DE69821475T3

DE69821475T3 - Verwendung von eindimensionaler kernspinresonanz für identifizierung von liganden für ziel-biomoleküle

Info

Publication number: DE69821475T3
Application number: DE69821475T
Authority: DE
Inventors: W. Stephen FESIK; J. Philip HAJDUK; T. Edward OLEJNICZAK
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1997-04-18
Filing date: 1998-04-17
Publication date: 2009-07-23
Anticipated expiration: 2018-04-18
Also published as: BG103856A; HUP0003956A3; SK285411B6; BG64326B1; PL336299A1; HK1027158A1; BR9808079A; EP0975954B2; CZ9903683A3; HUP0003956A2; JP2002507277A; HU228433B1; IL131726A0; SK141699A3; CZ297275B6; AU7138098A; ZA982919B; US6043024A; CN1225648C; NO995078L

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Screenen von Verbindungen für die Bindung an Ziel-Biomoleküle unter Verwendung von eindimensionaler kernmagnetischer Resonanz-(NMR)-Spektroskopie.
Hintergrund der Erfindung
Eines der wirkungsvollsten Werkzeuge für die Entdeckung neuer Wirkstoffentwicklungslinien ist das ungezielte Screenen von Banken synthetisch-chemischer oder natürlicher Produkte, um Verbindungen zu entdecken, welche an ein spezifisches Ziel-Molekül binden (d. h. die Identifizierung von Liganden dieses Ziels). Unter Verwendung dieses Verfahrens können Liganden anhand ihrer Fähigkeit eine physikalische Verbindung mit einem Ziel-Molekül einzugehen oder mittels ihrer Fähigkeit, die Funktion eines Ziel-Moleküls zu verändern, identifiziert werden.
Wenn nach einer physikalischen Bindung gesucht wird, wird typischerweise ein Ziel-Molekül gegenüber einer oder mehrerer Verbindungen ausgesetzt, von denen angenommen wird, daß sie Liganden darstellen, und es werden Untersuchungen durchgeführt, um festzustellen, ob sich Komplexe zwischen dem Ziel-Molekül und einer oder mehreren dieser Verbindungen bilden. Wie aus dem Stand der Technik wohl bekannt ist, prüfen solche Untersuchungen auf starke Veränderungen in dem Ziel-Molekül (beispielsweise Veränderung der Größe, Ladung, Mobilität), welche auf eine Komplexbildung hinweisen.
Dort, wo funktionelle Veränderungen gemessen werden, werden Untersuchungsbedingungen erstellt, welche die Messung eines biologischen oder chemischen Vorgangs erlauben, welcher mit dem Ziel-Molekül in Beziehung steht (beispielsweise eine Enzym-katalysierte Reaktion, eine Rezeptor-vermittelte Enzymaktivierung). Um eine Veränderung zu identifizieren, wird die Funktion des Ziel-Moleküls vor und nach der Exposition gegenüber diesen Testverbindungen festgestellt.
Es sind physikalische oder funktionelle Untersuchungen mit Erfolg angewendet worden, um neuartige Wirkstoffentwicklungslinien für die Verwendung bei der Entwicklung therapeutischer Verbindungen zu identifizieren. Es existieren jedoch diesen Untersuchungen innewohnende Beschränkungen, die deren Genauigkeit, Verläßlichkeit und Effizienz beeinträchtigen.
Ein Hauptnachteil der existierenden Untersuchungsverfahren betrifft das Problem von "Falsch Positiven". In einer typischen funktionellen Untersuchung ist eine "falsch positive" Verbindung eine Verbindung, welche bei der Untersuchung anspricht, jedoch die gewünschte physiologische Antwort nicht in wirksamer Weise auslöst. Bei einer typischen physikalischen Untersuchung ist eine "falsch positive" Verbindung eine Verbindung, welche sich beispielsweise an das Ziel anheftet, jedoch in einer nichtspezifischen Art und Weise (beispielsweise nichtspezifische Bindung). Falsch Positive sind insbesondere dann weit verbreitet und problematisch, wenn höhere Konzentrationen putativer Liganden gescreent werden, da viele Verbindungen bei diesen hohen Konzentrationen nichtspezifische Effekte aufweisen.
In ähnlicher Art und Weise leiden existierende Untersuchungen unter dem Problem von "Falsch-Negativen", welche sich ergeben, wenn eine Verbindung eine negative Antwort in der Untersuchung erzeugt, wobei jedoch die Verbindung tatsächlich ein Ligand des Ziels ist. Falsch-Negative treten typischerweise in Untersuchungen auf, bei denen Konzentrationen an Testverbindungen verwendet werden, die relativ zur Bindungs- oder Dissoziationskonstante der Verbindung gegenüber dem Ziel entweder zu hoch (was zu Toxizität führt) oder zu niedrig sind.
Es wurde kürzlich gezeigt, daß die zweidimensionale ¹⁵N/¹H-Spektralanalyse angewandt werden kann, um Verbindungen zu identifizieren, welche an ein Ziel-Protein binden und, daß dieser Ansatz viele der Probleme überwindet, die bei anderen existierenden Untersuchungen zur Identifizierung von Liganden auftreten. Jedoch setzt dieser Ansatz voraus, daß das Protein ¹⁵N-markiert und löslich ist und sich bis zu Konzentrationen von 0,3 mM oder höher gut handhaben lässt. Darüber hinausgehend können mit diesem Verfahren nur Proteine verwendet werden, die zu analysierbaren ¹⁵N/¹H-Wechselwirkungskartierungen führen, was bei der heutigen Technologie das Molekulargewicht des Zielproteins auf weniger als 40 kDa begrenzt. Zusätzlich dazu ist das Verfahren zeitaufwendig, da die Verbindungen in Kombinationen von 10 getestet werden müssen und jede Verbindung individuell auf die Bindung an das Ziel-Protein hin untersucht werden muss, wenn sich herausgestellt hat, daß mindestens eine der Verbindungen in der Mischung aktiv ist.
Aufgrund der Probleme, die den existierenden Screening-Verfahren zu eigen sind, besteht weiterhin Bedarf, neuartige, schnelle, effiziente, genaue und verläßliche Mittel zum Screenen von Verbindungen bereitzustellen, um Liganden zu identifizieren und zu entwickeln, die spezifisch an ein besonderes Ziel binden.
Kurze Zusammenfassung der Erfindung
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung in den Ansprüchen 1–8 definiertes Verfahren zum Screenen von Verbindungen bereit, um die Anwesenheit von Verbindungen festzustellen, die Liganden sind, welche an ein spezifisches Ziel-Molekül binden.
Das Verfahren umfaßt folgende Schritte:

a) Erzeugen eines ersten eindimensionalen T₂- oder Diffusions-gefilterten NMR-Spektrums einer Verbindung oder einer Mischung von chemischen Verbindungen;
b) Aussetzen der Verbindung oder der Mischung von chemischen Verbindungen gegenüber einem Ziel-Molekül;
c) Erzeugen eines zweiten eindimensionalen T₂- oder Diffusions-gefilterten NMR-Spektrums von dieser einen Verbindung oder der Mischung von chemischen Verbindungen, wenn sie gegenüber dem Ziel-Molekül in Schritt b) ausgesetzt sind; und
d) Vergleichen des ersten und zweiten eindimensionalen T₂- oder Diffusions-gefilterten NMR-Spektrums, um Unterschiede zwischen dem ersten und dem zweiten NMR-Spektrum zu bestimmen, wobei die Unterschiede die Anwesenheit von einer oder mehreren Verbindungen zwischen der einen Verbindung bzw. der Mischung von chemischen Verbindungen feststellen, die Liganden sind, welche an das Ziel-Molekül gebunden haben.

Wenn eine Mischung von chemischen Verbindungen in (b) verwendet wird, umfaßt das Verfahren weiterhin die auf Schritt (d) folgenden Schritte:

e) Erzeugen eines esten eindimensionalen T₂- oder Diffusions-gefilterten NMR-Spektrums von jeder Verbindung in der Mischung;
f) Aussetzen jeder Verbindung der Mischung einzeln gegenüber dem Ziel-Molekül;
g) Erzeugen eines zweiten eindimensionalen T₂- oder Diffusions-gefilterten NMR-Spektrums von jeder Verbindung, wenn sie gegenüber dem Ziel-Molekül in Schritt (f) ausgesetzt ist; und
h) Vergleichen jeden NMR-Spektrums, das in Schritt (g) erzeugt wurde, mit dem ersten NMR-Spektrum, um Unterschiede in irgendeinem dieser verglichenen NMR-Spektren zu bestimmen, wobei die Unterschiede die Anwesenheit einer Verbindung feststellen, die ein Ligand ist, welcher an das Ziel-Molekül gebunden hat.

Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist die Fähigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens, die Bindung potentieller Liganden an ein nicht markiertes Ziel-Molekül jedweder Größe oder Zusammensetzung festzustellen, unter der Voraussetzung, daß die Größe des Ziels ausreichend größer als der potentielle Ligand ist, so daß nach Bindung an das Zielmolekül Veränderungen in dessen Relaxations- oder Diffusionsgeschwindigkeiten erzeugt werden.
Ein anderer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist die Fähigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens, die Bindung von sogar nur schwach an das Ziel-Molekül bindenden Liganden festzustellen.
Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist die Fähigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens, eine aktive Verbindung oder Verbindungen in einer Mischung von Verbindungen zu identifizieren, durch direkten Vergleich der chemischen Verschiebungen in den Differenz-Spektren mit den bekannten chemischen Verschiebungen der die Mischung bildenden Verbindungen in Abwesenheit des Ziel-Biomoleküls.
Bei dieser bevorzugten Ausführungsform kann der Vorgang der Bestimmung der Bindung eines Liganden in Anwesenheit eines zweiten gebundenen Liganden durchgeführt werden. In Übereinstimmung mit dieser Ausführungsform wird das Ziel-Molekül an den zweiten Liganden gebunden, bevor dieses Ziel den Testverbindungen ausgesetzt wird.
Dieses Verfahren verwendet ein, wie oben erläutertes T₂- oder Diffusions-gefiltertes Protonenspektroskopie-Screeningverfahren, um einen ersten Liganden und darauf folgende Liganden, welche an das Ziel-Molekül binden, zu identifizieren. Es wird ein Komplex aus dem Ziel-Molekül und zwei oder mehreren Liganden gebildet und die Strukturdaten werden vorzugsweise unter Verwendung von NMR-Spektroskopie oder Röntgenkristallographie erhalten. Diese Strukturdaten werden verwendet, um die räumliche Orientierung der Liganden relativ zueinander und zu dem Ziel-Molekül zu bestimmen.
Basierend auf der räumlichen Orientierung werden die Liganden miteinander verknüpft, um einen Liganden mit hoher Affinität zu bilden, welcher als Ligand für das spezifische Ziel-Molekül geeignet ist und der nützlich ist als potentieller pharmazeutisch wirksamer Wirkstoff. Die Auswahl einer geeigneten verbindenden Gruppe erfolgt durch Aufrechterhalten der räumlichen Orientierung der Liganden zueinander und zu dem Ziel-Molekül, basierend auf Grundsätzen der Bindungswinkel- und Bindungslängeninformation, wie sie in der organischen Chemie wohl bekannt sind. Das Bindungsverfahren oder der Syntheseablauf zum Verbinden der mindestens zwei Liganden zur Bildung des Liganden mit hoher Affinität, wird mittels bekannter synthetischer Verfahren und/oder mittels retrosynthetischer Analyse durchgeführt. Der Ligand mit hoher Affinität kann auf jegliche Art und Weise hergestellt werden, die tatsächlich den endgültigen Liganden erzeugt, und diese ist nicht darauf beschränkt, einfach nur zwei Liganden über eine verbindende Gruppe miteinander zu verbinden. Es kann jedwedes Linearsynthese- oder konvergente Syntheseverfahren verwendet werden, um das Endprodukt zu bilden. Sobald die mindestens zwei Liganden mit Affinität für das Ziel-Molekül (vorzugsweise ein Protein) gefunden sind, wird der Ligand mit hoher Affinität mittels Verfahren erzeugt und hergestellt, die dem Fachmann wohlbekannt sind. Die Liganden werden aus einem Pool von verschiedenen kleinen Molekülen, welche mannigfaltige Atom- und Molekularanordnungen, Stereochemie usw. besitzen, ausgewählt. Der begrenzende Faktor ist, daß die mindestens zwei Liganden eine gewisse Affinität als Ligand für mindestens eine Stelle auf dem Polypeptid oder Ziel-Molekül besitzen. Das hierin offenbarte Screening-Verfahren kann gleichwohl einen einzelnen Liganden oder eine Mehrzahl von Liganden identifizieren, die ferner mittels herkömmlicher Verfahren zum Entwickeln von Wirkstoffen (Wirkstoff-Design-Verfahren) verändert werden können, um pharmazeutisch wirksame Produkte zu bilden, oder die bei dem hierin offenbarten Medikamentenentwicklungsverfahren verwendet werden können, um mindestens zwei Liganden zur Bildung eines Liganden mit hoher Affinität miteinander zu verknüpfen.
Somit umfaßt das molekulare Entwicklungsverfahren ein Verfahren, das folgendes umfaßt:

a) Identifizieren eines ersten Liganden für das Ziel-Molekül unter Verwendung von eindimensionaler T₂- oder Diffusions-gefilterter NMR-Spektroskopie unter Verwendung eines Verfahrens gemäß Anspruch 1;
b) Identifizieren von einem oder mehreren zusätzlichen Liganden für das Ziel-Molekül unter Verwendung von eindimensionaler T₂- oder Diffusions-gefilterter NMR-Spektroskopie;
c) Bilden eines Komplexes zwischen dem ersten identifizierten Liganden und dem einen oder den mehreren zusätzlichen identifizierten Liganden mit dem Ziel-Molekül;
d) Bestimmen der dreidimensionalen Struktur von mindestens einem Teil des Komplexes, worin der erste und einer oder mehrere zusätzliche Liganden an das Ziel-Molekül binden und somit Bestimmen der räumlichen Orientierung des ersten und eines oder mehrerer zusätzlicher Liganden auf dem Ziel-Molekül; und
e) Verknüpfen des ersten und des einen oder der mehreren zusätzlichen Liganden, um die räumliche Orientierung, die in Schritt (d) bestimmt wurde, aufrechtzuerhalten, um den Liganden mit hoher Affinität zu bilden.

Die Identifizierung von weiteren Liganden-Gruppen kann in Abwesenheit oder in Anwesenheit des ersten Liganden durchgeführt werden (beispielsweise kann das Ziel-Molekül an den ersten Liganden gebunden sein, bevor man es den Testverbindungen zur Identifizierung des zweiten Liganden aussetzt).
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das bei einem Screening- oder Entwicklungsverfahren verwendete Ziel-Molekül ein Polypeptid. Das Ziel-Polypeptid wird vorzugsweise in rekombinanter Form durch eine Wirtszelle hergestellt, welche mit einem Expressionsvektor transformiert ist, der ein Polynucleotid enthält, das für das Polypeptid codiert.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
In den Zeichnungen, die einen Teil der Beschreibung bilden, zeigen:
1(A) ein T₂-gefiltertes Spektrum der Verbindung 1 in wäßrigem Puffer, (B) ein T₂-gefiltertes Spektrum von Verbindung 1 in Anwesenheit von FKBP, (C) ein T₂-gefiltertes Spektrum von FKBP, (D) ein Differenz-Spektrum, erhalten durch Abziehen von (C) von (B), und (E) ein Differenz-Spektrum, erhalten durch Substraktion von (D) von (A). Für sämtliche Experimente betrug die T₂-Filter-Spin-Lock-Zeit 200 ms mit einer Spin-Echozeit von 1 ms, die Konzentration der Verbindung 1 betrug 100 μM, die Konzentration von FKBP betrug 50 μM und der Puffer war 50 mM PO₄, 100 mM NaCl, pH 6,5 (95% D₂O).
2(A) ein T₂-gefiltertes Spektrum einer Mischung der Verbindungen 1–9, (B) ein T₂-gefiltertes Spektrum einer Mischung der Verbindungen 1–9 in Anwesenheit von FKBP, (C) ein T₂-gefiltertes Spektrum von FKBP, (D) ein Differenzspektrum, erhalten durch Substraktion von (C) von (B), (E) ein Differenzspektrum, erhalten durch Abziehen von (D) von (A), und (F) ein Referenz-T₂-gefiltertes Spektrum von Verbindung 1 alleine. Für sämtliche Experimente betrug die T₂-Filter-Spin-Lock-Zeit 200 ms mit einer Spin-Echozeit von 1 ms, die Konzentration aller chemischen Verbindungen betrugt 100 μM, die Konzentration von FKBP betrug 50 μM und der Puffer war 50 mM PO₄, 100 mM NaCl, pH 6,5 (95% D₂O).
3(A) ein T₂-gefiltertes Spektrum einer Mischung der Verbindungen 2–9, (B) ein T₂-gefiltertes Spektrum einer Mischung der Verbindungen 2–9 in Anwesenheit von FKBP, (C) ein T₂-gefiltertes Spektrum einer Mischung von FKBP, (D) ein Differenzspektrum, erhalten durch Substraktion von (C) von (B), und (E) ein Differenzspektrum, erhalten durch Substraktion von (D) von (A). Für sämtliche Experimente betrug die T₂-Filter-Spin-Lock-Zeit 200 ms mit einer Spin-Echozeit von 1 ms, die Konzentration sämtlicher chemischer Verbindungen betrug 100 μM, die Konzentration von FKBP betrug 50 μM und der Puffer war 50 mM PO₄, 100 mM NaCl, pH 6,5 (95% D₂O).
4(A) ein Diffusions-gefiltertes Spektrum der Verbindung 1 in Anwesenheit von FKBP unter Verwendung einer niedrigen Gradientenstärke, (B) ein Diffusions-gefiltertes Spektrum der Verbindung 1 in Anwesenheit von FKBP unter Verwendung einer hohen Gradientenstärke, (C) ein Differenzspektrum, erhalten durch Substraktion von (B) von (A), (D) ein Diffusions-gefiltertes Spektrum der Verbindung 1 unter Verwendung einer geringen Gradientenstärke, und (E) ein Differenzspektrum, erhalten durch Substraktion von (C) von (D). Für sämtliche Experimente korrespondieren die niedrigen und hohen Gradientenstärken mit 3 bzw. 48 Gauss/cm. Die hohe Gradientenstärke reichte aus, um das Rest-HDO-Signal in der Probe zu eliminieren. Es wurde eine Diffusionsverzögerungszeit von 300 ms verwendet, die Konzentration sämtlicher chemischer Verbindungen betrug 100 μM, die Konzentration von FKBP betrug 50 μM und der Puffer war 50 mM PO₄, 100 mM NaCl, pH 6,5 (95% D₂O).
5(A) ein Diffusions-gefiltertes Spektrum einer Mischung der Verbindungen 1–9 in Anwesenheit von FKBP unter Verwendung einer niedrigen Gradientenstärke, (B) ein Diffusions-gefiltertes Spektrum einer Mischung der Verbindungen 1–9 in Anwesenheit von FKBP unter Verwendung einer hohen Gradientenstärke, (C) ein Differenzspektrum, erhalten durch Substraktion von (B) von (A), (D) ein Diffusions-gefiltertes Spektrum einer Mischung der Verbindungen 1–9 unter Verwendung einer niedrigen Gradientenstärke, (E) ein Differenzspektrum, erhalten durch Substraktion von (C) von (D), und (F) ein Referenzspektrum der Verbindung 1 allein. Für sämtliche Experimente korrespondierten die niedrigen und hohen Gradientenstärken mit 3 bzw. 48 Gauss/cm. Die hohe Gradientenstärke reichte aus, um Rest-HDO-Signal in der Probe zu eliminieren. Es wurde eine Diffusionsverzögerungszeit von 300 ms verwendet, die Konzentration sämtlicher chemischer Verbindungen betrug 100 μM, die Konzentration von FKBP betrug 50 μM und der Puffer war 50 mM PO₄, 100 mM NaCl, pH 6,5 (95% D₂O).
6(A) ein Diffusions-gefiltertes Spektrum einer Mischung der Verbindungen 2–9 in Anwesenheit von FKBP unter Verwendung einer niedrigen Gradientenstärke, (B) ein Diffusions-gefiltertes Spektrum einer Mischung der Verbindungen 2–9 in Anwesenheit von FKBP unter Verwendung einer hohen Gradientenstärke, (C) ein Differenzspektrum, erhalten durch Substraktion von (B) von (A), (D) ein Diffusions-gefiltertes Spektrum einer Mischung der Verbindungen 2–9 unter Verwendung einer niedrigen Gradientenstärke, und (E) ein Differenzspektrum, erhalten durch Substraktion von (C) von (D). Für sämtliche Experimente korrespondierten die geringen und hohen Gradientenstärken mit 3 bzw. 48 Gauss/cm. Die hohe Gradientenstärke reichte aus, um das Rest-HDO-Signal in der Probe zu eliminieren. Es wurde eine Diffusionsverzögerungszeit von 300 ms verwendet, die Konzentration sämtlicher chemischer Verbindungen betrug 100 μM, die Konzentration von FKBP betrug 50 μM und der Puffer betrug 50 mM PO₄, 100 mM NaCl, pH 6,5 (95% D₂O).
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein schnelles und effizientes Screeningverfahren zur Identifizierung von Liganden bereit, welche an therapeutische Ziel-Moleküle binden.
Die Liganden werden durch Untersuchung der Bindung von Molekülen an das Ziel-Molekül (beispielsweise Protein, Nucleinsäure, etc.) identifiziert, mittels Verfolgen der Veränderungen entweder der Relaxations- oder Diffusionsgeschwindigkeiten der Ligandresonanzen mit Hilfe von kernmagnetischer Resonanz(NMR)-Spektroskopie, nach der Zugabe des Ziels. Der Pool gescreenter Moleküle kann aus einer Verbindungs-Sammlung gewählt werden, wie beispielsweise solchen, wie sie momentan in den meisten pharmazeutischen Firmen oder Universitätslaboratorien zur Verfügung stehen.
Die Information über die Struktur/Aktivitäts-Beziehungen zwischen Liganden, die durch solch ein Verfahren identifiziert werden, kann anschließend verwendet werden, um neuartige Arzneimittel zu entwickeln, die als Liganden für das Ziel-Molekül dienen. Beispielsweise wird dort, wo zwei oder mehrere Liganden eines gegebenen Ziel-Moleküls identifiziert werden, ein Komplex aus diesen Liganden und dem Ziel-Molekül gebildet. Die räumliche Orientierung der Liganden zueinander sowie gegenüber dem Ziel-Molekül wird aus den Strukturdaten abgeleitet. Diese räumliche Orientierung definiert den Abstand zwischen den Bindungsstellen der zwei Liganden und die Orientierung jedes Liganden zu diesen Stellen.
Unter Verwendung dieser Informationen über die räumlichen Orientierungsdaten werden anschließend die zwei oder mehreren Liganden miteinander verknüpft, um einen neuen Liganden zu bilden. Die Verknüpfung wird auf eine Art und Weise erreicht, so daß die räumliche Orientierung der Liganden zueinander und dem Ziel-Molekül aufrechterhalten wird.
Es ergeben sich zahlreiche Vorteile für das 1D-NMR-basierten Ermittlungsverfahren der vorliegenden Erfindung. Erstens wird das Problem von Falsch-Positiven signifikant vermindert, da das erfindungsgemäße Verfahren Liganden mittels direkter Messung der Bindung an das Ziel-Molekül identifiziert.
Zweitens wird das Problem von Falsch-Negativen signifikant vermindert, da das vorliegende Verfahren Verbindungen mit einem breiten Bereich von Dissoziationskonstanten identifizieren kann, welche spezifisch an das Ziel-Molekül binden.
Drittens wird der Bedarf für ¹⁵N-markierte Proteine mit niedrigem Molekulargewicht (< 40 kDa), die bei hohen Konzentrationen stabil sind, wie sie für Verfahren, die ¹⁵N/¹H-Korrelationsspektroskopie verwenden, vorausgesetzt werden, durch die Verwendung der vorliegenden Erfindung beseitigt.
Viertens verringert die Fähigkeit, direkt aktive Verbindungen aus einer Mischung von Verbindungen mittels Vergleich von bekannten chemischen Verschiebungen, zu identifizieren signifikant den Zeitbedarf, der zum Screenen und Identifizieren aktiver, an das Ziel-Molekül bindender Verbindungen benötigt wird.
Da die Signale der potentiellen Liganden überwacht werden, um die Bindung an das Ziel-Molekül festzustellen, können zwei oder mehrere Liganden, welche gleichzeitig an das Ziel-Molekül binden, identifiziert werden. Die Fähigkeit, gleichzeitig die Bindungsstellen unterschiedlicher Liganden zu identifizieren, erlaubt es dem Fachmann, 1) die negative und positive kooperative Bindung zwischen Liganden zu definieren und 2) neue Arzneimittel zu entwerfen, durch Verknüpfung von zwei oder mehreren Liganden zu einer einzigen Verbindung unter Aufrechterhaltung einer richtigen Orientierung der Liganden zueinander und zu ihren Bindungsstellen.
In ihrem Haupt-Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Screenen von Verbindungen bereit, um die Anwesenheit von Verbindungen festzustellen, welche Liganden darstellen, die an ein spezifisches Ziel-Molekül binden. Das Verfahren umfaßt folgende Schritte:

a) Erzeugen eines ersten eindimensionalen T₂- oder Diffusions-gefilterten NMR-Spektrums einer Verbindung oder einer Mischung von chemischen Verbindungen;
b) Aussetzen der Verbindung oder der Mischung von chemischen Verbindungen gegenüber einem Ziel-Molekül;
c) Erzeugen eines zweiten eindimensionalen T₂- oder Diffusions-gefilterten NMR-Spektrums von dieser einen Verbindung oder der Mischung von chemischen Verbindungen, wenn sie gegenüber dem Ziel-Molekül in Schritt (b) ausgesetzt sind; und
d) Vergleichen des ersten und zweiten eindimensionalen T₂- oder Diffusions-gefilterten NMR-Spekturms, um Unterschiede zwischen dem ersten und dem zweiten NMR-Spektrum zu bestimmen, wobei die Unterschiede die Anwesenheit von einer oder mehreren Verbindungen zwischen der einen Verbindung bzw. der Mischung von chemischen Verbindungen feststellen, die Liganden sind, welche an das Ziel-Molekül gebunden haben.

Dort, wo ein erfindungsgemäßes Verfahren in Schritt (b) mehr als eine Verbindung screent, und dort, wo ein Unterschied zwischen den beobachteten Spektren vorliegt, kann die aktive Verbindung mittels vorbekanntem Wissen der chemischen Verschiebungen der Verbindungen in der Mischung, in Abwesenheit des Ziel-Moleküls, identifiziert werden. Fehlt eine solche Information, können zusätzliche Schritte durchgeführt werden, um festzustellen, welche spezifische Verbindung an das Ziel-Molekül bindet.
Diese zusätzlichen Schritte sind:

e) Erzeugen eines ersten eindimensionalen T₂- oder Diffusions-gefilterten NMR-Spektrums von jeder Verbindung in der Mischung;
f) Aussetzen jeder Verbindung der Mischung einzeln gegenüber dem Ziel-Molekül;
g) Erzeugen eines zweiten eindimensionalen T₂- oder Diffusions-gefilterten NMR-Spektrums von jeder Verbindung, wenn sie gegenüber dem Ziel-Molekül in Schritt (f) ausgesetzt ist; und
h) Vergleichen jeden NMR-Spektrums, das in Schritt (g) erzeugt wurde, mit dem ersten NMR-Spektrum, um Unterschiede in irgendeinem dieser verglichenen NMR-Spektren zu bestimmen, wobei die Unterschiede die Anwesenheit einer Verbindung feststellen, die ein Ligand ist, welcher an das Ziel-Molekül gebunden hat.

Bei einem erfindungsgemäßen Verfahren kann jegliches Ziel-Molekül verwendet werden, unter der Voraussetzung, daß das Ziel-Molekül ausreichend größer ist als die Testverbindungen, so daß sich nach der Bindung an das Ziel-Molekül große Unterschiede in den Relaxations- oder Diffusions-Geschwindigkeiten der Testverbindung ergeben. Aufgrund der Bedeutung von Proteinen in der medizinischen Chemie ist ein bevorzugtes Ziel-Molekül ein Polypeptid. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das Ziel-Molekül ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht von größer als 5 kDa.
Das Screening-Verfahren der vorliegenden Erfindung beginnt mit der Erzeugung oder Aufzeichnung entweder eines T₂-gefilterten oder Diffusions-gefilterten eindimensionalen Protonenspektrums der Verbindung oder der Mischung der Verbindungen. Möglichkeiten zur Erzeugung von T₂-gefilterten oder Diffusions-gefilterten eindimensionalen Protonenspektren sind aus dem Stand der Technik bekannt (vgl. beispielsweise S. Meiboom und D. Gill, Rev. Sci. Instrum. 29: 688 (1958), S. J. Gibbs und C. S. Johnson, Jr., J. Magn. Reson. 93: 395–402 (1991) und A. S. Altieri et al., J. Am. Chem. Soc. 117: 7566–7567 (1995)).
Um die Aufzeichnung von NMR-Daten einer großen Zahl von Verbindungen (beispielsweise einer Bank synthetischer oder natürlich vorkommender kleiner organischer Verbindungen) zu erleichtern, wird ein Probenwechsler eingesetzt. Wird der Probenwechsler verwendet, können insgesamt 60 Proben ohne Aufsicht bearbeitet werden. Somit können unter Verwendung der typischen Aufzeichnungsparameter (128 Scans pro freiem Induktionsdecay (fid) 100–120 Spektren innerhalb eines 24-Stunden-Zeitraums aufgezeichnet werden.
Zur Erleichterung der Verarbeitung der NMR-Daten werden Computerprogramme verwendet, um die zahlreichen eindimensionalen NMR-Daten zu übertragen und automatisch zu verarbeiten.
Ein repräsentatives eindimensionales T₂-gefiltertes Spektrum einer Mischung von Verbindungen wird in 1A gezeigt. Ein typisches eindimensionales Diffusions-gefiltertes Spektrum einer Mischung aus Verbindungen wird in 2A gezeigt.
Nach der Aufzeichnung des ersten Spektrums wird das markierte Zielmolekül der Einwirkung einer oder mehrerer Test-Verbindungen ausgesetzt. Dort, wo mehr als eine Test-Verbindung gleichzeitig getestet werden soll, ist es von Vorteil, eine Bank von Verbindungen, wie beispielsweise eine Vielzahl kleiner Molekülen, zu verwenden. Solche Moleküle werden typischerweise in perdeuteriertem Dimethylsulfoxid gelöst. Die Verbindungen der Bank können von Lieferanten erworben oder entsprechend der gewünschten Bedürfnisse erzeugt werden.
Einzelne Verbindungen können unter anderem aufgrund der Größe (Molekulargewicht = 100–300) und der molekularen Verschiedenheit ausgewählt werden. Verbindungen in der Sammlung können unterschiedliche Formen (beispielsweise ebene aromatische Ringe(s), gewinkelte aliphatische Ringe(s), geradkettige und verzweigtkettige Aliphaten mit Einfah-, Doppel- oder Dreifach-Bindungen) und diverse funktionelle Gruppen (z. B. Carbonsäuren, Ester, Ether, Amine, Aldehyde, Ketone und vielfältige heterocyclische Ringe) besitzen, um die Wahrscheinlichkeit zur Entdeckung von Verbindungen, welche mit vielfältigen unterschiedlichen Bindungsstellen in Wechselwirkung treten, zu maximieren.
Das NMR-Screening-Verfahren der vorliegenden Erfindung wendet Ligandenkonzentrationen im Bereich von etwa 0,05 bis etwa 1,0 mM an. Bei diesen Konzentrationen können Verbindungen, die sauer oder basisch sind, den pH der gepufferten Proteinlösungen signifikant verändern. Chemische Verschiebungen sind gegenüber pH-Veränderungen als auch direkten Bindungswechselwirkungen empfindlich und deshalb können "falsch positive" Veränderungen der chemischen Verschiebungen beobachtet werden, die nicht Ergebnis der Ligandenbindung sind, sondern der Veränderungen des pH. Es ist somit notwendig, sicherzustellen, daß der pH der gepufferten Lösung sich nicht nach der Zugabe des Liganden ändert. Eine Möglichkeit, den pH zu steuern, wird unten angeführt.
Die Verbindungen werden bei 263 K als 1,0 und 0,1 M Stammlösungen in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelagert. Dies ist aufgrund der beschränkten Löslichkeit der Liganden in wäßriger Lösung notwendig. Es ist nicht möglich, direkt den pH der DMSO-Lösung einzustellen. Darüber hinausgehend bilden HCl und NaOH unlösliche Salze in DMSO, so daß alternative Säuren und Basen verwendet werden müssen. Es hat sich herausgestellt, daß der folgende Ansatz zu einem stabilen pH führt.
Die 1,0 M Stammlösungen in DMSO werden 1:10 in 50 mM Phosphat, pH 7,0, verdünnt. Der pH dieser verdünnten Aliquotlösung wird gemessen. Falls der pH des Aliquots unverändert bleibt (d. h., bei 7,0 verbleibt), wird mittels 1:10-Verdünnung der DMSO-Stammlösung eine Arbeitslösung hergestellt, um eine 0,1 M Lösung zu erzeugen, die anschließend gelagert wird.
Falls der pH des verdünnten Aliquots weniger als 7,0 beträgt, wird Ethanolamin zu der 1,0 M DMSO-Stammlösung zugegeben, anschließend wird die Stammlösung 1:10 mit Phosphatpuffer verdünnt, um einen weiteren Aliquot herzustellen, und der pH des Aliquots wird erneut überprüft.
Falls der pH des verdünnten Aliquots größer als 7,0 ist, wird Essigsäure zu der 1,0 M DMSO-Stammlösung zugegeben, diese Stammlösung 1:10 mit Phosphatpuffer verdünnt, um ein weiteres Aliquot zu erzeugen, und der pH des Aliquots erneut überprüft.
Ethanolamin und Essigsäure sind in DMSO löslich und es werden die entsprechenden Äquivalente zugegeben, um sicherzustellen, daß der pH nach Transfer in wäßrigen Puffer unverändert bleibt. Das Einstellen des pH ist ein interaktiver Vorgang, welcher so lange wiederholt wird, bis das gewünschte Ergebnis erhalten wird.
Es ist zu beachten, daß dieses Verfahren in 1:10-Verdünnungen von 1,0 M Stammlösungen (100 mM Ligand) durchgeführt wird, um sicherzustellen, daß keine pH-Veränderungen bei den geringeren Konzentrationen, wie sie in den Experimenten (0,1 bis 10 mM) verwendet werden, oder bei unterschiedlichen/schwächeren Puffersystemen beobachtet werden.
Nachdem die Testverbindungen dem Ziel-Molekül ausgesetzt worden sind wird ein zweites eindimensionales T₂- oder Diffusions-gefiltertes Spektrum erzeugt. Für den T₂-gefilterten Ansatz wird das zweite Spektrum in der selben Art und Weise, wie oben angeführt, erzeugt. Die ersten und zweiten Spektren werden miteinander verglichen, um festzustellen, ob irgendwelche Unterschiede zwischen den zwei Spektren bestehen. Unterschiede in den eindimensionalen T₂-gefilterten Spektren weisen darauf hin, daß der Ligand an das Ziel-Molekül bindet. Die Unterschiede werden unter Verwendung von Standardverfahren, wie sie im Stand der Technik bekannt sind, bestimmt. Für das Diffusions-gefilterte Verfahren wird das zweite Spektrum durch Betrachten der Spektralunterschiede zwischen Gradienten niedriger und hoher Stärke erzeugt, womit nach solchen Verbindungen selektiert wird, deren Diffusionsgeschwindigkeiten vergleichbar sind mit denen, die in Abwesenheit des Ziel-Moleküls beobachtet werden.
Als Beispiel zeigt 1 Vergleiche von eindimensionalen T₂-gefilterten Spektren, bevor und nachdem verschiedene Ziel-Moleküle einer Mischung von Test-Verbindungen ausgesetzt worden sind sowie die darauf folgende Identifizierung einer aktiven Verbindung. Eine detaillierte Beschreibung, wie diese Untersuchungen durchgeführt werden, findet sich unten in Beispiel 1.
Weiterhin als Beispiel zeigt 2 Vergleiche zwischen eindimensional Diffusions-gefilterten Spektren, bevor und nachdem verschiedene Ziel-Moleküle einer Mischung von Test-Verbindungen ausgsetzt worden sind und die anschließende Identifizierung einer aktiven Verbindung. Eine detaillierte Beschreibung, wie diese Untersuchungen durchgeführt wurden, kann nachfolgend in Beispiel 2 gefunden werden.
Um zusätzliche Moleküle, welche an das Protein binden, zu entdecken, werden Moleküle zum Untersuchen basierend auf den Struktur/Wirksamkeits-Beziehungen der ursprünglichen Screen- und/oder Strukturinformation der ursprünglichen Entwicklungslinie, wenn diese an das Protein gebunden sind, ausgewählt. Beispielsweise führt das ursprüngliche Screening zu einer Identifizierung von Liganden, welche alle einen aromatischen Ring enthalten. Die zweite Runde des Screenens würde dann andere aromatische Moleküle als Test-Verbindungen verwenden.
Aufgrund ihrer Bedeutung für die medizinische Chemie ist ein bevorzugtes Ziel-Molekül zur Verwendung bei solch einem Verfahren ein Polypeptid. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform kann ein Verfahren zum Nachweis der Bindung eines Liganden an das Ziel-Molekül in Anwesenheit eines zweiten Liganden durchgeführt werden. In Übereinstimmung mit dieser Ausführungsform wird das Ziel-Molekül bevor es den Test-Verbindungen ausgesetzt wird an einen zweiten Liganden gebunden.
Bevorzugte Ziel-Moleküle, Mittel zur Erzeugung von Spektren und Wege zum Vergleichen der Spektren sind die gleichen wie oben angeführt.
Der Anfangsschritt des Entwicklungs-Verfahrens ist die Identifizierung von zwei oder mehreren Liganden, welche an das spezifische Ziel-Molekül binden. Die Identifizierung solcher Liganden erfolgt unter Anwendung eindimensionaler T₂- oder Diffusions-gefilterter Spektroskopie, wie oben angeführt.
Sobald festgestellt wurde, daß zwei oder mehrere Liganden an das Ziel-Molekül an unterschiedlichen Stellen binden, wird ein Komplex zwischen dem Ziel-Molekül und den Liganden gebildet. Dort, wo zwei Liganden vorliegen, ist dieser Komplex ein ternärer Komplex. Quaternäre oder andere Komplexe werden dort gebildet, wo drei oder mehr Liganden vorliegen.
Die Komplexe werden durch Vermischen des Ziel-Moleküls, entweder gleichzeitig oder nacheinander, mit den verschiedenen Liganden unter Bedingungen gebildet, die es erlauben, daß diese Liganden an das Ziel binden. Mittel zur Bestimmung dieser Bedingungen sind aus dem Stand der Technik bekannt.
Sobald dieser Komplex gebildet ist, werden die Strukturdaten erhalten. Jedes Mittel zum Gewinnen der Strukturdaten kann verwendet werden. Solche Verfahren sind aus dem Stand der Technik bekannt. Beispielhafte und bevorzugte Verfahren sind die NMR und Röntgenkristallographie.
Eine Analyse der Strukturdaten kann die räumliche Orientierung der Liganden relativ zueinander sowie gegenüber der Konformation des Ziel-Moleküls aufdecken. Als erstes erlaubt die räumliche Orientierung jedes Liganden gegenüber dem Ziel-Molekül die Identifizierung der Teile des Liganden, die direkt an der Bindung beteiligt sind (d. h. solche Teile, welche mit der Ziel-Bindungsstelle wechselwirken) und solcher Teile jedes Liganden, die von der Bindungsstelle weg zeigen, und festzustellen, welche Teile in darauffolgenden Verknüpfungsverfahren verwendet werden können.
Zweitens werden die räumlichen Orientierungsdaten dazu verwendet, die Positionen der Liganden jeweils relativ zueinander zu kartieren. In anderen Worten können diskrete Entfernungen zwischen den räumlich orientierten Liganden berechnet werden.
Drittens definieren die räumlichen Orientierungsdaten weiterhin die dreidimensionalen Beziehungen zwischen den Liganden und dem Ziel. Somit können zusätzlich zur Berechnung der absoluten Entfernungen zwischen den Liganden auch die Winkelorientierungen dieser Liganden festgestellt werden.
Die Kenntnis der räumlichen Orientierungen der Liganden und des Ziels wird anschließend dazu verwendet, Linker auszuwählen, welche zwei oder mehrere Liganden zu einer einzigen Einheit verknüpfen, die sämtliche Liganden enthält. Die Entwicklung der Linker basiert auf den Entfernungen und der Winkelorientierung, die notwendig sind, um jeden der Ligandenteile der einzelnen Einheit in der richtigen Orientierung zu dem Ziel zu halten.
Die dreidimensionale Konformation geeigneter Linker ist bekannt oder leicht durch den Fachmann bestimmbar. Obwohl es theoretisch möglich ist, zwei oder mehrere Liganden miteinander über einen beliebigen Abstandsbereich und dreidimensionaler Projektion zu verknüpfen, sind in der Praxis bestimmte Einschränkungen des Absatnds und der Projektion bevorzugt. Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind die Liganden durch einen Abstand von weniger als etwa 15 Angström (Å), noch bevorzugter weniger als ewa 10 Å und am meisten bevorzugt weniger als etwa 5 Å voneinander getrennt.
Sobald eine geeignete Linker-Gruppe identifiziert ist, werden die Liganden über diesen Linker miteinander verknüpft. Mittel zur Verknüpfung von Liganden sind aus dem Stand der Technik bekannt und hängen von der chemischen Struktur des Liganden und der Verknüpfungsgruppe als solcher ab. Die Liganden werden unter Verwendung der Teile des Liganden, die nicht direkt an der Bindung an das Ziel-Molekül beteiligt sind miteinander verknüpft.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung und schränken die Beschreibung und die Ansprüche in keiner Weise ein.
Beispiel 1
Screenen von Verbindungen unter Anwendung von T₂-gefilterter Spektroskopie
A. FKBP
Rekombinantes humanes FK-Bindeprotein (FKBP) wurde wie in Logan et al., J. Mol. Biol., 236: 637–648 (1994) beschrieben hergestellt.
Die für das Auswerten der Veränderungen in den transversalen (T₂) Relaxationsgeschwindigkeiten potentieller Liganden in Anwesenheit des Ziel-Moleküls verwendete Pulssequenz ist die in S. Meiboom und D. Gill, Rev. Sci. Instrum., 29: 688 (1958) beschriebene Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)-Sequenz.
Die vorliegende Erfindung nutzt die Tatsache, daß große Moleküle oder Komplexe von Molekülen, die in Lösung langsam rotieren, kürzere transversale (T₂)-Relaxationszeiten besitzen als kleine, schnell in Lösung rotierende Moleküle. Dies ist im Stand der Technik wohlbekannt. Die vorliegende Erfindung bedient sich der Tatsache, daß ein kleines Molekül, welches normalerweise, wenn es frei in Lösung vorliegt, schnell rotiert, langsamer rotieren wird, wenn es an ein größeres Ziel-Molekül gebunden ist. Somit werden sich die transversalen (T₂)-Relaxationsgeschwindigkeiten des kleinen Moleküls verändern (verringern), wenn es an ein Ziel-Molekül gebunden ist.
Dies wird in 1 für FKBP und die Verbindung 1 gezeigt, die an FKBP mit einer Affinität von 200 μM bindet. In 1A wird eine CPMG-Sequenz mit einer Spin-Lock-Zeit von 200 ms auf die Verbindung in Abwesenheit von FKBP angewendet. Da die transversalen Relaxationsgeschwindigkeiten kleiner Moleküle, die frei in Lösung sind, im allgemeinen im Bereich von Sekunden liegen, tritt eine vernachlässigbare Relaxation während der Spin-Lock-Zeit auf, und somit werden die Signale der freien Liganden beobachtet. In Anwesenheit von FKBP jedoch werden die Ligandensignale nach der Spin-Lock-Zeit signifikant verringert und es verbleiben nur Restprotein- und Liganden-Peaks im Spektrum, wie in 1B gezeigt. Diese Unterschiede können entweder mittels direkter Untersuchung oder durch ein spektrales Differenzierungsverfahren festgestellt werden, in welchem das Spektrum von FKBP allein (nach dem Spin-Lock, 1C) vom Spektrum der Verbindung in Anwesenheit von FKBP (auch nach dem Spin-Lock, 1B) abgezogen wird, wodurch sich das Spektrum wie in 1D gezeigt ergibt. Dieses Spektrum enthält nur die Peaks der restlichen Liganden, welche, falls gewünscht, durch Anwendung längerer Spin-Lock-Zeiten weiter in ihrer Intensität vermindert werden können. Dieses Spektrum (1D) wird anschließend vom Spektrum der Test-Verbindung alleine (1A) substrahiert, wodurch sich das Spektrum, wie in 1E gezeigt ergibt. Die positiven Peaks in dem Differenzspektrum korrespondieren mit den chemischen Verschiebungen der Verbindung in Abwesenheit des Ziel-Proteins, wie durch einen Vergleich von 1A mit 1E gezeigt wird, während die negativen Peaks mit den chemischen Verschiebungen der Verbindung korrespondieren, wenn diese an FKBP gebunden ist. Diese Information kann verwendet werden, um die aktive Verbindung zu identifizieren.
Dieselben Experimente können auf eine Mischung der Verbindungen angewendet werden. In diesen Experimenten wurden die Verbindungen 2–9, welche bekanntermaßen nicht an FKBP binden, mit Verbindung 1 kombiniert. 2 zeigt die T₂-gefilterten Spektren der Mischung der Verbindungen in Abwesenheit von FKBP (2A), in Anwesenheit von FKBP (2B) und für FKBP alleine (2C). Das Spektrum in 2D, erhalten durch Substraktion von 2C von 2B, enthält die Resonanzen der Liganden in Anwesenheit des Proteins. Das Spektrum in 2E, erhalten mittels Substraktion von 2D von 2A, enthält positive Peaks, welche mit den Positionen der Resonanzen der Verbindung 1 in Abwesenheit von FKBP korrespondieren, wie im Referenzspektrum in 2F gezeigt. Die in 2E enthaltene Information der chemischen Verschiebung wird nicht nur verwendet, um die Anwesenheit eines an das Protein bindenden Liganden nachzuweisen, sondern kann weiterhin verwendet werden, um festzustellen, welche Verbindung aus der Mischung von Verbindungen bindet, vorausgesetzt, daß eine solche Information der chemischen Verschiebung über die freien Liganden von vornherein bekannt ist.
3 zeigt den gleichen Satz von Experimenten mit einer Mischung der Verbindungen 2–9 allein, die nicht an FKBP binden. Wie in 3E zu sehen ist, werden keine positiven, absorptiven Ligandenresonanzen im Differenzspektrum beobachtet, was darauf hinweist, daß keine Liganden an FKBP binden.
Beispiel 2
Screenen von Verbindungen unter Anwendung der Diffusions-gefilterten Spektroskopie
A. FKBP
Die für die Auswertung der Veränderungen der Diffusionsgeschwindigkeiten potentieller Liganden, in Anwesenheit des Ziel-Moleküls, verwendete Pulssequenz ist die von S. J. Gibbs und C. S. Johnson, Jr., J. Magn. Reson., 93: 395–420 (1991) und A. S. Altieri, et al., J. Am. Chem. Soc., 117: 7566–7567 (1995) beschriebene.
Die vorliegende Erfindung nutzt die Tatsache aus, daß kleine Moleküle in Lösung schneller diffundieren als große Moleküle. Dies ist aus dem Stand der Technik bekannt. Die vorliegende Erfindung nutzt die Tatsache, daß kleine Moleküle, die normalerweise in freier Lösung schneller diffundieren, langsamer diffundieren, wenn sie an ein größeres Ziel-Molekül gebunden sind. Somit werden sich die Diffusionsgeschwindigkeiten des kleinen Moleküls verändern (verringern), wenn dieses an ein Ziel-Molekül gebunden ist.
Die Fähigkeit, die Ligandenbindung unter Verwendung von Diffusionsfiltern zu detektieren, wird für die FKBP-Bindung an Verbindung 1 in 4 gezeigt. Zuerst werden die Diffusions-gefilterten Spektren einer Probe von Verbindung 1 in Anwesenheit von FKBP (4A bzw. 4B) bei schwachen und starken Gradientenstärken aufgezeigt. Diese Spektren werden anschließend voneinander substrahiert, um in 4C gezeigte Spektrum zu erzeugen. Das Spektrum enthält Restligandenresonanzen der Verbindung 1. Dieses Spektrum wird anschließend von einem Referenzspektrum der Verbindung 1 alleine (nach einem schwachen Gradienten, 4D) substrahiert, um ein Spektrum zu ergeben, das die Resonanzen des an das Protein bindenden Liganden enthält (4E). Wie bei dem T₂-gefilterten Experiment korrespondieren die positiven Peaks in 4E mit den chemischen Verschiebungen des Liganden in Abwesenheit von Protein, während die negativen Peaks mit den chemischen Verschiebungen der Verbindung korrespondieren, wenn diese an FKBP gebunden ist. Diese Information kann dazu verwendet werden, die aktive Verbindung zu identifizieren.
Dieselben Experimente können auf eine Mischung von Verbindungen angewendet werden. In diesen Experimenten werden die Verbindungen 2–9, welche bekanntlich nicht an FKBP binden, mit Verbindung 1 kombiniert. 5A und 5B zeigen Spektren der Mischung von Verbindungen in Anwesenheit von FKBP nach schwachen bzw. starken Gradientenstärken. Der Unterschied zwischen diesen Spektren ergibt ein Spektrum (5C). Die Substraktion dieses Spektrums von einem Kontrollspektrum der Mischung von Liganden in Abwesenheit von FKBP (nach einem schwachen Gradienten, 5D) erzeugt ein Spektrum (5E), welches positiven Resonanzen an den chemischen Verschiebungen der Verbindung 1 in Abwesenheit von FKBP (5F) enthält. Die in 5E enthaltene Information der chemischen Verschiebung wird nicht nur verwendet, um die Anwesenheit eines an das Protein bindenden Liganden zu detektieren, sondern kann auch verwendet werden, um festzustellen, welche Verbindung in der Mischung von Verbindungen bindet, unter der Voraussetzung, daß Informationen über die chemische Verschiebung der freien Liganden im Vorfeld bekannt sind.
6 zeigt denselben Satz von Experimenten mit einer Mischung der Verbindungen 2–9 allein, welche nicht an FKBP binden. Wie in 6E gezeigt, werden keine positiven Ligandenresonanzen im Differenzspektrum beobachtet, was darauf hinweist, daß keine Liganden an FKBP binden.
Sämtliche NMR-Spektren wurden bei 300 K auf einem Bruker AMX500 NMR-Spektrometer aufgezeichnet. Alle Spektren wurden mit 256 Abtastungen und einer Protonensweep-Breite von 8333,3 Hz und einer 90 Grad Protonenpulslänge von 7 μs aufgezeichnet. Für die T₂-gefilterten Experimente betrug die Spin-Lock-Zeit 200 ms mit einer Spin-Echo-Zeit von 1 ms. Für die Gradienten-gefilterten Spektren korrespondierten die niedrigen und hohen Gradientenstärken mit 3 bzw. 48 Gauss/cm, und es wurde eine Diffusions-Ver-zö-ge-rungszeit von 300 ms verwendet. In sämtlichen Experimenten betrug die Konzentration jedes Liganden 100 μM, die Konzentration von FKBP betrug 50 μM und der Puffer war 50 mM PO₄, 100 mM NaCl, pH 6,5 (95% D₂O). Die NMR-Daten wurden auf einem Silicon-Graphics-Computer verarbeitet und analysiert.
Die obigen Beispiele stellen keine Einschränkung dar und die vorliegende Erfindung richtet sich auch auf ein Verfahren für das Entwerfen eines Liganden mit hoher Affinität, der die verknüpfte Kombination von mindestens zwei Liganden ist, die in dem oben gezeigten Beispiel gefunden wurden. Tabelle 1

^aDer K_D-Wert für Verbindung 1 wurde aus S. Shuker, et al., Science, 274: 1531–1534 (1996) erhalten, während diejenigen für die Verbindungen 2–9 aufgrund der Abwesenheit der beobachteten Veränderungen der chemischen Verschiebung in ¹⁵N-HSQC-Spektren von FKBP bei Verbindungskonzentrationen von 1,0 mM ermittelt wurden, die in der gleichen Referenz beschrieben sind.

Claims

Ein Verfahren zum Screenen von Verbindungen, um die Anwesenheit von Verbindungen festzustellen, die Liganden sind, welche an ein spezifisches Ziel-Molekül binden, das folgende Schritte umfasst: a) Erzeugen eines ersten eindimensionalen T₂- oder Diffusions-gefilterten NMR-Spektrums einer Verbindung oder einer Mischung von chemischen Verbindungen; b) Aussetzen der Verbindung oder der Mischung von chemischen Verbindungen gegenüber einem Ziel-Molekül: c) Erzeugen eines zweiten eindimensionalen T₂- oder Diffusions-gefilterten NMR-Spektrums von dieser einen Verbindung oder der Mischung von chemischen Verbindungen, wenn sie gegenüber dem Ziel-Molekül in Schritt b) ausgesetzt sind; und d) Vergleichen des ersten und zweiten eindimensionalen T₂- oder Diffusions-gefilterten NMR-Spektrums, um Unterschiede zwischen dem ersten und dem zweiten NMR-Spektrum zu bestimmen, wobei die Unterschiede die Anwesenheit von einer oder mehreren Verbindungen zwischen der einen Verbindung bzw. der Mischung von chemischen Verbindungen feststellen, die Liganden sind, welche an das Ziel-Molekül gebunden haben.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin eine Mischung von chemischen Verbindungen in b) verwendet wird, das weiterhin nach Schritt d) folgende Schritte umfasst: e) Erzeugen eines ersten eindimensionalen T₂- oder Diffusions-gefilterten NMR-Spektrums von jeder Verbindung in der Mischung; f) Aussetzen jeder Verbindung der Mischung einzeln gegenüber dem Ziel-Molekül; g) Erzeugen eines zweiten eindimensionalen T₂- oder Diffusions-gefilterten NMR-Spektrums von jeder Verbindung, wenn sie gegenüber dem Ziel-Molekül in Schritt f) ausgesetzt ist; und h) Vergleichen jeden NMR-Spektrums, das in Schritt g) erzeugt wurde, mit dem ersten NMR-Spektrum, um Unterschiede in irgendeiner dieser verglichenen NMR-Spektren zu bestimmen, wobei die Unterschiede die Anwesenheit einer Verbindung feststellen, die ein Ligand ist, welcher an das Ziel-Molekül gebunden hat.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, das weiterhin den Schritt Binden des Ziel-Moleküls an einen zweiten Liganden vor Schritt a) umfasst.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die gescreenten Verbindungen gewählt sind aus einer Verbindungs-Sammlung von unterschiedlichen kleinen Molekülen.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das Ziel-Molekül gewählt ist aus einem Polypeptid.
Das Verfahren gemäß Anspruch 5, worin das Polypeptid gewählt ist aus einem Enzym oder aus einem Rezeptor.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das Ziel-Molekül gewählt ist aus einer Polynukleinsäure.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das Ziel-Molekül unmarkiert ist.
Ein Verfahren zum Entwerfen eines Liganden mit hoher Affinität für ein Ziel-Molekül, das folgendes umfasst: a) Identifizieren eines ersten Liganden für das Ziel-Molekül unter Verwendung von eindimensionaler T₂- oder Diffusions-gefilterter NMR-Spektroskopie unter Verwendung eines Verfahrens gemäß Anspruch 1; b) Identifizieren von einem oder mehreren zusätzlichen Liganden für das Ziel-Molekül unter Verwendung von eindimensionaler T₂- oder Diffusions-gefilterter NMR-Spektroskopie; c) Bilden eines Komplexes zwischen dem ersten identifizierten Liganden und dem einen oder den mehreren zusätzlichen identifizierten Liganden mit dem Ziel-Molekül; d) Bestimmen der dreidimensionalen Struktur von mindestens einem Teil des Komplexes, worin der erste und einer oder mehrere zusätzliche Liganden an das Ziel-Molekül binden und somit Bestimmen der räumlichen Orientierung des ersten und eines oder mehrerer zusätzlicher Liganden auf dem Ziel-Molekül; und e) Verknüpfen des ersten und des einen oder der mehreren zusätzlichen Liganden, um die räumliche Orientierung, die in Schritt d) bestimmt wurde, aufrecht zu erhalten, um den Liganden mit hoher Affinität zu bilden.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 9, worin das Ziel-Molekül aus einem Polypeptid gewählt ist.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 9, worin das Ziel-Molekül unmarkiert ist.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 9, worin der Ligand und einer oder mehrere zusätzliche Liganden zusammen durch eine konvergente oder lineare organische Synthese verknüpft werden, um einen Liganden mit hoher Affinität zu bilden.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 9, worin der Ligand mit hoher Affinität ein pharmazeutisch wirksamer Anteil ist.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 9, worin der erste und der eine oder die mehreren zusätzlichen Liganden aus einem Pool von verschiedenen kleinen Molekülen gewählt sind.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 14, worin die kleinen Moleküle aus einer Verbindungs-Sammlung gewählt sind.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 9, worin der Komplex durch Kombinieren des ersten und des einen oder der mehreren zusätzlichen Liganden mit dem Ziel-Molekül in Lösung gebildet wird.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 16, worin der in Lösung gebildete Komplex ähnlich oder identisch ist mit dem Komplex, der zwischen dem Liganden oder einem oder mehreren zusätzlichen Liganden unter physiologischen Bedingungen gebildet wurde.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, das weiterhin folgende Schritte umfasst: e) Verwenden des Vergleichs, um bei der Identifizierung einer chemischen Verbindung zu helfen, welche ein Ligand für das Ziel-Molekül ist, und f) Herstellen der Verbindung.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 9, das weiterhin vor Schritt a) einen Schritt Auswählen eines Ziel-Moleküls umfasst, und nach Schritt e) einen Schritt Herstellen einer chemischen Verbindung, deren Struktur diejenige ist, welche durch Verknüpfen des ersten und des zusätzlichen identifizierten Liganden erhalten wurde, in einer Art und Weise, dass die räumliche Orientierung, die in Schritt d) bestimmt wurde, aufrecht erhalten wird.
Das Verfahren gemäß Anspruch 18 oder Anspruch 19, worin das Ziel-Molekül ein Polypeptid ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 20, worin das Polypeptid ein Molekulargewicht größer als 5 kDa hat.