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Die
Erfindung betrifft Verfahren für
die Auswahl von Führungssubstanzen
oder aktiven Verbindungen aus Banken. Insbesondere stellt die Erfindung
Verfahren für
die Auswahl von Führungssubstanzen
oder Verbindungen bereit, die gegenüber einer erwünschten
Zielstruktur aktiv und selektiv sind. Die vorliegende Erfindung
kann beispielsweise in Verfahren der Wirkstoffauffindung verwendet
werden.
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Die
gängigen
Methoden in der Wirkstoffauffindung beinhalten die Durchmusterung
großer
Mengen von Verbindungen natürlichen
Ursprungs oder von Verbindungen, die durch Verfahren der kombinatorischen
Chemie gewonnen wurden. Solche Verfahren sind z.B. in „The Journal
of Immunological Methods" (1996,
193, 2, 189–197)
und in „Molecular
diversity" (1996,
1, 4, 233–240)
beschrieben.
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Üblicherweise
werden in einem einzigen Durchgang der Wirkstoffauffindung Banken
mit mehreren Dutzend oder Hunderttausenden von Verbindungen getestet
(1). Die ausgewählten
Verbindungen, Treffer genannt, können
sehr zahlreich sein. Die durchschnittliche Trefferrate wird auf
0,1% geschätzt.
Daher ist es wahrscheinlich, dass die Durchmusterung einer Bank
mit 100.000 Verbindungen 100 Treffer erzeugt. Vom Treffer bis zum
Kandidatenwirkstoff ist es ein langer Prozess, der mehrere Syntheserunden
und die Durchmusterung fokussierter chemischer Banken beinhaltet.
Dieser Prozess der Führungssubstanzoptimierung
ist sehr zeitaufwändig
und erfordert ein großes
Budget.
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In
der Tat werden Treffer, die weiter untersucht werden sollen, üblicherweise
auf der Basis ihrer Aktivitätsstärke gegenüber der
Zielsubstanz, auf die sie durchmustert wurden, ausgewählt. Jede
Runde der Führungssubstanzoptimierung
sollte die Herstellung wirkungsvollerer Verbindungen erlauben. Wenn
wenige Treffer die erwartete Wirkung aufweisen, üblicherweise nach mehreren
Optimierungsrunden, werden sie zu Führungssubstanzen, die anschließend auf
ihre Selektivität
gegen eine große
Anzahl biologischer Zielstrukturen getestet werden („Profilbestimmung
der Führungssubstanz"). Die Wirkstoffkandidaten
werden auf Basis ihrer Affinität
für die
ausgewählte
Zielstruktur und ihre Spezifität
für diese
Zielstruktur ermittelt (d.h. sie sollten keine Wirkung gegenüber Zielstrukturen
zeigen, die mit der im Mittelpunkt des Programms stehenden Erkrankung
in keiner Beziehung stehen). Es ist nicht selten, dass sich die
ausgewählten
Führungssubstanzen
als unspezifisch erweisen, so dass sie höchstwahrscheinlich unerwünschte Wirkungen
verursachen. In diesem Fall ist es notwendig, das Verfahren von
einem weniger wirkungsvoller Treffer ausgehend wieder zu beginnen.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft verbesserte Verfahren für die Identifizierung
von Führungssubstanzen
oder wirksamen Verbindungen aus Banken. Die Erfindung betrifft auch
ein Hochdurchsatz-Profilbestimmungsverfahren, das die Durchmusterung
selektiver Verbindungen aus großen
und unterschiedlichen Zusammensetzungen erlaubt. Die Erfindung stellt
auch neuartige fokussierte Banken bereit, die eine Vielzahl von
Verbindungen mit strukturell vielfältigen, jedoch funktional gemeinsamen
Eigenschaften umfassen.
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Die
Verfahren der vorliegenden Erfindung betreffen insbesondere die
Bestimmung der Trefferspezifität („Profilbestimmung") in einer sehr frühen Phase
des Wirkstoffauffindungsprozesses. Diese neuen Verfahren erlauben
die Identifizierung von Führungssubstanzen
mit verbesserten Eigenschaften (d.h. das Verbinden der Kriterien
Stärke
und Selektivität
gegenüber
einer gegebenen Zielstruktur), die gegebenenfalls in Führungssubstanzoptimierungsprozessen
verwendet werden können,
um Wirkstoffkandidaten vorhersagbarer und mit geringeren Kosten
zu identifizieren.
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Es
ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren
für die
Identifizierung von Führungssubstanzen
aus einer Verbindungsbank bereitzustellen, wobei das Verfahren die
folgenden Schritte umfasst:
- (a) Durchmusterung
einer Verbindungsbank auf Aktivität gegen eine erwünschte Zielstruktur,
um wirkungsvolle Treffer zu erlangen;
- (b) Profilbestimmung der wirkungsvollen Treffer aus Schritt
(a), um so wirkungsvolle und selektive Führungssubstanzen zu erhalten.
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Wie
oben erklärt,
beinhalten die bestehenden Verfahren der Wirkstoffauffindung oder
Führungssubstanzauswahl
eine Durchmusterung einer Verbindungsbank auf Aktivität gegenüber einer
erwünschten
Führungssubstanz,
und die so erhaltenen Treffer werden anschließend in einer Führungssubstanzoptimierungsrunde
weiter prozessiert, so dass die Führungssubstanzen hergestellt
werden. Allerdings basieren diese Schritte nur auf der Durchmusterung
von Banken oder fokussierten Banken auf eine erwünschte Zielstruktur hin, d.h.
auf die Auswahl von Verbindungen mit der Fähigkeit, mit einer gegebenen
Zielstruktur zu interagieren. Keines der bestehenden Verfahren beinhaltet
allerdings einen Profilbestimmungsschritt gemäß der vorliegenden Erfindung.
Das erfindungsgemäße Hochdurchsatz-Durchmusterungsverfahren
stellt einen solchen Profilbestimmungsschritt der Bank bereit, so
dass die erhaltenen Führungssubstanzen
sowohl das Kriterium der Wirksamkeit (Fähigkeit, mit einer gegebenen
Zielsubstanz zu interagieren) als auch Selektivität (geringe
oder Fehlen von Interaktion mit anderen Zielstrukturen) in sich
vereinen.
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Es
ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren
für die
Identifizierung aktiver Verbindungen aus einer Verbindungsbank bereitzustellen,
wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
- (i) eine Hochdurchsatz-Durchmusterung, umfassend die Schritte:
- (a) Durchmusterung einer Verbindungsbank auf Aktivität gegen
eine erwünschte
Zielstruktur, um so wirkungsvolle Treffer zu erhalten;
- (b) Profilbestimmung der wirkungsvollen Treffer aus Schritt
(a), um so wirkungsvolle und selektive Führungssubstanzen zu erhalten;
- (c) Herstellung (einer) fokussierter(n) Bank(en) von Verbindungen,
die strukturell mit den Führungssubstanzen
aus Schritt (b) verwandt sind;
- (ii) ein- oder mehrmalige Wiederholung von Schritt (i) unter
Verwendung der fokussierten Bank(en) aus Schritt (c), um so weiter
fokussierte Banken herzustellen, und
- (iii) Durchmusterung und Profilbestimmung der fokussierten Banken
aus Schritt (i) oder (ii) auf Aktivität gegen die Zielstruktur, um
so aktive und spezifische Verbindungen zu erhalten.
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Dieses
Verfahren ist in 2 dargestellt und umfasst sowohl
die sequentiellen Schritte des Führungssubstanz-Identifizierungsverfahrens
wie oben offenbart als auch die Führungssubstanz-Optimierungsschritte, welche
die aktiven Verbindungen herstellen.
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Um
der Klarheit willen bezeichnet der Ausdruck „Treffer" im Rahmen der vorliegenden Erfindung
jede beliebige Verbindung, die nach einem Durchmusterungsschritt
einer primären
Bank ausgewählt
wurde. Ein Treffer ist daher eine Verbindung, die nach der ersten
Stufe der Selektion gewonnen wurde, und die daher wenigstens die
minimale Wirksamkeit gegenüber
einer erwünschten
Zielstruktur besitzt. Eine „Führungssubstanz" ist ein optimierter
Treffer, d.h. ein Treffer, dessen Wirksamkeit bestätigt wurde,
wobei vorzugsweise ein unterschiedlicher Auswahltest verwendet wurde.
Führungssubstanzen
sind daher Verbindungen, die nach wenigstens 2 Durchmusterungsschritten
gewonnen wurden. Führungssubstanzen
stellen das Ausgangsmaterial für
weitere Optimierungsschritte dar, welche die Ausgestaltung fokussierter
Banken, Auswahl wirkungsvoller Verbindungen, deren chemische Modifikation,
funktionale Überprüfung, etc.
umfassen, und welche Wirkstoffkandidaten erzeugen.
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Bei
dem erfindungsgemäßen Verfahren
wird eine Bank auf Aktivität
gegenüber
einer ausgewählten Zielstruktur
durchmustert. Im Allgemeinen kann die Zielstruktur jedes beliebige
Molekül
sein, beispielsweise ein Rezeptor, ein Protein, ein Teil eines Rezeptors,
ein Antikörper,
ein Ligand; ein infektiöses
Partikel, wie ein Virus, ein Bakterium, ein Pilz oder eine Nukleinsäure, etc.,
entweder auf dem Gebiet der Pharmazeutik oder der Agrochemie. Vorzugsweise
ist die Zielstruktur ein Molekül,
das in biologischen oder pathologischen Reaktionswegen beteiligt
ist, beispielsweise ein Rezeptor, ein Enzym, ein Nukleinsäurebereich,
ein Ionenkanal, etc. Besondere Arten von Zielstrukturen sind beispielsweise
Rezeptoren, wie diejenigen, die in der Tabelle I aufgeführt sind,
und Enzyme, wie sie in Tabelle II aufgeführt sind.
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Wie
oben angegeben, umfasst Schritt (a) der beanspruchten Verfahren
die Durchmusterung einer Bank auf Aktivität gegenüber einer gegebenen Zielstruktur.
Die Durchmusterung auf Aktivität
gegenüber
einer gegebenen Zielstruktur betrifft im Allgemeinen die Auswahl
beliebiger Verbindungen der Bank mit der Fähigkeit, mit der Zielstruktur
zu interagieren. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bedeutet der
Ausdruck „Interaktion" entweder physikalische
oder funktionale Interaktion. Vorzugsweise umfasst in Schritt (a)
des Verfahrens das Durchmustern nach Verbindungen mit Aktivität gegenüber einer
erwünschten
Zielstruktur die Durchmusterung (oder Auswahl) von Verbindungen,
die in der Lage sind, an die erwünschte
Zielstruktur zu binden, die Aktivität eines Enzyms zu modifizieren
oder die Expression eines Gens zu regulieren.
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In
einer besonderen Ausführungsform
der Erfindung umfasst Schritt (a) das Durchmustern nach Verbindungen,
die an eine Zielstruktur binden. In einer bevorzugten Ausführungsform
wird die Fähigkeit
einer Verbindung, an eine gegebene Zielstruktur zu binden, durch
die Fähigkeit
der Verbindung gemessen, die Bindung eines Referenzstoffs, ein markiertes
Molekül,
an die Zielstruktur zu inhibieren. Beispielsweise kann die Fähigkeit
einer Verbindung, an einen gegebenen Zielrezeptor zu binden, anhand
der Fähigkeit
der Verbindung gemessen werden, die Bindung eines markierten Liganden
des Rezeptors an den Zielrezeptor zu inhibieren. Für diesen
besonderen Fall umfasst die Durchmusterung daher für jede Verbindung
die Bestimmung der Prozent Inhibition der Bindung eines markierten
Liganden an die Zielstruktur. Die Fähigkeit einer Verbindung, an
eine gegebene Zielstruktur zu binden, kann auch in einem Zell-basierten
Assay gemessen werden. Insbesondere kann die Bindung durch Messung
der Wirkung, die durch die Verbindung innerhalb der Zelle induziert
wird, mit geeigneten Markern ermittelt werden.
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In
einer weiteren besonderen Ausführungsform
der Erfindung umfasst Schritt (a) die Durchmusterung nach Verbindungen,
die in der Lage sind, die Aktivität eines Enzyms zu modifizieren.
Diese Modifikation beinhaltet beispielsweise die Stimulierung oder
Inhibition der Aktivität
des Enzyms oder die Veränderung
der Spezifität
oder der Regulation der Aktivität
des Enzyms.
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Die
Aktivität
der Verbindung im Hinblick auf die Zielstruktur kann mit verschiedenen,
dem Fachmann bekannten Verfahren bestimmt werden, beispielsweise
enzymatische (insbesondere immunoenzymatische) Verfahren, Fluoreszenz-basierte
Nachweisverfahren oder Radioassays. Als besonders geeignete Beispiele
für Fluoreszenz-basierte
Nachweistechniken kann Fluoreszenzpolarisierung, die Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie
(Eigen et al., PNAS 91 (1994) 5740) und die zeitaufgelöste Fluoreszenz
als Beispiele genannt werden. Bevorzugte Beispiele solcher Techniken
beinhalten beispielsweise PSA (Baum et al., Anal. Biochem. 237 (1996)
129), HTRF (Mathis G., Clin. Chem. 39 (1993) 1953). Im Hinblick
auf geeignete Beispiele für
Radio-/Immunoassays ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung
vorteilhaft, beispielsweise ELISA oder IRA zu verwenden.
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Diese
Verfahren können
in in vitro-Systemen oder in Zell-basierten Assays, wie im Experimentalteil
beschrieben, ausgeführt
werden. Insbesondere werden diese Assays im Allgemeinen in Behältern wie
Platten (Mikrowell-Platten) ausgeführt, die mit den geeigneten
Reagenzien beladen sind (Zielstruktur, Puffer, Versuchsverbindung).
Geeignete Platten umfassen 96-well-Platten und Platten mit einer
höheren
Anzahl von wells (Vertiefungen), insbesondere 384, 864, 1536 oder
mehr. Solche Platten sind kommerziell erhältlich.
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Damit
das Durchmusterungsverfahren genauer wird, wird man vorzugsweise
die Aktivität
der Verbindungen im Hinblick auf die Zielstruktur bestätigen. Eine
Bestätigung
kann beispielsweise erreicht werden, indem einfach das oben genannte
Durchmusterungsverfahren wiederholt wird, wobei jedoch die Verbindung
in einer isolierten oder aufgereinigten Form verwendet wird und
nicht als Bestandteil der gesamten Bank. In Abhängigkeit von der Größe der Ausgangsbank
kann die Anzahl der bestätigten
Treffer zwischen 5 und 500 schwanken, üblicherweise zwischen 5 und
100.
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Ferner
umfasst die Durchmusterung in Schritt (a) in einer bevorzugten Ausführungsform
die Messung der Affinität
der Verbindungen, die in der Lage sind, an die erwünschte Zielstruktur
zu binden, um als wirkungsvolle Treffer die Verbindungen auszuwählen, welche
die beste Affinität
besitzen. Um die Affinität
zu bestimmen, werden die bestätigten
Treffer üblicherweise
resynthetisiert und aufgereinigt. Die Affinität wird anschließend mit
dem Fachmann bekannten Verfahren bestimmt, beispielsweise mit der „Scatchard"-Analyse, wie sie
in den Beispielen offenbart ist. Ebenso können während dieses Schrittes Verbindungen
weiterhin verworfen werden auf Grund ihrer chemischen Struktur.
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Verbindungen,
die durch die Durchmusterung gemäß Schritt
(a) gewonnen wurden, im Allgemeinen zwischen 5 und 500, werden anschließend Schritt
(b) unterworfen. Der Profilbestimmungsschritt (b) umfasst allgemein
gesagt das Austesten der wirkungsvollen Treffer auf verschiedenen
Zielstrukturen und die Auswahl der Verbindungen, die für die erwünschte Zielstruktur
spezifisch sind. Dieser Schritt ermöglicht daher die Führungssubstanzen
zurückzubehalten,
welche die erwartete Wirkung gegenüber der Zielstruktur und ein
gutes Selektivitätsprofil
aufweisen. Schritt (b) umfasst üblicherweise
die Bestimmung der Fähigkeit
der ausgewählten Treffer,
mit verschiedenen Zielstrukturen zu interagieren, vorzugsweise an
sie zu binden.
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In
einer besonderen Ausführungsform
dieser Erfindung umfasst Schritt (b) das Testen der wirkungsvollen
Treffer an mehr als 25 Zielstrukturen. In einer besonderen Ausführungsform umfasst
der Profilbestimmungsschritt (b) das Testen der wirkungsvollen Treffer
an mehr als 50 Zielstrukturen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform
umfasst der Profilbestimmungsschritt (b) das Testen der wirkungsvollen
Treffer an mehr als 60 Zielstrukturen. Erläuternde Beispiele von Zielstrukturen,
die in Schritt (b) getestet werden können, sind in Tabelle I unten
aufgeführt.
In einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung umfasst der Profilbestimmungsschritt (b) das Durchmustern
der ausgewählten
Treffer an den folgenden Zielstrukturen, wenigstens:
- – nicht-peptidische
G-gekoppelte Rezeptoren, umfassend einen Adenosinrezeptor, einen
adrenergen Rezeptor, einen Dopaminrezeptor, einen Histaminrezeptor,
einen Melatoninrezeptor, einen muscarinischen Rezeptor und einen
Sigma-Rezeptor;
- – peptidische
G-gekoppelte Rezeptoren, umfassend einen Angiotensinrezeptor, einen
Bombesinrezeptor, einen Bradykininrezeptor, einen Cholecystokininrezeptor,
einen Chemokinrezeptor, einen Endothelinrezeptor, einen Galaninrezeptor,
einen Neurochininrezeptor, einen Neuropeptid-Y-Rezeptor und einen
Vasopressinrezeptor;
- – einen
Ionenkanal-gekoppelten Rezeptor, umfassend einen Serotoninrezeptor;
und
- – Ionenkanäle, umfassend
einen Calciumkanal und einen Kaliumkanal.
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Sogar
noch bevorzugter umfassen die getesteten Zielstrukturen weiterhin:
- – Enzyme,
einschließlich
einer Phosphodiesterase und einer Tyrosinkinase, und gegebenenfalls
eine Proteinkinase und eine Protease.
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In
einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform
umfasst der Profilbestimmungsschritt ferner einen oder mehrere Zell-basierte
Assays, ausgewählt
aus:
- – einem
Cytokin-Sekretionsassay, wie einem TNF-α-Sekretionsassay auf humanen
Monozyten;
- – einem
freie Radikale-Assay, wie einem O2-Sekretionsassay
auf humanen Granulozyten (z.B. HL60);
- – einem
Adhäsionsassay,
insbesondere zwischen humanen Monozyten (z.B. U937-Zellen) und humanen endothelialen
Zellen;
- – einem
Cytotoxizitätsassay,
beispielsweise auf humane Monozyten.
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In
einer typischen erläuternden
spezifischen Ausführungsform
der Erfindung umfasst der Profilbestimmungsschritt (b) die Durchmusterung
der Verbindungen gegen jede einzelne Zielstruktur, die in Tabelle
III aufgelistet ist.
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In
einer weiteren typischen erläuternden
spezifischen Ausführungsform
der Erfindung umfasst der Profilbestimmungsschritt (b) die Durchmusterung
der Verbindung gegenüber
jeder einzelnen Zielstruktur, die in Tabelle I aufgelistet ist.
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Die
Fähigkeit
dieser Verbindungen, mit diesen Zielstrukturen zu interagieren oder
an sie zu binden, kann in vitro oder in Zell-basierten Systemen
gemäß derselben
Methodik bestimmt werden, wie sie in Schritt (a) beschrieben ist.
Ein wichtiger Aspekt der Erfindung ist die Fähigkeit, für eine große Anzahl von Verbindungen
(wirkungsvollen Treffern) eine Profilbestimmung auszuführen, um
im Hinblick auf Verfahren des Stands der Technik verbesserte Führungssubstanzen
herzustellen. Diesbezüglich,
um den Profilbestimmungsschritt (b) zu erleichtern, hat der Anmelder
ein Konzept der Hochdurchsatz-Profilbestimmung (High Throughput
Profiling „HTP") entwickelt, die
es erlaubt, zahlreiche Verbindungen (beispielsweise im Bereich von
einem bis zweihundert) schnell in vitro gegenüber einer großen Anzahl
von Zielstrukturen, wie sie oben offenbart sind, zu testen. Insbesondere
umfasst dieses HTP ein Robotersystem, das in der Lage ist, bis zu
20 Protokolle (ein Protokoll pro Zielstruktur) pro Tag auszuführen. Dieses
Verfahren ist in den Beispielen detaillierter offenbart. Grundsätzlich wird,
in einer besonderen Ausführungsform
der Erfindung, die HTP ausgeführt,
indem eine Vorrichtung verwendet wird, welche die folgenden Elemente
umfasst:
- – Arbeitsstationen,
umfassend:
- • mehrere
Inkubatoren, vorzugsweise 2 oder 3
- • eine
oder mehr Filtrierstationen
- • Reagenzien-Spender
- – Behälter, vorzugsweise
Platten und
- – Mittel,
um die Behälter
zu den verschiedenen Arbeitsstationen zu bewegen.
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Insbesondere
erlauben die Reagenzien-Spender die Verteilung von 10–20 Zielstrukturen
und über
100 Testverbindungen. Der Reagenzien-Spender kann manuell oder automatisiert
bedient werden.
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Wie
oben dargelegt, können
die die in der HTP verwendeten Platten 96-, 384-, 864- oder 1536-well-Platten sein.
Vorzugsweise enthalten sie 86, 384 oder 864 wells (Vertiefungen).
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Die
Verbindungen, die nach dem Schritt (b) zurückbehalten werden, sind diejenigen,
die mit der erwünschten
Zielstruktur interagieren und die mit keiner anderen Zielstruktur
interagieren oder nur mit wenigen von ihnen oder schwach mit anderen
Zielstrukturen interagieren. Die Anforderungen an die Selektivität können von
einer Zielstruktur zur nächsten
variieren und können
vom Durchschnittsfachmann angepasst werden. Insbesondere, in Abhängigkeit
von der erwarteten Verwendung der Verbindungen, kann eine Interaktion
mit mehreren verwandten Zielstrukturen (beispielsweise mehreren
Serotoninrezeptoren) toleriert werden, solange die Verbindung keine
Interaktion mit anderen nicht-verwandten Zielstrukturen aufweist
(beispielsweise einem Histaminrezeptor). Schritt (b) des vorliegenden
Verfahrens ist sehr wichtig hinsichtlich der Tatsache, dass er den Grad
an Selektivität
bestimmt, die im Wirkstoff-Auffindungsprozess
gesucht wird.
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In
einer am meisten bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren
weiterhin einen Hochdurchsatzschritt zur Führungssubstanzentwicklung,
direkt vor oder nach Schritt (b). Diesbezüglich umfasst in einer bevorzugten
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung der Ausdruck Profilbestimmung die Bestimmung
der Spezifität
genauso wie die Bestimmung der pharmakologischen Eigenschaften (d.h.
den Führungssubstanz-Entwicklungsschritt).
Dieser Hochdurchsatz-Führungssubstanz-Entwicklungsschritt („HTLD") umfasst vorzugsweise
die Durchmusterung der Treffer auf ihre pharmakologischen Eigenschaften. Insbesondere
umfasst HTLD die Durchmusterung der Treffer auf die folgenden Eigenschaften:
- – Toxizität,
- – Metabolismus
und/oder
- – Pharmakokinetik.
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Die
Toxizität
wird vorzugsweise bestimmt, indem die Verbindungen mit Reporterzellen
kontaktiert werden, beispielsweise humane Monozyten, und indem die
Freisetzung einer markierten Reporterverbindung (z.B. Cr) gemäß bekannter
Verfahren gemessen wird.
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Der
Metabolismus ist im Rahmen einer Voraussage wichtig, wie sich die
Verbindung in vivo verhalten würde.
Die Bestimmung des Metabolismus der Verbindungen kann in vitro oder
mit Zell-basierten Assays ausgeführt
werden, indem die Verbindung mit Cytochrom(en) P450 kontaktiert
wird und die Eigenschaften der resultierenden Metaboliten bestimmt
werden.
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Die
Pharmakokinetik wird vorzugsweise in einem Zellmodell des intestinalen
Lumens, insbesondere mit Caco-2- oder MDCK-Zellen, getestet.
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In
einer besonderen Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst Schritt
(i) deshalb:
- (a) Durchmusterung einer Verbindungsbank
auf Aktivität
gegen eine erwünschte
Zielstruktur, um wirkungsvolle Treffer zu erlangen; und
- (b) Profilbestimmung der wirkungsvollen Treffer aus Schritt
(a) auf Selektivität
für die
erwünschte
Zielstruktur und ihrer pharmakologischen Eigenschaften, um so wirkungsvolle
und selektive Führungssubstanzen zu
erhalten.
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Noch
mehr bevorzugt umfasst Schritt (b) die Profilbestimmung der wirkungsvollen
Treffer aus Schritt (a) auf Selektivität für die erwünschte Zielstruktur und Fehlen
von Toxizität
für humane
Zellen in vitro. Sogar noch bevorzugter umfasst Schritt (b) die
Profilbestimmung der wirkungsvollen Treffer aus Schritt (a) auf
Selektivität
für die
erwünschte
Zielstruktur, das Fehlen von Toxizität für humane Zellen in vitro und
die Fähigkeit,
ein Modell basierend auf intestinalem Lumen zu durchqueren. In einer
besonders vorteilhaften Ausführungsform werden
die Verbindungen auch auf ihren Metabolismus in Gegenwart von Cytochrom(en)
P450 getestet. Eine schematische Darstellung solcher Verfahren ist
in 3 dargestellt.
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Die
dadurch erhaltenen Führungssubstanzen
können
entweder direkt in einem Wirkstoffkandidaten-Auswahlprogramm oder
im Schritt (c) des Verfahrens verwendet werden, um als Vorlagen
zu dienen, um fokussierte Verbindungsbanken zu entwickeln und zu
synthetisieren, die strukturell mit ihnen verwandt sind. Diese fokussierten
Banken können
gemäß den unten
offenbarten Techniken hergestellt werden und sind dem Durchschnittsfachmann
bekannt, und sie können
mehrere tausend Verbindungen enthalten. Der Ausdruck „strukturell
verwandt" zeigt
an, dass diese Banken entwickelt worden sind, so dass ihre Verbindungen
Strukturen oder Motive enthalten, die auch in den Führungssubstanzen
vorliegen. Z.B. können
diese Banken spezifische Monomere oder Blöcke, die in den Führungssubstanzen
identifiziert wurden, enthalten, wie es in den Beispielen offenbart
ist. Insbesondere beinhaltet die Konstruktion fokussierter Banken
in einem ersten Schritt die molekulare Charakterisierung der Führungssubstanzen,
um ihre konstitutiven Blöcke
zu bestimmen. Gegebenenfalls kann dieser anfängliche Schritt auch das Zusammenfassen
von Führungssubstanzen
beinhalten, die gemeinsame strukturelle Charakteristiken besitzen,
um eine begrenzte Anzahl fokussierter Banken zu synthetisieren.
Ausgehend von dieser ersten Analyse werden die üblichsten Blöcke und
ihre Analogen in einem molekularen Modellierungsschritt verwendet,
um die fokussierte Bank herzustellen. Die Wahl der Analogen kann
gemäß verschiedener,
bekannter Analogisierungsstrategien ausgeführt werden, einschließlich der
Analogisierung von Monomeren oder dem Analogisieren der gesamten
Struktur. Dieses Analogisieren kann z.B. mit geeigneter Software
mittels einer virtuellen Durchmusterung von Banken durchgeführt werden.
Die Banken werden anschließend
gemäß bekannter
Verfahren der kombinatorischen Chemie, wie sie unten offenbart sind, hergestellt.
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Ausgehend
von diesen fokussierten Banken können
die Schritte (a) bis (c) wiederholt werden, so dass weitere fokussierte
Banken gewonnen werden (Schritt (ii)). In Abhängigkeit von der Selektivität oder Wirksamkeit,
die gesucht wird, kann diese Runde 0 bis 10 Mal wiederholt werden,
vorzugsweise 1 bis 5 Mal.
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Diese
Banken werden letztendlich auf die gegebene Zielstruktur hin durchmustert
(Schritt (iii)), so dass aktive Verbindungen gewonnen werden. Die
Durchmusterung gemäß Schritt
(iii) kann gemäß Verfahren
ausgeführt
werden, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind. Vorzugsweise
wird die Durchmusterung gemäß Schritt
(iii) auf eine ähnliche
Weise ausgeführt,
wie die Durchmusterung und Profilbestimmung der oben angegebenen
Schritte (a) und (b). Diese Durchmusterung kann auch zusätzliche
Schritte wie einen Genotoxizitätsassay
oder einen funktionalen Assay, wie in den Beispielen beschrieben,
enthalten.
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Die
oben offenbarten Verfahren können
auf verschiedene Verbindungsbanken angewendet werden, einschließlich Verbindungsbanken
natürlichen
Ursprungs, oder auf Banken, die mittels wohlbekannter Verfahren
der kombinatorischen Chemie gewonnen wurden. Diese Verfahren der
kombinatorischen Chemie beinhalten die Synthese einer zufälligen oder
fokussierten Reihe von Verbindungen, beginnend von Monomeren oder Blöcken, indem
beispielsweise Festphasen- oder Flüssigsynthese-, Parallelsynthese-,
Mikrobeads-, Spaltpartnerrekombinations- oder jedes andere beliebige
Verfahren, das dem Durchschnittsfachmann bekannt ist, verwendet
wird (N. K. Terret, M. Gardner, D. W. Gordon, R. J. Kobylecki, J.
Steele. „Combinatorial
synthesis. The design of compound libraries and their application
to drug discovery".
Tetrahedron, Bd. 51, Nr. 30, (1995), S. 8135–8173). Die Verbindungen können daher
Nukleinsäuren,
Peptide, andere Chemikalien oder eine Kombination daraus sein. Diese
Banken können
beispielsweise zwischen 5.000 und 500.000 Verbindungen, beispielsweise
zwischen 10.000 und 20.000 Verbindungen, umfassen.
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Die
erfindungsgemäßen Verfahren
können
effizient verwendet werden, um verschiedene Typen aktiver Verbindungen
zu identifizieren, wie Wirkstoffkandidaten, Rezeptorliganden. Die
Vorteile dieser Verfahren liegen in der Möglichkeit, Führungssubstanzen
herzustellen, die sowohl wirkungsvoll als auch selektiv für eine Zielstruktur
sind, wobei auf diese Weise die Weiterbehandlung schlechter Führungssubstanzen
verhindert wird.
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In
dieser Hinsicht betrifft die Erfindung auch ein Verfahren der Hochdurchsatz-Profilbestimmung,
das die Durchmusterung einer großen Anzahl von Verbindungen
auf ihre Fähigkeit
umfasst, unter einer großen
Anzahl von Zielstrukturen mit einer gegebenen Zielstruktur zu interagieren.
Vorzugsweise umfasst die Anzahl der getesteten Verbindungen zwischen
5 und 500, insbesondere zwischen 5 und 100, beispielsweise zwischen
5 und 50 Verbindungen. Die Anzahl der untersuchten Zielstrukturen
liegt vorzugsweise über
25, noch bevorzugter über
50. Es wird insbesondere bevorzugt, eine Anzahl von Zielstrukturen
zu verwenden, die über
60 liegt, beispielsweise 62 oder 73. Eine erläuternde Auflistung solcher
Zielstrukturen wird in Tabelle I bereitgestellt.
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In
einer besonderen Ausführungsform
umfasst das HTP-Verfahren dieser Erfindung daher die Durchmusterung
von wenigstens 50 Verbindungen auf ihre Fähigkeit, unter wenigstens 50
unterschiedlichen Zielstrukturen mit einer gegebenen Zielstruktur
zu interagieren.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
umfasst das HTP-Verfahren dieser Erfindung die Durchmusterung von
wenigstens 50 Verbindungen auf ihre Fähigkeit, unter wenigstens 50 unterschiedlichen Zielstrukturen
mit einer gegebenen Zielstruktur zu interagieren und auf ihre pharmakologischen
Eigenschaften.
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Die
Durchmusterung der Verbindungen wird üblicherweise ausgeführt, indem
jede Verbindung mit jeder Zielstruktur inkubiert wird, gefolgt von
der Bestimmung einer Interaktion (z.B. einer Bindung). Eine solche Durchmusterung
kann beispielsweise in Mikrotiterplatten ausgeführt werden, um so viele Durchmusterungen wie
möglich
in einem begrenzten Zeitraum auszuführen. In dieser Hinsicht offenbart
die Erfindung ein Robotersystem, das es erlaubt, diese Durchmusterung
schnell auszuführen,
wobei solch ein Robotersystem für
eine automatisierte Verteilung der Verbindungen in die Platten sorgt,
gefolgt von einer Bestimmung der Fähigkeit der Verbindung, die
Bindung eines Liganden an die Zielstruktur zu inhibieren. Um dieses
Verfahren auszuführen,
umfassen die Platten üblicherweise
die Zielstruktur in einer an deren Oberfläche geknüpfte Struktur sowie einen markierten
Liganden. Wie in den Beispielen gezeigt ist, erlaubt dieses Verfahren
die Bestimmung verschiedener Verbindungen auf zahlreichen Zielstrukturen
(73) in einem verhältnismäßig kurzen
Zeitraum.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch verbesserte Verbindungsbanken
bereit. Insbesondere stellt die Erfindung fokussierte Banken bereit,
die eine Vielzahl von Verbindungen umfassen, wobei die Verbindungen eine
strukturelle Diversität
besitzen und von Verbindungen abstammen, welche die Fähigkeit
haben, selektiv an eine gemeinsame, erwünschte Zielstruktur zu binden.
Während
die fokussierten Banken des Stands der Technik im Wesentlichen Verbindungen
umfassen, die von Treffern stammen, welche die Fähigkeit haben, an eine Zielstruktur
zu binden, stellt die Erfindung jetzt definiertere Banken bereit,
die Verbindungen umfassen, die von Treffern stammen, die nicht nur
die Fähigkeit
haben, an eine Zielstruktur zu binden, sondern die auch für die besagte
Zielstruktur spezifisch sind. Diese Banken sind daher fokussierter
als die vorhergehenden und können
als eine Verbindungsquelle in einem Wirkstoff-Auffindungsprogramm verwendet werden.
Der Ausdruck „stammen" bedeutet in diesem
Rahmen, gewonnen durch Verfahren der kombinatorischen Chemie, die auf
der Struktur solcher Treffer basieren, gemäß Verfahren, die dem Durchschnittsfachmann
bekannt sind.
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Die
vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen, die nur
erläuternd
sind und in keiner Weise den Umfang der vorliegenden Erfindung beschränken, detaillierter
offenbart.
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Beschreibung
der Figuren
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1:
Klassisches Wirkstoff-Auffindungsverfahren
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2:
Wirkstoff-Auffindungsverfahren der Erfindung
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3:
Wirkstoff-Auffindungsverfahren der Erfindung
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4:
Bestimmung der IC50 ausgewählter Treffer
für den
mu-Rezeptor der Ratte.
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Vergleichsverbindung:
DAGO.
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5: Struktur von 12 Führungssubstanzen.
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6:
Bestimmung der Affinität
der ausgewählten
Treffer für
den humanen mu-Rezeptor.
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7:
HTP-Daten für
ausgewählte
Treffer. Die Verbindungen, die aus der Affinitätsuntersuchung ausgewählt wurden,
wurden auf vielen Zielstrukturen getestet. Die Identität der Verbindungen
ist in Tabelle I beschrieben. Für
jeden Fall wird die Wirkung durch die Intensität des Grautons angegeben, wobei
weiß inaktiv und
schwarz die maximale Wirkung bedeutet. Am unteren Rand der Figuren
sind die Daten aus Tabelle IV angegeben, nämlich die Affinitätswerte
der Verbindungen für
die Opioidrezeptoren.
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8:
Funktionalitätsassay:
Bestimmung der Inhibition der Ileum-Kontraktion von Meerschweinchen durch
die ausgewählten
Führungssubstanzen.
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Beispiele
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Beispiel 1: Trefferauswahl
für den
Opioid-mu-Rezeptor
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Es
wurde eine Bank von 10.000 Verbindungen entwickelt, synthetisiert
und in einem Modellsystem für Opioid-mu-Rezeptoren
aus der Ratte durchmustert, wobei ein klassisches Bindungsassay-System
verwendet wurde. Insbesondere wurden Verbindungen in Lösung getestet,
bei einer Konzentration von 10–5 M, in Gegenwart von
[3H] DAMGO als ein Radioligand, auf einem
Homogenat von Ratten-Cortex. Eine spezifische Bindung wurde durch
Flüssigszintillation
unter Kompetition mit Naloxon bestimmt.
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Diese
primäre
Durchmusterung ergab zahlreiche Treffer (4): 180
Verbindungen inhibierten um mehr als 50% die Bindung des Radioliganden,
der für
den mu-Rezeptor spezifisch ist. 111 inhibierten um mehr als 60%
dieser Bindung und 42 um mehr als 70%. Um aktive Verbindungen mit
einer hohen Wirksamkeit zu gewinnen, wurden die letzteren 42 Verbindungen
für die
weiteren Schritte verwendet.
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Die
chemische Struktur dieser 42 Verbindungen wurde analysiert.
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Von
diesen 42 Verbindungen wurden 24 wegen ihrer chemischen Struktur
verworfen (d.h. Inkompatibilität
mit gewerblicher Anwendbarkeit) und 18 wurden für die weitere Analyse behalten.
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Eine
dieser Verbindungen (CER680827) wurde im Ratten-mu-Assay nicht als
aktiv bestätigt.
Die 17 verbleibenden Verbindungen wurden gemäß bekannter Verfahren re-synthetisiert,
aufgereinigt, und ihre Affinität
wurde in humanen mu-, delta- und kappa-Rezeptorbindungsassays gemessen.
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Wie
in Tabelle II gezeigt ist, wurden fünf Verbindungen als inaktiv
nachgewiesen (CER680435, CER728422, CER728428, CER829741, CER838941),
entweder aus dem Grund, weil der beobachtete Effekt in der primären Durchmusterung
auf einem Nebenprodukt beruhte (die primäre Durchmusterung wird mit nicht-aufgereinigten
Verbindungen ausgeführt)
oder wegen einer Spezies-Selektivität dieser Verbindungen (die
primäre
Durchmusterung wurde unter Verwendung des Rattenrezeptors ausgeführt und
die Affinität
wurde unter Verwendung des humanen Rezeptors bestimmt).
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Allerdings
wiesen 12 Treffer die erwartete Affinität für den mu-Rezeptor auf und nur
für einen
von diesen (CER798967) wurde gefunden, dass er aktiver auf dem delta-Rezeptor
ist als auf dem mu-Rezeptor. Die Struktur dieser 12 Verbindungen
ist in 5 dargestellt. Die Daten sind
in 6 und in Tabelle IV zusammengefasst.
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Diese
12 Verbindungen wurden anschließend
im HTP-System getestet, d.h. ihr Selektivitätsprofil wurde unter Verwendung
von 62 Rezeptoren, wie sie in Tabelle I beschrieben sind, bestimmt.
Zu diesem Zweck wurden 10 μM
von jeder Verbindung in Mikrotiterplatten inkubiert, die zuvor mit
den in Tabelle I gezeigten Zielstrukturen beschichtet wurden, wobei
die Inkubation in Gegenwart eines markierten Referenzliganden erfolgte, der
für jede
dieser Zielstrukturen spezifisch ist. Jede Verbindung wurde in einem
Doppelversuch getestet.
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Die
erhaltenen Resultate sind in 7 zusammengefasst.
Die HTP ergab wertvolle Informationen, da sie es erlaubte, zu zeigen,
dass einige der Verbindungen, die auf Basis ihrer relativen Affinität für Opioidrezeptoren
hätten
ausgewählt
werden können,
sich auf vielen unverwandten Zielstrukturen als aktiv zu erweisen. Diese
Verbindungen wurden auf Grund ihrer Unspezifität daher verworfen.
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Die
Kombination der Kriterien der Wirksamkeit (Affinität der Treffer
gegenüber
den mu- und anderen Opioidrezeptoren) und der Selektivität erlaubte
4 Verbindungen (Führungssubstanzen)
als Kandidaten für
die Weiterführung
des Führungssubstanz-Optimierungsprozesses
auszuwählen.
Diese Verbindungen sind CER704252, CER704261, CER704889 und CER710830.
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Um
die Funktionalität
der gemäß des vorliegenden
Verfahrens gewonnenen Führungsverbindungen zu
bestätigen,
wurde jede dieser Verbindungen wie folgt auf ihre Fähigkeit
hin getestet, die Ileum-Kontraktion von Meerschweinchen zu inhibieren:
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Experimentelle Verfahren:
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Ileum-Segmente
wurden von 300–350
g schweren männlichen
Dunkin-Hartley-Meerschweinchen gewonnen. Die Gewebe wurden zwischen
zwei rostfreien Stahlhaken in Organbädern mit Sauerstoff angereicherter
und vorgewärmter
physiologischer Kochsalzlösung
aufgehängt,
wo sie zur Ermittlung der isometrischen Dehnung mit Kraftaufnehmern
verbunden wurden. Zuckungskontraktionen wurden durch eine elektrische
Feldstimulation (Einzelimpulse, 1 ms Länge, maximale Intensität, 0,1 Hz)
durch zwei Platinelektroden mit einem Mehrkanal-Gleichstromstimulator erzeugt. Die Gewebe
wurden bis zu einer optimalen verbleibenden Spannung gedehnt und
anschließend
wenigstens 30 min. äquilibriert,
währenddessen
sie wiederholt gewaschen wurden. Wirkstoffe wurden hinzu gegeben,
nachdem die Zuckungskontraktionsamplitude reproduzierbar war.
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Test auf Agonistenaktivität:
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Die
Gewebe wurden anfänglich
einer effektiven Konzentration des Referenzagonisten DAMGO ausgesetzt,
um die Reaktionsfähigkeit
des Gewebes zu verifizieren. Nach dem Auswaschen und einem weiteren Äquilibrierungszeitraum
wurden die Gewebe mehreren ansteigenden Konzentrationen der Testverbindungen oder
demselben Agonisten ausgesetzt. Die unterschiedlichen Konzentrationen
wurden kumulativ hinzugefügt und
jede verbleibt in Kontakt mit den Geweben, bis eine stabile Reaktion
erreicht wird. Wenn eine Agonisten-ähnliche Reaktion erreicht wird
(Inhibition der Zuckungskontraktionen), wird nach der Wirkung der
höchsten
Konzentration der Testverbindungen der Referenzantagonist Naloxon
hinzugefügt,
um die Beteiligung der μ-Rezeptoren
in dieser Reaktion zu überprüfen.
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Die
in 8 dargestellten Resultate bestätigen, dass die ausgewählten Führungssubstanzen
alle die Fähigkeit
besitzen, Ileum-Kontraktionen von Meerschweinchen zu inhibieren,
was ferner die Verlässlichkeit des
erfindungsgemäßen Verfahrens
zeigt.
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Alles
zusammen genommen dauerte diese erste Runde der Führungssubstanzoptimierung
6 Wochen (Synthese, primäre
Durchmusterung, Bestätigung,
Affinität
zu Opioidrezeptoren und HTP) und könnte auf 3 Wochen reduziert
werden, hauptsächlich
indem die Rundengeschwindigkeit der HTP verringert wird. Dies wird die
Auffindung von Führungssubstanzen
sowohl schnell als auch sicher machen, und zwar in dem Sinne, dass dies
die Weiterverfolgung schlechter Führungssubstanzkandidaten verhindern
wird. Tabelle
I: Liste der Assays, die das HTP-System beinhaltet Hochdurchsatz-Profilbestimmung
(HTP)
Tabelle
II: Liste der Enzyme, die das HTP-System beinhaltet
- (h) zeigt an, dass der Assay mit einem
Enzym humanen Ursprungs ausgeführt
wurde
Tabelle
III: Typische Liste von Assays für
das HTP-System G-PROTEIN-GEKOPPELTE
REZEPTOREN Nicht-peptidische
Rezeptoren Adenosin | A1 |
Adrenergika | α1
α2
β1
β2 |
Dopamin | D1
D2 |
Histamin | H1 |
Melatonin | ML1 |
Muscarinergika | M1
M3 |
Opiate | mu
(h) |
Serotonin | 5-HT1A
5-HT1D
5-HT2C
5-HT6 |
Sigma | σ1 |
Peptidische
Rezeptoren Angiotensin | AT1 |
Bombesin | BB |
Bradykinin | B2 |
CGRP | CGRP |
Cholecystokinin | CCKA |
Chemokin
und Cytokin | IL-1β
CCR2 |
Endothelin | ETA |
Galanin | Galanin |
Glucagon-ähnliches
Peptid | GLP-1 |
Neurokinin | NK1 |
Neuropeptid
Y | Y1 |
Vasopressin | V1A |
IONENKANAL-GEKOPPELTE
REZEPTOREN Benzodiazepin
zentral | BZDc |
Serotonin | 5-HT3 |
TRÄGER Norepinephrin | NE-Aufnahme |
Dopamin | DA-Aufnahme |
Serotonin | 5-HT-Aufnahme |
IONENKANÄLE Calciumkanal | Ca
(Verapamil) |
Kaliumkanal | K
(ATP-abhängig) |
Natriumkanal | Na
(Stelle 2) |
Chloridkanal | Cl-Ionophor |
ENZYME Phosphodiesterasen | PDE
II
PDE IV |
Proteinkinasen | MAP-Kinase
Pkc |
Tyrosinkinasen | EGF-tyr-Kinase
p56-tyr-Kinase |
Proteasen | Angiotensin-konvertierendes
Enzym
(ACE)
Cathepsin B
Elastase |
ZELL-BASIERTE
ASSAYS Cytokin | TNF-α-Sekretion
durch humane Monozyten |
Freie
Radikal | O2-Sekretion durch humane Granulozyten (HL60) |
Adhäsion | von
humanen Monozyten (U937) auf humanen endothelialen Zellen |
Cytotoxizität | für humane
Monozyten |
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Tabelle
IV: Affinität
der Treffer für
Opioidrezeptoren
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Die
Affinitäten
der Verbindungen sind in nM angegeben. Das Zeichen - zeigt das Fehlen
der Wirksamkeit im getesteten Konzentrationsbereich an (0,1 bis
10.000 nM).