherapeutischer Substanzen binden.
18. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dad urch geken nzeichnet, dass
die Sondenmoleküle spezifisch ein oder mehrere Epitope des Monomers einer biotherapeutischen Substanz binden.
19. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dad u rch gekennzeich net, dass
die Sondenmoleküle spezifisch Aggregate einer biotherapeutischen Substanz binden.
20. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dad u rch gekennzeich net, dass
die Sondenmoleküle mit einem detektierbaren Molekül gekennzeichnet sind.
21 . Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dadu rch geken nzeichnet, dass
die Sondenmoleküle mit Fluoreszenzfarbstoffen gekennzeichnet sind.
22. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dad u rch geken nzeich net, dass
ein oder mehrere unterschiedliche Sondenmoleküle eingesetzt werden.
23. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dad u rch geken nzeichnet, dass
eine Mischung aus unterschiedlichen Sondenmolekülen mit unterschiedlich gekennzeichneten detektierbaren Molekülen eingesetzt werden.
24. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dad u rch gekennzeichnet, dass
eine Mischung aus gleichen Sondenmolekülen mit unterschiedlich
gekennzeichneten detektierbaren Molekülen eingesetzt werden.
25. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dad u rch gekennzeich net, dass
die Detektion mittels ortsauflösender Mikroskopie durchgeführt wird.
26. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dad urch geken nzeich net, dass
die Detektion mittels ortsauflösender Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt wird.
27. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dadu rch gekennzeichnet, dass
die Detektion mittels konfokaler Fluoreszenzmikroskopie, Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS), optional in Kombination mit Kreuzkorrelation und Single-Particle-Immunosolvent Laserscanning-Assay, Laser-Scanning- Mikroskopie (LSM), Weitfeld-Mikroskopie und/oder TIRF-Mikroskopie, sowie die entsprechenden superauflösenden Varianten STED, SIM, STORM, dSTORM, durchgeführt wird.
28. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dad u rch gekennzeichnet, dass
bei der Detektion so viele Datenpunkte gesammelt werden, dass die Detektion eines einzelnen Aggregates vor dem Hintergrundsignal ermöglicht ist.
29. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass
ein interner oder externer Standard zur Quantifizierung und Größenbestimmung von Aggregaten biotherapeutischer Substanzen eingesetzt wird.
30. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dadurch geken nzeichnet, dass
der Standard zur Quantifizierung und Größenbestimmung von Aggregaten biotherapeutischer Substanzen aus den Monomeren der biotherapeutischen Substanz besteht.
31. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche,
dad u rch gekennzeichnet, dass
der Standard zur Quantifizierung und Größenbestimmung von Aggregaten biotherapeutischer Substanzen aus den Monomeren der biotherapeutischen Substanz besteht kovalent stabilisiert wurde.
32. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dad urch geken nzeichnet, dass
der Standard zur Quantifizierung und Größenbestimmung von Aggregaten biotherapeutischer Substanzen ein Partikel ist, an den zwei oder mehreren identische oder unterschiedliche Polypeptidsequenzen gebunden sind, die bezüglich ihrer Sequenz identisch im entsprechenden Teilbereich der
Sequenzen der Monomere biotherapeutischer Substanzen sind, welche von Fänger- und/oder Sondenmolekülen gebunden werden.
33. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dad urch gekennzeichnet, dass
der Standard zur Quantifizierung und Größenbestimmung von Aggregaten biotherapeutischer Substanzen ein Partikel ist, an den zwei oder mehrere Monomere der biotherapeutischen Substanz gebunden werden.
34. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche,
geken nze ichnet d u rch
die Wahl eines Partikels aus Silika.
35. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche,
geken nzeichnet d u rch
die Wahl eines Partikels mit einer hydrophilen Beschichtung.
36. Kit, zur selektiven Quantifizierung von Aggregaten biopharmazeutischer Wirkstoffe nach einem der vorangehenden Ansprüche, enthaltend eine oder mehrere der folgenden Komponenten:
• Substrat;
• Sonden-Moleküle, die durch spezifische Bindung an die Aggregate biotherapeutischer Substanzen binden;
• Optional: Standard;
• Optional: Fängermolekül.
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