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PATENTANSPRUCH I
Verfahren zum Nachweis eines spezifischen Proteins in eine Lösung gemäss dem Patentanspruch I des Hauptpatentes, dadurch gekennzeichnet, dass man zum Nachweis eines Antigens oder Antikörpers die Platte in eine wässrige Lösung eines mit dem Antigen spezifisch reagierenden Antikörpers bzw. eines mit dem Antikörper spezifisch reagierenden Antigens taucht.
UNTERANSPRÜCHE
1. Verfahren gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Antigen ein Protein verwendet wird.
2. Verfahren gemäss Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man die Platte mit einem geschlossenen Metallfilm überzieht.
3. Verfahren gemäss Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man ein die Platte schlecht benetzendes Metall, vorzugsweise Indium, Gold, Silber, Zinn oder Blei, so auf die vorzugsweise aus Glas, Kunststoff, glasartigem Siliciumdioxid, Glimmer oder Quarz bestehende Platte aufdampft, dass es sich in Form von Kügelchen abscheidet.
4. Verfahren gemäss einem der Unteransprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man die Prüfung, ob an der Platte eine bi- oder monomolekulare Schicht haftet, durchführt, indem man an der Schicht eine elektrische Kapazität misst, vorzugsweise indem man auf der oberen Oberfläche der Schicht eine zweite Elektrode anordnet, insbesondere in Form eines Quecksilbertropfens, und die Katazität gegenüber der metallischen Oberfläche des Substrats als erster Elektrode misst.
5. Verfahren gemäss einem der Unteransprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man auf die Platte ein Metall, das mit Quecksilber sichtbar amalgamiert, aufbringt, und dass man die Prüfung, ob an der Platte eine bi- oder monomolekulare Schicht haftet, durchführt, indem man auf die obere Oberfläche der Schicht einen Tropfen Quecksilber aufbringt und die Zeit bis zum Auftreten des Amalgams misst.
6. Verfahren gemäss einem der Unteransprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man die Prüfung, ob an der Platte eine bi- oder monomolekulare Schicht haftet, durchführt, indem man auf die obere Oberfläche der Schicht nach dem Eintauchen in die zu untersuchende Probe eine zweite Metallschicht, vorzugsweise durch galvanische Abscheidung, aufbringt und die Platte im reflektierten Licht betrachtet.
7. Verfahren gemäss einem der Unteransprüche 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, dass man Indium bei einem Druck von etwa 5.10-5 Torr aus einem Tantaltrog auf die Platte aufdampft.
8. Verfahren gemäss einem der Unteransprüche 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, dass man die Platte zur Prüfung, ob eine bi- oder monomolekulare Schicht daran haftet, mit dem Metall und der Schicht nach unter auf die Oberfläche einer Flüssigkeit aufbringt.
9. Verfahren gemäss einem der Unteransprüche 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, dass man die Prüfung, ob an der Platte eine bi- oder monomolekulare Schicht haftet, durchführt, indem man das Substrat in ein die immunologische Bindung spaltendes Reagens, vorzugsweise eine schwache Säure, eintaucht und die Veränderung der Schichtdicke mit einem Ellipsometer beobachtet,
10. Verfahren gemäss Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Eintauchen in die Lösung auf das Metall eine Metalloxidschicht aufgebracht wird, wobei das Metall vorzugsweise Titan und das Metalloxid Titandioxid ist.
11. Verfahren gemäss Patentanspruch I und Unteranspruch 10 zum Nachweis von Gonorrhoe, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat mit einer monomolekularen Schicht aus Neisseria-Gonorrhoe-Antigen überzogen wird.
12. Verfahren gemäss Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass die Platte zum Nachweis von Antikörpern zur
Hepatitis mit einer monomolekularen Schicht des mit der Hepatitis verbundenen Antigens und zum Nachweis von
Antigenen zur Hepatitis mit einer monomolekularen Schicht des antikörpers zum mit der Hepatitis verbundenen Antigen überzogen wird.
PATENTANSPRUCH II
Vorrichtung nach Patentanspruch II des Hauptpatentes zur Durchführung des Verfahrens gemäss Patentanspruch I hiervor, dadurch gekennzeichnet, dass die monomolekulare Schicht mit dem nachzuweisenden Antigen spezifisch reagierende Antikörper bzw. mit dem nachzuweisenden Antikörper spezifisch reagierende Antigene enthält.
UNTERANSPRÜCHE
13. Vorrichtung gemäss Patentanspruch II, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen ein Protein ist.
14. Vorrichtung gemäss Patentanspruch II, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Vielzahl von unterschiedlichen monomolekularen Schichten aufweist, von denen jede einen Teil des Substrats und der Metallkügelchen bedeckt.
15. Vorrichtung gemäss Patentanspruch II, dadurch gekennzeichnet, dass die Metallkügelchen Indiumteilchen mit Durchmessern im Bereich von 1 bis 200 nm sind.
16. Vorrichtung gemäss Unteranspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Metallkügelchen Gold, Tantal, Indium, Titan oder mit Titandioxid bedecktes Titan enthalten.
17. Vorrichtung gemäss Unteranspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Metallkügelchen Gold und ein anderes Metall zur Verbesserung der Haftfähigkeit zwischen dem Gold und dem Substrat enthalten, wobei das andere Metall vorzugsweise eine Legierung mit dem Gold bildet.
18. Vorrichtung gemäss Patentanspruch II, zur Diagnose einer Schwangerschaft, dadurch gekennzeichnet, dass die monomolekulare Schicht der spezifisch reagierende Antikörper für das HCG-Antigen ist.
19. Vorrichtung gemäss Patentanspruch II, zum Nachweis von Hepatitis, dadurch gekennzeichnet, dass die monomolekulare Schicht das mit der Hepatitis verbundene Antigen oder der Heptitis-Antikörper ist.
20. Vorrichtung gemäss Patentanspruch II, zum Nachweis von Gonorrhoe, dadurch gekennzeichnet, dass die monomolekulare Schicht der Antikörper zum Neisseria-Gonorrhoe Antigen ist.
Der Patentanspruch I des Hauptpatentes betrifft ein Verfahren zum Nachweis eines spezifischen Proteins in einer Lösung, wobei man ein Metall auf eine Platte aus lichtdurchlässigem Material aufbringt, die beschichtete Platte durch Eintauchen in eine Lösung eines mit dem nachzuweisenden Protein spezifisch reagierenden Proteins mit einer monomolekularen Schicht dieses spezifisch reagierenden Proteins bedeckt, die so behandelte Platte in die zu untersuchende Lösung taucht und schliesslich prüft, ob an der Platte eine bimolekulare oder monomolekulare Proteinschicht haftet.
Der Patentanspruch II des Hauptpatentes betrifft eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens gemäss Patentanspruch I, mit einem Substrat mit einer Vielzahl von Metallkügelchen, die an einer Oberfläche des Substrates haften, und einer monomolekularen Schicht eines immunologisch reaktiven Proteins, die mindestens einen Teil des Substrates und der Metallkügelchen bedeckt.
Veröffentlichungen, die in erster Linie Hintergrundmaterial für die vorliegende Erfindung bilden, sind: aOptimal Measurement of the Thickness of a Film Adsorbed from a Solution von Irving Langmuir et al in Journal of the American Chemical Society, Band 59 (Juli bis Dezember 1937, S. 1406), Immunological and Enzymatic Reactions Carried Out at a Solid-Liquid Interface von Alexandre Rothen in Physiological Chemistry and Physics, 5, (1973), S 243-258, Interactions Among Human Blood Proteins at Interfaces von Leo Vroman et al, Federation Prodeedings, Band 30, Nr. 5 (September/Oktober 1971) S.
1494-1502 und The Antibody-Antigen-Reaktion: A Visual observation von Ivar Giaever in Journal of Immunology, Band 110, Nr. 4, (Mai 1973) S. 1424-1425.
Immunologische Reaktionen sind hochspezifische Wechselwirkungen, in denen ein Antigen mit einem entsprechenden zweiten biologischen Bestandteil reagiert, der spezifisch gegenüber dem Antigen ist, und im allgemeinen als der
Antikörper bekannt ist, wobei ein immunologischer Komplex gebildet wird. Immunologische Reaktionen, die innerhalb eines biologischen Systems stattfinden, wie einem Tier oder einem
Menschen, sind lebenswichtig bei der Bekämpfung von Krankheit. In einem biologischen System verursacht der Eintritt eines fremden biologischen Bestandteiles, z.B. des Antigens, die Erzeugung des spezifischen Antikörpers gegenüber dem
Antigen in einem Verfahren, das derzeit noch nicht voll verstanden ist.
Die Antikörper-Moleküle verfügen über chemische Bindestellen, die die am Antigenmolekül ergänzen, so dass sich Antigen und Antikörper unter Bildung des immu nologischen Komplexes miteinander verbinden.
Antikörper werden durch biologische Systeme als Reaktion auf das Eindringen von Fremdkörpern erzeugt. Der Nachweis von Antikörpern in einem biologischen System ist daher von medizinisch diagnostischem Wert bei der Bestimmung der
Antigene, denen das System ausgesetzt worden ist. Es wäre z.B.
brauchbar, menschliches Blut, Plasma oder ein Gewebe auf die
Anwesenheit des Antikörpers gegenüber Syphilis oder Gonorr hoe zu untersuchen. Umgekehrt hat auch der Nachweis gewisser Antigene in einem biologischen System medizinisch diagnostischen Wert. Beispiele für den diagnostischen Nachweis von Antigenen schliessen den Nachweis der menschlichen chorionischen Gonadotrophin-Proteinmoleküle (abgekürzt
HCG genannt) im Urin als einen Test auf Schwangerschaft und den Nachweis der mit der Hepatitis verbundenen Antigenmole küle (abgekürzt HAA) im Blut in Aussicht genommener
Blutspender ein.
Die meisten Antigene sind Proteine oder enthalten Proteine als wesentlichen Bestandteil, während alle Antikörper Proteine sind, Proteine sind grosse Moleküle hohen Molikulargewichtes, d.h. sie sind Polymere, die aus Aminsäureketten bestehen. Das
Antigen und Antikörper-Protein kann jedes mehrere Verbin dungsstellen haben. Die fünfHauptklassenvonAntikörpern (die
Immunoglobuline (Ig-G Ig M, Ig A, Ig E und Ig D) sind jedes augenscheinlich durch mindestens zwei schwere (lange)
Peptidketten von Aminosäuren und mindestens zwei leichte (kurze) Peptidketten der Säuren charakterisiert, in denen die
Bindung zwischen den Aminosäureeinheiten als Peptidbindung bekannt ist.
Diese schweren und leichten Peptidketten sind in der allgemeinen Gestalt des Buchstaben Y orientiert und die aktiven oder Verbindungsstellen befinden sich an den äusser sten Enden der beiden Arme des Y-förmigen Antikörpers beim Ig G-Antikörper.
Zusätzlich zu der zwischen spezifischen Protein-Antigenen und spezifischen Protein-Antikörpern stattfindenden immunologischen Reaktion, die zur Bildung eines Protein-Antigen Protein-Antikörper-Komplexes führt, werden durch die vorliegende Erfindung auch andere immunologisch komplexierende Reaktionen zwischen immunologisch reaktiven Antigenen und Antikörpern umfasst. Weiter werden auch spezifische Reaktionen zwischen anderen biologischen Teilchen, wie Enzymen und deren Substraten, durch die Bezeichnung immunologische Reaktion , wie sie in der vorliegenden Anmeldung verwendet wird, umfasst. Schliesslich sollen die in der vorliegenden Anmeldung verwendeten Begriffe Antigen und Antikörper solche Begriffe wie Enzyme, Substrate von Enzymen und ähnliche biologische Teilchen mit umfassen.
Auch ist das Verfahren vielseitig genug, das Austauschen eines spezifischen Antikörpers durch das entsprechende Antigen und des Antigens durch den entsprechenden spezifischen Antikörper zu gestatten.
So schliessen z.B. die folgenden Systeme biologische Teilchen ein, welche die immunologischen Reaktionen, die in der vorliegenden Anmeldung beschrieben werden, ausführen können:
Viren, Bakterien und Bakteriengifte, Pilze, Parasiten, tierische Gewebe, tierische Körperflüssigkeiten und ähnliche.
Im Hinblick auf Viren sind die Antigene Virenkulturen oder Teile davon, und die dazu spezifischen Antikörper können hergestellt werden, indem man sie einem lebenden Wirt verabreicht. Beispielhafte Antigen-Antikörper-Komplexe in den folgenden Virensystemen sind für das erfindungsgemässe Verfahren geeignet:
Röteln-Viruskultur (Antigen) - Röteln-Virus-Antikörper, Polio-Viruskultur (Antigen) - Polio-Virus-Antikörper, die Kultur des die bläschenförmige Mundschleimhautentzündung verursachenden Virus (Vesicular stomatitis Virus, abgekürzt VSV) (Antigen) - VSV-Antikörper.
Im Hinblick auf Bakterien und Bakteriengifte sind die Antigene die jeweiligen Bakterien oder Bakteriengifte oder deren Teile, und der Antikörper wird hergestellt durch Injek tion in einen lebenden Wirt. Die folgenden Beispiele von Antigen-Antikörper-Paaren können in dem erfindungsgemäs sen Verfahren verwendet werden.:
Tetanustoxoid-Suspension (Antigen) - Tetanus-Antikör- per, Diphtherietoxin-Suspension (Antigen) - Diphtheri-
Antikörper, Neisseria gonorrhoesche Suspension (Antigen)
Gonorrhoe-Antikörper Treponema palladium-Suspension (Antigen) - Syphilis-Antikörper.
Bei Pilzen sind die Antigene die antigenischen Extrakte von
Pilz-Suspensionen und der Antikörper ist der Pilz-Antikörper, der durch Injektion in einen lebenden Wirt erzeugt wird.
Antigen-Antikörper-Komplexe von Pilzsystemen sind durch die folgenden Beispiele veranschaulicht:
Aspergillusextrakt-Suspension (Antigen) - Aspergilluspilz
Antikörper, Candidaextrakt-Suspension (Antigen) - Candidapilz-Antikörper
Antigene und Antikörper in parasitischen Systemen werden in ähnlicher Weise erhalten wie bei Pilzen. Das System Toxoplasma gondii-Extrakt (Antigen) - Toxoplasma gondii
Antikörper ist ein typisches Beispiel.
Mit der Bezeichnung Polysaccharide ist ein System gemeint, in dem das Antigen ein Kohlenhydrat-Antigen ist.
Ein Beispiel für ein solches Antigen-Antikörper enthaltendes System ist Pneumococcus-Polysaccharides (Antigen)
Pneumococcus-Antikörper.
Zusätzlich zu der typischen Enzym-Enzymsubstrat
Reaktion, die durch die vorliegende Erfindung mit umfasst werden soll, können Enzyme selbst oder Teile davon als
Antigene eingesetzt werden und der Antikörper ist der jeweilige Enzym-Antikörper, der von einem lebenden Wirt nach Injektion gebildet wird. Beispielhaft für Antigen-Antikör per-Komplexe von Enzym-Systemen sind:
Trypsinextrakt - Trypsin-Antikörper
Chymotrypsinextrakt - Chymotrypsin-Antikörper Pepsinextrakt - Pepsin-Antikörper Ribonuclease Extrakt - Ribonuclease-Antikörper Thrombinextrakt - Thrombin-Antikörper
Amylase-Extrakt - Amylase-Antikörper
Penicillinase Extrakt - Penicillinase-Antikörper.
Bei Hormonen wird der Antigenbestandteil üblicherweise in einem Hormonextrakt gefunden und der Antikörper ist der jeweilige Hormon-Antikörper, der von einem lebenden
Organismus nach der Injektion gebildet wird. Ein beispielhafter
Antigen-Antikörper-Komplex ist: Insulin - Insulin-Antikörper.
Obwohl die nachfolgende Beschreibung hauptsächlich auf immunologische Wechselwirkungen zwischen spezifischen Proteinantigenen und spezifischen Proteinantikörpern gerichtet ist, kann sie ebenso auf die vorbeschriebenen Systeme und immunologisch reaktiven Antigene und Antikörper angewendet werden.
In der derzeit ausgeführten Weise beruht die diagnostische Verwendung der immunologisch aktiven Antikörper und Antigene auf deren ausfällenden oder agglutinierenden Eigenschaften, die sich aus der immunologischen Komplexierungs-Reaktion ergeben. Das klassische Beispiel dieser diagnotischen Verwendungen ist das Verfahren zur Bestimmung der Blutgruppe, bei dem Blutproben mit Alpha- und Beta-Serumantikörpern vermischt werden und die Blutgruppe durch Beobachten einer auftretenden Agglutinierung in der Blutprobe bestimmt wird.
Die Schwangerschaftsbestimmung über Das HCG-Protein, wie sie derzeit ausgeführt wird, ist ein Inhibitionstest. Dieser Test wird ausgeführt, indem man eine Menge des HCG Antiserums in eine Urinprobe einmischt. Dann gibt man Polystyrol-Kügelchen, die mit HCG-Protein überzogen worden sind, in die so vorbereitete Urinprobe. Die Polystyrol-Kügelchen werden agglutinieren, wenn, aber auch nur wenn HCG Protein in der Urinprobe nicht vorhanden ist. Ist in einer Urinprobe kein HCG-Protein vorhanden, dann komplexiert das HCG-Protein auf den Polystyrol-Kügelchen mit dem vorher in die Urinprobe eingeführten HCG-Antiserum und die Kügelchen agglutinieren.
Ist andererseits in der Urinprobe HCG Protein in ausreichenden Mengen vorhanden, dass komplexiert dieses mit dem vorher eingeführten HCG-Antiserum unter Bildung eines Komplexes, der aus der Probe ausfällt, so dass das vorher eingeführte Antiserum für ein Komplexieren mit dem HCG-Protein auf den Kügelchen unter Agglutinierung nicht mehr verfügbar ist. Gemäss der vorliegenden Erfindung konnte der gegenwärtige HCG-Protein-Schwangerschaftstest vereinfacht werden, indem man HCG-Antiserum an die Polystyrolkügelchen haften lässt und direkt eine Urinprobe untersucht. In diesem Falle würden die Polystyrol-Kügelchen agglutinieren, wenn, aber auch nur wenn HCG-Protein in der Probe vorhanden ist.
Der Grund für die Nichtanwendung dieses einfacheren Verfahrens scheint der zu sein, dass die verfügbaren HCG Antiseren komplexe Mischungen sind, die einen grossen Anteil von anderen Bestandteilen als HCG-Antikörpern enthalten.
Der nach dem Stand der Technik erforderliche zusätzliche Aufwand zur Extrahierung der Antikörper aus den HCG Antiseren machten bei direkter Verwendung der Seren den Inhibitionstest nach dem Stand der Technik vorteilhafter.
Gemäss einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird jedoch ein Verfahren geschafften, durch das der einfachere direkte Test ausführbar wird. Ein ernster Nachteil der Agglutinierungstests, der durch das erfindungsgemässe direkte Verfahren überwunden wird, ist der, dass die dabei verwendeten Teilchen auf einer Vielzahl von Gründen, die nichts mit der immunologischen Agglutinierung zu tun haben, agglormerieren können, wodurch die Verlässlichkeit des Tests verringert wird.
Obwohl daher die Agglutimerungstests mit grosser Sorgfalt durch ausgebildete Techniker ausgeführt werden, treten gelegentlich diagnostische Fehler auf.
Obwohl es bekannt ist, dass die Antigen-Antikörper Komplexierungs-Reaktion stattfinden wird, wenn ein Antigen (oder Antikörper) an einer Oberfläche adsorbiert ist, ist dieses Technik nicht sehr auf medizinische Diagnosen unter Verwendung von Objektträgern als Substraten angewendet worden.
Die Komplexierungsreaktion an einer Oberfläche ist mit einem Ellipsometer beobachtet worden. Ein Ellipsomter ist ein komplexes optisches Instrument mit dem es möglich ist, die Dicke von Filmen in der Grössenordung von 0,1 Ä zu messen.
Ellipsometer sind teuer und erfordern erfahrenes Bedienungspersonal. Beim Studium von immunologischen Reaktionen mit Ellipsometern sind bisher zwei Verfahren angewendet worden.
Bei dem einen Verfahren lässt man die zu studierende Reaktion stattfinden und danach legt man den Objektträger, auf dem die Reaktion stattgefunden hat, in ein Ellipsometer und misst die Filmdicke. Bei dem anderen Verfahren wird der Objektträger für die stattfindende immunologische Reaktion in dem Ellipsometer angeordnet und man beobachtet die Veränderung der Filmdicke. Die Messung der absoluten Dicke erfordert ausserordentlich Sorgfalt. Ist andererseits die Konzentration der Antikörper in der Lösung gering, dass erfordert die Messung der absoluten Dicke eine lange Zeit. Aus praktischen Gründen ist daher der Nachweis immunologischer Reaktionen an einer Oberfläche mit einem Ellipsometer nicht für diagnostische Zwecke eingesetzt worden.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Feststellung, dass irgendein willkürlich ausgewähltes immunologisch reaktives Antigen an einem Substrat nur in einer monomolekularen Schicht adsobiert wird und dass nur ein spezifischer Antikörper für ein solches willkürlich ausgewähltes Antigen sich mit diesem unter Bildung einer bimolekularen Schicht mit dem Substrat verbinden wird. Bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung sind solche Schichten leicht und rasch nachweisbar.
Diese Feststellung gestattet daher die Schaffung von Verfahren und Vorrichtungen zur Durchführung des Verfahrens, die eine grosse Brauchbarkeit in medizinisch diagnostischen und pharmakologischen Anwendungen haben.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, das Verfahren zum Nachweis eines spezifischen Proteins in einer Lösung so zu verbessern, dass es zum Nachweis eines Antigens oder Antikörpers dienen kann. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, die Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens gemäss Patentanspruch I des Hauptpatentes so zu verbessern, dass sie zur Durchführung des genannten Nachweises eines Antigens oder Antikörpers dienen kann.
Die erstgenannte Aufgabe wird erfindungsgemäss dadurch gelöst, dass man zum Nachweis eines Antigens oder Antikörpers die Platte in eine wässrige Lösung eines mit dem Antigen spezifisch reagierenden Antikörpers bzw. eines mit dem Antikörper spezifisch reagierenden Antigens taucht.
Die zweite Aufgabe wird erfindungsgemäss durch eine Vorrichtung entsprechend dem Patentanspruch II des Hauptpatentes gelöst, bei der die monomolekulare Schicht mit dem nachzuweisenden Antigen spezifisch reagierende Antikörper bzw. mit dem nachzuweisenden Antikörper spezifisch reagierende Antigene enthält.
Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens kann man beispielsweise so vorgehen, dass man zuerst ein Metall auf ein Substrat aufbringt und dann das Substrat mit einem wässrigen Medium in Berührung bringt, welches das für den spezifischen Antikörper spezifisch reagierende Antigen enthält, um das gesamte Substrat oder einen Teil davon mit einer monomolekularen Schicht des spezifisch reagierenden Antigens zu überziehen, eintaucht und danach das überzogene Substrat untersucht, um zu bestimmen, ob an dem Substrat eine bimolekulare oder eine monomolekulare Schicht haftet. Wird eine bimolekulare Schicht nachgewiesen, dann zeigt dies, dass die biologische Probe den interessierenden spezifischen Antikörper enthält. Andererseits zeigt die Abwesenheit einer bimolekularen Schicht, dass die Probe den Antikörper nicht enthielt.
Nachfolgend wird die Erfindung unter Bezugnahme auf die Zeichnung näher erläutert. Im einzelnen zeigen:
Figur 1 einen Ablaufplan, der die Verfahrensstufen der Verschiedenen Ausführungsformen des erfindungsgemässen Verfahrens veranschaulicht,
Figuren 2a, 2b und 2c Seitenansichten der diagnostischen Vorrichtung, welche des Herstellungsverfahren und ihre Verwendung zeigt,
Figuren 3a, 3b und 3c Seitenansichten einer für diagnostische Zwecke brauchbaren anderen Ausführungsform einer Vorrichtung gemäss der vorliegenden Erfindung,
Figur 4 eine Fotoaufnahme,
die den Betrieb der diagnostischen Vorrichtung veranschaulicht,
Figuren 5a und Sb Seitenansichten diagnostischer Vorrichtungen,
Figur 6 eine Seitenansicht einer diagnostischen Vorrichtung welche eine Modifikation des Anwendungsverfahrens der Vorrichtung nach Figur 2 zeigt,
Figur 7 eine graphische Darstellung, welche das Arbeitsprinzip der diagnostischen Vorrichtung gemäss der Ausführungsform der Figur 8 zeigt und
Figur 8 eine Seitenansicht einer anderen Ausführungsform der diagnostischen Vorrichtung.
In der Figur 1 zeigt der Ablaufplan von oben nach unten in jeder vertikalen Höhe eine Stufe des Verfahrens, die in der Zeit auf die darüber liegende folgt. Das Aufführen mehrerer Stufen horizontal in einer gegebenen vertikalen Höhe zeigt alternative Ausführungsformen des erfindungsgemässen Verfahrens.
Gemäss einer ersten Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung beginnt das Verfahren mit Block 13 der Figur 1, in der eine Scheibe aus Substratmaterial, das Metall, Glas, Glimmer Kunststoff, glasartiges Siliciumoxid, Quarz oder ein ähnliches Material sein kann, wobei Metall bevorzugt ist, da es den grössten Unterschied im Brechungsindex gegenüber Antigen oder Antikörper hat und das Metall vorzugsweise in
Form eines metallisierten Glasobjektträgers vorliegt, mit einer Lösung in Berührung gebracht wird, die ein erstes interessierendes Antigen enthält, das in einem relativ konzentrierten wässrigen Medium, z.B. einer Lösung, erhältlich ist und das zum Nachweisen oder Reinigen seines entsprechenden spezifisch reagierenden Antikörpers benutzt werden soll. Das in Berührungsbringen kann nach irgendeiner Technik erfolgen, z.B.
indem man ein oder mehrere Tropfen des Mediums auf die Scheibe aufbringt oder man diese teilweise oder ganz eintaucht.
Je nach der angewendeten Technik und der Konzentration des Antigens im wässrigen Medium wird das erste Antigen auf der gesamten Oberfläche des Substrates oder einem Teil davon in einer monomolekularen Schicht haften. Ein Antigen wird nur in monomolekularer Schicht haften, es wird keine weitere Adsorption stattfinden. DaSheisst, das Antigen wird zwar an dem Substrat haften, nicht aber an sich selbst. Die zum Adsorbieren der monomolekularen Schicht auf dem Substrat erforderliche Zeit ist eine Funktion der Konzentration des Antigens in der Lösung und des Grades, mit dem die Lösung gerührt wird. Beispielsweise überzieht eine 1 %ige Rinderserumalbuminlösung einen Objektträger in etwa 30 Minuten vollständig mit einer monomolekularen Proteinschicht.
Die nächste in Block 14 der Figur 1 veranschaulichte Stufe besteht darin, das mit dem Antigen überzogene Substrat in eine Lösung einzutauchen, von der man vermutet, dass sie den spezifisch reagierenden Antikörper für das erste Antigen enthält. Diese Lösung kann und tut es üblicherweise auch, viele Bestandteile zusätzlich zu dem spezifisch reagierenden Antikörper enthalten, dessen Anwesenheit man nachweisen möchte. Es wird jedoch kein anderer Antikörper als ein spezifisch reagierender Antikörper an der ersten Schicht auf dem Substrat haften. Es ist selbstverständlich bekannt, das gewisse biologische Substanzen, gemäss der als nicht-spezifisches Haften bekannten Erscheinung sich anlagern können. Solche Substanzen finden sich in Seren usw.
Es gibt jedoch eine Reihe von Möglichkeiten, das nichtspezifische Haften zurückzudrängen, von denen die bequemste das Verdünnen des solche Substanzen enthaltenden Mediums zu sein scheint. Ist der spezifisch reagierende Antikörper nicht vorhanden, dann wird das Substrat nach dem Eintauchen in die Lösung, in der man den spezifisch reagierenden Antikörper vermutet hat, doch immer nur eine monomolekulare Antigenschicht aufweisen. Ist dagegen der spezifisch reagierende Antikörper in der Lösung vorhanden, dann findet ein immunologisches Komplexieren zwischen dem ersten Antigen und seinem entsprechenden spezifisch reagierenden Antikörper statt und das Substrat wird nach einer gewissen Zeit eine bimolekulare Schicht tragen. Es ist darauf hinzuweisen, dass die in den Blöcken 13 und 14 der Figur 1 veranschaulichten Stufen für alle Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gemeinsam sind.
Die für die Adhäsion einer vollständigen zweiten monomolekularen Schicht auf dem überzogenen Substrat erforderliche Zeit ist wieder eine Funktion der Konzentration des entsprechenden spezifisch reagierenden Antikörpers in der Lösung. Für Antikörper im Blutserum kann dies in Abhängigkeit von der Konzentration von Minuten bis zu einem Tag dauern.
Die nächste Stufe gemäss einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Eintauchen des überzogenen Substrates in ein Reagenz, das immunologische Bindungen spalten kann, wie in Block 15 der Figur 1 veranschaulicht, während gleichzeitig das überzogene Substrat 1 in einem Ellipsometer beobachtet wird, wie in Block 22 der Figur 1 veranschaulicht. Ein solches Reagenz kann eine schwache Säurelösung, eine Basenlösung oder eine starke Salzlösung sein und ähnliches. Während die Bindung des spezifisch reagierenden Antikörpers an das mit Antigen überzogene Substrat längere Zeit dauern kann, wird die immunologische Bindung zwischen den beiden Schichten sehr rasch durch das Spaltreagenz gespalten. Die mit dem Ellipsometer ausgeführte Beobachtung kann daher eine relativ einfache Beobachtung der Veränderung der Filmdicke sein anstelle der komplizierten Messung der absoluten Filmdicke.
Ausserdem kann das Abspalten der spezifisch reagierenden Antigen/Antikörperschicht durch das die immunologische Bindung spaltende Reagenz sehr viel rascher erfolgen als das nach dem Stand der Technik übliche Beobachten des Aufbauens der spezifisch reagierenden Antikörperschicht. Es können daher viele Testobejktträger gemäss Block 13 hergestellt und jeder eine Lösung, z.B. einer Serumprobe ausgesetzt werden, wie in Block 14 angezeigt und dann kann man sie serienmässig für kurze Zeit gemäss den Stufen der Blöcke 15 und 22 untersuchen, um zu bestimmen, welche der Serumproben den spezifisch reagierenden Antikörper zum ersten Antigen enthielt.
Da das die immunologische Bindung spaltende Reagenz das erste Antigen oder den ersten Antikörper vom Substrat nicht ablösen wird, werden die überzogenen Substrate, die in Medien eingetaucht wurden, welche den spezifisch reagierenden Antikörper nicht enthielten, keine Veränderung der Filmdicke zeigen, wenn sie in das Spaltenreagenz eingetaucht und in einem Ellispometer beobachtet werden. Die Objektträger dagegen, die in eine Lösung eingetaucht wurden, welche den spezifisch reagierenden Antikörper enthielt, werden etwa einen Faktor von 2 bis 5 hinsichtlich der Dickenveränderung zeigen, wenn sie in das Spaltreagenz eingetaucht und in einem Ellipsometer beobachtet werden. Jede Beobachtung kann in wenigen Minuten ausgeführt werden und auf diese Weise ist ein wirksames diagnostisches Testverfahren geschaffen.
Obwohl die beschriebene erste Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens eine wirksamere Nutzung des Ellipsometers für den immunologischen Nachweis schafft, ist es trotzdem wirtschaftlich erwünscht, die Notwendigkeit des Einsatzes des Ellipsometers vollständig zu beseitigen. Gemäss einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bestimmt man daher relative Filmdicken elektrisch. Bei dieser Ausführungsform wird entweder ein metallisches Substrat ausgewählt oder ein Substrat eines anderen Materials wird erst mit einem Metallfilm überzogen, wie in Block 11 der Figur 1 veranschaulicht. Das Metallsubstrat oder metallüberzogene Substrat wird dann mit einem Medium in Berührung gebracht, welches Antigene enthält, gemäss den vorbeschriebenen Stufen der Blöcke 13 und 14. Die an dem Substrat haftenden Schichten sind elektrisch isolierend.
Die nächste Stufe besteht darin, einen Quecksilbertropfen oder eine andere Elektrode auf der oberen Antigenschicht anzuordnen, wie in Block 16 der Figur 1 gezeigt. Die obere Antigenschicht ist entweder das erste Antigen, wenn die Lösung, in der man den spezifisch reagierenden Antikörper vermutete, einen solchen nicht enthielt, oder es ist der spezifisch reagierende Antikörper, wenn ein solcher in der Lösung enthalten war. Der Metallfilm oder das Metallsubstrat und der Quecksilbertropfen stellen daher die beiden leitenden Platten eines elektrischen Kondensators dar, der durch eine isolierende Schicht, die entweder eine monomolekulare oder eine bimolekulare Schicht von Antigen oder Antikörpern ist, getrennt sind.
Die elektrische Kapazität dieses Kondensators wirddannwiein Block 19 der Figur 1 angezeigt mittels eines geeigneten Instrumentes gemessen, z.B. einer Heathkit Impedanz Brücke Modell IB-28. Die elektrische Kapazität von Kondensatoren mit einer bimolekularen dielektrischen Schicht variiert etwa um einen Faktor 2 bis 5 gegenüber einem Kondensator mit einer monomolekularen Schicht.
Gemäss einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Nachweis des spezifisch reagierenden Antikörpers weiter vereinfacht, indem man seine Anwesenheit durch das blosse Auge beobachten kann. Bei dieser Ausführungsform verwendet man ein Metallsubstrat, das ein Amalgam mit Quecksilber bildet oder ein anderes Substrat, wie Glas, das gemäss der Stufe in Block 11 mit einem dünnen Metallfilm überzogen wird, das ein Amalgam mit Quecksilber bildet, vorzugsweise mit Gold. Das Substrat wird dann den Stufen gemäss Block 13 und 14 ausgesetzt und dann ordnet man einen Quecksilbertropfen auf der oberen Schicht an, wie in Block 16 angedeutet.
Bei dieser Ausführungsform wird jedoch keine elektrische Messung vorgenommen sondern die nächste Stufe besteht darin, das überzogene Substrat visuell zu beobachten und die Zeit zu bestimmen, die vergeht, bevor ein sichtbares Amalgam zwischen dem Quecksilber und dem das Substrat überziehenden Metallfilm gebildet wird. Diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beruht auf der Feststellung, das Quecksilber durch eine monomolekulare Schicht in etwa 1 Minute diffundiert, jedoch 10 Minuten oder länger benötigt, um durch eine bimolekulare Schicht zu diffundieren.
Da das Quecksilber durch die Schicht oder Schichten diffundieren muss, um ein sichtbares Amalgam mit dem Metallfilm auf dem Substrat zu bilden, zeigt die Zeit zwischen dem Anordnen des Quecksilbertropfens auf der oberen Schicht und dem Erscheinen des sichtbaren Amalgams an, ob auf dem Substrat eine monomolekulare oder eine bimolekulare Schicht vorhanden ist und demgemäss ob die Lösung den vermutete spezifisch reagierenden Antikörper zum ersten Antigen enthielt oder nicht. Dem Fachmann wird nach den vorstehenden Erläuterungen klar sein, dass die Kapazitätsmessung bei der vorherigen Ausführungsform innerhalb von 1 Minute nach dem Anordnen des Quecksilbertropfens auf der oberen Schicht ausgeführt sein muss, da die Quecksilberelektrode durch die isolierende Schicht diffundiert und den Kondensator kurzschliesst.
Das Kurzschliessen kann aber auch verhindert werden, indem man das Metall mit einer isolierenden Metalloxidschicht überzieht und den Antikörper oder das Antigen an dem Metalloxid haften lässt. Eine überschlagsmässige quantitative Messung der Konzentration des spezifisch reagierenden Antikörpers in der Lösung, in der man ihn vermutet, kann nach dieser Ausführungsform erfolgen, indem man mehrere Substrate gemäss der Stufe des Blockes 13 herstellt und sie gleichzeitig in die Lösung eintaucht, in der man den Antikörper vermutet, wie in Block 14 angegeben, sie jedoch nacheinander über einen längeren Zeitraum aus der Lösung herauszieht.
Da die Geschwindigkeit, mit der sich die Schicht des spezifisch reagierenden Antikörpers bildet, eine Funktion der Konzentration des spezifisch reagierenden Antikörpers in der Lösung ist, ergibt ein Vergleich der Diffusionszeiten für den Quecksilbertropfen durch die Schichten auf einer Reihe von Substraten, die der Lösung für verschiedene Zeiten ausgesetzt worden sind, eine grobe quantitative Anzeige der Konzentration des spezifisch reagierenden Antikörpers in der Lösung.
In einer anderen Ausführungsform wird ein Substrat mit einem Metallfilm überzogen, wie in Block 11 der Figur 1 abgebildet. Wie bei der zuletzt beschriebenen Ausführungsform wird das Substrat dann mit den Medien in Berührung gebracht, wie in Block 13 und 14 gezeigt. Die nächste Stufe bei dieser Ausführungsform besteht im Überziehen der oberen Antigenoder Antikörperschicht mit einer zweiten Metallschicht, wie in Block 17 der Figur 1 illustriert und dem Beobachten der so erhaltenen Struktur im reflektierten Licht, wie in Block 21 der Figur 1 veranschaulicht. Das zweite Metall wird vorzugsweise durch Elektroplattieren aufgebracht.
Bei dieser Ausführungs form erhält man im wesentlichen eine Struktur, die als Diffraktionsgitter wirkt und der Unterschied zwischen einer monomo lekularen und einer bimolekularen Antigen- oder Antikörper
Isolationsschicht ist aus den im reflektierten Licht beobachtba ren Spektralen Bestandteilen bestimmbar.
Die Figuren 5a und 5b veranschaulichen eine Vorrichtung gemäss dieser Ausführungsform. Eine metallische Oberfläche 81 eines Substrates, das entweder ein metallisches oder ein nicht-metallisches Substrat sein kann, wobei das letztere mit einem Metallfilm überzogen ist, weist eine darauf aufgebrachte erste Antigenschicht 82 auf, wie in Block 13 der Figur 1 gezeigt.
Das die Schicht 82 aufweisende Substrat wird dann in die zu testende Lösung eingetaucht und es bildet sich eine zweite Schicht 83 des entsprechenden spezifisch reagierenden Antikörpers zum Antigen der Schicht 82 darauf, wenn der Antikörper in der Lösung vorhanden ist. Eine zweite Metallisationsschicht wird dann auf die freie Oberfläche des Films aufgebracht. Eine sehr geringe Menge Metall wird aufgebracht, so dass die zweite Metallisationsschicht in Form vieler nicht zusammenhängender metallisierter Bereiche vorliegt, wie z.B.
bei 84 und 85. Ein durch die Strahlen 86 dargestellter Lichtstrahl wird dann auf den so zubereiteten Objektträger gerichtet.
Das Licht wird an den Metallgrenzen reflektiert. Der Abstand zwischen den reflektierenden Oberflächen der Metallsubstratoberfläche 81 und der Metallisationsteilchen 84 z. B. ist eine Funktion der Dicke des Films zwischen den Teilen 81 und 84.
Das beobachtete reflektierte Licht, das durch die Strahlen 87 veranschaulicht ist, variiert daher in der spektralen Zusammensetzung zwischen einer monomolekularen und einer bimolekularen Schicht aus Antigen oder Antikörper.
Eine andere in Figur 1 veranschaulichte Ausführungsform umfasst die durch die Blöcke 12, 13 14 und 18 gezeigten Stufen.
Bei dieser Ausführungsform muss das Substrat lichtduchlässig sein, wie Glas, Kunststoff, glasartiges Siliciumdioxid, Glimmer,
Quarz und ähnliche und es ist vorzugsweise Glas, wobei mikroskopische Objektträger eine bequem erhältliche Quelle sind, und dieses Substrat wird durch Aufdampfen eines Metalles mit vielen Metallkügelchen überzogen, z.B. aus Indium, wie in Block 12 der Figur 1 angegeben. Das Indium wird bei einem üblichen Vakuum von etwa 5 x 10-5 mm Hg langsam aus einem Tantalboot auf das Glassubstrat aufgedampft. Da die Indiumatome auf der Oberfläche des Substrates eine hohe Beweglichkeit haben und das Glassubstrat nicht merklich benetzen, sammelt sich das aufgedampfte Indium auf dem Substrat in kleinen Teilchen. Jedes Metall, das ähnliche Eigenschaften hat, so dass es Kügelchen auf dem Substrat bildet, wenn es darauf gedampft wird, kann benutzt werden.
So können ausser Indium Gold, Silber, Zinn, Blei und Wismut verwendet werden. Das Aufdampfen des Metalles wird fortgesetzt, bis das Substrat leicht braun erscheint. Zu diesem Zeitpunkt haben die Metallkügelchen einen Durchmesser in der Grössenordnung von
1000 . Die genaue Grösse der Kügelchen ist nicht kritisch, doch müssen sie Durchmesser haben, die gleich den Wellenlängen eines grossen Teiles des sichtbaren Lichtes sind. In der nächsten Stufe bringt man das Kügelchenüberzogene Substrat mit einem Medium in Berührung, welches ein Antigen enthält, wie in Block 13 der Figur 1 veranschaulicht. Das Antigen haftet in einer monomolekularen Schicht auf dem Substrat und den darauf befindlichen Kügelchen.
Nachdem sich eine monomolekulare Schicht gebildet hat, kann das überzogene Substrat zum Testen von Lösungen auf die Anwesenheit eines entsprechenden spezifisch reagierenden Antikörpers zum Antigen verwendet werden, indem man das überzogene Substrat in die ent prechende Lösung eintaucht, wie in Block 14 der Figur 1 angedeutet. Wenn der vermutete spezifisch reagierende Antikörper vorhanden ist, dann haben das Substrat und die Metallkügelchen danach eine bimolekulare Schicht. Ist dagegen der spezifisch reagierende Antikörper nicht vorhanden, dann liegt auf dem Substrat und den Metallkügelchen nur eine monomolekulare Schicht.
Das überzogene Substrat wird dann entweder im reflektierten oder durchgehenden Licht beobachtet, wie in Block 18 der Figur 1 angezeigt und man bestimmt aufgrund des Aussehens des überzogenen Substrates die Dicke der daran haftenden Schicht und demgemäss, ob der vermutete spezifisch reagierende Antikörper in der Lösung vorhanden war oder nicht. Der Nachweis der Schichten entspricht Variationen in der Braunschattierung, die in dem überzogenen Substrat beobachtet werden. Diese Variationen sind sehr ausgeprägt und der Nachweis der Schichten ist daher einfach und direkt. Die Teilchen allein auf dem Substrat erscheinen als ein erster Braunton. Die mit einer monomolekularen Antigenschicht überzogenen Teilchen erscheinen als ein dunklerer Braunton und die mit einer bimolekularen Schicht bedeckten Teilchen erscheinen als ein noch dunklerer Braunton.
Dieses Nachweisverfahren beruht aus der Tatsache, dass elektromagnetische Strahlung von leitenden Kugeln, die einen Durchmesser gleich einem grossen Teil einer Wellenlänge des einfallenden Lichtes haben, zerstreut wird und dass im Falle des Zerstreuens durch solche Kugeln das Zerstreuen stark durch einen auf die Kugeln aufgebrachten dünnen dielektrischen Überzug beeinflusst wird.
Figur 4 gibt eine fotographische Aufnahme einer diagnostischen Vorrichtung gemäss dieser Ausführungsform wieder. In jener Ansicht der Figur 4 ist der Testobjektträger mit durchgehendem Licht betrachtet. Die Ansicht 4a enthält einen Glasobjektträger mit Indiumkügelchen auf der Oberfläche 100. Die Ansicht 4b zeigt einen Objektträger, der wie der Objektträger der Ansicht 4a zubereitet ist, dessen linke Kante in eine Lösung von Rinderserumalbumin eingetaucht worden ist und der dabei eine monomolekulare Schicht 101 des Rinderserumalbumins absorbiert hat.
Die Ansicht 4c zeigt einen ähnlichen Objektträger, in dem die linke Kante in Rinderserumalbumin eingetaucht worden ist, wodurch eine monomolekulare Schicht 101 von Rinderserumalbumin darauf haftet und dessen untere Kante in eine Lösung von Eialbumin eingetaucht worden ist und dadurch eine monomolekulare Schicht 102 von Eialbumin darauf aufweist. Es ist wichtig darauf hinzuweisen, dass das Aussehen der überzogenen Teile des Objektträgers der Ansicht 4b ähnlich sind und damit anzeigen, dass auf dem Objektträger nur eine monomolekulare Proteinschicht vorhanden ist. Dies zeigt, dass das Rinderserumalbumin und das Eialbumin an einem Objektträger adsorbiert sind und dass das Eialbumin nicht an dem Teil des Objektträgers haftet, der vorher mit Rinderserumalbumin überzogen worden ist.
In anderen Worten veranschaulicht die Ansicht 4c, dass irgendein willkürlich aus gewähltes Antigen oder ein solcher Antikörper an dem Substrat haften wird, dass jedoch ein anderes Antigen oder ein anderer Antikörper nicht an einem willkürlich ausgewählten Antigen oder Antikörperfilm haften wird, ausgenommen wenn ein immunologischer Komplex gebildet wird und falls ein nichtspezifisches Haften auftritt. Der Objektträger der Ansicht 4d war zubereitet worden, indem man die linke Kante in Rinderserumalbumin-Lösung eintauchte, um darauf eine monomole kulare Schicht 101 aufzubringen, die rechte Kante war dann in Eialbumin-Lösung eingetaucht worden, um darauf eine monomolekulare Schicht 102 aufzubringen und schliesslich wurde die untere Kante in eine Lösung von Kaninchenantiser um gegenüber dem Rinderserumalbumin eingetaucht.
Demgemäss ist 103 eine monomolekulare Schicht von Kaninchenantiserum gegen Rinderserumalbumin. Das Aussehen der unteren rechten Ecke zeigt, dass das Kaninchenantiserum zum Rinder serumalbumin nicht an der Eialbuminschicht 102 haftete und demgemäss ist die untere rechte Ecke des Objektträgers der Ansicht 4d nur mit einer monomolekularen Schicht von Eialbumin überzogen. Die untere linke Ecke der Ansicht 4d ist ausgeprägt dunkel und dies zeigt die Anwesenheit einer bimolekularen Proteinschicht darauf, die eine erste monomole kulare Schicht aus Rinderserumalbumin und eine zweite monomolekulare Schicht aus Kaninchenantikörpern gegenüber dem Rinderserumalbumin umfasst, die immunologisch mit dem darunter liegenden Rinderserumalbumin komplexiert ist.
Dies zeigt, dass nur das spezifisch reagierende Proteinpaar eine bimolekulare Schicht auf dem Objektträger bildet, während alle anderen Überzüge monomolekular sind.
In einer Modifikation dieser Ausführungsform die für ein medizinisch diagnostisches System geeignet ist, wird das
Substrat mit den Metallkügelchen darauf teilweise bis zu einer ersten Tiefe in eine Lösung eines ersten Antigens eingetaucht.
Das Substrat wird mit einer monomolekularen Schicht des ersten Antigens auf dem Bereich bedeckt, der in die Lösung eingetaucht ist. Dann wird das Substrat getrocknet und bis zu einer zweiten Tiefe in eine Lösung eines zweiten Antigens eingetaucht. Das zweite Antigen haftet nicht an dem ersten
Antigen doch haftet es an dem nicht überzogenen Teil des
Substrates, der in die Lösung eingetaucht ist. Das Substrat wird dann wiederum getrocknet und bis zu einer dritten und grösseren Tiefe in eine Lösung eines dritten Antigens einge taucht. Das dritte Antigen haftet an dem Teil und nur an dem Teil des Substrates, der nicht von dem ersten oder zweiten
Antigen überzogen ist. Das Verfahren wird für irgendeine Zahl von interessierenden Antigenen wiederholt. Man erhält ein Substrat, das mit vielen bandförmigen monomolekularen
Schichten verschiedener Antigene überzogen ist.
Dieser überzogene Objektträger ist das diagnostische Werkzeug. Die diagnostische Prozedur besteht dann darin, den Objektträger in eine Probe, z.B. von Blut, für mehrere Stunden einzutauchen.
Danach wird der Objektträger aus der Probe herausgenommen und nach dem Waschen in Wasser wird er in reflektiertem oder durchgehendem Licht betrachtet. Der Objektträger weist dann ein Muster hellerer und dunklerer Bänder auf, die die in der Probe befindlichen Antikörper anzeigen, woraus eine medizinische Diagnose gestellt werden kann.
Die Figuren 2a, 2b und 2c zeigen stark vergrösserte Seitenansichten eines Teiles der diagnostischen Vorrichtung gemäss der zuletzt beschriebenen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
Figur 2a zeigt ein Teil des Substratmaterials 31, auf das viele Metallkügelchen 32 aufgedampft sind. Die Teilchen 32 sind vorzugsweise durch Aufdampfen von Indium auf das Substrat 31 hergestellt, doch können sie ebenso gut durch Aufdampfen von Gold, Silber, Zinn, Blei oder eines anderen Metalles mit ähnlichen Eigenschaften hinsichtlich der Nichtbenetzung und der atomaren Beweglichkeit hergestellt werden. Eine grosse Zahl von Metallen wird diese Eigenschaften aufweisen, wenn die Temperatur des Substrates variiert wird. Nach dem in Berührungbringen mit einem Medium, welches ein Antigen enthält, wird das Objektträgersegment, welches das Substrat 31 und die Metallkügelchen 32 umfasst, teilweise oder vollständig mit einer monomolekularen Schicht der Moleküle 34 des Antigens überzogen, wie in Figur 2b allgemein bei 33 gezeigt.
Die bei 33 gezeigte Vorrichtung ist das diagnostische Instrument, das dazu benutzt wird, Testlösungen auf die Anwesenheit der entsprechenden spezifisch reagierenden Antikörper zur Antigenschicht 34 zu untersuchen. Wenn die allgemein mit 33 bezeichnete Vorrichtung dem spezifisch reagierenden Antikörper zur Antigenschicht 34 ausgesetzt ist, dann nimmt die Vorrichtung ein Aussehen an, wie es allgemein in Figur 2c bei 35 gezeigt ist, wo das Substrat 31 und die Metallkügelchen 32 mit einer bimolekularen Schicht überzogen sind, welche die Schicht 34 des Antigens umfasst, das eine erste monomolekulare Schicht auf dem Substrat 31 und den Kügelchen 32 bildet und eine zweite monomolekulare Schicht, die aus der Schicht 36 des spezifisch reagierenden Antikörpers besteht, die immunologisch mit den Molekülen der ersten Schicht verbunden ist.
Die Figur 6 veranschaulicht eine Abänderung dieser Ausführungsform, die für einen vergrösserten Kontrast auf dem überzogenen diagnostischen Objektträger sorgt. In Figur 6 wird der Objektträger 31 mit den Kügelchen 32 darauf und überzogen mit einer monomolekularen Antigenschicht 34 wie in Figur 2b eingetaucht mit der überzogenen Seite nach unten in eine Menge 71 einer lichtreflektierenden Flüssigkeit. Der Objektträger 31 wird dann von seiner oberen Oberfläche im reflektierten Licht betrachtet. Um für eine Totalreflektion des einfallenden Lichtes auf der diagnostischen Vorrichtung der Figur 6 zu sorgen, ist die reflektierende Flüssigkeit 71 vorzugsweise eine metallische Flüssigkeit und im besonderen vorzugsweise Quecksilber.
Wird eine nicht-metallische Flüssigkeit verwendet, dann werden die optischen Einfalls- und Beobachtungswinkel bei der Ausführungsform der Figur 6 kritisch, wenn Totalreflektion beobachtet werden soll. Das Aussehen eines gemäss diesen Lehren betrachteten Objektträgers ist ähnlich dem in Figur 4, jedoch mit verstärktem Kontrast.
Die Figuren 3a, 3b und 3c geben stark vergrösserte Schnittansichten der gemäss einer anderen Ausführungsform der Erfindung für diagnostische Zwecke brauchbaren Vorrichtung wieder. In Figur 3 ist mit 40 ein Substrat 41 bezeichnet, das mit einer monomolekularen Schicht von Antikörpermolekülen 42 überzogen ist, die wie oben beschrieben zubereitet wurde. In der Figur 3b ist mit 43 ein Substrat 41 mit einer Antigenschicht 42 bezeichnet, mit der immunologisch eine zweite monomolekulare Schicht von Molekülen 44 gemäss den oben beschriebenen Verfahren immunologisch verbunden worden ist. Ein zweites Substrat 45 trägt einen Tropfen 46 eines Reagenz, das immunologische Bindungen spalten kann, z.B. einer schwachen Säurelösung.
Die sich gegenüberstehende Oberflächen der Substrate 41 und 45 tragen daher eine bimolekulare Schicht bzw. einen Tropfen des Reagenz, z.B. einer 0,1 normalen Zitronensäurelösung und werden so miteinander physisch in Berührung gebracht. Gemäss der vorliegenden Erfindung trennt der Reagenztropfen 46 die immunologischen Bindungen zwischen den Molekülen 42 und den Molekülen 44, ohne die Eigenschaften von Antigen oder Antikörper zu beeinflussen und ohne die Adhäsionsbildung zwischen den ersten Molekülen 42 und dem Substrat 41 zu trennen. Werden Substrat 41 und 45 dann wieder voneinander getrennt, wie in Figur 3c allgemein bei 47 gezeigt, dann haftet auf dem Substrat 41 eine monomolekulare Schicht von Antigenmolekülen 42 und auf dem Substrat 45 eine monomolekulare Schicht der entsprechenden spezifisch reagierenden Antikörpermoleküle 44.
Das Substrat 41 mit den Molekülen 42 darauf kann dann wieder als Testobjektträger gemäss der vorstehenden beschriebenen Ausführungsform der Erfindung eingesetzt werden. Das Substrat 45 mit dem spezifisch reagierenden Antikörper 44 darauf kann als Testobjektträger für Lösungen eingesetzt werden, in denen man die Anwesenheit von Molekülen seines entsprechenden Antigens vermutet, und zwar gemäss den anderen vorstehend beschriebenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.
Die vorliegende Ausführungsform der Erfindung wird als besonders bedeutsam angesehen, da im Falle der üblichen Immunogene biologischen Interesses Antigene recht einfach in gereinigter Form erhältlich sind und so an einem Substrat adsorbiert werden können, um einen Testobjektträger mit dem Nachweis der Anwesenheit von Antikörpern in Lösungen zu bilden, während die Antikörper nicht in dem Masse erhältlich sind. Es ist daher vor der vorliegenden Erfindung nicht möglich gewesen, Testobjektträger für das Untersuchen von Lösungen auf die Anwesenheit von Antigenen herzustellen. Verfahren und Vorrichtung, wie sie in Figur 3 veranschaulicht sind, gestatten demgegenüber die Herstellung von Testobjektträgern mit einem Substrat 45, das mit einer monomolekularen Schicht von z.B.
Antikörpermolekülen 44 überzogen ist, die dann zum Testen von Lösungen auf die Anwesenheit von Antigen verwendet werden können.
Eine andere Ausführungsform der diagnostischen Vorrichtung gemäss der vorliegenden Erfindung ist in Figur 8 gezeigt und hinsichtlich seines Wirkungsprinzips in Figur 7 graphisch veranschaulicht. Die diagnostische Vorrichtung der Figur 8 umfasst ein Goldsubstrat 91, für das aus wirtschaftlichen Gründen eine dünne Goldschicht auf ein anderes Metall plattiert ist und an dem eine monomolekulare Schicht 92 eines ersten Antigens oder Antikörpers adsorbiert ist. Gold hat ein Adsorptionsband innerhalb des sichtbaren Spektrums. Diese Tatsache bedingt die charakteristische Goldfarbe und gestattet die vorliegende Ausführungsform.
Figur 7 veranschaulicht den Betrieb dieser Ausführungsform und stellt einen Satz von Kurven dar, in denen das relative Reflektionsvermögen als eine Funktion der Wellenlänge aufgetragen ist. Die Kurve 93 gibt das Reflektionsvermögen von Goldmetall wieder.
Die Kurve 94 gibt das Reflektionsvermögenvon Goldmetall wieder, das eine Monomolekulare Antigenschicht trägt. Die Kurve 95 gibt das Reflektionsvermögen von Goldmetall wieder, das eine bimolekulare Schicht darauf trägt. Ein Goldsubstrat 91 hat daher gemäss Kurve 93 die charakteristische leuchtend gelbe Farbe des Goldmetalles. Wird eine erste Antigenschicht 92 auf das Substrat 91 aufgebracht, dann hat der Testobjektträger gemäss der Kurve 94 ein mattgelbes Aussehen. Nachdem der Testobjektträger einer Lösung ausgesetzt worden ist, von der man annimmt, dass sie den entsprechenden immunologisch reagierenden Antikörper zu der Antigenschicht 92 enthält, dann trägt der Testobjektträger, wenn in der Lösung ein solcher Antikörper vorhanden war, eine bimolekulare Schicht und hat, wie die Kurve 95 anzeigt, ein deutlich grünes Aussehen.
Gemäss bisher ausgeführten Tests scheinen die Ausfüh rungsformen der vorliegenden Erfindung, die ein Substrat mit
Metallkügelchen verwendeten, am brauchbarsten, wenn ein Goldsubstrat und wenn ein Metall, z.B. Titan, bedeckt mit einem Oxidüberzug, z.B. einem Titanoxid, eingesetzt wird.
Weiter wurde bestimmt, dass diese Ausführungsformen in
Abhängigkeit von der Dicke der interessierenden Filme unterschiedliche Empfindlichkeiten haben. Im besonderen
Falle weisen die grösste Empfindlichkeit Substrate mit Metall kügelchen auf, deren Filme Dicken unterhalb von etwa 200 Ä haben. Die Gold- und anderen Substratformen haben die grösste Empfindlichkeit für Filme, die 30 Ä in der Dicke übersteigen.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert.
Beispiel 1
Ein Inhibitionstest für Hepatitis wurde folgendermassen ausgeführt:
Glasobjektträger wurden mit einer dünnen Indiumschicht überzogen und dann darauf eine Goldschicht aufgebracht. Die Verwendung einer Unterschicht aus Indium ist erforderlich, um die Haftung zwischen dem Glas und dem Gold zu verbessern.
Es wurde weiter festgestellt, dass die Diffusion des Indiums in das darüberliegende Gold die optischen Eigenschaften der Testobjektträger verbessert. Die so vorbereiteten Objektträger wurden mit einer monomolekularen Schicht des mit der Heptitis verbundenen Antigens überzogen. Proben des auf Hepatitis zu testenden menschlichen Blutes wurden zubereitet, indem man eine Menge Antikörper für das HAA einmischte und zwar ausreichend, dass sie immunologisch aus der Mischung entfernt wurden, wenn HAA in der Probe vorhanden war. Die Testobjektträger wurden dann in die so vorbereiteten
Blutproben eingetaucht.
Nach dem Herausnehmen trugen die in Hepatitis negative Proben eingetauchten Objektträger eine bimolekulare Proteinschicht aus dem HAA, das vorher aufgebracht war, und einer zweiten Schicht aus Antikörpern zum HAA, die immunologisch damit verbunden waren, wie ein grünes Band auf dem Objektträger zeigte. Objektträger, die in Hepatitis positive Proben eingetaucht worden waren, behalten ihr anfängliches mattgelbes Aussehen und dies zeigt, dass nur die monomolekulare HAA-Schicht darauf vorhanden war, während die in die Probe eingeführten Antikörper mit dem darin enthaltenen Antigen komplexiert wurden und aus der Probe ausfielen und so daher zu einer Reaktion mit dem Antigen auf dem Testobjektträger nicht zur Verfügung standen.
Beispiel 2
In einem direkten Test auf Hepatitis wurden Glas/Indium/ Gold-Objektträger wie in Beispiel 1 beschrieben zubereitet und dann mit einer monomolekularen Schicht von Antikörpern zum HAA überzogen. Einige der Objektträger wurden dann in Serum eingetaucht, das von Hepatitis-Patienten entnommen war und von dem man wusste, dass es HAA enthält. Andere
Objektträger wurden in Serumproben eingetaucht, von denen man wusste, dass sie kein HAA enthalten. Die in die erstgenannten Seren eingetauchten Objektträger hatten bimolekulare Proteinschichten darauf, was visuell als dunklere Zonen nachweisbar war, während die in die anderen Blutproben eingetauchten Objektträger nur monomolekulare Schichten aufweisen.
Theoretisch ist der in diesem Beispiel beschriebene direkte Test bevorzugt, und zwar sowohl wegen seiner relativen Einfachheit als auch weil er eine grössere Empfindlichkeit hat als der Inhibitionstest des Beispiels 1. Die höhere Empfindlichkeit des direkten Tests rührt von der Tatsache, dass die HAA Moleküle sehr viel grösser sind als die Moleküle der Antikörper zum HAA. Der direkte Test ergibt daher eine sehr viel grössere prozentuale Veränderung der Filmdicke und somit ist ein grösserer Kontrast beobachtbar.
Die Konzentration des HAA im Blut einer Person, das dieser Krankheit ausgesetzt ist, ist eine Funktion der Zeit. Die Konzentration des HAA während der klinischen und unmittelbar vorklinischen Phasen der Hepatitis ist sehr hoch. In den weit nach-klinischen Phasen ist die Konzentration des HAA im Blut einer Person jedoch sehr gering. Beide Zustände sind medizinisch von Interesse. Der Nachweis des Antigens während der klinische Zwecke von Wert. Der Nachweis des Antigens in der weit nach-klinischen Phase ist von Wert für das Überprüfen des Blutes in Aussicht genommener Blutspender. Der einfachere empfindlichere direkte Test ist daher für diagnostische Zwecke bevorzugt, da er wegen der relativ hohen Konzentration des HAA in der Blutprobe leicht ausgeführt werden kann.
Beispiel 3
Der Inhibitionstest des Beispiels 1, der für Auswahlzwecke beschrieben wurde, erfuhr eine experimentelle Auswertung zur
Bestimmung seines Wertes in Bezug auf andere Auswahltests auf Hepatitis. In diesen Tests wurde Hepatitis-positives Serum mit bekanntem Hepatitis-negativem Serum verdünnt. Unter Anwendung des Inhibitionsverfahrens des Beispiels 1 war eine
Verdünnung eines Teiles Hepatitis-positiven Serums mit 32 Teilen Hepatitis-negativen Serums geeignet für einen zuverlässigen Nachweis während einer Stunde. Benutzte man eine Verdünnung von einem Teil Hepatitis-positivem Serum auf
3000 Teile Hepatitis-negativen Serums, dann konnte ein zuverlässiger Nachweis innerhalb von 20 Stunden geführt werden.
Diese Ergebnisse erweisen sich als sehr ähnlich hinsichtlich der Empfindlichkeit und der benötigten Zeit, wie das bekannte Gegenelektrophorese-Verfahren und das Radioimmunitäts-Verfahren. Ein Auswahlverfahren gemäss der vorliegenden Erfindung ergibt daher Resultate, die vergleichbar sind den besten bekannten Verfahren, wobei man den Vorteil gewinnt, diese Ergebnisse mit einem beträchtlich billigeren Verfahren zu erhalten.
Der bevorzugte Gebrauch eines goldüberzogenen Substrates verglichen mit einem mit Metallkügelchen überzogenen Substrat bei der vorbeschriebenen Hepatitis-Diagnose liegt darin begründet, dass die HAA-Moleküle einen Durchmesser von etwa 210 A haben. Mit solchen Filmdicken kann man bei goldüberzogenen Substraten eine empfindliche Anzeige erhalten, doch sind sie zu dick für eine hohe Empfindlichkeit bei mit Metallkügelchen überzogenem Substrat.
Beispeil 4
Ein diagnostischer Test auf Gonorrhoe wurde folgendermassen ausgeführt:
Ein Glasobjektträger wurde mit einer Titanschicht metallisiert und die Oberflächenschicht dann oxidiert unter Bildung einer Deckschicht aus Titanoxid. Dann löste man Neisseria Gonorrhoe-Extrakt in Salzwasser, um eine Konzentration von
1 mg/ml zu erzeugen. Ein Tropfen der Lösung des Antigens wurde im Zentrum des Objektträgers aufgebracht. Der Objektträger wurde in einer Feuchtigkeitskammer (Kunststoffbehälter gefüllt mit feuchten Schwämmen) bei Zimmertemperatur (23" C) inkubiert, bis das Antigen an der Oxidoberfläche haftete (10-30 Minuten). Der Objektträger wurde dann mit destillierten Wasser gewaschen und mit einem Luftstrahl trockengeblasen. Zu diesem Zeitpunkt kann der Objektträger zur späteren Verwendung gelagert werden.
Für diese Verwendung wird der Objektträger in Blutserum eingetaucht, welches den Antikörper zum Neisseria-Antigen enthält, wobei das Gesamtvolumen 2 ml beträgt. Objektträger und Antikörperlösung werden in einem Plastikbehälter, der auf einer Schüttelvorrichtung befestigt ist, 12 Stunden bei 23 " C inkubiert. Nach der Inkubation wird der Objektträger wieder mit destilliertem Wasser gewaschen. Wenn nach dem Trocknen ein scharf kontrastierender sichtbarer Fleck im Zentrum des Objektträgers beobachtet wird, zeigt dies eine positive Reaktion. In Fällen, in denen das Blutserum keine Gonorrhoe-Antikörper enthält, bildet sich keine bimolekulare Schicht und man sieht keinen Fleck.
Beispiel 5
Ein diagnostischer Test auf Röteln wurde nach dem allgemeinen Verfahren des Beispiels 4 ausgeführt. Ein goldmetallisierter Glasobjektträger wurde verwendet und das Antigen war ein Extrakt einer Röteln-Viren-Kultur. Nach der Behandlung des Objektträgers mit einer menschlichen Serumzubereitung, die Röteln-Antikörper enthielt, wurde ein scharf kontrastierender sichtbarer Fleck beobachtet. Das Verfahren wurde wiederholt unter Verwendung eines tantalmetallisierten Objektträgers. Dabei erhielt man im wesentlichen die gleichen Ergebnisse.
Derzeit werden Röteln-Antikörper unter Verwendung eines Hämagglutinations-Inhibitionstestes nachgewiesen. Dieser wird bei Patienten in Entbindungskliniken ebenso wie bei Frauen im geburtsfähigen Alter ausgeführt, die durch Vorsorgekliniken gehen. Dieser Test erfordert zwei Tage. Der erfindungsgemässe Test benötigt nur zwei Stunden und ergibt im wesentlichen die gleichen Resultate.
Beispiel 6
Ein diagnostischer Test auf Poliomeylitis wurde nach dem allgemeinen Verfahren des Beispiels 4 ausgeführt. Ein goldmetallisierter Glasobjektträger wurde hierfür verwendet und das Antigen war ein Extrakt einer Polio-Viren-Kultur. Nach der Behandlung des Objektträgers mit einer menschlichen Serumzubereitung mit Polio-Antikörper wurde ein scharf kontrastierender sichtbarer Fleck beobachtet. Das gleiche Verfahren mit einem tantalmetallisierten Glasobjektträger ergab im wesentlichen die gleichen Resultate.
Dieses Testverfahren ist sehr viel einfacher als das übliche Verfahren, bei dem das Polio-Antikörper-Niveau mittels eines Komplement-Fixationstestes bestimmt wird.
Beispiel 7
Ein Test auf Proteine der bläschenförmigen Mundschleimhautentzündung wurde nach dem allgemeinen Verfahren des Beispiels 4 ausgeführt. Hierzu wurde ein goldmetallisierter Glasobjektträger verwendet und das Antigen war ein Extrakt des die bläschenförmige Mundschleimhautentzündung verursachenden Virus. Nach dem Behandeln des Objektträgers mit Proteinen, die spezifisch für das Antigen sind, wurde ein scharf kontrastierender sichtbarer Fleck beobachtet. Tantalmetallisierte Glasobjektträger ergaben im wesentlichen die gleichen Resultate.
Beispiel 8
Ein diagnostischer Test auf Tetanus wurde nach dem allgemeinen Verfahren des Beispiels 4 ausgeführt. Hierzu wurde ein goldmetallisierter Glasobjektträger verwendet und das Antigen als ein wässriger Extrakt eines Tetanustoxoids aufgebracht. Nach Behandlung mit einer menschlichen Serumzubereitung, die Tetanustoxoid-Antikörper enthielt, wurde ein scharf kontrastierender sichtbarer Fleck beobachtet.
Das Verfahren konnte mit im wesentlichen den gleichen Resultaten an einem tantalmetallisierten Glasobjektträger ausgeführt werden.
Beispiel 9
Ein diagnostischer Test auf Diphtherie wurde nach dem allgemeinen Verfahrens des Beispiels 4 ausgeführt. Hierfür wurde ein tantalmetallisierter Glasobjektträger benutzt und das Antigen war ein wässriger Extrakt des Diphtheriebakterientoxins. Nach der Behandlung mit einer menschlichen Serumzubereitung, die Antikörper für die Diphtherietoxine enthielt, wurde ein scharf kontrastierender sichtbarer Fleck beobachtet.
Beispiel 10
Ein diagnostischer Test auf Syphilis wurde nach dem allgemeinen Verfahrens des Beispiels 4 ausgeführt. Hierzu verwendete man einen goldmetallisierten Glasobjektträger und das Antigen war eine wässrige Suspension von Treponema pallidum. Nach der Behandlung mit einer menschlichen Serumzubereitung, die Antikörper zur Syphilis enthielt, wurde ein scharf kontrastierender sichtbarer Fleck beobachtet.
Tantalmetallisierte Glasobjektträger konnten mit im wesentlichen den gleichen Ergebnissen benutzt werden.
Beispiel 11 und 12
Diagnostische Tests auf Pilzantikörper wurden nach dem allgemeinen Verfahren des Beispiels 4 ausgeführt. Ein tantalmetallisierter Glasobjektträger wurde verwendet und die Antigene waren wässrige Suspensionen der Familie Aspergillus bzw. Candida. Nach einer Behandlung mit einer menschlichen Blutserumzubereitung, welche die entsprechenden Pilz Antikörper enthielt, wurden scharf kontrastierende sichtbare Flecke beobachtet.
Beispiel 13
Ein diagnostischer Test auf einen Parasiten wurde nach dem allgemeinen Verfahren des Beispiels 4 ausgeführt. Man verwendete einen goldmetallisierten Glasobjektträger und das Antigen war ein wässriger Extrakt von Toxoplasma gondii.
Nach der Behandlung mit einer menschlichen Serumzubereitung, die Antikörper zu diesen Parasiten enthielt, wurde ein scharf kontrastierender sichtbarer Fleck beobachtet Mit tantalund indiummetallisierten Glasobjektträgern wurden im wesentlichen die gleichen Ergebnisse erhalten.
Unter Verwendung von gold- und tantal-metallisierten Glasobjektträgern wurden auch quantitative Tests ausgeführt, indem man zweifache Verdünnung aus dem Serum des Patienten (Antikörper) herstellte und als Endpunkt für die Titration die Konzentration benutzte, mit der der letzte sichtbare Fleck erzeugt werden konnte.
Der Parasit hatte eine unbekannte Ätiologie, doch war festgestellt worden, dass latente und/oder unsymptomatische Infektionen in schwangeren Frauen viele Geburtsfehler verursachen. Es ist kein anderes serologisches Verfahren entwickelt worden, um auch Antikörper zu diesem Organismus zu testen.
Beispiel 14
Ein diagnostischer Test auf Antikörper zum menschlichen Nukleoprotein-DNA wurde nach dem allgemeinen Verfahren des Beispiels 4 ausgeführt. Hierzu wurde ein goldmetallisierter Glasobjektträger verwendet und das Antigen war eine wässrige Suspension des DNA-Histonkomplexes, der in den Kernen menschlicher Zellen gefunden wird. Nach der Behandlung mit Zubereitungen meschlicher Blutseren, die Antikörper zum DNA-Histonkomplex (Nukleoprotein) und/oder Antikörper zum DNA (nicht komplexiert mit Histon) enthielten, wurden scharf kontrastierende sichtbare Flecke beobachtet. Der Vorteil dieser Technik liegt darin, dass sowohl Nukleo-Protein als auch DNA-Antikörper auf einem einzigen Objektträger bestimmt werden können. Mit tantalmetallisierten Glasobjektträgern wurden im wesentlichen die gleichen Ergebnisse erhalten.
In gewissen Krankheitszuständen können Auto-Antikörper zu diesen meschlichen Molekülen zum DNA-Teil des Moleküls, zum Histon oder zur Bindung zwischen beiden dirigiert werden.
In 30% der Fälle von Lupuserythematosus wird ein Antikörper erzeugt, der spezifisch für DNA ist und daher ist sein Nachweis diagnostisch brauchbar. Gegenwärtige Verfahren zum Testen auf solche Antikörper verwenden Objektträger und ein Mäuselebergewebe und ein spezielles Peroxidase-Färbemittel oder eine Fluoreszens-Antikörper-Technik. Beide Prozeduren dauern lange und die Objektträger sind schwer abzulesen.
Im Gegensatz dazu ist das erfindungsgemässe Verfahren sehr viel kürzer, die Objektträger sind leicht abzulesen und sie zeigen eine starke Korrelation mit den gegenwärtigen Analyseverfahren.
Beispiel 15
Ein diagnostischer Test auf Antikörper zum menschlichen Proteinthyroglobulin wurde nach dem allgemeinen Verfahren des Beispiels 4 ausgeführt. Solche Antikörper werden bei gewissen Krankheitszuständen, z.B. Hashimotos-Krankheit gebildet. Es wurde ein gollmetallisierter Glasobjektträger verwendet und das Antigen war eine wässrige Suspension von Thyroglobulin. Nach der Behandlung mit einer Zubereitung von menschlichem Blutserum, die Antikörper zum Thyroglobulin enthielt, wurde ein scharf kontrastierender sichtbarer Fleck beobachtet. Mit tantalmetallisierten Glasobjektträgern wurden im wesentlichen die gleichen Resultate erhalten.
Beispiel 16
Ein diagnostischer Verfahren auf Antikörper zum Kollagen wurde nach dem allgemeinen Verfahren des Beispiels 4 ausgeführt. Es wurde dazu ein tantalmetallisierter Glasobjektträger verwendet und die Antigenzubereitung war ein wässriges kollagenhaltiges Medium. Nach der Behandlung mit Kaninchenblutseren, die Antikörper enthielten, die durch Verabreichung von Kollagenfraktionen gebildet waren, wurde ein scharf kontrastierender sichtbarer Fleck beobachtet. Kaninchen, die man mit einer hoch cholesterinhaltigen Diät fütterte, erzeugten Antikörper zum Kollagen.
Beispiel 17 und 18
Zum Nachweis der Schwangerschaft wurde ein Inhibitionstest ausgeführt. Hierzu benutzte man einen goldmetallisierten Glasobjektträger und das Antigen war eine wässrige Zubereitung des menschlichen chorionischen Gonadotrophins. Solches HCG enthaltende Blutserum wurde einer Serienverdünnung ausgesetzt und eine bekannte Konzentration des HCG Antikörpers hinzugegeben. Der Objektträger wurde in die Zubereitung eingetaucht. Ist der Test positiv, wurde kein sichtbarer Fleck festgestellt. Ein sichtbarer Fleck entspricht einem negativen Test. Mengen von mehr als 2000 internationalen Einheiten HCG auf 100 ml Serum zeigen Schwangerschaft an. Dieses Verfahren kann auch zum Testen von Prostatatumoren verwendet werden.
Dieser Verfahren wurde wiederholt und dabei anstelle des HCG Insulin verwendet. Ein blosser Objektträger entspricht einem positiven Test. Antikörper-Titrationen wurden sowohl auf gold- als auch auf tantalmetallisierten Glasobjektträgern ausgeführt und zwar mit einer Empfindlichkeit von 100 Nanogramm, die leicht vergrössert werden kann.
Beispiel 19
Ein diagnostischer Test auf Antikörper für das Schlüssellochschnecken-Hämocyaninprotein wurde nach dem allgemeinen Verfahren des Beispiels 4 ausgeführt. Es wurde ein goldmetallisierter Glasobjektträger verwendet und die Antigenzubereitung war ein wässriges Medium des vorgenannten Proteins. Nach der Behandlung mit einer Zubereitung menschlichen Blutserums, die Antikörper zu diesem Protein enthielt, wurde ein scharf kontrastierender sichtbarer Fleck beobachtet.
Mit tantalmetallisierten Glasobjektträgern wurden im wesentlichen die gleichen Ergebnisse erhalten.
Derzeit wird eine Untersuchung vorgenommen, um ein Antigen zu finden, das in Menschen Verwendung fingen kann, um die Wirksamkeit ihrer Antikörper-Erzeugungssysteme zu testen. Zu diesem Zwecke ist ein Antigen erforderlich, das mit dem Wirt bisher noch nicht in Berührung gelangt ist und as vorgenannte Protein ist ein wahrscheinlicher Kandidat. Das erfindungsgemässe Verfahren ist hierfür geeignet, da es geringe Konzentrationen von Antikörpern zu diesem Protein nachweisen kann und nicht mühsam und zeitaufwendig ist und auch nicht unempfindlich.
Während das an der Substratoberfläche adsorbierte reaktive Protein im vorstehenden als Antigen beschrieben worden ist, kann solche erste reaktive Proteinschicht selbstverständlich auch ein Antikörper sein und die zweite Proteinschicht wäre dann ein Antigen spezifisch für einen solchen Antikörper und die dritte Schicht wäre wiederum der Antikörper.
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PATENT CLAIM I
Method for detecting a specific protein in a solution according to claim I of the main patent, characterized in that the plate is immersed in an aqueous solution of an antibody specifically reacting with the antigen or an antigen specifically reacting with the antibody to detect an antigen or antibody .
SUBCLAIMS
1. The method according to claim 1, characterized in that a protein is used as the antigen.
2. The method according to claim I, characterized in that the plate is coated with a closed metal film.
3. The method according to claim I, characterized in that a metal which wets the plate poorly, preferably indium, gold, silver, tin or lead, is vaporized onto the plate, which is preferably made of glass, plastic, vitreous silicon dioxide, mica or quartz, that it is deposited in the form of beads.
4. The method according to one of the dependent claims 1 and 2, characterized in that the test of whether a bimolecular or monomolecular layer adheres to the plate is carried out by measuring an electrical capacitance on the layer, preferably by measuring on the upper surface the layer arranges a second electrode, in particular in the form of a mercury drop, and measures the Katazität with respect to the metallic surface of the substrate as the first electrode.
5. The method according to one of the dependent claims 1 and 2, characterized in that a metal which is visibly amalgamated with mercury is applied to the plate, and that the test is carried out to determine whether a bimolecular or monomolecular layer adheres to the plate, by placing a drop of mercury on the upper surface of the layer and measuring the time taken for the amalgam to appear.
6. The method according to any one of the dependent claims 1 and 2, characterized in that the test of whether a bi- or monomolecular layer adheres to the plate is carried out by placing a on the upper surface of the layer after immersion in the sample to be examined second metal layer, preferably by galvanic deposition, and the plate viewed in reflected light.
7. The method according to any one of the dependent claims 1 and 3, characterized in that indium is vapor-deposited onto the plate from a tantalum trough at a pressure of about 5.10-5 Torr.
8. The method according to one of the dependent claims 1 and 3, characterized in that the plate is applied to the surface of a liquid with the metal and the layer facing down to test whether a bi- or monomolecular layer adheres to it.
9. The method according to one of the dependent claims 1 and 3, characterized in that the test whether a bimolecular or monomolecular layer adheres to the plate is carried out by converting the substrate into a reagent which splits the immunological bond, preferably a weak acid, immersed and observed the change in layer thickness with an ellipsometer,
10. The method according to claim I, characterized in that a metal oxide layer is applied to the metal prior to immersion in the solution, the metal preferably being titanium and the metal oxide being titanium dioxide.
11. The method according to claim I and dependent claim 10 for the detection of gonorrhea, characterized in that the substrate is coated with a monomolecular layer of Neisseria gonorrhea antigen.
12. The method according to claim I, characterized in that the plate for the detection of antibodies for
Hepatitis with a monomolecular layer of the antigen associated with the hepatitis and for the detection of
Antigens to hepatitis is coated with a monomolecular layer of the antibody to the antigen associated with hepatitis.
PATENT CLAIM II
Device according to patent claim II of the main patent for performing the method according to patent claim I above, characterized in that the monomolecular layer contains antibodies specifically reacting with the antigen to be detected or antigens specifically reacting with the antibody to be detected.
SUBCLAIMS
13. Device according to claim II, characterized in that the antigen is a protein.
14. Device according to claim II, characterized in that it has a multiplicity of different monomolecular layers, each of which covers part of the substrate and the metal balls.
15. Device according to claim II, characterized in that the metal spheres are indium particles with diameters in the range from 1 to 200 nm.
16. Device according to dependent claim 13, characterized in that the metal balls contain gold, tantalum, indium, titanium or titanium covered with titanium dioxide.
17. Device according to dependent claim 16, characterized in that the metal balls contain gold and another metal to improve the adhesiveness between the gold and the substrate, the other metal preferably forming an alloy with the gold.
18. Device according to claim II, for diagnosing pregnancy, characterized in that the monomolecular layer is the specifically reacting antibody for the HCG antigen.
19. Device according to claim II, for the detection of hepatitis, characterized in that the monomolecular layer is the antigen associated with the hepatitis or the heptitis antibody.
20. Device according to claim II, for the detection of gonorrhea, characterized in that the monomolecular layer is the antibody to the Neisseria gonorrhea antigen.
Claim I of the main patent relates to a method for the detection of a specific protein in a solution, whereby a metal is applied to a plate made of translucent material, the coated plate by immersion in a solution of a protein which reacts specifically with the protein to be detected and has a monomolecular layer of this specifically reacting protein covered, the plate treated in this way is immersed in the solution to be examined and finally checks whether a bimolecular or monomolecular protein layer is adhering to the plate.
Claim II of the main patent relates to a device for carrying out the method according to claim I, with a substrate with a plurality of metal spheres that adhere to a surface of the substrate, and a monomolecular layer of an immunologically reactive protein that contains at least part of the substrate and the Metal balls covered.
Publications that primarily form background material for the present invention are: aOptimal Measurement of the Thickness of a Film Adsorbed from a Solution by Irving Langmuir et al in Journal of the American Chemical Society, Volume 59 (July to December 1937, pp. 1406), Immunological and Enzymatic Reactions Carried Out at a Solid-Liquid Interface by Alexandre Rothen in Physiological Chemistry and Physics, 5, (1973), pp. 243-258, Interactions Among Human Blood Proteins at Interfaces by Leo Vroman et al, Federation Prodeedings , Volume 30, No. 5 (September / October 1971) p.
1494-1502 and The Antibody-Antigen Response: A Visual observation by Ivar Giaever in Journal of Immunology, Volume 110, No. 4, (May 1973) pp. 1424-1425.
Immunological reactions are highly specific interactions in which an antigen reacts with a corresponding second biological component specific to the antigen, and generally as that
Antibody is known, whereby an immunological complex is formed. Immunological reactions that take place within a biological system, such as an animal or a
Humans are vital in fighting disease. In a biological system, the entry of a foreign biological component, e.g. of the antigen, the generation of the specific antibody against the
Antigen in a process that is not yet fully understood.
The antibody molecules have chemical binding sites that complement those on the antigen molecule so that the antigen and antibody combine to form the immunological complex.
Antibodies are generated by biological systems in response to the entry of foreign objects. The detection of antibodies in a biological system is therefore of medical diagnostic value in determining the
Antigens to which the system has been exposed. It would be e.g.
usable to human blood, plasma or tissue
To examine the presence of the antibody to syphilis or gonorrhoe. Conversely, the detection of certain antigens in a biological system also has medical diagnostic value. Examples of the diagnostic detection of antigens include the detection of human chorionic gonadotrophin protein molecules (abbreviated
HCG) in the urine as a test for pregnancy and the detection of the hepatitis-related antigen molecules (HAA for short) in the blood
Blood donor one.
Most antigens are proteins or contain proteins as an integral part, while all antibodies are proteins, proteins are large molecules of high molecular weight, i.e. they are polymers made up of amino acid chains. The
Antigen and antibody protein can each have multiple sites of attachment. The five major classes of antibodies (the
Immunoglobulins (Ig-G, Ig M, Ig A, Ig E, and Ig D) are each evidenced by at least two severe (long)
Characterized peptide chains of amino acids and at least two light (short) peptide chains of the acids in which the
Bond between amino acid units is known as a peptide bond.
These heavy and light peptide chains are oriented in the general shape of the letter Y and the active or connection sites are at the extremes of the two arms of the Y-shaped antibody in Ig G antibodies.
In addition to the immunological reaction taking place between specific protein antigens and specific protein antibodies, which leads to the formation of a protein-antigen-protein-antibody complex, the present invention also encompasses other immunologically complexing reactions between immunologically reactive antigens and antibodies. Furthermore, specific reactions between other biological particles, such as enzymes and their substrates, are also encompassed by the term immunological reaction as used in the present application. Finally, the terms antigen and antibody used in the present application are intended to include such terms as enzymes, substrates of enzymes and similar biological particles.
The method is also versatile enough to allow a specific antibody to be exchanged for the corresponding antigen and the antigen for the corresponding specific antibody.
E.g. the following systems incorporate biological particles capable of carrying out the immunological reactions described in the present application:
Viruses, bacteria and bacterial toxins, fungi, parasites, animal tissues, animal body fluids and the like.
With regard to viruses, the antigens are cultures of viruses or parts thereof and the antibodies specific thereto can be produced by administering them to a living host. Exemplary antigen-antibody complexes in the following virus systems are suitable for the method according to the invention:
Rubella virus culture (antigen) - rubella virus antibody, polio virus culture (antigen) - polio virus antibody, the culture of the virus (vesicular stomatitis virus, abbreviated VSV) (antigen) - VSV antibody.
With regard to bacteria and bacterial toxins, the antigens are the respective bacteria or bacterial toxins or parts thereof, and the antibody is produced by injection into a living host. The following examples of antigen-antibody pairs can be used in the inventive method:
Tetanus toxoid suspension (antigen) - tetanus antibodies, diphtheria toxin suspension (antigen) - diphtheria
Antibody, Neisseria Gonorrhoeic Suspension (Antigen)
Gonorrhea antibody Treponema palladium suspension (antigen) - Syphilis antibody.
In fungi, the antigens are the antigenic extracts of
Fungal suspensions and the antibody is the fungal antibody that is produced by injection into a living host.
Antigen-antibody complexes of fungal systems are illustrated by the following examples:
Aspergillus extract suspension (antigen) - Aspergillus fungus
Antibody, Candida extract suspension (antigen) - Candida fungus antibodies
Antigens and antibodies in parasitic systems are obtained in a manner similar to that of fungi. The Toxoplasma gondii extract (antigen) system - Toxoplasma gondii
Antibody is a case in point.
The term polysaccharides refers to a system in which the antigen is a carbohydrate antigen.
An example of such an antigen-antibody-containing system is Pneumococcus polysaccharides (antigen)
Pneumococcus antibodies.
In addition to the typical enzyme-enzyme substrate
Reaction, which is to be encompassed by the present invention, enzymes themselves or parts thereof as
Antigens are used and the antibody is the respective enzyme antibody that is formed by a living host after injection. Examples of antigen-antibody complexes of enzyme systems are:
Trypsin Extract - Trypsin Antibodies
Chymotrypsin Extract - Chymotrypsin Antibodies Pepsin Extract - Pepsin Antibodies Ribonuclease Extract - Ribonuclease Antibodies Thrombin Extract - Thrombin Antibodies
Amylase Extract - Amylase Antibodies
Penicillinase Extract - Penicillinase Antibodies.
In the case of hormones, the antigen component is usually found in a hormone extract and the antibody is the particular hormone antibody produced by a living one
Organism is formed after the injection. An exemplary one
The antigen-antibody complex is: insulin - insulin-antibody.
Although the following description is mainly directed to immunological interactions between specific protein antigens and specific protein antibodies, it can also be applied to the systems described above and immunologically reactive antigens and antibodies.
In the manner currently carried out, the diagnostic use of the immunologically active antibodies and antigens is based on their precipitating or agglutinating properties, which result from the immunological complexing reaction. The classic example of these diagnostic uses is the method of determining blood type, in which blood samples are mixed with alpha and beta serum antibodies and the blood type is determined by observing agglutination that occurs in the blood sample.
The determination of pregnancy via the HCG protein, as it is currently carried out, is an inhibition test. This test is carried out by mixing a quantity of the HCG antiserum into a urine sample. Then you put polystyrene beads that have been coated with HCG protein in the prepared urine sample. The polystyrene beads will agglutinate if, and only if, HCG protein is not present in the urine sample. If no HCG protein is present in a urine sample, the HCG protein on the polystyrene beads complexes with the HCG antiserum previously introduced into the urine sample and the beads agglutinate.
On the other hand, if HCG protein is present in the urine sample in sufficient quantities that it complexes with the previously introduced HCG antiserum to form a complex which precipitates out of the sample so that the previously introduced antiserum can complex with the HCG protein on the beads is no longer available under agglutination. According to the present invention, the current HCG protein pregnancy test could be simplified by having HCG antiserum attached to the polystyrene beads and directly examining a urine sample. In this case, the polystyrene beads would agglutinate if, but only if, HCG protein is present in the sample.
The reason for not using this simpler procedure appears to be that the available HCG antisera are complex mixtures containing a large proportion of components other than HCG antibodies.
The additional effort required according to the state of the art to extract the antibodies from the HCG antisera made the state of the art inhibition test more advantageous when the sera were used directly.
According to one embodiment of the present invention, however, a method is created by means of which the simpler direct test can be carried out. A serious disadvantage of agglutination tests, which is overcome by the direct method of the invention, is that the particles used therein can agglutinate for a variety of reasons unrelated to immunological agglutination, thereby reducing the reliability of the test.
Therefore, although the agglutination tests are carried out with great care by trained technicians, diagnostic errors occasionally occur.
Although it is known that the antigen-antibody complexation reaction will take place when an antigen (or antibody) is adsorbed on a surface, this technique has not been applied very much to medical diagnosis using slides as substrates.
The complexation reaction on a surface was observed with an ellipsometer. An ellipsometer is a complex optical instrument with which it is possible to measure the thickness of films in the order of 0.1 Å.
Ellipsometers are expensive and require skilled operators. In studying immunological reactions with ellipsometers, two methods have heretofore been used.
In one method, the reaction to be studied is allowed to take place and then the slide on which the reaction took place is placed in an ellipsometer and the film thickness is measured. In the other method, the slide for the immunological reaction to take place is placed in the ellipsometer and the change in film thickness is observed. The measurement of the absolute thickness requires extreme care. On the other hand, when the concentration of antibodies in the solution is low, measurement of the absolute thickness takes a long time. For practical reasons, the detection of immunological reactions on a surface with an ellipsometer has therefore not been used for diagnostic purposes.
The present invention is based on the finding that any arbitrarily selected immunologically reactive antigen is adsorbed on a substrate only in a monomolecular layer and that only a specific antibody for such an arbitrarily selected antigen will combine with this to form a bimolecular layer with the substrate . Such layers are readily and quickly detectable in the practice of the present invention.
This finding therefore allows the creation of methods and devices for carrying out the method which are of great utility in medical, diagnostic and pharmacological applications.
It is an object of the present invention to improve the method for the detection of a specific protein in a solution in such a way that it can be used for the detection of an antigen or antibody. Another object of the present invention is to improve the device for carrying out the method according to patent claim I of the main patent so that it can be used for carrying out said detection of an antigen or antibody.
The first-mentioned object is achieved according to the invention in that, in order to detect an antigen or antibody, the plate is immersed in an aqueous solution of an antibody which reacts specifically with the antigen or an antigen which reacts specifically with the antibody.
The second object is achieved according to the invention by a device according to patent claim II of the main patent, in which the monomolecular layer contains antibodies specifically reacting with the antigen to be detected or antigens specifically reacting with the antibody to be detected.
When carrying out the method according to the invention, one can proceed, for example, in such a way that first a metal is applied to a substrate and then the substrate is brought into contact with an aqueous medium which contains the antigen specifically reacting for the specific antibody, around the entire substrate or one To coat part of it with a monomolecular layer of the specifically reacting antigen, immerse and then examine the coated substrate to determine whether a bimolecular or a monomolecular layer is adhered to the substrate. If a bimolecular layer is detected, this indicates that the biological sample contains the specific antibody of interest. On the other hand, the absence of a bimolecular layer indicates that the sample did not contain the antibody.
The invention is explained in more detail below with reference to the drawing. Show in detail:
FIG. 1 shows a flow chart which illustrates the process stages of the various embodiments of the process according to the invention,
Figures 2a, 2b and 2c are side views of the diagnostic device showing the manufacturing process and its use,
FIGS. 3a, 3b and 3c side views of another embodiment of a device according to the present invention which can be used for diagnostic purposes,
Figure 4 is a photo,
which illustrates the operation of the diagnostic device,
Figures 5a and 5b side views of diagnostic devices,
FIG. 6 shows a side view of a diagnostic device which shows a modification of the method of using the device according to FIG.
FIG. 7 shows a graphic representation which shows the working principle of the diagnostic device according to the embodiment of FIG
Figure 8 is a side view of another embodiment of the diagnostic device.
In FIG. 1, the flow chart shows, from top to bottom, at each vertical level a stage of the process that follows the one above in time. Performing several steps horizontally at a given vertical height shows alternative embodiments of the method according to the invention.
According to a first embodiment of the present
In the invention, the method begins with block 13 of Figure 1, in which a disk of substrate material, which can be metal, glass, mica, plastic, vitreous silicon oxide, quartz or a similar material, with metal being preferred because it has the greatest difference in refractive index Has antigen or antibody and the metal is preferably in
In the form of a metallized glass slide, is brought into contact with a solution containing a first antigen of interest which is present in a relatively concentrated aqueous medium, e.g. a solution which is available and which is to be used to detect or purify its corresponding specifically reacting antibody. The contacting can be done by any technique, e.g.
by applying one or more drops of the medium to the disc or by immersing it partially or completely.
Depending on the technique used and the concentration of the antigen in the aqueous medium, the first antigen will adhere to the entire surface of the substrate or a part thereof in a monomolecular layer. An antigen will only adhere in a monomolecular layer; no further adsorption will take place. That is, the antigen will adhere to the substrate but not to itself. The time required for the monomolecular layer to adsorb onto the substrate is a function of the concentration of the antigen in the solution and the degree to which the solution is agitated. For example, a 1% bovine serum albumin solution completely covers a slide with a monomolecular protein layer in about 30 minutes.
The next step, illustrated in block 14 of FIG. 1, consists in immersing the substrate coated with the antigen in a solution which is suspected to contain the specifically reacting antibody for the first antigen. This solution can, and usually does, contain many ingredients in addition to the specific reacting antibody whose presence one wishes to detect. However, no antibody other than a specifically reactive antibody will adhere to the first layer on the substrate. It is of course known that certain biological substances, according to the phenomenon known as non-specific adhesion, can accumulate. Such substances are found in serums, etc.
There are, however, a number of ways of reducing non-specific adhesion, the most convenient of which appears to be to dilute the medium containing such substances. If the specifically reacting antibody is not present, the substrate will only ever have a monomolecular antigen layer after it has been immersed in the solution in which the specifically reacting antibody was suspected. If, on the other hand, the specifically reacting antibody is present in the solution, an immunological complexing takes place between the first antigen and its corresponding specifically reacting antibody and the substrate will wear a bimolecular layer after a certain time. It should be pointed out that the stages illustrated in blocks 13 and 14 of FIG. 1 are common to all embodiments of the present invention.
The time required for a complete second monomolecular layer to adhere to the coated substrate is again a function of the concentration of the corresponding specifically reacting antibody in the solution. For antibodies in blood serum, this can take anywhere from minutes to a day, depending on the concentration.
The next step according to an embodiment of the present invention is the immersion of the coated substrate in a reagent which can cleave immunological bonds, as illustrated in block 15 of FIG. 1, while at the same time the coated substrate 1 is observed in an ellipsometer, as in block 22 Figure 1 illustrates. Such a reagent can be a weak acid solution, a base solution or a strong salt solution and the like. While the binding of the specifically reacting antibody to the antigen-coated substrate can take a long time, the immunological bond between the two layers is very quickly broken by the cleavage reagent. The observation carried out with the ellipsometer can therefore be a relatively simple observation of the change in the film thickness instead of the complicated measurement of the absolute film thickness.
In addition, the cleavage of the specifically reacting antigen / antibody layer by the reagent that cleaves the immunological bond can take place much more quickly than the observation of the build-up of the specifically reacting antibody layer, which is customary according to the prior art. Many test slides can therefore be prepared according to block 13 and each one has a solution, e.g. exposed to a serum sample, as indicated in block 14 and then you can test them in series for a short time according to the steps of blocks 15 and 22 in order to determine which of the serum samples contained the specifically reacting antibody to the first antigen.
Since the immunological bond cleaving reagent will not detach the first antigen or antibody from the substrate, the coated substrates immersed in media which did not contain the specifically reacting antibody will not show any change in film thickness when placed in the cleaving reagent immersed and observed in an ellisometer. In contrast, the slides immersed in a solution containing the specifically reacting antibody will show about a factor of 2 to 5 in terms of change in thickness when immersed in the cleavage reagent and observed in an ellipsometer. Each observation can be made in a matter of minutes and thus an effective diagnostic test procedure is created.
Although the described first embodiment of the method according to the invention provides a more effective use of the ellipsometer for immunological detection, it is nevertheless economically desirable to completely eliminate the need to use the ellipsometer. According to another embodiment of the present invention, therefore, relative film thicknesses are determined electrically. In this embodiment, either a metallic substrate is selected or a substrate of a different material is first coated with a metal film, as illustrated in block 11 of FIG. The metal substrate or metal-coated substrate is then brought into contact with a medium which contains antigens, according to the steps described in blocks 13 and 14. The layers adhering to the substrate are electrically insulating.
The next stage is to place a drop of mercury or other electrode on the top antigen layer as shown in block 16 of FIG. The upper antigen layer is either the first antigen if the solution in which one suspects the specifically reacting antibody did not contain one, or it is the specifically reacting antibody if one was present in the solution. The metal film or the metal substrate and the mercury drop therefore constitute the two conductive plates of an electrical capacitor which are separated by an insulating layer, which is either a monomolecular or a bimolecular layer of antigen or antibodies.
The capacitance of this capacitor is then measured, as indicated in block 19 of Figure 1, by means of a suitable instrument, e.g. a Heathkit impedance bridge model IB-28. The electrical capacitance of capacitors with a bimolecular dielectric layer varies approximately by a factor of 2 to 5 compared to a capacitor with a monomolecular layer.
According to a further embodiment of the present invention, the detection of the specifically reacting antibody is further simplified in that its presence can be observed with the naked eye. In this embodiment, a metal substrate is used which forms an amalgam with mercury or another substrate, such as glass, which, according to the step in block 11, is coated with a thin metal film which forms an amalgam with mercury, preferably gold. The substrate is then subjected to the steps shown in blocks 13 and 14, and a drop of mercury is then placed on the top layer, as indicated in block 16.
In this embodiment, however, no electrical measurement is made, but the next step is to visually observe the coated substrate and determine the time that elapses before a visible amalgam is formed between the mercury and the metal film covering the substrate. This embodiment of the present invention is based on the discovery that mercury diffuses through a monomolecular layer in about 1 minute, but takes 10 minutes or more to diffuse through a bimolecular layer.
Since the mercury has to diffuse through the layer or layers in order to form a visible amalgam with the metal film on the substrate, the time between the placing of the mercury drop on the upper layer and the appearance of the visible amalgam indicates whether a monomolecular amalgam on the substrate or a bimolecular layer is present and accordingly whether the solution contained the suspected specifically reacting antibody to the first antigen or not. It will be clear to a person skilled in the art after the above explanations that the capacitance measurement in the previous embodiment must be carried out within 1 minute of placing the mercury drop on the upper layer, since the mercury electrode diffuses through the insulating layer and short-circuits the capacitor.
The short-circuit can also be prevented by coating the metal with an insulating metal oxide layer and letting the antibody or the antigen adhere to the metal oxide. An approximate quantitative measurement of the concentration of the specifically reacting antibody in the solution in which it is suspected can be made according to this embodiment by producing several substrates according to the stage of block 13 and simultaneously immersing them in the solution in which the antibody is being used suspected, as indicated in block 14, but pulls them out of the solution one after the other over a longer period of time.
Since the rate at which the layer of the specifically reacting antibody is formed is a function of the concentration of the specifically reacting antibody in the solution, a comparison of the diffusion times for the mercury drop through the layers on a number of substrates shows that of the solution for different Times have been exposed, a rough quantitative indication of the concentration of the specifically reacting antibody in the solution.
In another embodiment, a substrate is coated with a metal film, as shown in block 11 of FIG. As in the last-described embodiment, the substrate is then brought into contact with the media, as shown in blocks 13 and 14. The next step in this embodiment consists in coating the upper antigen or antibody layer with a second metal layer, as illustrated in block 17 of FIG. 1, and observing the structure thus obtained in reflected light, as illustrated in block 21 of FIG. The second metal is preferably applied by electroplating.
In this embodiment, a structure is obtained that acts as a diffraction grating and the difference between a monomolecular and a bimolecular antigen or antibody
The insulation layer can be determined from the spectral components observable in the reflected light.
Figures 5a and 5b illustrate a device according to this embodiment. A metallic surface 81 of a substrate, which can be either a metallic or a non-metallic substrate, the latter being coated with a metal film, has a first antigen layer 82 applied thereon, as shown in block 13 of FIG.
The substrate having the layer 82 is then immersed in the solution to be tested and a second layer 83 of the corresponding specifically reacting antibody to the antigen of the layer 82 is formed thereon, if the antibody is present in the solution. A second layer of metallization is then applied to the exposed surface of the film. A very small amount of metal is applied so that the second metallization layer is in the form of many non-contiguous metallized areas, e.g.
at 84 and 85. A beam of light represented by rays 86 is then directed onto the slide so prepared.
The light is reflected at the metal boundaries. The distance between the reflective surfaces of the metal substrate surface 81 and the metallization particles 84 is e.g. B. is a function of the thickness of the film between parts 81 and 84.
The observed reflected light, illustrated by rays 87, therefore varies in spectral composition between a monomolecular and a bimolecular layer of antigen or antibody.
Another embodiment illustrated in FIG. 1 includes the stages shown by blocks 12, 13, 14 and 18.
In this embodiment, the substrate must be translucent, such as glass, plastic, vitreous silicon dioxide, mica,
Quartz and the like, and it is preferably glass, microscopic slides being a convenient source, and this substrate is coated with many metal beads by vapor deposition of a metal, e.g. made of indium, as indicated in block 12 of FIG. The indium is slowly evaporated from a tantalum boat onto the glass substrate under a standard vacuum of about 5 × 10-5 mm Hg. Since the indium atoms on the surface of the substrate have a high mobility and do not noticeably wet the glass substrate, the evaporated indium collects on the substrate in small particles. Any metal that has similar properties such that it will globule the substrate when evaporated thereon can be used.
In addition to indium, gold, silver, tin, lead and bismuth can be used. The vapor deposition of the metal is continued until the substrate appears light brown. At this point in time, the metal spheres have a diameter of the order of magnitude
1000. The exact size of the spheres is not critical, but they must have diameters which are equal to the wavelengths of a large part of visible light. In the next step, the bead-coated substrate is brought into contact with a medium which contains an antigen, as illustrated in block 13 of FIG. The antigen adheres in a monomolecular layer to the substrate and the beads located on it.
After a monomolecular layer has formed, the coated substrate can be used to test solutions for the presence of a corresponding specifically reacting antibody to the antigen by immersing the coated substrate in the corresponding solution, as indicated in block 14 of FIG. If the suspected specifically reacting antibody is present, then the substrate and the metal beads have a bimolecular layer thereafter. If, on the other hand, the specifically reacting antibody is not present, then there is only a monomolecular layer on the substrate and the metal beads.
The coated substrate is then observed either in reflected or transmitted light, as indicated in block 18 of FIG. 1, and the thickness of the layer adhering to it is determined based on the appearance of the coated substrate and, accordingly, whether the suspected specifically reacting antibody was present in the solution or not. The detection of the layers corresponds to variations in the shade of brown observed in the coated substrate. These variations are very pronounced and the detection of the layers is therefore simple and direct. The particles alone on the substrate appear as a first shade of brown. The particles coated with a monomolecular antigen layer appear as a darker shade of brown, and the particles coated with a bimolecular layer appear as an even darker shade of brown.
This detection method is based on the fact that electromagnetic radiation is scattered by conductive spheres having a diameter equal to a large part of a wavelength of the incident light and that, in the case of scattering by such spheres, the scattering is strongly by a thin dielectric applied to the spheres Coating is affected.
FIG. 4 shows a photograph of a diagnostic device according to this embodiment. In that view of FIG. 4, the test slide is viewed with transmitted light. The view 4a contains a glass slide with indium beads on the surface 100. The view 4b shows a slide which is prepared like the slide of the view 4a, the left edge of which has been immersed in a solution of bovine serum albumin and which has a monomolecular layer 101 of the bovine serum albumin has absorbed.
View 4c shows a similar slide in which the left edge has been immersed in bovine serum albumin, whereby a monomolecular layer 101 of bovine serum albumin is adhered thereon and the lower edge has been immersed in a solution of egg albumin and thereby has a monomolecular layer 102 of egg albumin thereon . It is important to note that the appearance of the coated parts of the slide is similar to view 4b, indicating that there is only one monomolecular protein layer on the slide. This shows that the bovine serum albumin and the egg albumin are adsorbed on a slide and that the egg albumin does not adhere to the part of the slide that has been previously coated with bovine serum albumin.
In other words, view 4c illustrates that any arbitrarily selected antigen or antibody will adhere to the substrate, but that another antigen or antibody will not adhere to an arbitrarily selected antigen or antibody film except when an immunological complex is formed and if non-specific sticking occurs. The slide of view 4d was prepared by dipping the left edge in bovine serum albumin solution to apply a monomolecular layer 101, the right edge was then immersed in egg albumin solution to apply a monomolecular layer 102 and finally the lower edge was immersed in a solution of rabbit antiserum to the bovine serum albumin.
Accordingly, 103 is a monomolecular layer of rabbit antiserum against bovine serum albumin. The appearance of the lower right corner shows that the rabbit antiserum to bovine serum albumin did not adhere to the egg albumin layer 102 and accordingly the lower right corner of the slide of view 4d is coated with only a monomolecular layer of egg albumin. The lower left corner of view 4d is markedly dark and this indicates the presence thereon of a bimolecular protein layer comprising a first monomolecular layer of bovine serum albumin and a second monomolecular layer of rabbit antibodies to the bovine serum albumin that is immunologically complexed with the underlying bovine serum albumin.
This shows that only the specifically reacting protein pair forms a bimolecular layer on the slide, while all other coatings are monomolecular.
In a modification of this embodiment which is suitable for a medical diagnostic system, the
Substrate with the metal beads thereon partially immersed to a first depth in a solution of a first antigen.
The substrate is covered with a monomolecular layer of the first antigen on the area that is immersed in the solution. The substrate is then dried and immersed to a second depth in a solution of a second antigen. The second antigen does not adhere to the first
Antigen yet it adheres to the uncoated part of the
Substrate immersed in the solution. The substrate is then dried again and immersed in a solution of a third antigen to a third and greater depth. The third antigen adheres to that part and only to that part of the substrate other than the first or second
Antigen is coated. The procedure is repeated for any number of antigens of interest. A substrate is obtained which has many ribbon-shaped monomolecular
Layers of different antigens is coated.
This coated slide is the diagnostic tool. The diagnostic procedure then consists in placing the slide in a sample, e.g. of blood to soak for several hours.
The slide is then removed from the sample and, after washing in water, viewed in reflected or transmitted light. The slide then has a pattern of lighter and darker bands that indicate the antibodies in the sample, from which a medical diagnosis can be made.
FIGS. 2a, 2b and 2c show greatly enlarged side views of part of the diagnostic device according to the last-described embodiment of the present invention.
FIG. 2a shows a part of the substrate material 31 onto which many small metal balls 32 are vapor-deposited. The particles 32 are preferably made by vapor deposition of indium on the substrate 31, but they can equally well be produced by vapor deposition of gold, silver, tin, lead or any other metal with similar non-wetting and atomic mobility properties. A large number of metals will exhibit these properties if the temperature of the substrate is varied. After being brought into contact with a medium containing an antigen, the slide segment, which comprises the substrate 31 and the metal beads 32, is partially or completely coated with a monomolecular layer of the molecules 34 of the antigen, as shown generally at 33 in FIG. 2b.
The device shown at 33 is the diagnostic instrument which is used to examine test solutions for the presence of the corresponding specifically reacting antibodies to the antigen layer 34. When the device, generally designated 33, is exposed to the specifically reactive antibody to the antigen layer 34, the device takes on an appearance as shown generally in Figure 2c at 35, where the substrate 31 and metal beads 32 are coated with a bimolecular layer which comprises the layer 34 of antigen which forms a first monomolecular layer on the substrate 31 and beads 32 and a second monomolecular layer consisting of the layer 36 of the specific reacting antibody immunologically linked to the molecules of the first layer .
FIG. 6 illustrates a modification of this embodiment which provides for an increased contrast on the coated diagnostic slide. In Figure 6, the slide 31 with the beads 32 thereon and coated with a monomolecular antigen layer 34 as in Figure 2b is immersed with the coated side down in a quantity 71 of a light-reflecting liquid. The slide 31 is then viewed from its upper surface in the reflected light. In order to ensure total reflection of the incident light on the diagnostic device of FIG. 6, the reflective liquid 71 is preferably a metallic liquid and in particular preferably mercury.
If a non-metallic liquid is used, the optical angles of incidence and observation are critical in the embodiment of FIG. 6 if total reflection is to be observed. The appearance of a slide viewed according to these teachings is similar to that in FIG. 4, but with increased contrast.
FIGS. 3a, 3b and 3c show greatly enlarged sectional views of the device which can be used for diagnostic purposes according to another embodiment of the invention. In FIG. 3, 40 denotes a substrate 41 which is coated with a monomolecular layer of antibody molecules 42 which has been prepared as described above. In FIG. 3b, 43 designates a substrate 41 with an antigen layer 42, to which a second monomolecular layer of molecules 44 has been immunologically linked according to the above-described method. A second substrate 45 carries a drop 46 of reagent capable of cleaving immunological bonds, e.g. a weak acid solution.
The opposite surfaces of the substrates 41 and 45 therefore carry a bimolecular layer or a drop of the reagent, e.g. a 0.1 normal citric acid solution and are brought into physical contact with each other. According to the present invention, the reagent drop 46 separates the immunological bonds between the molecules 42 and the molecules 44 without influencing the properties of the antigen or antibody and without separating the adhesion formation between the first molecules 42 and the substrate 41. If substrate 41 and 45 are then separated from one another again, as shown generally at 47 in FIG. 3c, a monomolecular layer of antigen molecules 42 adheres to substrate 41 and a monomolecular layer of the corresponding specifically reacting antibody molecules 44 adheres to substrate 45.
The substrate 41 with the molecules 42 thereon can then be used again as a test slide according to the embodiment of the invention described above. The substrate 45 with the specifically reacting antibody 44 thereon can be used as a test slide for solutions in which one suspects the presence of molecules of its corresponding antigen, in accordance with the other embodiments of the present invention described above.
The present embodiment of the invention is considered to be particularly significant since, in the case of the usual immunogens of biological interest, antigens are quite easily available in purified form and can thus be adsorbed on a substrate in order to form a test slide with the detection of the presence of antibodies in solutions , while the antibodies are not readily available. Therefore, prior to the present invention, it has not been possible to prepare test slides for testing solutions for the presence of antigens. In contrast, the method and apparatus as illustrated in Figure 3 permit the production of test slides having a substrate 45 coated with a monomolecular layer of e.g.
Antibody molecules 44, which can then be used to test solutions for the presence of antigen.
Another embodiment of the diagnostic device according to the present invention is shown in FIG. 8 and graphically illustrated in FIG. 7 with regard to its principle of action. The diagnostic device of FIG. 8 comprises a gold substrate 91, for which, for economic reasons, a thin gold layer is plated on another metal and on which a monomolecular layer 92 of a first antigen or antibody is adsorbed. Gold has an adsorption band within the visible spectrum. This fact causes the characteristic gold color and allows the present embodiment.
Figure 7 illustrates the operation of this embodiment and is a set of curves plotting relative reflectivity as a function of wavelength. Curve 93 shows the reflectivity of gold metal.
Curve 94 represents the reflectivity of gold metal bearing a monomolecular antigen layer. Curve 95 represents the reflectivity of gold metal which has a bimolecular layer on it. According to curve 93, a gold substrate 91 therefore has the characteristic bright yellow color of the gold metal. If a first antigen layer 92 is applied to the substrate 91, the test slide has a dull yellow appearance according to the curve 94. After the test slide has been exposed to a solution believed to contain the appropriate immunologically responsive antibody to the antigen layer 92, if such an antibody was present in the solution, the test slide will have a bimolecular layer like that Curve 95 indicates a distinct green appearance.
According to tests carried out so far, the embodiments of the present invention appear to have a substrate
Metal beads are most useful when a gold substrate and when a metal, e.g. Titanium covered with an oxide coating, e.g. a titanium oxide is used.
It was further determined that these embodiments in
Have different sensitivities depending on the thickness of the films of interest. In particular
Trap show the greatest sensitivity substrates with metal spheres, the films of which are less than about 200 Å thick. The gold and other substrate forms have the greatest sensitivity for films exceeding 30 Å in thickness.
The invention is explained in more detail below using examples.
example 1
An inhibition test for hepatitis was carried out as follows:
Glass slides were coated with a thin layer of indium and then a layer of gold was applied to it. The use of an underlayer of indium is necessary to improve the adhesion between the glass and the gold.
It was further found that the diffusion of the indium into the overlying gold improves the optical properties of the test slides. The slides thus prepared were coated with a monomolecular layer of the antigen associated with heptitis. Samples of the human blood to be tested for hepatitis were prepared by mixing in a quantity of antibody to the HAA sufficient to be immunologically removed from the mixture if HAA was present in the sample. The test slides were then placed in the so prepared
Immersed blood samples.
Once removed, the slides immersed in hepatitis negative samples had a bimolecular protein layer made up of the HAA previously applied and a second layer of antibodies to the HAA that were immunologically linked, as indicated by a green band on the slide. Slides immersed in hepatitis positive samples retain their initial dull yellow appearance, indicating that only the HAA monomolecular layer was present on them while the antibodies introduced into the sample were complexed with the antigen contained therein and precipitated out of the sample and so therefore were not available to react with the antigen on the test slide.
Example 2
In a direct test for hepatitis, glass / indium / gold slides were prepared as described in Example 1 and then coated with a monomolecular layer of antibodies to the HAA. Some of the slides were then immersed in serum taken from hepatitis patients that were known to contain HAA. Other
Slides were immersed in serum samples that were known not to contain HAA. The slides immersed in the former sera had bimolecular protein layers on them, which was visually detectable as darker zones, while the slides immersed in the other blood samples only had monomolecular layers.
In theory, the direct test described in this example is preferred, both for its relative simplicity and because it has greater sensitivity than the inhibition test of Example 1. The higher sensitivity of the direct test is due to the fact that the HAA molecules are very large are larger than the molecules of the antibodies to the HAA. The direct test therefore results in a much greater percentage change in the film thickness and thus a greater contrast can be observed.
The concentration of HAA in the blood of a person exposed to this disease is a function of time. The concentration of HAA during the clinical and immediately preclinical phases of hepatitis is very high. In the post-clinical phases, however, the concentration of HAA in a person's blood is very low. Both conditions are of medical interest. The detection of the antigen during clinical purposes is of value. The detection of the antigen in the post-clinical phase is of value for checking the blood of prospective blood donors. The simpler, more sensitive direct test is therefore preferred for diagnostic purposes because it can be carried out easily because of the relatively high concentration of HAA in the blood sample.
Example 3
The inhibition test of Example 1, which has been described for selection purposes, was experimentally evaluated for
Determination of its value in relation to other screening tests for hepatitis. In these tests, hepatitis positive serum was diluted with known hepatitis negative serum. Using the inhibition procedure of Example 1 was one
Dilution of one part of hepatitis-positive serum with 32 parts of hepatitis-negative serum suitable for reliable detection within one hour. A dilution of one part of hepatitis-positive serum was used
3000 parts of hepatitis-negative serum, then reliable detection could be made within 20 hours.
These results are found to be very similar in sensitivity and time required to the known counterelectrophoresis method and the radioimmunity method. A selection process according to the present invention therefore gives results which are comparable to the best known processes, with the advantage of obtaining these results with a considerably cheaper process.
The preferred use of a gold-coated substrate compared to a substrate coated with metal beads in the above-described diagnosis of hepatitis is due to the fact that the HAA molecules have a diameter of approximately 210 Å. Such film thicknesses can provide a sensitive display with gold-coated substrates, but are too thick for high sensitivity with metal-bead-coated substrates.
Example 4
A diagnostic test for gonorrhea was carried out as follows:
A glass slide was metallized with a layer of titanium and the surface layer was then oxidized to form a top layer of titanium oxide. Neisseria gonorrhea extract was then dissolved in salt water to bring about a concentration of
1 mg / ml to produce. A drop of the solution of the antigen was placed in the center of the slide. The slide was incubated in a humidity chamber (plastic container filled with damp sponges) at room temperature (23 "C) until the antigen adhered to the oxide surface (10-30 minutes). The slide was then washed with distilled water and blown dry with an air jet. At this point the slide can be stored for later use.
For this use, the slide is immersed in blood serum which contains the antibody to the Neisseria antigen, the total volume being 2 ml. The slide and antibody solution are incubated in a plastic container attached to a shaker for 12 hours at 23 ° C. After the incubation, the slide is washed again with distilled water. If, after drying, a sharply contrasting visible spot is observed in the center of the slide If the blood serum does not contain anti-gonorrhea antibodies, no bimolecular layer will form and no stain will be seen.
Example 5
A rubella diagnostic test was carried out following the general procedure of Example 4. A gold-plated glass slide was used and the antigen was an extract from a rubella virus culture. After treating the slide with a human serum preparation containing rubella antibodies, a sharply contrasting visible spot was observed. The procedure was repeated using a tantalum plated slide. Essentially the same results were obtained.
Currently, rubella antibodies are detected using a hemagglutination inhibition test. This is carried out on patients in maternity clinics as well as on women of childbearing age who go to preventive clinics. This test takes two days. The test according to the invention takes only two hours and gives essentially the same results.
Example 6
A diagnostic test for poliomeylitis was carried out following the general procedure of Example 4. A gold-plated glass slide was used for this and the antigen was an extract from a poliovirus culture. After treating the slide with a human serum preparation with polio antibody, a sharply contrasting visible spot was observed. The same procedure with a tantalum metallized glass slide gave essentially the same results.
This test procedure is much simpler than the usual procedure in which the polio-antibody level is determined using a complement fixation test.
Example 7
An assay for vesicular inflammation proteins was carried out according to the general procedure of Example 4. A gold-plated glass slide was used for this and the antigen was an extract of the virus causing the vesicular inflammation of the oral mucosa. After treating the slide with proteins specific for the antigen, a sharply contrasting visible spot was observed. Tantalum metallized glass slides gave essentially the same results.
Example 8
A diagnostic test for tetanus was carried out according to the general procedure of Example 4. A gold-plated glass slide was used for this and the antigen was applied as an aqueous extract of a tetanus toxoid. After treatment with a human serum preparation containing tetanus toxoid antibodies, a sharply contrasting visible spot was observed.
The procedure could be carried out on a tantalum-metallized glass slide with essentially the same results.
Example 9
A diagnostic test for diphtheria was carried out following the general procedure of Example 4. A tantalum-metallized glass slide was used for this and the antigen was an aqueous extract of the diphtheria bacterial toxin. After treatment with a human serum preparation containing antibodies for the diphtheria toxins, a sharply contrasting visible spot was observed.
Example 10
A diagnostic test for syphilis was carried out according to the general procedure of Example 4. A gold-plated glass slide was used for this and the antigen was an aqueous suspension of Treponema pallidum. After treatment with a human serum preparation containing antibodies to syphilis, a sharply contrasting visible spot was observed.
Tantalum metallized glass slides could be used with essentially the same results.
Example 11 and 12
Diagnostic tests for fungal antibodies were carried out according to the general procedure of Example 4. A tantalum metalized glass slide was used and the antigens were aqueous suspensions of the Aspergillus and Candida families, respectively. After treatment with a human blood serum preparation containing the corresponding fungal antibodies, sharply contrasting visible spots were observed.
Example 13
A diagnostic test for a parasite was carried out following the general procedure of Example 4. A gold-plated glass slide was used and the antigen was an aqueous extract of Toxoplasma gondii.
After treatment with a human serum preparation containing antibodies to these parasites, a sharply contrasting visible spot was observed. Essentially the same results were obtained with tantalum and indium metallized glass slides.
Quantitative tests were also carried out using gold and tantalum metallized glass slides by making a two-fold dilution of the patient's serum (antibody) and using as the endpoint for the titration the concentration at which the last visible stain could be produced.
The aetiology of the parasite was unknown, but latent and / or unsymptomatic infections had been found to cause many birth defects in pregnant women. No other serological method has been developed to test antibodies to this organism.
Example 14
A diagnostic test for antibodies to human nucleoprotein DNA was carried out according to the general procedure of Example 4. A gold-plated glass slide was used for this and the antigen was an aqueous suspension of the DNA-histone complex that is found in the nuclei of human cells. Sharply contrasting visible spots were observed after treatment with human blood serum preparations containing antibodies to DNA-histone complex (nucleoprotein) and / or antibodies to DNA (not complexed with histone). The advantage of this technique is that both nucleoproteins and DNA antibodies can be determined on a single slide. Essentially the same results were obtained with tantalum metallized glass slides.
In certain disease states, auto-antibodies to these human molecules can be directed to the DNA portion of the molecule, to the histone, or to the bond between the two.
In 30% of the cases of lupus erythematosus an antibody is generated which is specific for DNA and therefore its detection is diagnostically useful. Current methods of testing for such antibodies use microscope slides and mouse liver tissue and a special peroxidase stain or fluorescent antibody technique. Both procedures take a long time and the slides are difficult to read.
In contrast to this, the method according to the invention is very much shorter, the slides are easy to read and they show a strong correlation with the current analysis methods.
Example 15
A diagnostic test for antibodies to human protein thyroglobulin was carried out according to the general procedure of Example 4. Such antibodies are used in certain disease states, e.g. Hashimoto's disease formed. A gold metallized glass slide was used and the antigen was an aqueous suspension of thyroglobulin. After treatment with a preparation of human blood serum containing antibodies to thyroglobulin, a sharply contrasting visible spot was observed. Essentially the same results were obtained with tantalum metallized glass slides.
Example 16
A diagnostic procedure for antibodies to collagen was carried out following the general procedure of Example 4. A tantalum-metallized glass slide was used for this and the antigen preparation was an aqueous, collagen-containing medium. After treatment with rabbit blood sera containing antibodies produced by the administration of collagen fractions, a sharply contrasting visible spot was observed. Rabbits fed a diet high in cholesterol produced antibodies to collagen.
Example 17 and 18
An inhibition test was carried out to confirm pregnancy. A gold-plated glass slide was used for this and the antigen was an aqueous preparation of the human chorionic gonadotrophin. Such HCG-containing blood serum was subjected to serial dilution and a known concentration of the HCG antibody was added. The slide was immersed in the preparation. If the test is positive, no visible stain was found. A visible stain corresponds to a negative test. Quantities of more than 2000 international units of HCG per 100 ml of serum indicate pregnancy. This procedure can also be used to test prostate tumors.
This procedure was repeated using insulin instead of the HCG. A bare slide corresponds to a positive test. Antibody titrations were carried out on both gold and tantalum metalized glass slides with a sensitivity of 100 nanograms, which can be easily enlarged.
Example 19
A diagnostic test for antibodies to keyhole limpet hemocyanin protein was carried out according to the general procedure of Example 4. A gold-plated glass slide was used and the antigen preparation was an aqueous medium of the aforementioned protein. After treatment with a preparation of human blood serum containing antibodies to this protein, a sharply contrasting visible spot was observed.
Essentially the same results were obtained with tantalum metallized glass slides.
A study is currently underway to find an antigen that may be used in humans to test the effectiveness of their antibody production systems. For this purpose, an antigen that has not yet come into contact with the host is required and the aforementioned protein is a likely candidate. The method according to the invention is suitable for this because it can detect low concentrations of antibodies to this protein and is not laborious and time-consuming and is also not insensitive.
While the reactive protein adsorbed on the substrate surface has been described above as an antigen, such a first reactive protein layer can of course also be an antibody and the second protein layer would then be an antigen specific for such an antibody and the third layer in turn would be the antibody.