DE69613146T3

DE69613146T3 - Verwendung von kernspinresonanz zur bestimmung von liganden für zielbiomoleküle

Info

Publication number: DE69613146T3
Application number: DE69613146T
Authority: DE
Inventors: W. Stephen FESIK; J. Philip HAJDUK; T. Edward OLEJNICZAK
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1995-11-14
Filing date: 1996-11-13
Publication date: 2007-06-14
Anticipated expiration: 2016-11-14
Also published as: WO1997018469A3; ES2159056T5; ES2159056T3; DE69613146D1; AU7680496A; EP0870197B1; PT870197E; ATE201768T1; IL123572A0; MX9803805A; EP0870197B2; WO1997018469A2; DK0870197T4; EP0870197A2; DK0870197T3; GR3036454T3; JP3300366B2; IL123572A; DE69613146T2; AU711092B2

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für die Verwendung einer zweidimensionalen ¹⁵N/¹H-NMR-Korrelationsspektralanalyse zur Gestaltung von Liganden, die an ein Zielbiomolekül binden.
Hintergrund der Erfindung
Eines der leistungsfähigsten Werkzeuge zum Entdecken neuer Leitsubstanzen für Arzneistoffe, sog. Drug-leads, ist Zufalls-Screening synthetischer chemischer und naturlicher Produktdatenbanken zum Aufdecken von Verbindungen, die an ein bestimmtes Zielmolekül binden (d.h. die Identifikation von Liganden für dieses Ziel). Unter Verwendung dieses Verfahrens können Liganden durch ihre Fähigkeit identifiziert werden, eine physikalische Assoziation mit einem Zielmolekül zu bilden, oder durch ihre Fähigkeit, eine Funktion eines Zielmoleküls zu verändern.
Wenn physikalische Bindung gesucht wird, wird ein Zielmolekül normalerweise einer oder mehreren Verbindungen ausgesetzt, von denen angenommen wird, dass sie Liganden sind, und Assays werden durchgeführt, um zu bestimmen, ob sich Komplexe zwischen dem Zielmolekül und einer oder mehrerer dieser Verbindungen gebildet haben. Wie auf dem Gebiet gut bekannt ist, prüfen solche Assays auf grobe Veränderungen in dem Zielmolekül (z.B. Änderungen von Größe, Ladung, Mobilität), die eine Komplexbildung anzeigen.
Wo funktionale Veränderungen gemessen werden, sind Assaybedingungen etabliert, die die Messung eines biologischen oder chemischen Ereignisses in Bezug auf das Zielmolekül ermöglichen (z.B. enzymkatalysierte Reaktion, rezeptorvermittelte Enzymaktivierung). Um eine Veränderung zu identifizieren, wird die Funktion des Zielmoleküls bestimmt, bevor und nachdem sie der Testverbindung ausgesetzt wurde.
Gegenwärtige physikalische und funktionelle Assays wurden erfolgreich verwendet, um neue Leitsubstanzen für Arzneistoffe für die Verwendung bei der Gestaltung therapeutischer Verbindungen zu identifizieren. Es gibt jedoch Einschränkungen, die diesen Assays innewohnen, wodurch deren Genauigkeit, Zuverlässigkeit und Wirksamkeit beeinträchtigt wird.
Eine bedeutende Unzulänglichkeit gegenwärtiger Assays betrifft das Problem "falscher positiver Ergebnisse". In einem typischen Funktionsassay ist ein "falsches positives Ergebnis" eine Verbindung, die den Assay auslöst, die jedoch unwirksam beim Hervorrufen der gewünschten physiologischen Response ist. In einem typischen physikalischen Assay ist ein "falsches positives Ergebnis" eine Verbindung, die sich zum Beispiel selbst an das Ziel anlagert, jedoch auf eine unspezifische Weise (z.B. unspezifische Bindung). Falsche positive Ergebnisse sind insbesondere beim Screening hoher Konzentrationen möglicher Liganden weit verbreitet und problematisch, da viele Verbindungen bei diesen Konzentrationen unspezifische Wirkungen zeigen.
Auf ähnliche Weise werden gegenwärtige Assays von dem Problem "falscher negativer Ergebnisse" heimgesucht, das auftritt, wenn eine Verbindung eine negative Response in dem Test auslöst, jedoch tatsächlich ein Ligand für das Ziel ist. Falsche negative Ergebnisse tauchen typischerweise in Assays auf, die Konzentrationen von Testverbindungen verwenden, die entweder zu hoch sind (was zu Toxizität führt) oder zu gering sind bezüglich der Bindungs- oder Dissoziationskonstante der Verbindung für das Ziel.
Eine andere bedeutende Unzulänglichkeit gegenwärtiger Assays ist der begrenzte Informationswert, den der Assay selbst liefert. Während der Assay Verbindungen, die an das Zielmolekül binden oder eine Response von dem Zielmolekül hervorbringen, möglicherweise genau identifizieren kann, liefern solche Assays typischerweise keine Informationen entweder über spezifische Bindungsstellen auf dem Zielmolekül oder über Struktur-Wirksamkeits-Beziehungen zwischen der überprüften Verbindung und dem Zielmolekül. Die Unfähigkeit, solche Informationen zu liefern, ist insbesondere problematisch, wenn der Sreening-Assay dazu verwendet wird, Leitsubstanzen für weitere Untersuchungen zu identifizieren.
Es wurde in jüngster Zeit vorgeschlagen, dass Röntgenkristallographie verwendet werden kann, um die Bindungsstellen organischer Lösungsmittel an Makromolekülen zu identifizieren. Dieses Verfahren kann jedoch nicht die relative Bindungsaffinitäten an unterschiedliche Stellen auf dem Ziel bestimmen. Es ist nur auf sehr stabile Zielproteine anwendbar, die in Gegenwart hoher Konzentrationen organischer Lösungsmittel nicht denaturieren. Außerdem ist dieser Ansatz kein Screening-Verfahren zum schnellen Überprüfen vieler Verbindungen, die chemisch verschieden sind, sondern beschränkt sich wegen der langen Zeit, die zum Bestimmen der einzelnen Kristallstrukturen benötigt wird, auf die Kartierung der Bindungsstellen von nur wenigen Lösungsmitteln.
Verbindungen werden gescreent, um Leitsubstanzen zu identifizieren, die verwendet werden können bei der Gestaltung neuer Arzneistoffe, die die Funktion des Zielbiomoleküls verändern. Solche neuen Arzneistoffe können Strukturanaloga identifizierter Leitsubstanzen sein, oder sie können Konjugate einer oder mehrerer solcher Leitsubstanzverbindungen sein. Wegen der Probleme, die gegenwärtigen Screening-Verfahren innewohnen, sind diese Verfahren oftmals wenig hilfreich bei der Gestaltung neuer Arzneistoffe.
Fesik, S. W. et al., Biochemical Pharmacology, 40, Seite 161-167 (1990), geben die Verwendung multidimensionaler NMR-Spektroskopie zur Bestimmung dreidimensionaler Strukturen von Enzym-Inhibitor-Komplexen als ein Hilfsmittel bei der Gestaltung von Arzneistoffen bekannt. Meadows, R. P. et al., Biochemistry, 32, Seite 754-765 (1993) offenbaren die Verwendung multidimensionaler heteronuklearer NMR-Spektroskopie zur Bestimmung dreidimensionaler Strukturen von Protein-Ligand-Komplexen. Es wird vorgeschlagen, dass die aufgelöste Struktur bei der Aufdeckung von Liganden mit gesteigerter biologischer Aktivität behilflich sein könnte. WO 91/10140 offenbart die Verwendung multidimensionaler homonuklearer NMR-Spektroskopie zum Modellieren dreidimensionaler Strukturen von Liganden in einem biologischen Ligand-Rezeptor-Komplex. Dieses Dokument offenbart, dass die aufgelöste Ligandenstruktur verwendet werden kann, um Nachahmungsliganden zu gestalten.
Es besteht weiterhin ein Bedürfnis, neue, schnelle, wirksame, genaue und zuverlässige Mittel zum Screenen von Verbindungen bereitzustellen, um Liganden zu identifizieren und zu gestalten, die spezifisch an ein bestimmtes Zielmolekül binden.
Kurze Zusammenfassung der Erfindung
In ihrem Hauptaspekt liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Gestaltung und Identifikation von Verbindungen, die an ein bestimmtes Zielbiomolekül binden. Dieses Verfahren umfasst die Schritte: a) Identifizieren eines ersten Liganden für das Zielmolekül unter Verwendung zweidimensionaler ¹⁵N/¹H-NMR-Korrelationsspektroskopie; b) Identifizieren eines zweiten Liganden für das Zielmolekül unter Verwendung zweidimensionaler ¹⁵N/¹H-NMR-Korrelationsspektroskopie; c) Bilden eines ternären Komplexes durch Binden des ersten und zweiten Liganden an das Zielmolekül; d) Bestimmen der dreidimensionalen Struktur des ternären Komplexes und somit der räumlichen Anordnung des ersten und zweiten Liganden auf dem Zielmolekül; e) Verbinden des ersten und zweiten Liganden, um den Arzneistoff zu bilden, worin die räumliche Anordnung von Schritt (d) beibehalten wird.
Diese Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung verwendet das wie unten dargestellte zweidimensionale ¹⁵N/¹H-NMR korrelationsspektroskopische Screening-Verfahren, um einen ersten und einen nachfolgenden Liganden zu bestimmen, der an das Zielmolekül bindet. Ein Komplex aus dem Zielmolekül und zwei oder mehr Liganden wird gebildet, und die dreidimensionale Struktur dieses Komplexes wird vorzugsweise unter Verwendung von NMR-Spektroskopie oder Röntgenkristallographie bestimmt. Diese dreidimensionale Struktur wird verwendet, um die räumliche Anordnung der Liganden zueinander und bezüglich des Zielmoleküls zu bestimmen.
Auf der Basis der räumlichen Anordnung werden die Liganden miteinander verbunden, um einen Arzneistoff zu bilden. Die Auswah1 einer geeigneten Bindungsgruppe wird unter Beibehalten der räumlichen Anordnung der Liganden zueinander und zu dem Zielmolekül auf der Grundlage von Bindungswinkel- und Bindungslängeninformationen, die auf dem Gebiet der organischen Chemie gut bekannt sind, erreicht.
Somit umfasst die Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung zur Molekülgestaltung Identifizieren einer ersten Ligandenkomponente für das Zielmolekül unter Verwendung zweidimensionaler ¹⁵N/¹H-NMR-Korrelationsspektroskopie; Identifizieren nachfolgender Ligandenkomponenten für das Zielmolekül unter Verwendung zweidimensionaler ¹⁵N/¹H-NMR-Korrelationsspektroskopie; Bilden eines Komplexes aus der ersten und nachfolgenden Ligandenkomponenten und dem Zielmolekül; Bestimmen der dreidimensionalen Struktur des Komplexes und somit der räumlichen Anordnung der ersten und nachfolgenden Ligandenkomponenten auf dem Zielmolekül; und Verbinden der ersten und nachfolgenden Ligandenkomponenten, um den Arzneistoff zu bilden und um die räumliche Anordnung der Ligandenkomponenten beizubehalten.
Die Identifikation nachfolgender Ligandenkomponenten kann in Abwesenheit oder Gegenwart des ersten Liganden durchgeführt werden (z.B. kann das Zielmolekül an den ersten Liganden gebunden werden, bevor es den Testverbindungen zur Identifikation des zweiten Liganden ausgesetzt wird.) Chemische Verbindungen können auf Bindung an ein gegebenes Zielbiomolekül durch ein Verfahren gescreent werden, das folgende Schritte umfasst: a) zuerst Erzeugen eines ersten zweidimensionalen ¹⁵N/¹H-NMR-Korrelationsspektrums eines ¹⁵N-markierten Zielmoleküls; b) Aussetzen des markierten Zielmoleküls gegenüber einer chemischen Verbindung oder einem Gemisch chemischer Verbindungen; c) als nächstes Erzeugen eines zweiten zweidimensionalen ¹⁵N/¹H-NMR-Korrelationsspektrums des markierten Zielmoleküls, das einer Verbindung oder einem Gemisch aus Verbindungen in Schritt (b) ausgesetzt wurde; und d) Vergleichen des ersten und zweiten zweidimensionalen ¹⁵N/¹H-NMR-Korrelationsspektrums, um Unterschiede zwischen dem ersten und dem zweiten Spektrum zu bestimmen, wobei die Unterschiede die Gegenwart einer oder mehrerer Verbindungen anzeigen, die Liganden sind, die sich an das Zielmolekül gebunden haben.
Wenn das Verfahren mehr als eine Verbindung in Schritt (b) screent, d.h. ein Gemisch von Verbindungen, und wenn ein Unterschied zwischen dem ersten Spektrum, das von dem Zielmolekül allein erzeugt wurde, und dem Spektrum von dem Zielmolekül in Gegenwart des Gemischs besteht, werden weitere Schritte durchgeführt, um zu identifizieren, welche spezifische Verbindung oder Verbindungen, die in dem Gemisch enthalten waren, an das Zielmolekül binden. Diese weiteren Schritte umfassen die Schritte e) Aussetzen des ¹⁵N-markierten Zielmoleküls einzeln gegenüber jeder Verbindung des Gemischs; f) Erzeugen eines zweidimensionalen ¹⁵N/¹H-NMR-Korrelationsspektrums des markierten Zielmoleküls, das einzeln jeder Komponente ausgesetzt wurde; und g) Vergleichen jedes in Schritt (f) erzeugten Spektrums mit dem ersten Spektrum, das von dem Zielmolekül allein erzeugt wurde, um Unterschiede in diesen einzelnen verglichenen Spektren zu bestimmen, wobei die Unterschiede die Gegenwart einer Verbindung anzeigen, die ein Ligand ist, der sich an das Zielmolekül gebunden hat.
Da die chemischen Verschiebungswerte der einzelnen ¹⁵N/¹H-Signale in dem zweidimensionalen Korrelationsspektrum bekannten spezifischen Positionen von Atomgruppierungen in dem Zielmolekül entsprechen (z.B. den N-H-Atomen der Amid- oder Peptidverbindung eines bestimmten Aminosäurerestes in einem Polypeptid), ermöglicht das Screening-Verfahren nicht nur die Identifikation, welche Verbindung(en) an ein bestimmtes Zielmolekül binden, sondern auch die Bestimmung der einzelnen Bindungsstelle des Liganden auf dem Zielmolekül.
Die Dissoziationskonstante K_D für einen bestimmten Liganden und dessen Zielmolekül kann, falls erwünscht, durch dieses Verfahren bestimmt werden durch Ausführen der Schritte a) Erzeugen eines ersten zweidimensionalen ¹⁵N/¹H-NMR-Korrelationsspektrums eines ¹⁵N-markierten Zielmoleküls; b) Aussetzen des markierten Zielmoleküls gegenüber verschiedenen Konzentrationen eines Liganden; c) Erzeugen eines zweidimensionalen ¹⁵N/¹H-NMR-Korrelationsspektrums bei jeder Ligandenkonzentration in Schritt (b); d) Vergleichen jedes Spektrums von Schritt (c) mit dem ersten Spektrum von Schritt (a); und e) Berechnen der Dissoziationskonstante zwischen dem Zielmolekül und dem Liganden aus diesen Unterschieden nach der Formel:
Eine vorteilhafte Eigenschaft des Screening-Verfahrens ist die Fähigkeit, die Dissoziationskonstante eines Liganden des Zielmoleküls in Gegenwart eines zweiten Moleküls zu bestimmen, das bereits an den Liganden gebunden ist. Das ist allgemein nicht möglich mit Verfahren nach dem Stand der Technik, die "nasschemische" Analyseverfahren zur Bestimmung der Bindung eines Liganden an ein Zielmolekülsubstrat verwenden.
Das Verfahren zum Bestimmen der Dissoziationskonstante eines Liganden kann in Gegenwart eines zweiten gebundenen Liganden durchgeführt werden. Entsprechend wird das ¹⁵N-markierte Zielmolekül an den zweiten Liganden gebunden, bevor dieses Ziel den Testverbindungen ausgesetzt wird.
Die Fähigkeit des Screening-Verfahrens, nicht nur das Vorhandensein einer Bindung zwischen einem Liganden und dem Zielmolekül zu bestimmen, sondern auch die jeweilige Stelle der Bindung in Gegenwart eines zweiten gebundenen Liganden, verleiht die Fähigkeit, einen Arzneistoff zu gestalten, der zwei oder mehr verbundene Komponenten umfasst, die von den Liganden gebildet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Zielmolekül, das in dem Molekülgestaltungsverfahren verwendet wird, ein Polypeptid. Das Polypeptidziel wird vorzugsweise in rekombinanter Form von einer Wirtszelle hergestellt, die mit einem Expressionsvektor transformiert wurde, der ein Polynucleotid enthält, das das Polypeptid codiert, durch Kultivieren der transformierten Wirtszelle in einem Medium, das eine assimilierbare Quelle für ¹⁵N enthält, so dass das rekombinant hergestellte Polypeptid mit ¹⁵N markiert ist.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
In den Zeichnungen, die einen Teil der Beschreibung bilden, ist folgendes dargestellt:
1 zeigt ein ¹⁵N/¹H-NMR-Korrelationsspektrum der DNA-Bindungsdomäne von einheitlich ¹⁵N-markiertem humanen Papillomavirus E2. Das Spektrum (80 Komplexpunkte, 4 Abtastungen/FID) wurde ermittelt an einer 0,5-mM-Probe von E2 in 2 mM Phosphat (pH 6,5), 10 mM Dithiothreitol (DTT) und 10% Deuteriumoxid (D₂O).
2 zeigt ¹⁵N/¹H-NMR-Korrelationsspektren der DNA-Bindungsdomäne von einheitlich ¹⁵N-markiertem humanen Papillomavirus E2 vor (mehrere dünne Konturlinien) und nach (eine dicke Konturlinie) der Zugabe einer finalen Testverbindung. Die Endkonzentration der Verbindung betrugt 1,0 mM. Alle anderen Bedingungen sind wie in 1 angegeben. Ausgewählte Reste, die signifikante Veränderungen auf die Bindung zeigen, sind gekennzeichnet.
3 zeigt ¹⁵N/¹H-NMR-Korrelationsspektren der DNA-Bindungsdomäne von einheitlich ¹⁵N-markiertem humanen Papillomavirus E2 vor (mehrere dünne Konturlinien) und nach (eine dicke Konturlinie) der Zugabe einer zweiten Testverbindung. Die Endkonzentration der Verbindung betrugt 1,0 mM. Alle anderen Bedingungen sind wie in 1 angegeben. Ausgewählte Reste, die signifikante Veränderungen auf die Bindung zeigen, sind gekennzeichnet.
4 zeigt ¹⁵N/¹H-NMR-Korrelationsspektren der katalytischen Domäne von einheitlich ¹⁵N-markiertem Stromelysin vor (mehrere dünne Konturlinien) und nach (eine dicke Konturlinie) der Zugabe einer Testverbindung. Die Endkonzentration der Verbindung betrugt 1,0 mM. Die Spektren (80 Komplexpunkte, 8 Abtastungen/FID) wurden ermittelt an einer 0,3-mM-Probe von SCD in 20 mM TRIS (pH 7,0), 20 mM CaCl₂ und 10% D₂O. Ausgewählte Reste, die signifikante Veränderungen auf die Bindung zeigen, sind gekennzeichnet.
5 zeigt ¹⁵N/¹H-NMR-Korrelationsspektren der Ras- Bindungsdomäne von einheitlich ¹⁵N-markiertem RAF-Peptid (Reste 55-132) vor (mehrere dünne Konturlinien) und nach (eine dicke Konturlinie) der Zugabe einer Testverbindung. Die Endkonzentration der Verbindung betrugt 1,0 mM. Die Spektren (80 Komplexpunkte, 8 Abtastungen/FID) wurden ermittelt an einer 0,3-mM-Probe des RAF-Fragmentes in 20 mM Phosphat (pH 7,0), 10 mM DTT und 10% D₂O. Ausgewählte Reste, die signifikante Veränderungen auf die Bindung zeigen, sind gekennzeichnet.
6 zeigt ¹⁵N/¹H-NMR-Korrelationsspektren von einheitlich ¹⁵N-markiertem FKBP vor (mehrere dünne Konturlinien) und nach (eine dicke Konturlinie) der Zugabe einer Testverbindung. Die Endkonzentration der Verbindung betrugt 1,0 mM. Die Spektren (80 Komplexpunkte, 4 Abtastungen/FID) wurden ermittelt an einer 0,3-mM-Probe von FKBP in 50 mM Phosphat (pH 6,5), 100 mM NaCh und 10% D₂O. Ausgewählte Reste, die signifikante Veränderungen auf die Bindung zeigen, sind gekennzeichnet.
7 zeigt eine erste Darstellung der NMR-abgeleiteten Struktur der DNA-Bindungsdomäne von E2. Die beiden Monomere des symmetrischen Dimers sind übereinander angeordnet, und die N- und C-Termini jedes Monomers sind gekennzeichnet (N und C für das eine Monomer, N* und C* für das andere). Als Bänder sind die Reste angezeigt, die signifikante Änderungen der chemischen Verschiebung (Dd(¹H) > 0,04 ppm; Dd(¹⁵N) > 0,1 ppm) auf die Bindung an eine erste Testverbindung aufweisen. Diese Reste korrespondieren mit der DNA-Erkennungshelix von E2. Ausgewählte Reste sind als Hilfe für die Sichtbarmachung nummeriert.
8 zeigt eine zweite Darstellung der NMR-abgeleiteten Struktur der DNA-Bindungsdomäne von E2. Die beiden Monomere des symmetrischen Dimers sind übereinander angeordnet, und die N- und C-Termini jedes Monomers sind gekennzeichnet (N und C für das eine Monomer, N* und C* für das andere). Als Bänder sind die Reste angezeigt, die signifikante Änderungen der chemischen Verschiebung (Dd(¹H) > 0,04 ppm; Dd(¹⁵N) > 0,1 ppm) auf die Bindung an eine zweite Testverbindung aufweisen. Diese Reste befinden sich in erster Linie in der Dimer-Grenzflächenregion. Ausgewählte Reste sind als Hilfe für die Sichtbarmachung nummeriert.
9 zeigt eine Darstellung der NMR-abgeleiteten Struktur der katalytischen Domäne von Stromelysin. Die N- und C-Termini sind gekennzeichnet. Als Bänder sind die Reste angezeigt, die signifikante Änderungen der chemischen Verschiebung (Dd(¹H) > 0,04 ppm; Dd(¹⁵N) > 0,1 ppm) auf die Bindung an eine Testverbindung aufweisen. Diese bilden entweder einen Teil die S1'-Bindungsstelle oder sind räumlich nahe an dieser Stelle. Ausgewählte Reste sind als Hilfe für die Sichtbarmachung nummeriert.
10 zeigt ein Banddiagramm eines ternären Komplexes aus erstem und zweitem Liganden, die an die katalytische Domäne von Stromelysin gebunden sind.
11 zeigt die Korrelation zwischen den NMR-Bindungsdaten und eine Ansicht der NMR-abgeleiteten dreidimensionalen Struktur von FKBP.
12 zeigt ein Banddiagramm eines ternären Komplexes, der FKBP, ein Fragment-Analog von Ascomycin und eine Benzanilidverbindung umfasst.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein schnelles und wirksames Verfahren zur Gestaltung von Liganden bereit, die an therapeutische Zielmoleküle binden.
Liganden werden durch Testen der Bindung von Molekülen an ein Zielmolekül (z.B. Protein oder Nucleinsäure) identifiziert, indem mit kernmagnetischer Resonanz(NMR)-Spektroskopie die Änderungen von chemischen Verschiebungen des Zielmoleküls auf die Zugabe der Ligandenverbindungen in der Datenbank verfolgt werden.
Durch eine Analyse der Änderungen der chemischen Verschiebung des Zielmoleküls als eine Funktion der Ligandenkonzentration werden außerdem die Bindungsaffinitäten von Liganden für Biomoleküle bestimmt.
Die Position der Bindungsstelle für jeden Liganden wird durch eine Analyse der chemischen Verschiebungen des Biomoleküls bestimmt, die sich durch die Zugabe des Liganden und durch Kern-Overhauser-Effekte (NOE) zwischen dem Liganden und dem Biomolekül ändern.
Informationen über die Struktur-/Wirksamkeits-Beziehungen zwischen Liganden, die durch solch ein Verfahren identifiziert wurden, können verwendet werden, um neue Arzneistoffe zu gestalten, die als Liganden für das Zielmolekül dienen. Wenn zum Beispiel zwei oder mehr Liganden für ein gegebenes Zielmolekül identifiziert sind, wird ein Komplex aus diesen Liganden und dem Zielmolekül gebildet. Die räumliche Anordnung der Liganden zueinander sowie zu dem Zielmolekül wird aus der dreidimensionalen Struktur abgeleitet. Diese räumliche Anordnung definiert den Abstand zwischen den Bindungsstellen der zwei Liganden und die Anordnung jedes Liganden zu diesen Stellen.
Unter Verwendung dieser räumlichen Anordnungsdaten werden die zwei oder mehr Liganden miteinander verbunden, um einen neuen Liganden zu bilden. Die Verbindung wird auf eine Weise erreicht, bei der die räumliche Anordnung der Liganden zueinander und zu dem Zielmolekül beibehalten wird.
Es gibt zahlreiche Vorteile für die NMR-basierten Entdeckungs- und Gestaltungsverfahren der vorliegenden Erfindung. Erstens wird das Problem falscher positiver Ergebnisse signifikant verringert, da ein Verfahren der vorliegenden Erfindung Liganden durch direkte Messung von Bindung an das Zielmolekül identifiziert. Da das vorliegende Verfahren spezifische Bindungsstellen auf dem Zielmolekül identifiziert, wird das Problem falscher positiver Ergebnisse, das aus der unspezifischen Bindung von Verbindungen an das Zielmolekül bei hohen Konzentrationen resultiert, beseitigt.
Zweitens wird das Problem falscher negativer Ergebnisse signifikant verringert, da das vorliegende Verfahren Verbindungen identifizieren kann, die an das Zielmolekül in einem weiten Bereich an Dissoziationskonstanten spezifisch binden. Die Dissoziations- oder Bindungskonstante für Verbindungen kann tatsächlich mit dem vorliegenden Verfahren bestimmt werden.
Andere Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der Vielzahl und der Genauigkeit der Daten, die zu jedem Liganden mit den Entdeckungs- und Gestaltungsverfahren bereitgestellt werden.
Da die Position des gebundenen Liganden aus einer Analyse der chemischen Verschiebungen des Zielmoleküls, die sich durch die Zugabe des Liganden und durch Kern-Overhauser-Effekte (NOE) zwischen dem Liganden und dem Biomolekül ändern, bestimmt werden kann, kann die Bindung eines zweiten Liganden in Gegenwart eines ersten Liganden, der bereits an das Ziel gebunden ist, gemessen werden. Die Fähigkeit, Bindungsstellen unterschiedlicher Liganden gleichzeitig zu identifizieren, ermöglicht es einem Fachmann, 1) negative und positive kooperative Bindung zwischen Liganden zu definieren, und 2) neue Arzneistoffe durch Verbinden von zwei oder mehr Liganden zu einer einzigen Verbindung unter Beibehaltung einer richtigen Anordnung der Liganden zueinander und zu ihren Bindungsstellen zu gestalten.
Ferner kann, wenn mehrere Bindungsstellen vorhanden sind, die relative Affinität einzelner Bindungskomponenten für die unterschiedlichen Bindungsstellen aus einer Analyse der Änderungen der chemischen Verschiebung des Zielmoleküls als eine Funktion der zugesetzten Konzentration des Liganden gemessen werden. Durch gleichzeitiges Screenen zahlreicher Strukturanaloga einer bestimmten Verbindung werden detaillierte Struktur-/Wirksamkeits-Beziehungen über Liganden bereitgestellt. Teilweise stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Screenen von Verbindungen bereit, um Liganden zu identifizieren, die an ein bestimmtes Zielmolekül binden. Das Verfahren umfasst die Schritte: a) Erzeugen eines ersten zweidimensionalen ¹⁵N/¹H-NMR-Korrelationsspektrums eines ¹⁵N-markierten Zielmoleküls; b) Aussetzen des markierten Zielmoleküls gegenüber einer oder mehreren chemischen Verbindungen; c) Erzeugen eines zweiten zweidimensionalen ¹⁵N/¹H-NMR-Korrelationsspektrums des markierten Zielmoleküls, das den Verbindungen von Schritt (b) ausgesetzt wurde; und d) Vergleichen des ersten und zweiten Spektrums, um zu bestimmen, ob Unterschiede in diesen zwei Spektren vorhanden sind, wobei diese Unterschiede die Gegenwart eines oder mehrerer Liganden anzeigen, die sich an das Zielmolekül gebunden haben. Wenn ein Verfahren der vorliegenden Erfindung mehr als eine Verbindung in Schritt (b) screent, und wenn ein Unterschied zwischen Spektren beobachtet wird, werden zusätzliche Schritte durchgeführt, um zu identifizieren, welche spezifische Verbindung an das Zielmolekül bindet. Diese zusätzlichen Schritte umfassen das Erzeugen eines zweidimensionalen ¹⁵N/¹H-NMR-Korrelationsspektrums für jede einzelne Verbindung und Vergleichen jedes Spektrums mit dem ersten Spektrum, um zu bestimmen, ob es in einem dieser verglichenen Spektren Unterschiede gibt, wobei die Unterschiede die Gegenwart eines Liganden anzeigen, der sich an das Zielmolekül gebunden hat.
Jedes ¹⁵N-markierte Zielmolekül kann in einem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Wegen der Bedeutung von Proteinen in der medizinischen Chemie ist ein bevorzugtes Zielmolekül ein Polypeptid. Das Zielmolekül kann mit ¹⁵N markiert werden unter Verwendung aller Mittel, die auf dem Gebiet bekannt sind. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Zielmolekül in rekombinanter Form unter Verwendung transformierter Wirtszellen hergestellt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Zielmolekül ein Polypeptid. Jedes Polypeptid, das ein hochauslösendes NMR-Spektrum ergibt und teilweise oder einheitlich mit ¹⁵N markiert werden kann, kann verwendet werden. Die Herstellung einheitlich ¹⁵N-markierter beispielhafter Polypeptid-Zielmoleküle wird nachfolgend in den Beispielen dargelegt.
Ein bevorzugtes Mittel zur Herstellung geeigneter Mengen einheitlich ¹⁵N-markierter Polypeptide besteht darin, eine Wirtszelle mit einem Expressionsvektor, der ein Polynucleotid enthält, das dieses Polypeptid codiert, zu transformieren, und die transformierte Zelle in einem Kulturmedium zu kultivieren, die assimilierbare Quellen für ¹⁵N enthält. Assimilierbare Quellen für ¹⁵N sind auf dem Gebiet gut bekannt. Eine bevorzugte Quelle ist ¹⁵NH₄Cl.
Mittel zur Herstellung von Expressionsvektoren, die Polynucleotide enthalten, die bestimmte Polypeptide codieren, sind auf dem Gebiet gut bekannt. Auf ähnliche Weise sind Mittel zum Transformieren von Wirtszellen mit solchen Vektoren und Mittel zum Kultivieren solcher transformierter Zellen, so dass das Polypeptid exprimiert wird, ebenfalls auf dem Gebiet gut bekannt.
Das Screening-Verfahren beginnt mit der Erzeugung oder Erfassung eines zweidimensionalen ¹⁵N/¹H-Korrelationsspektrums des markierten Zielmoleküls. Mittel zum Erzeugen zweidimensionaler ¹⁵N/¹H-Korrelationsspektren sind auf dem Gebiet gut bekannt [Siehe z.B. D. A. Egan et al., Biochemistry, 32:8, Seite 1920-1927 (1993); Bax, A., Grzesiek, S., Acc. Chem. Res., 26:4, Seite 131-138 (1993)].
Die NMR-Spektren, die typischerweise in der Screening-Prozedur der vorliegenden Erfindung aufgezeichnet werden, sind zweidimensionale ¹⁵N/¹H Heteronuclear-Single- Quantum-Correlation(HSQC)-Spektren. Da die ¹⁵N/¹H-Signale, die den Hauptkettenamiden der Proteine entsprechen, normalerweise gut aufgelöst sind, werden die Änderungen der chemischen Verschiebung für die einzelnen Amide schnell angezeigt.
Beim Erzeugen solcher Spektren wird das große Wassersignal durch Spoiling-Gradienten unterdrückt. Um die Erfassung von NMR-Daten für eine große Zahl von Verbindungen (z.B. eine Datenbank synthetischer oder natürlich vorkommender kleiner organischer Verbindungen) zu erleichtern, wird ein Probenwechsler verwendet. Unter Verwendung des Probenwechslers können insgesamt 60 Proben unbeaufsichtigt ausgeführt werden. Somit können unter Verwendung der typischen Erfassungsparameter (4 Abtastungen pro freiem Induktionszerfall (FID)), 100-120 HSQC-Spektren innerhalb von 24 Stunden erfasst werden.
Um die Verarbeitung der NMR-Daten zu erleichtern, werden Computerprogramme verwendet, um die vielen zweidimensionalen NMR-Datensätze zu übertragen und automatisch zu verarbeiten, einschließlich einer Routine zum automatischen Synchronisieren der zweidimensionale NMR-Daten. Die Analyse der Daten kann erleichtert werden durch Formatieren der Daten, so dass die einzelnen HSQC-Spektren schnell angezeigt und mit dem HSQC-Spektrum der Kontrollprobe, die nur das Bindemittel für die zugesetzte Verbindung (DMSO), jedoch keine zugesetzte Verbindung enthält, verglichen werden. Ausführliche Beschreibungen der Mittel zum Erzeugen solcher zweidimensionaler ¹⁵N/¹H-Korrelationsspektren werden nachfolgend in den Beispielen dargelegt.
Ein repräsentatives zweidimensionales¹⁵N/¹H-NMR-Korrelationsspektrum eines ¹⁵N-markierten Zielmoleküls (Polypeptid) ist in 1 dargestellt (die DNA-Bindungsdomäne des Proteins E2).
Nach der Erfassung des ersten Spektrums wird das markierte Zielmolekül einer oder mehreren Testverbindungen ausgesetzt. Wenn mehr als eine Testverbindung gleichzeitig untersucht werden soll, wird vorzugsweise eine Datenbank von Verbindungen verwendet, z.B. eine Vielzahl kleiner Moleküle. Solche Moleküle sind typischerweise in perdeuteriertem Dimethylsulfoxid gelöst. Die Verbindungen in der Datenbank können von Händlern gekauft oder je nach Bedarf erzeugt werden.
Einzelne Verbindungen können unter anderem auf der Basis Größe (Molekulargewicht=100-300) und Moleküldiversität ausgewählt werden. Verbindungen in der Sammlung können unterschiedliche Formen haben (z.B. ebene aromatische Ringe, nicht ebene aliphatische Ringe, geradkettige und verzweigte aliphatische Verbindungen mit Einfach-, Doppel- oder Dreifachbindungen) und diverse funktionelle Gruppen aufweisen (z.B. Carbonsäuren, Ester, Ether, Amine, Aldehyde, Ketone und verschiedene heterocyclische Ringe), um die Möglichkeit zu maximieren, Verbindungen zu entdecken, die mit sehr unterschiedlichen Bindungsstellen in Wechselwirkung treten.
Das NMR-Screening-Verfahren benutzt Ligandenkonzentrationen im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 10,0 mM. Bei diesen Konzentrationen können Verbindungen, die sauer oder basisch sind, signifikant den pH gepufferter Proteinlösungen ändern. Chemische Verschiebungen reagieren empfindlich auf pH-Änderungen sowie direkte Bindungswechselwirkungen, und "falsche positive" Änderungen der chemischen Verschiebung, die nicht das Ergebnis einer Ligandenbindung, sondern von Änderungen des pH-Wertes sind, können deshalb beobachtet werden. Es ist daher notwendig, sicherzustellen, dass sich der pH der gepufferten Lösung durch die Zugabe des Liganden nicht ändert. Eine Möglichkeit zum Kontrollieren des pH wird unten dargelegt.
Die Verbindungen werden bei 263°K als 1,0 und 0,1 M Stammlösungen in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelagert. Das ist wegen der begrenzten Löslichkeit der Liganden in wässriger Lösung notwendig. Es ist nicht möglich, den pH der DMSO-Lösung direkt einzustellen. Zusätzlich bilden HCl und NaOH unlösliche Salze in DMSO, so dass andere Säuren und Basen verwendet werden müssen. Für den folgenden Ansatz wurde festgestellt, dass er zu einem stabilen pH führt.
Die 1,0 M Stammlösungen in DMSO werden 1:10 in 50 mM Phosphat, pH 7,0 verdünnt. Der pH dieser verdünnten Aliquotlösung wird gemessen. Wenn der pH des verdünnten Aliquots unverändert bleibt (d.h. bei 7,0 bleibt), wird eine Arbeitslösung durch Verdünnen der DMSO-Stammlösung 1:10 gebildet, um eine 0,1 M Lösung herzustellen, und diese Lösung wird gelagert.
Falls der pH des verdünnten Aliquots kleiner als 7,0 ist, wird Ethanolamin zu der 1,0 M DMSO-Stammlösung hinzugegeben, diese Stammlösung wird 1:10 mit Phosphatpuffer verdünnt, um ein weiteres Aliquot herzustellen, und der pH des Aliquots wird erneut geprüft.
Falls der pH des verdünnten Aliquots größer als 7,0 ist, wird Essigsäure zu der 1,0 M DMSO-Stammlösung hinzugegeben, diese Stammlösung wird dann 1:10 mit Phosphatpuffer verdünnt, um ein weiteres Aliquot herzustellen, und der pH des Aliquots wird überprüft.
Ethanolamin und Essigsäure sind in DMSO löslich, und es werden die richtigen Äquivalente hinzugegeben, um sicherzustellen, dass bei der Überführung in wässrige Pufferlösung der pH unverändert bleibt. Das Einstellen des pH-Wertes ist ein interaktiver Prozess, der wiederholt wird, bis das gewünschte Resultat erhalten wird.
Beachten Sie, dass diese Prozedur mit 1:10-Verdünnungen von 1,0 M Stammlösungen (100 mM Ligand) durchgeführt wird, um sicherzustellen, dass keine pH-Änderungen bei den niedrigeren Konzentrationen, die in den Experimenten (0,1 bis 10 mM) verwendet werden, oder in anderen/schwächeren Puffersystemen beobachtet werden.
Nach der Aussetzung des ¹⁵N-markierten Zielmoleküls gegenüber einer oder mehreren Testverbindungen wird ein zweites zweidimensionales ¹⁵N/¹H-NMR-Korrelationsspektrum erzeugt. Dieses zweite Spektrum wird genauso erzeugt, wie zuvor dargelegt wurde. Das erste und das zweite Spektrum werden dann miteinander verglichen, um festzustellen, ob es Unterschiede zwischen den beiden Spektren gibt. Unterschiede zwischen den zweidimensionalen ¹⁵N/¹H-NMR-Korrelationsspektren, die die Anwesenheit eines Liganden anzeigen, entsprechen ¹⁵N-markierten Stellen in dem Zielmolekül. Solche Unterschiede werden unter Verwendung von Standardverfahren bestimmt, die auf dem Gebiet gut bekannt sind.
Als Beispiele zeigen 2, 3, 4, 5 und 6 Vergleiche von Korrelationsspektren vor und nach dem Aussetzen verschiedener Zielmoleküle gegenüber verschiedenen Testkomponenten. Eine ausführliche Beschreibung, wie diese Untersuchungen durchgeführt wurden, ist weiter unten in den Beispielen 2 und 3 zu finden.
Einzelne Signale in einem zweidimensionalen ¹⁵N/¹H-NMR-Korrelationsspektrum entsprechen bestimmten Stickstoff- und Protonatomen in dem Zielmolekül (z.B. bestimmten Amiden der Aminosäurereste in dem Protein). Als Beispiel ist aus 2 zu ersehen, dass chemische Verschiebungen in einer zweidimensionalen ¹⁵N/¹H-Korrelation der DNA-Bindungsdomäne von E2, das einer Testverbindung ausgesetzt ist, an den Restpositionen 15 (I15), 21 (Y21), 22 (R22) und 23 (L23) auftreten.
Aus 2 ist zu ersehen, dass die Bindung des Liganden den Isoleucin(Ile)-Rest an Position 15, den Tyrosin(Tyr)-Rest an Position 21, den Arginin(Arg)-Rest an Position 22 und den Leucin(Leu)-Rest an Position 23 betrifft. Daher kann ein Verfahren der vorliegenden Erfindung auch verwendet werden, um die spezifische Bindungsstelle zwischen einem Liganden und einem Zielmolekül zu identifizieren.
Die Region des Proteins, die für die Bindung der einzelnen Verbindungen verantwortlich ist, wird aus den einzelnen Amidsignalen identifiziert, die sich durch Zugabe der Verbindungen ändern. Diese Signale werden den einzelnen Amidgruppen des Proteins durch Standardverfahren unter Verwendung einer Vielzahl gut eingeführter heteronuklearer multidimensionaler NMR-Experimente zugeordnet.
Um Moleküle zu entdecken, die fester an das Protein binden, werden Moleküle zum Testen basierend auf den Struktur-/Wirksamkeits-Beziehungen aus dem Anfangsscreen und/oder Strukturinformationen zu den Ausgangsleitsubstanzen, wenn sie an das Protein gebunden sind, ausgewählt. Zum Beispiel kann das Anfangsscreening zu der Identifikation von Liganden führen, die alle einen aromatischen Ring enthalten. Die zweite Screening-Runde würde dann andere aromatische Moleküle als Testverbindungen verwenden.
Wie weiter unten in Beispiel 2 dargelegt wird, identifizierte ein Anfangsscreeningassay zur Bindung von Stromelysin an die katalytische Domäne zwei Biarylverbindungen als Liganden. Die zweite Screening-Runde verwendete daher eine Reihe von Biarylderivaten als Testverbindungen.
Der zweite Satz Testverbindungen wird anfänglich bei einer Konzentration von 1mM gescreent, und Bindungskonstanten werden für jene Verbindungen gemessen, die Affinität zeigten. Beste Leitsubstanzen, die an das Protein binden, werden dann mit den Ergebnissen verglichen, die in einem Funktionsassay erhalten wurden. Jene Verbindungen, die geeignete Leitsubstanzen sind, werden chemisch modifiziert, um Analoga herzustellen, mit dem Ziel, ein neues pharmazeutisches Mittel zu entdecken.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Bestimmung der Dissoziationskonstante zwischen einem Zielmolekül und einem Liganden, der an dieses Zielmolekül bindet, bereit. Dieses Verfahren umfasst die Schritte: a) Erzeugen eines ersten zweidimensionalen ¹⁵N/¹H-NMR-Korrelationsspektrums eines ¹⁵N-markierten Zielmoleküls; b) Titrieren des markierten Zielmoleküls mit verschiedenen Konzentrationen eines Liganden; c) Erzeugen eines zweidimensionalen ¹⁵N/¹H-NMR-Korrelationsspektrums für jede Ligandenkonzentration von Schritt (b); d) Vergleichen jedes Spektrums von Schritt (c) sowohl mit dem ersten Spektrum von Schritt (a) als auch mit allen anderen Spektren von Schritt (c), um Unterschiede in diesen Spektren als eine Funktion der finderungen der Ligandenkonzentration zu quantifizieren; und e) Berechnen der Dissoziationskonstante (K_D) zwischen dem Zielmolekül und dem Liganden aus diesen Unterschieden.
Wegen ihrer Bedeutung in der medizinischen Chemie ist ein bevorzugtes Zielmolekül für die Verwendung in einem solchen Verfahren ein Polypeptid. In einer bevorzugten Ausführungsform kann ein Verfahren zur Bestimmung der Dissoziationskonstante eines Liganden in Gegenwart eines zweiten Liganden durchgeführt werden. Gemäß dieser Ausführungsform wird das ¹⁵N-markierte Zielmolekül an diesen zweiten Liganden gebunden, bevor dieses Zielmolekül den Testverbindungen ausgesetzt wird.
Bindungs- oder Dissoziationskonstanten werden durch Verfolgen der ¹⁵N/¹H-chemischen Verschiebungen des Proteins als eine Funktion der Ligandenkonzentration gemessen. Eine bekannte Konzentration ([P]₀) des Zielmoleküls wird mit einer bekannten Konzentration ([L]₀) des zuvor identifizierten Liganden gemischt und das zweidimensionale ¹⁵N/¹H-Korrelationsspektrum gewonnen. Aus diesem Spektrum werden beobachtete chemische Verschiedungswerte (δ_obs) erhalten. Das Verfahren wird für verschiedene Konzentrationen des Liganden wiederholt, falls möglich bis zur Sättigung des Zielmoleküls, wobei in diesem Fall der chemische Grenzverschiebungswert für Sättigung (δ_sat) gemessen wird.
In den Fällen, bei denen Sättigung des Zielmoleküls erhalten wird, wird die Dissoziationskonstante für die Bindung eines bestimmten Liganden an das Zielmolekül berechnet unter Verwendung der folgenden Formel:
worin [P]_o die molare Gesamtkonzentration des Zielmoleküls ist; [L]_o ist die molare Konzentration des Liganden; und x ist die molare Konzentration der gebundenen Spezies. Der Wert von x wird bestimmt aus der Gleichung:
worin δ_free die chemische Verschiebung der freien Spezies ist; δ_obs = ist die beobachtete chemische Verschiebung; und D ist der Unterschied zwischen dem chemischen Grenzverschiebungswert für Sättigung (δ_sat) und dem chemischen Verschiebungswert des Zielmoleküls ohne Liganden (δ_free).
Die Dissoziationskonstante wird dann durch Variieren ihres Wertes solange, bis die beste Übereinstimmung mit den beobachteten Daten erhalten wird, unter Verwendung von statistischen Standardverfahren zur Kurvenanpassung bestimmt.
Für den Fall, dass δ_sat nicht direkt bekannt ist, werden sowohl K_D als auch δ_sat variiert und dem gleichen Kurvenanpassungsverfahren unterworfen.
Die Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens zur Bestimmung der Dissoziations- oder Bindungsaffinität verschiedener Liganden für verschiedene Zielmoleküle wird weiter unten in den Beispielen 2. und 3 dargelegt.
Bevorzugte Zielmoleküle, Mittel zum Erzeugen von Spektren und Mittel zum Vergleichen von Spektren sind die gleichen, wie oben dargelegt.
In ihrer Hauptausgestaltung stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Gestaltung neuer Liganden bereit, die an ein spezifisches Trägermolekül binden, indem zwei oder mehrere Moleküle, die an das Trägermolekül binden, verbunden werden.
Der Anfangsschritt in dem Gestaltungsverfahren ist die Identifikation von zwei oder mehr Liganden, die an das spezifische Zielmolekül binden. Die Identifikation solcher Liganden erfolgt unter Verwendung von zweidimensionaler ¹⁵N/¹H-NMR-Korrelationsspektroskopie, wie weiter oben dargelegt wurde. Sobald zwei oder mehr Liganden identifiziert sind, an das Zielmolekül an unterschiedlichen Stellen zu binden, wird ein Komplex zwischen dem Zielmolekül und den Liganden gebildet. Bei zwei Liganden ist dieser Komplex ein ternärer Komplex. Quartäre und andere Komplexe werden gebildet, wenn es sich um drei oder mehr Liganden handelt.
Komplexe werden gebildet, indem das Zielmolekül gleichzeitig oder nacheinander mit den verschiedenen Liganden gemischt wird unter Bedingungen, die das Binden dieser Liganden an das Ziel ermöglichen. Mittel zum Feststellen dieser Bedingungen sind auf dem Gebiet gut bekannt.
Sobald dieser Komplex gebildet ist, wird seine dreidimensionale Struktur bestimmt. Alle Mittel zur Bestimmung dreidimensionaler Strukturen können verwendet werden. Solche Verfahren sind auf dem Gebiet gut bekannt. Beispielhafte und bevorzugte Verfahren sind NMR und Röntgenkristallographie. Die Verwendung dreidimensionaler Doppel- und Dreifachresonanz-NMR zum Bestimmen der dreidimensionalen Struktur von zwei Liganden, die an die katalytische Domäne von Stromelysin gebunden sind, wird nachfolgend in Beispiel 4 ausführlich dargelegt.
Eine Analyse der dreidimensionalen Struktur deckt die räumliche Anordnung der Liganden relativ zueinander sowie zu der Konformation des Zielmoleküls auf. Erstens erlaubt die räumliche Anordnung jedes Liganden zu dem Zielmolekül die Identifikation jener Abschnitte des Liganden, die direkt an der Bindung beteiligt sind (d.h. jener Abschnitte, die mit der Zielbindungsstelle in Wechselwirkung treten), und jener Abschnitte jedes Liganden, die von der Bindungsstelle wegragen und für nachfolgende Bindungsprozeduren verwendet werden können. Zweitens werden die Daten zur räumlichen Anordnung verwendet, um die Positionen jedes Liganden relativ zueinander abzubilden. Anders ausgedrückt, es können diskrete Abstände zwischen den räumlich angeordneten Liganden berechnet werden.
Drittens definieren die Daten zur räumlichen Anordnung das dreidimensionale Verhältnis zwischen den Liganden und dem Ziel. Daher können zusätzlich zur Berechnung der absoluten Abstände zwischen Liganden die Winkelanordnungen dieser Liganden bestimmt werden.
Die Kenntnis der räumlichen Anordnungen der Liganden und des Ziels wird dann verwendet zur Auswahl von Verbindungsstücken, um zwei oder mehr Liganden zu einer Einheit zu verbinden, die alle Liganden enthält. Die Gestaltung der Verbindungsstücke basiert auf den Abständen und der Winkelanordnung, die notwendig sind, um jeden der Ligandenabschnitte der Einheit in der richtigen Anordnung zum Ziel zu erhalten.
Die dreidimensionale Konformation geeigneter Verbindungsstücke ist einem Durchschnittsfachmann gut bekannt oder von ihm schnell zu ermitteln. Während es theoretisch möglich ist, zwei oder mehr Liganden über jeden Abstand und jede dreidimensionale Projektion zu verbinden, werden in der Praxis bestimmte Einschränkungen für Abstand und Projektion bevorzugt. In einer bevorzugten Ausführungsform sind Liganden durch einen Abstand von weniger als etwa 15 Angstrom (Ã), noch besser weniger als etwa 10 Ã, und am bestens weniger als 5 Ã getrennt.
Sobald eine geeignete Verbindungsgruppe identifiziert. ist, werden die Liganden mit diesem Verbindungsstück verbunden. Mittel zum Verbinden von Liganden sind auf dem Gebiet gut bekannt und sind abhängig von der chemischen Struktur des Liganden und der Verbindungsgruppe selbst. Liganden werden miteinander unter Verwendung jener Abschnitte des Liganden verbunden, die nicht direkt von der Bindung an das Zielmolekül betroffen sind.
Eine ausführliche Beschreibung der Gestaltung eines neuen Arzneistoffes, der die proteolytische Aktivität von Stromelysin hemmt, wobei dieser Arzneistoff unter Verwendung eines Verfahrens der vorliegenden Erfindung gestaltet wurde, wird nachfolgend in Beispiel 4 dargelegt.
Die folgenden Beispiele stellen bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar und schränken die Spezifikation und Ansprüche in keiner Weise ein.
Beispiel 1
Herstellung einheitlich ¹⁵N-markierter Zielmoleküle
A. Stromelysin
Humanes Stromelysin ist ein 447-Aminosäureprotein, von dem angenommen wird, dass es an dem proteolytischen Abbau von Knorpelgewebe beteiligt ist. Es wird angenommen, dass die Proteolyse von Knorpelgewebe zu einem Abbauverlust von Gelenkknorpel und zu der resultierenden Beeinträchtung der Gelenkfunktion führt, die sowohl bei Osteoarthrose als auch bei rheumatoider Arthrose beobachtet wird. Das Protein verfügt über eine Reihe von Domänen, zu denen N-terminale latente und Propeptid-Domänen, eine C-terminale Domäne homolog mit Homopexin und eine interne katalytische Domäne gehören.
Untersuchungen haben gezeigt, dass die Entfernung der N-terminalen Prosequenz von ungefähr achtzig Aminosäuren das Proenzym zu dem gereiften 45 kDa Enzym umzuwandeln scheint. Ferner haben Untersuchungen gezeigt, dass die C-terminale Homopexin-Homolog-Domäne für die richtige Faltung der katalytischen Domäne oder für die Wechselwirkung mit einem Inhibitor nicht erforderlich ist. (Siehe z.B. A. I. Marcy, Biochemistry, 30: 6476-6483 (1991)). Daher wurde das innere 81-256-Aminosäurerest-Segment von Stromelysin als das Proteinfragment für die Verwendung bei der Identifikation von Verbindungen gewählt, die daran binden und das Potential haben, als Inhibitor von Stromelysin zu agieren.
Um das Verfahren der vorliegenden Erfindung einzusetzen, war es notwendig, das 81-256-Fragment (SEQ-ID-Nr: 1) von Stromelysin herzustellen, in dem die Peptidhauptkette isotopisch mit ¹⁵N angereichert war. Dies erfolgte durch Einfügen eines Plasmids, das für die Herstellung des Proteinfragments codierte, in einen E. coli-Stamm und Aufzucht des genetisch modifizierten Bakterienstamms in einem begrenzenden Kulturmedium, das mit ¹⁵NH₄Cl und ¹³C-Glucose angereichert war.
Das isotopisch angereicherte Proteinfragment wurde von dem Kulturmedium isoliert, gereinigt und anschließend als Basis für die Bewertung der Bindung von Testverbindungen verwendet. Die Prozeduren für diese Verfahren sind unten beschrieben.
Humane Hautfibroblasten (ATCC-Nr. CRL 1507) wurden aufgezogen und unter Verwendung der von Clark et al., Archiv. Biochem. and Biophys., 241: 36-45 (1985) beschriebenen Prozedur induziert. Die gesamte RNA wurde von 1 g Zellen unter Verwendung eines Promega RNAgents^® Total RNA Isolation System Kit (Cat.-Nr. Z5110, Promega Corp., 2800 Woods Hollow Road, Madison, WI 53711- 5399) nach Anweisungen des Herstellers isoliert. Ein 1-μg-Teil der RNA wurde 5 Minuten lang bei 80°C hitzedenaturiert und dann einer reversen Transkriptase-PCR unter Verwendung eines GeneAmp^® RNA PCR-Kits (Cat.-Nr. N808-0017, Applied Biosystems/Perkin-Elmer, 761 Main Avenue, Norwalk, CT 06859-0156) nach Anweisungen des Herstellers unterworfen.
Ineinandergeschachtelte PCR wurde unter Verwendung erster Primer (A) GAAATGAAGAGTC TTCAA (SEQ-ID-Nr. 3) und (B) GCGTCCCAGGTTCTGGAG (SEQ-ID-Nr. 4) und 35 Zyklen bei 94°C, zwei Minuten; 45°C, zwei Minuten und 72°C, drei Minuten durchgeführt. Darauf folgte eine Reamplifikation mit internen Primern (C) ATACCATGGCCTATCCAT TGGATGGAGC (SEQ-ID-Nr. 5) und (D) ATAGGATCCTTAGGTCTCAGGGGA GTCAGG (SEQ-ID-Nr. 6) unter Verwendung von dreißig Zyklen unter den gleichen Bedingungen wie zuvor beschrieben, um eine DNA-Codierung für die Aminosäurereste 1-256 von humanem Stromelysin zu erzeugen.
Das PCR-Fragment wurde dann in den PCR-Klonierungsvektor pT7Blue^® (Novagen, Inc., 597 Science Drive, Madison, WI 53711) nach Anweisungen des Herstellers kloniert. Das resultierende Plasmid wurde mit NcoI und BamHI geschnitten und das Stromelysin-Fragment in den Novagen-Expressionsvektor pET3d (Novagen, Inc., 597 Science Drive, Madison, WI 53711) subkloniert, wiederum unter Verwendung der Anweisungen des Herstellers.
Ein vollreifes Stromelysin-Expressionskonstrukt, das für Aminosäurereste 81-256 codiert, sowie ein Starter-Methionin wurden von dem 1-256-Expressionskonstrukt durch PCR-Amplifikation erzeugt. Das resultierende PCR-Fragment wurde erst in den Novagen pT7Blue(R)-Vektor kloniert und dann in den Novagen pET3d-Vektor subkloniert, nach Anweisungen des Herstellers wie oben beschrieben, um das Plasmid (pETST-83-256) herzustellen. Dieses Endplasmid ist identisch mit dem von Qi-Zhuang et al., Biochemistry, 31: 11231-11235 (1992) beschriebenen Plasmid, mit der Ausnahme, dass die vorliegenden Codes für eine Peptidsequenz zwei Aminosäuren früher beginnen, bei Position 81 in der Sequenz von humanem Stromelysin.
Plasmid pETST-83-256 wurde in E. coli-Stamm BL21(DE3)/pLysS (Novagen, Inc., 597 Science Drive, Madison, WI 53711) nach Anweisungen des Herstellers transformiert, um einen Expressionsstamm, BL21(DE3)/pLysS/pETST-255-1, zu erzeugen.
Ein Vorkulturmedium wurde durch Lösen von 1,698 g Na₂HP₄·7H₂O, 0,45 g KH₂PO₄, 0,075 g NaCl, 0,150 g ¹⁵NH₄Cl, 0,300 13C-Glucose, 300 μl 1 M wässrige MgSO₄-Lösung und 15 μl wässrige CaCl₂-Lösung in 150 ml deionisiertem Wasser hergestellt.
Die resultierende Vorkulturmediumlösung wurde sterilisiert und in eine sterile 500-ml-Spritzflasche überführt. Unmittelbar vor der Beimpfung des Vorkulturmediums mit dem Bakterienstamm wurden 150 μl einer Lösung mit 34 mg/ml Chloramphenicol in 100% Ethanol und 1,5 ml einer Lösung mit 20 mg/ml Ampicillin zu dem Flascheninhalt hinzugegeben.
Der Flascheninhalt wurde dann mit 1 ml Glycerolstammlösung von genetisch modifiziertem E. coli, Stamm BL21(DE3)/pLysS/pETST-255-1, beimpft. Der Flascheninhalt wurde geschüttelt (225 Upm) bei 37°C, bis eine optische Dichte von 0,65 beobachtet wurde.
Ein Fermentationsnährmedium wurde durch Lösen von 113,28 g Na₂HP₄·7H₂O, 30 g KH₂PO₄, 5 g NaCl und 10 ml 1%igem DF-60-Antischaummittel in 9604 ml deionisiertem Wasser hergestellt. Diese Lösung wurde in einen New Brunswick Scientific Micros Fermenter (Edison, NJ) gebracht und bei 121°C 40 Minuten lang sterilisiert.
Unmittelbar vor der Beimpfung des Fermentationsmediums wurden die folgenden vorsterilisierten Komponenten zu dem Inhalt des Fermentationskessels hinzugegeben: 100 ml einer l0%igen wässrigen Lösung von ¹⁵NH₄Cl, 100 ml einer 10%igen wässrigen Lösung von 13C-Glucose, 20 ml einer wässrigen 1 M Lösung von MgSO₄, 1 ml einer wässrigen 1 M CaCl₂-Lösung, 5 ml einer wässrigen Lösung von Thiaminhydrochlorid (10 mg/ml), 10 ml einer Lösung mit 34 mg/ml Chloramphenicol in 100 Ethanol und 1,9 g Ampicillin, gelöst in der Chloramphenicollösung. Der pH der resultierenden Lösung wurde durch die Zugabe einer wässrigen Lösung von 4 N H₂SO₄ auf pH 7,00 eingestellt.
Die Vorkultur von E. coli, Stamm BL21(DE3)/pLysS/pET5T-255-1, von der oben beschriebenen Prozedur im Schüttelflaschenmaßstab, wurde zu dem Fermenterinhalt hinzugegeben, und Zellwachstum wurde solange zugelassen, bis eine optische Dichte von 0,48 erreicht wurde. Während dieses Verfahrens wurde der Fermenterinhalt durch Zugabe von 4 N H₂SO₄ oder 4 N KOH, je nach Bedarf, automatisch auf pH 7,00 gehalten. Der gelöste Sauerstoffgehalt des Fermenterinhalts wurde über eine kaskadierte Schleife über 55% Luftsättigung gehalten, mit gesteigerter Rührgeschwindigkeit, wenn der gelöste Sauerstoffgehalt unter 55% absackte. Die Luft wurde mit 7 Standardliter pro Minute (SLPM) in den Fermenter eingespeist, und die Kulturtemperatur wurde während des Verfahrens bei 37°C gehalten.
Die Zellen wurden durch 10 Minuten Zentrifugation bei 17.000 g und 4°C geerntet, und die resultierenden Pellets wurden gesammelt und bei –85°C gelagert. Die Nasszellausbeute betrug 3,5 g/l. Eine Analyse der löslichen und unlöslichen Fraktionen von Zelllysaten durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) ergab, dass etwa 50% des ¹⁵N-Stromelysins in der lösbaren Phase zu finden war.
Das wie oben beschrieben hergestellte isotopenmarkierte Stromelysin-Fragment wurde gereinigt unter Einsatz einer Modifikation der Technik, die von Ye, et al., Biochemistry, 31: 11231-11235 (1992) beschrieben wurde.
Die geernteten Zellen wurden suspendiert in 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8, 0), Natriumazidlösung mit 1 mM MgCl₂, 0,5 mM ZnCl₂, 25 Einheiten/ml Benzonase^®-Enzym und einem Inhibitorgemisch, hergestellt aus 4-(2-Aminoethyl)-benzensulfonylfluorid ("AEBSF"), Leupeptin^®, Aprotinin^® und Pepstatin^® (Alle bei Konzentrationen von 1 μl/ml. AEBSF, Leupeptin^®, Aprotinin^® und Pepstatin^® sind erhältlich von American International Chemical, 17 Strathmore Road, Natick, MA 01760.)
Das resultierende Gemisch wurde eine Stunde leicht gerührt und dann auf 4°C gekühlt. Die Zellen wurden dann durch Beschallung aufgespalten unter Verwendung eines 50%-Funktionszyklus. Das resultierende Lysat wurde 30 Minuten bei 14.000 Upm zentrifugiert und der Pellet der unlöslichen Fraktion für die Weiterverarbeitung (siehe unten) bei –80°C eingefroren.
Natriumammoniumsulfat wurde zu dem Überstand bis zu dem Wert 20% Sättigung hinzugegeben und die resultierende Lösung auf eine 700-ml-Phenylsepharose-Fast-Flow ("Q-Sepharose-FF")-Säule (Pharmacia Biotech., 800 Centennial Ave., P. O. Box 1327, Piscataway, NJ 08855) aufgebracht. Zuvor wurde die Sepharose-Säule mit 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6 bei 4°C), 5 mM CaCl₂ und 1M (NH₄)₂SO₄ ins Gleichgewicht gebracht. Die beladene Säule wurde mit einem linearen Gradienten mit abnehmender Konzentration von wässrigem (NH₄)₂SO₄ (von 1 bis runter auf 0 M) und zunehmender Konzentration von wässrigem CaCl₂ (von 5 auf 20 mM) in Tris-HCl-Puffer bei pH 7,6 eluiert.
Die aktiven Eluatfraktionen wurden gesammelt und in einer Amicon-Rührzelle (Amicon, Inc., 72 Cherry Hill Drive, Beverly, MA 01915) eingeengt. Die konzentrierte Probe wurde über Nacht in dem Anfangspuffer, der mit der Q-Sepharose-FF-Säule verwendet wurde, 50 mM Tris-HCl (pH 8,2 bei 4°C) mit 10mM CaCl₂ dialysiert.
Die dialysierte Probe wurde dann auf die Q-Sepharose-FF-Säule aufgebracht und mit einem linearen Gradienten, der den Anfangspuffer und 200 mM NaCl enthielt, eluiert. Die gereinigte lösliche Fraktion des isotopenmarkierten Stromelysin-Fragments wurde eingeengt und bei 4°C gelagert.
Der Pellet wurde in 8 M Guanidin-HCl löslich gemacht. Die Lösung wurde 20 Minuten bei 20.000 Upm zentrifugiert und der Überstand zu einem Faltungspuffer, der 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM CaCl₂, 0,5 mM ZnCl₂ und den Inhibitorcocktail aus AEBSF, Leupeptin^®, Aprotinin^® und Pepstatin^® (alle bei einer Konzentration von 1 μg/ml) enthielt, tropfenweise hinzugegeben. Das Volumen des Faltungspuffers war zehnmal so groß wie das des Überstandes. Das Gemisch aus Überstand und Faltungspuffer wurde 30 Minuten bei 20.000 Upm zentrifugiert.
Der Überstand von dieser Zentrifugation wurde bei 4°C gelagert, und der Pellet wurde zweimal den oben beschriebenen Schritten Löslichmachung in Guanidin-HCl, erneutem Falten in Puffer und Zentrifugation unterworfen. Die Endüberstände von allen drei Zentrifugationen wurden vereinigt und festes Ammoniumsulfat wurde bis zu dem Wert 20% Sättigung hinzugegeben. Die resultierende Lösung, die so von der unlöslichen Fraktion abgeleitet wurde, wurde einer Reinigung auf Phenyl-Sepharose und Q-Sepharose unterworfen, wie weiter oben für die lösliche Fraktion beschrieben wurde.
Die gereinigten löslichen und unlöslichen Fraktionen wurden vereinigt und bildeten etwa 1,8 mg gereinigtes isotopenmarkiertes Stromelysin-81-256-Fragment pro Gramm ursprünglicher Zellpaste.
B. Humanes Papillomavirus (HPV) E2-Inhibitoren
Die Papillomaviren sind eine Familie kleiner DNA-Viren, die genitale Warzen und Zervixkarzinome verursachen. Das E2-Protein von HPV reguliert die virale Transkription und ist für die virale Replikation erforderlich. Daher können Moleküle, die die Bindung von E2 an DNA blockieren, nützliche therapeutische Mittel gegen HPV sein. Das Protein, und nicht die DNA, wurde als ein Ziel ausgewählt, da zu erwarten ist, dass Agenzien mit großer Selektivität gefunden werden, die eher an das Protein als an die DNA binden.
Die DNA-Bindungsdomäne von humanem Papillomavirus E2 wurde aus der vollen DNA-Länge, die für E2 kodiert, unter Verwendung von PCR kloniert, und unter Verwendung des T7 Expressionssystems in Bakterien überexprimiert. Einheitlich ¹⁵N-markiertes Protein wurde von Bakterien isoliert, die auf einem Minimalmedium wuchsen, das ¹⁵N-markiertes Ammoniumchlorid enthielt. Das Protein wurde von dem Bakterienzelllysat unter Verwendung einer S-Sepharose-Fast-flow-Säule gereinigt, die mit Puffer (50 mM Tris, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH = 8,3) ins Gleichgewicht gebracht war. Das Protein wurde mit einem linearen Gradienten von 100-500 mM NaCl in Puffer eluiert, vereinigt und auf eine Mono-S-Säule bei einem pH von 7,0 aufgebracht. Das Protein wurde mit einem Salzgradienten (100-500 mM) eluiert, auf 0,3 mM eingeengt, und in eine TRIS (50 mM, pH = 7,0)-gepufferte H₂O/D₂O (9/1)-Lösung, die Natriumazid (0,5%) enthielt, ausgetauscht.
C. RAF
Einheitlich ¹⁵N-markierte Ras-Bindungsdomäne des RAF-Proteins wurde, wie in Emerson, et al., Biochemistry, 34 (21): 6911-6918 (1995) beschrieben, hergestellt.
D. FKBP
Einheitlich ¹⁵N-markiertes rekombinantes humanes FK-Bindungsprotein (FKBP) wurde, wie in Logan, et al., J. Mol. Biol., 236. 637-648 (1994) beschrieben, hergestellt.
Beispiel 2
Screening von Verbindungen unter Verwendung zweidimensionaler ¹⁵N/¹H-NMR-Korrelationsspektralanalyse
Die katalytische Domäne von Stromelysin wurde gemäß der Prozeduren von Beispiel 1 hergestellt. Die Proteinlösungen, die in dem Sreening-Assay verwendet wurden, enthielten die einheitlich ¹⁵N-markierte katalytische Domäne von Stromelysin (0,3 mM), Acetohydroxamsäure (500 mM), CaCl₂ (20 mM) und Natriumazid (0,5%) in einer H₂O/D₂O(9/1)-gepufferten TRIS-Lösung (50 mM, pH = 7,0).
Zweidimensionale ¹⁵N/¹H-NMR-Spektren wurden bei 29°C auf einem Bruker AMX500 NMR-Spektrometer, ausgestattet mit einer Dreifachresonanzsonde und einem Bruker Probenwechsler, erzeugt. Die ¹⁵N/¹H-HSQC-Spektren wurden als 80 × 1024 Komplexpunkte unter Verwendung von Sweep-Weiten von 2000 Hz (¹⁵N, t₁) und 8333 Hz (¹H, t₂) gewonnen. Es wurden eine Verzögerung von 1 Sekunde zwischen einzelnen Abtastungen und 8 Abtastungen pro freiem Induktionszerfall (FID) bei der Datensammlung verwendet. Alle NMR-Spektren wurden auf Silicon Graphics-Computern unter Verwendung selbstgeschriebener Software verarbeitet und analysiert.
Ein erstes zweidimensionales ¹⁵N/¹H-NMR-Korrelationsspektrum wurde für das ¹⁵N-markierte Stromelysin-Zielmolekül, wie oben beschrieben, gewonnen. Das Stromelysin-Ziel wurde dann einer Datenbank von Testverbindungen ausgesetzt. Stammlösungen der Verbindungen wurden mit 100 mM und 1 M hergestellt. Zusätzlich wurde eine Kombinationsbibliothek hergestellt, die 8–10 Verbindungen pro Probe bei einer Konzentration von 100 mM für jede Verbindung enthielt.
Der pH der 1 M Stammlösung wurde mit Essigsäure und Ethanolamin eingestellt, so dass keine pH-Änderung bei einer 1/10-Verdünnung mit einer 100 mM phosphatgepufferten Lösung (pH = 70) beobachtet wurde. Es ist wichtig, den pH einzustellen, da kleine Änderungen des pH-Werts die chemischen Verschiebungen der Biomoleküle ändern und die Interpretation der NMR-Daten erschweren können. Die Verbindungen in der Datenbank wurden auf der Basis Größe (Molekulargewicht = 100-300) und molekulare Diversität ausgewählt. Die Moleküle in der Sammlung hatten unterschiedliche Formen (z.B. ebene aromatische Ringe, nicht ebene aliphatische Ringe, geradkettige und verzweigte aliphatische Verbindungen mit Einfach-, Doppel- oder Dreifachbindungen) und diverse funktionelle Gruppen (z.B. Carbonsäuren, Ester, Ether, Amine, Aldehyde, Ketone und verschiedene heterocyclische Ringe), um die Möglichkeit zu maximieren, Verbindungen zu entdecken, die mit sehr unterschiedlichen Bindungsstellen in Wechselwirkung treten. Die NMR-Proben wurden hergestellt durch Zugabe von 4 μl der DMSO-Stammlösung der Verbindungsgemische, die jede einzelne Verbindung bei einer Konzentration von 100 mM enthielt, zu 0,4 ml H₂O/D₂O(9/1)-gepufferter Lösung des einheitlich ¹⁵N-markierten Proteins. Die Endkonzentration jeder einzelnen Verbindung in der NMR-Probe betrug etwa 1 mM.
In einem Anfangs-Screening wurden zwei Verbindungen gefunden, die an die katalytische Domäne von Stromelysin binden. Beide Verbindungen enthalten eine Biarylkomponente. Auf der Grundlage dieser anfänglichen Treffer wurden strukturell ähnliche Verbindungen gegen Stromelysin getestet. Die Struktur dieser Biarylverbindungen wird durch die Struktur I unten dargestellt. (Definitionen für R₁-R₃ und A₁-A₃ siehe Tabelle 1).
In einer zweiten Screening-Runde wurde die Bindung sowohl in Abwesenheit als auch in Gegenwart von Sättigungsmengen an Acetohydroxamsäure (500 mM) untersucht.
Für viele der Biarylverbindungen wurde herausgefunden, dass sie an die katalytische Domäne von Stromelysin binden. 4 zeigt ein repräsentatives zweidimensionales ¹⁵N/¹H-NMR- Korrelationsspektrum, bevor und nachdem Stromelysin einer Biaryltestverbindung ausgesetzt wurde. Aus 4 ist ersichtlich, dass die Verbindung chemische Verschiebungen von ¹⁵N-Stellen, wie die als W124, T187, A199 und G204 bezeichneten Stellen, verursachte.
Diese Stellen korrespondieren mit einem Tryptophan(Trp)-Rest an Position 124, einem Threonin(Thr)-Rest an Position 187, einem Alanin(Ala)-Rest an Position 199 und einem Glycin(Gly)-Rest an Position 204 von SEQ-ID-Nr. 1. 9 zeigt die Korrelation zwischen den NMR-Bindungsdaten und eine Ansicht der NMR-abgeleiteten dreidimensionalen Struktur der katalytischen Domäne von Stromelysin. Die Fähigkeit, die spezifische Bindungsstelle eines bestimmten Liganden zu lokalisieren, ist ein Vorteil der vorliegenden Erfindung.
Einige Verbindungen binden nur in Gegenwart von Hydroxamsäure an Stromelysin. Daher wurde die Bindungsaffinität einiger Verbindungen in Gegenwart der Hydroxamsäure (d.h. kooperativ) verbessert. Diese Ergebnisse veranschaulichen eine weitere bedeutende Möglichkeit des vorliegenden Screening-Assays: die Fähigkeit zur Identifikation von Verbindungen, die an das Protein in Gegenwart anderer Moleküle binden.
Verschiedene Biarylverbindungen mit der Struktur I wurden auf Bindung an Stromelysin bei unterschiedlichen Konzentrationen getestet. Die bei jeder Konzentration erzeugten ¹⁵N/¹H-Spektren wurden beurteilt, um Unterschiede in den Spektren als eine Funktion der Verbindungskonzentration zu quantifizieren. Eine Bindungs- oder Dissoziationskonstante (K_D) wurde unter Verwendung von auf dem Gebiet gut bekannten Standardverfahren aus diesen Unterschieden berechnet. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Angaben für R₁-R₃ und A₁-A₃ in Tabelle 1 beziehen sich auf die entsprechenden Positionen in der Struktur I, oben. Tabelle 1
Die Daten in Tabelle 1 zeigen die Nützlichkeit eines Verfahrens der vorliegenden Erfindung bei der Bestimmung von Dissoziations- oder Bindungskonstanten zwischen einem Liganden und einem Zielmolekül.
Ein weiterer Vorteil eines NMR-Screening-Assays der vorliegenden Erfindung ist die Fähigkeit, beobachtete chemische Verschiebungen aus den zweidimensionalen ¹⁵N/¹H-NMR-Korrelationsspektren mit anderen Spektren oder Projektionen einer Zielmolekülkonfiguration zu korrelieren. Die Ergebnisse einer solchen repräsentativen Korrelation sind in 9 dargestellt, worin Regionen innerhalb des Polypeptids veranschaulicht werden, an denen Bindung mit dem Substratmolekül am wahrscheinlichsten auftritt. In dieser Figur sind die augenscheinlichen Bindungsregionen in Stromelysin für Verbindung 1 (von Tabelle 1) dargestellt.
Verbindungen von der Datenbank wurden auf ähnliche Weise auf Bindung an die DNA-Bindungsdomäne des E2-Proteins gescreent. Solche Verbindungen hatten die Struktur II unten, worin R₁-R₄ und A wie in Tabelle 2 definiert sind.
NMR-Experimente wurden bei 29°C auf einem Bruker AMX500 NMR-Spektrometer, ausgestattet mit einer Dreifachresonanzsonde und einem Bruker Probenwechsler, erzeugt. Die ¹⁵N/¹H-HSQC-Spektren wurden als 80 × 1024 Komplexpunkte unter Verwendung von Sweep-Weiten von 2000 Hz (¹⁵N, t₁) und 8333 Hz (¹H, t₂) gewonnen. Es wurden eine Verzögerung von 1 Sekunde zwischen einzelnen Abtastungen und 4 Abtastungen pro freiem Induktionszerfall (FID) bei der Datensammlung verwendet. Alle NMR-Spektren wurden auf Silicon Graphics-Computern verarbeitet und analysiert.
2 und 3 zeigen repräsentative zweidimensionale ¹⁵N/¹H-NMR-Korrelationsspektren, bevor und nachdem die DNA-Bindungsdomäne von E2 einer ersten bzw. einer zweiten Testverbindung ausgesetzt wurde.
Aus 2 ist ersichtlich, dass die erste Testverbindung chemische Verschiebungen von ¹⁵N-Stellen, wie die als I15, Y21, R22. und L23 bezeichneten Stellen, verursachte. Diese Stellen korrespondieren mit einem Isoleucin(Ile)-Rest an Position 15, einem Tyrosin(Tyr)-Rest an Position 21, einem Arganin(Arg)-Rest an Position 22 und einem Leucin(Leu)-Rest an Position 23 von SEQ-ID-Nr. 6.
Aus 3 ist ersichtlich, dass die zweite Testverbindung chemische Verschiebungen an bestimmten ¹⁵N-Stellen mit den Bezeichnungen I6, G11, H38 und T52 verursachte. Diese Stellen korrespondieren mit einem Isoleucin(Ile)-Rest an Position 6, einem Glycin(Gly)-Rest an Position 11, einem Histidin(His)-Rest an Position 38 und einem Threonin(Thr)-Rest an Position 52 von SEQ-ID-Nr. 6.
7 und 8 zeigen die Korrelation zwischen diesen NMR-Bindungsdaten und eine Ansicht der NMR-abgeleiteten dreidimensionalen Struktur der DNA-Bindungsdomäne von E2.
Mehrere strukturell ähnliche Verbindungen verursachten Änderungen der chemischen Verschiebung der Proteinsignale, wenn sie bei einer Konzentration von 1 mM gescreent werden. Für zwei verschiedene Sätze von Amidresonanzen wurde herausgefunden, dass sie sich durch die Zugabe der Verbindungen ändern: ein Signalsatz, der mit Amiden korrespondiert, die sich in der zwischen den zwei Monomeren gebildeten b-Trommel befinden, und ein zweiter Satz, der mit Amiden korrespondiert, die sich in der Nähe der DNA-Bindungsstelle befinden.
Zum Beispiel verursachten Verbindungen, die zwei Phenylringe enthalten, wobei eine Carbonsäure an dem Kohlenstoff angelagert ist, der die beiden Ringe verbindet, nur Änderungen der chemischen Verschiebung für die Amide in der DNA-Bindungsstelle. Im Gegensatz dazu banden Benzophenone und phenoxyphenylhaltige Verbindungen nur an die b-Trommel. Andere Verbindungen verursachten Änderungen der chemischen Verschiebung für beide Signalsätze, wobei jedoch die Signale in jedem Satz um unterschiedliche Beträge verschoben wurden, was das Vorhandensein von zwei unterschiedlichen Bindungsstellen nahelegt.
Durch Verfolgen der Änderungen der chemischen Verschiebung als eine Funktion der Ligandenkonzentration wurden außerdem Bindungskonstanten für die beiden Bindungsstellen gemessen. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind unten in Tabelle 2 zusammengefasst. Tabelle 2

^a ein Bindestrich (–) für A bedeutet kein Atom (d.h. eine Biphenylbindung)

Eine einheitlich ¹⁵N-markierte Ras-Bindungsdomäne des RAF-Proteins wurde wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt und unter Verwendung der zweidimensionalen ¹⁵N/¹H-NMR-Korrelationsspektralanalyse gemäß der weiter oben beschrieben NMR-Prozeduren gescreent. Die Ergebnisse einer beispielhaften Untersuchung sind in 5 dargestellt, worin zweidimensionale ¹⁵N/¹H-NMR-Korrelationsspektren sowohl vor als auch nach Aussetzen gegenüber einer Testverbindung veranschaulicht sind.
Einheitlich ¹⁵N-markiertes FKBP wurde wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt und unter Verwendung der zweidimensionalen ¹⁵N/¹H-NMR-Korrelationsspektralanalyse gemäß der weiter oben beschrieben NMR-Prozeduren gescreent. Die Ergebnisse einer beispielhaften Untersuchung sind in 6 dargestellt, worin zweidimensionale ¹⁵N/¹H-NMR-Korrelationsspektren sowohl vor als auch nach Aussetzen gegenüber einer Testverbindung veranschaulicht sind.
Beispiel 3
Vergleich von NMR-, enzymatischen, Filterbindungs- und Gel-Shift-Sreening-Assays
Untersuchungen wurden durchgeführt, um die Bindungskonstanten von Liganden zu verschiedenen Biomolekülen, die durch das NMR-Verfahren der vorliegenden Erfindung bestimmt wurden, mit ähnlichen Ergebnissen, die mit Verfahren nach dem Stand der Technik erhalten wurden, zu vergleichen.
In einer ersten Untersuchung wurden Bindungskonstanten sowohl durch das NMR-Verfahren der vorliegenden Erfindung als auch durch einen enzymatischen Assay nach dem Stand der Technik bestimmt. Das Zielmolekül war die katalytische Domäne von Stromelysin, hergestellt nach den Prozeduren von Beispiel 1. Die NMR-Bindungskonstanten K_D wurden wie in Beispiel 2 beschrieben unter Verwendung zweidimensionaler ¹⁵N/¹H-NMR-Korrelationsspektroskopie hergeleitet. Die so erhaltenen K_D-Werte wurden mit einer Inhibitionskonstante K_I, wie sie in einem enzymatischen Assay bestimmt wurde, verglichen.
In dem enzymatischen Assay wurde die Spaltungsrate eines fluoreszierenden Substrats durch Verfolgen der Fluoreszenzzunahme bei Peptidspaltung, die eine Trennung zwischen dem Fluorophor und dem Quencher verursacht, bestimmt. Die enzymatische Aktivität wurde unter Verwendung einer Matrix verschiedener Konzentrationen von Acetohydroxamsäure und Biarylverbindungen gemessen. Der Assay ist eine Modifikation des Verfahrens, das von H. Weingarten, et al., in Anal. Biochem., 147: 437-440 (1985) beschrieben wurde, unter Einsatz der fluoreszierenden Substrateigenschaften, die von E. Matayoshi, et al. in Science: 247: 954-958 (1990) beschrieben wurden.
Es wurden acht Acetohydroxamsäurekonzentrationen im Bereich von 0,0 bis 1,0 M verwendet, und es wurden sechs Verbindungskonzentrationen verwendet, was zu insgesamt 48 Messpunkten führte. Einzelne Verbindungskonzentrationen schwankten aufgrund von Löslichkeit und Wirksamkeit.
Alle NMR-Messungen wurden in Gegenwart von 500 mM Acetohydroxamsäure durchgeführt, außer die Titration von Acetohydroxamsäure selbst. Dissoziationskonstanten wurden aus der Abhängigkeit der beobachteten Änderungen der chemischen Verschiebung bei zugesetztem Liganden erhalten. Inhibitionskonstanten wurden dann unter Verwendung von Standardverfahren aus den Inhibitionsdaten erhalten.
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind unten in Tabelle 3 zusammengefasst und zeigen den Vergleich von NMR-abgeleiteten Dissoziationskonstanten (K_D) mit Inhibitionskonstanten (K_I), die in dem enzymatischen Assay unter Verwendung eines fluoreszierenden Substrats gemessen wurden. Tabelle 3
Die Daten in Tabelle 3 zeigen, dass ein NMR-Verfahren der vorliegenden Erfindung eine schnelle, wirksame und genaue Art der Bestimmung von Dissoziations- oder Bindungskonstanten von Liganden zu Zielbiomolekülen bereitstellt. Ein Vergleich der Bindungskonstanten, die nach den zwei Verfahren bestimmt wurden, führt zu der gleichen Einstufung der Wirksamkeiten der getesteten Verbindungen. Das heißt, während die Werte für ein bestimmtes Substrat, wie sie nach den zwei Verfahren bestimmt wurden, nicht gleich sind, verhalten sie sich zueinander proportional.
In einer zweiten Untersuchung wurden die Ergebnisse zur Bindung der DNA-Bindungsdomäne von E2 an ihre Ziel-DNA durch Verfahren nach dem Stand der Technik erhalten und mit Ergebnissen verglichen, die nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wurden. Das Ziel war die DNA-Bindungsdomäne von E2, hergestellt gemäß der Prozeduren von Beispiel 1. NMR-Sreening-Assays und NMR-Verfahren zur Bestimmung von Ligandendissoziationskonstanten wurden wie weiter oben in Beispiel 2 dargelegt durchgeführt.
Die Bindungskonstante aus dem NMR-Verfahren wurde mit den Ergebnissen eines physikalischen Filterbindungsassays verglichen, bei dem die Bindung von DNA an das Ziel gemessen wurde. Der Hochdurchsatz-Filterbindungsassay wurde unter Verwendung von E2, hergestellt gemäß Beispiel 2 oben, durchgeführt. Das ³³P-markierte DNA-Konstrukt umfasste ein 10.329-Rasenpaar-Plasmid, das durch Insertion des HPV-11-Genoms, das drei E2-Bindungsstellen mit hoher Affinität und eine E2-Bindungsstelle mit geringer Affinität enthielt, in das PSP-65-Plasmid (Promega, Madison, WI) gebildet wurde.
Die Bindungsaffinitäten an den unterschiedlichen Stellen, wie sie durch NMR bestimmt wurden, wurden für einen Teil der Verbindungen mit der Inhibition von E2-Bindung an DNA, wie sie in dem Filterbindungsassay gemessen wurde, verglichen. Wie in Tabelle 2 oben dargestellt, korrelierten die in dem Filterbindungsassay bestimmten Aktivitäten eng mit den Bindungsaffinitäten, die von den Amiden der DNA-Bindungsstelle berechnet wurden, jedoch nicht mit den Affinitäten, die für die b-Trommelstelle gemessen wurde. Das steht im Einklang mit den relativen Positionen jeder Stelle.
In einer alternativen Untersuchung wurde ein Vergleich der NMR-bestimmten Bindungsergebnisse mit ähnlichen Ergebnissen, die mit einem Gel-Shift-Assay nach dem Stand der Technik unter Verwendung von Techniken, die auf dem Gebiet gut bekannt sind, erhalten wurden, durchgeführt. Der Gel-Shift-Assay wurde unter Verwendung eines GST-Fusionsproteins durchgeführt, das E2 in voller Länge und ein ³³P-markiertes 62-BasenpaaY-DNA-Fragment mit zwei E2-Bindungsstellen enthielt.
Das Verfahren identifizierte zahlreiche Verbindungen, die positive Ergebnisse in dem Gel-Shift-Assay erbrachten. Von einigen dieser positiven Ergebnisse wurde jedoch angenommen, dass sie durch die Bindung an die DNA verschuldet wurden, da in diesen Fällen keine Bindung des E2-Proteins unter Verwendung des NMR-Verfahrens dieser Erfindung beobachtet wurde. Für diese Verbindungen wurde gezeigt, dass sie tatsächlich eher an DNA binden als an E2, wie durch Änderungen der chemischen Verschiebungen der DNA und nicht des Proteins nach Zugabe dieser Verbindungen bewiesen wurde. Diese Daten zeigen, dass ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung die Fähigkeit ist, das Auftauchen falscher positiver Ergebnisse zu minimieren.
Beispiel 4
Gestaltung eines wirksamen Nicht-Peptid-Inhibitors von Stromelysin
Untersuchungen wurden durchgeführt, um neue Liganden zu gestalten, die an die katalytische Domäne von Stromelysin binden. Da Stromelysin eine Autolyse durchläuft, wurde ein Inhibitor gesucht, um den Abbau von Stromelysin zu blockieren. Dieser Inhibitor würde das Screening anderer potentieller Liganden, die an andere Stellen des Enzyms binden, erleichtern. Die Kriterien, die bei der Auswahl von Verbindungen beim Screening nach anderen Bindungsstellen verwendeten wurden, basierten in erster Linie auf der Größe des Liganden. Es wurde der kleinste Ligand gesucht, der genügend Löslichkeit aufwies, um das Enzym zu sättigen (> 98% Enzymbelegung) und zu inhibieren. Die Klonierung, Expression und Reinigung der katalytischen Domäne von Stromelysin wurde unter Verwendung der in Beispiel 1 dargelegten Prozeduren erreicht. Ein Anfangsschritt bei der Gestaltung des neuen Liganden war die Identifikation eines ersten Liganden, der an das Stromelysin-Ziel band. Diese Identifikation wurde gemäß eines wie oben offenbarten zweidimensionalen ¹⁵N/¹H-NMR-Korrelations-Screening-Verfahrens ausgeführt.
Eine Vielzahl von Hydroxamsäuren mit der allgemeinen Formel R-(CO)NHOH wurde auf Bindung an Stromelysin unter Verwendung von in Beispiel 2 dargelegten Prozeduren gescreent. Von den getesteten Verbindungen befriedigte Acetohydroxamsäure [CH₃(CO)NHOH] die Auswahlkriterien am besten: sie hat eine Bindungsaffinität für Stromelysin von 17 mM und eine gute Wasserlöslichkeit. Bei einer Konzentration von 500 mM hemmt Acetohydroxamsäure den Abbau des Enzyms und ermöglicht das Screening anderer potentieller Liganden.
Der zweite Schritt in dem Gestaltungsverfahren war die Identifikation eines zweiten Liganden, der an das Ziel Stromelysin an einer anderen Stelle als der Bindungsstelle von Acetohydroxamsäure band. Dies erfolgte durch Screening von Verbindungen auf ihre Fähigkeit, an Stromelysin in Gegenwart von Sättigungsmengen an Acetohydroxamsäure zu binden. Einzelheiten zu Prozeduren und Ergebnisse dieses zweiten Identifikationsschrittes sind oben in Beispiel 2 dargelegt.
Die Verbindung, die bei diesen Untersuchungen als ein zweiter Ligand identifiziert wurde und in späteren Gestaltungsschritten verwendet wurde, war die Verbindung, die in Tabelle 1 als Verbindung Nr. 4 bezeichnet ist (siehe Beispiel 2).
Der nächste Schritt in dem Gestaltungsverfahren war der, einen ternären Komplex aus dem Ziel Stromelysin, dem ersten Liganden und dem zweiten Liganden aufzubauen. Dies wurde erreicht, indem das Stromelysin-Ziel den zwei Liganden ausgesetzt wurde unter Bedingungen, die zur Komplexbildung führten. Die dreidimensionale Struktur des ternären Komplexes wurde dann mit Hilfe von NMR-Spektroskopie wie unten beschrieben bestimmt.
Die ¹H-, ¹³C- und ¹⁵N-Hauptkettenresonanzen von Stromelysin in dem ternären Komplex wurden durch eine Analyse mehrerer 3D Doppel- und Dreifachresonanz-NMR-Spektren zugeordnet (A. Bax, et al., Acc. Chem. Res., 26: 131-138 (1993)). Die C^a-Resonanzen benachbarter Spinsysteme wurden identifiziert durch eine Analyse dreidimensionaler (3D) HNCA-Spektren (L. Kay, et al., J. Maan. Reson., 89: 496-514 (1990)) und HN(CO)CA-Spektren (A. Bax, et al., J. Bio. NMR, 1: 99 (1991)), die mit identischen Spektralweiten von 1773 Hz (35,0 ppm), 3788 Hz (30,1 ppm) und 8333 Hz (16, 67 ppm) in den Dimensionen F₁ (¹⁵N), F₂ (¹³C) bzw. F₃ (¹H) aufgezeichnet wurden.
Die Datenmatrix bildeten 38 (t₁) × 48 (t₂) × 1024 (t₃) Komplexpunkte für das HNCA-Spektrum und 32 (t₁) × 40 (t₂) × 1024 (t₃) Komplexpunkte für das HN(CO)CA-Spektrum. Beide Spektren wurden mit 16 Abtastungen pro Inkrement gewonnen. Ein 3D CBCA(CO)NH-Spektrum (S. Grzesiek, et al., J. Am. Chem. Soc., 114: 6261-6293 (1992)) wurde mit 32 (t₁, ¹⁵N) × 48 (t₂, ¹³C) × 1024 (t₃, ¹H) Komplexpunkten und 32 Abtastungen pro Inkrement erfasst. Die Spektralweiten waren 1773 Hz (35,0 ppm), 7575,8 Hz (60,2 ppm) und 8333 Hz (16, 67 ppm) in den Dimensionen ¹⁵N, ¹³C bzw. ¹H.
Für alle drei Spektren war die ¹H-Trägerfrequenz auf die Wasserresonanz eingestellt, und die ¹⁵N-Trägerfrequenz lag bei 119,1 ppm. Die ¹³C-Trägerfrequenz war in den HNCA- und HN(CO)CA-Experimenten auf 55,0 ppm und in dem CBCA(CO)NH-Experiment auf 46,0 ppm eingestellt.
Die Hauptkettenzuordnungen wurden durch eine Analyse der Kreuzspeaks bestätigt, die in einem ¹⁵N-separierten 3D NOESY-HSQC-Spektrum und einem 3D HNHA-J-Spektrum beobachtet wurden. Das ¹⁵N-separierte 3D NOESY-HSQC-Spektrum (S. Fesik, et al., J. Maan. Reson., 87: 588-593 (1988)); D. Marion, et al., J. Am. Chem. Soc., 111: 1515-1517 (1989)) wurde mit einer Mischzeit von 80 ms erfasst. Es wurden insgesamt 68 (t₁, ¹⁵N) × 96(t₂, ¹H) × 1024(t₃, ¹H) Komplexpunkte mit 16 Abtastungen pro Inkrement erfasst, und die Spektralweiten waren 1773 Hz, (35,0 ppm) für die ¹⁵N-Dimension, 6666, 6 Hz (t₂, ¹H, 13, 3 ppm) und 8333 Hz (16, 7 ppm) für die ¹H-Dimension.
Das 3D HNHA-J-Spektrum (G. Vuister, et al., J. Am. Chem. Soc., 115: 7772-7777 (1993), das auch verwendet wurde, um ³JHNHa- Kopplungskonstanten zu erhalten, wurde mit insgesamt 35(t₁, ¹⁵N) × 64 (t₂, ¹H)) × 1024 (t₃, ¹H) Komplexpunkten und 32 Abtastungen pro Inkrement erfasst. Spektralweiten und Trägerfrequenzen waren identisch mit denen des ¹⁵N-separierten NOESY-HSQC-Spektrums. Mehrere der H^b-Signale wurden unter Verwendung des HNHB-Experimentes zugeordnet. Die Sweep-Weiten waren die gleichen wie in dem ¹⁵N-separierten NOESY-HSQC-Spektrum, das mit 32(t₁, ¹⁵N) × 96 (t₂, ¹H) × 1024 (t₃, ¹H) Komplexpunkten erfasst wurde.
Die ¹H- und ¹³C-chemischen Verschiebungen wurden für nahezu alle Seitenkettenresonanzen zugeordnet. Ein 3D HCCH-TOCSY-Spektrum (L. Kay, et al., J. Maan. Reson., 101b: 333-337 (1993)) wurde mit einer Mischzeit von 13 ms unter Verwendung der DIPSI-2-Sequenz (S. Rucker, et al., Mol. Phys., 68: 509 (1989)) für ¹³C-isotrope Mischung erfasst. Es wurden insgesamt 96(t₁, ¹³C) × 96(t₂, ¹H) × 1024(t₃, ¹H) Komplexdatenpunkte mit 16 Abtastungen pro Inkrement mit einer Spektralweite von 10638 Hz (70,8 ppm, w1), 4000 Hz (6,67 ppm, w2) und 4844 (8,07 ppm, w3) erfasst. Trägerpositionen waren 40 ppm, 2,5 ppm und bei der Wasserfrequenz für die ¹³C-Dimension, indirekt nachgewiesene ¹H- bzw. beobachtete ¹H-Dimension.
Eine andere 3D HCCH-TOCSY-Untersuchung wurde mit dem ¹³C-Träger bei 12.2,5 ppm durchgeführt, um die aromatischen Reste zuzuordnen. Die Spektren wurden mit 36 (t₁, ¹³C) × 48 (t₂, ¹H) × 1024(t₃, ¹H) Komplexpunkten mit Spektralweiten von 5263 Hz (35,0 ppm, w1), 3180 Hz (5,30 ppm, w2) und 10.000 Hz (16,7 ppm, w3) erfasst. Trägerpositionen waren 122,5 ppm, 7,5 ppm und bei der Wasserfrequenz für die ¹³C-Dimension, indirekt nachgewiesene ¹H- bzw. beobachtete ¹H-Dimension.
Ein ¹³C-separiertes 3D NOESY-HMQC-Spektrum (S. Ferik, et al., J. Maan. Reson., 87: 588-593 (1988); D. Marion, et al., J. Am. Chem. Soc., 111: 1515-1517 (1989)) wurde unter Verwendung einer Mischzeit von 75 ms aufgezeichnet. Es wurden insgesamt 80(t₁, ¹³C) × 72 (t₂, ¹H) × 1024 (t₃, ¹H) Komplexdatenpunkte mit 16 Abtastungen pro Inkrement mit Spektralweiten von 10638 Hz, (70,49 ppm, w1), 6666, 6 Hz (13, 3 ppm, w2) und 8333, 3 (16, 67 ppm, w3) erfasst. Die ¹H-Trägerfrequenzen waren auf die Wasserresonanz eingestellt, und die ¹³C-Trägerfrequenz war bei 40,0 ppm angeordnet.
Stereospezifische Zuordnungen von Methylgruppen der Valin- und Leucin-Reste wurden erhalten unter Verwendung einer biochemischen Annäherung (Neri, et al., Biochem., 28: 7510-7516 (1989)) auf der Basis des ¹³C-¹³C-Einfachbindung-Kopplungsmusters, das in einem hochauflösenden ¹H, ¹³C-HSQC-Spektrum (G. Bodenhausen, et al., J. Chem. Phys. Lett., 69: 185-189 (1980)) einer fraktionell ¹³C-markierten Proteinprobe beobachtet wurde. Das Spektrum wurde mit 200 (t₁, ¹³C) ×2048 (t₂, ¹H) Komplexpunkten mit Spektralweiten von 5000 Hz, (39,8 ppm, ¹³C) und 8333 Hz (16,7 ppm, ¹H) erfasst. Trägerpositionen waren 20,0 ppm für die ¹³C-Dimension und bei der Wasserfrequenz für die ¹H-Dimension.
Zum Nachweis von NOEs zwischen den zwei Liganden und dem Protein wurde ein 3D ¹²C-gefiltertes, ¹³C-editiertes NOESY-Spektrum erfasst. Das Pulsschema bestand aus einer doppelten ¹³C-Filtersequenz (A. Gemmeker, et al., J. Maan. Reson., 96: 199-204 (1992)), verknüpft mit einer NOESY-HMQC-Sequenz (S. Fesik, et al., J. Maan. Reson., 87: 588-593 (1988)); D. Marion, et al., J. Am. Chem. Soc., 111: 1515-1517 (1989)). Das Spektrum wurde mit einer Mischzeit von 80 ms und insgesamt 80 (t₁, ¹³C) ×80 (t₂, ¹H) × 1024(t₃, ¹H) Komplexpunkten mit 16 Abtastungen pro Inkrement aufgezeichnet. Die Spektralweiten waren 8865 Hz, (17,73 ppm, w1), 6667 Hz (13,33 ppm, w2) und 8333 (16,67 ppm, w3), und die Trägerpositionen waren 40,0 ppm für die Kohlenstoffdimension und bei der Wasserfrequenz für beide Protondimensionen.
Zum Identifizieren von Amidgruppen, die sich langsam mit dem Lösungsmittel austauschten, wurden eine Reihe von ¹H, ¹⁵N-HSQC-Spektren (G. Bodenhausen, et al., J. Chem. Phys. Lett., 69: 185-189 (1980)) bei 25°C in 2-Stunden-Intervallen aufgezeichnet, nachdem das Protein in D₂O ausgetauscht wurde. Die Erfassung des ersten HSQC-Spektrums wurde 2 Stunden nach der Zugabe von D₂O gestartet.
Alle NMR-Spektren wurden bei 25°C auf einem Bruker AMX500 oder AMX600 NMR-Spektrometer aufgezeichnet. Die NMR-Daten wurden auf Silicon Graphics-Computern verarbeitet und analysiert. In allen NMR-Experimenten wurden dann, wenn es geeignet war, gepulste Feldgradienten angewendet wie beschrieben (A. Bax, et al., J. Maan. Reson., 99: 638 (1992)), um die Unterdrückung des Lösungsmittelsignals und spektraler Kunstprodukte zu gewähren. Quadraturdetektion in indirekt detektierten Dimensionen wurde erreicht unter Verwendung des States-TPPI-Verfahrens (D. Marion, et al., J. Am. Chem. Soc., 111: 1515-1517 (1989)). Lineare Vorhersage wurde eingesetzt wie beschrieben (E. Olejniczak, et al., J. Maan. Reson., 87: 628-632 (1990)).
Die abgeleitete dreidimensionale Struktur des ternären Komplexes wurde dann verwendet, um die räumliche Anordnung des ersten und zweiten Liganden zueinander sowie zu dem Zielmolekül Stromelysin festzulegen.
Abstandsbeschränkungen, abgeleitet von den NOE-Daten, wurden in sechs Kategorien auf der Basis der NOE-Kreuzpeakintensität und mit einer Untergrenze von 1,8 Å und Obergrenzen von 2,5 Å, 3,0 Å, 3,5 Å, 4,0 Å, 4,5 Å bzw. 5,0 Å klassifiziert. Beschränkungen für Torsionswinkel F wurden von ³JHNHa-Kopplungskonstanten abgeleitet, die aus dem 3D HNHA-J-Spektrum bestimmt wurden (G. Vuister, et al., J. Am. Chem. Soc., 115: 7772-7777 (1993)). Der Winkel F wurde auf 120° ± 40° für ³JHNHa > 8,5 Hz und 60° ± 40° für ³JHNHa < 5Hz beschränkt.
Wasserstoffbrückenbindungen, die für langsam austauschende Amide auf der Basis von Anfangsstrukturen identifiziert wurden, wurden durch zwei Beschränkungen definiert: 1,8-2,5 Å für den H-O-Abstand und 1,8-3,3 Å für den N-O-Abstand. Strukturen wurden mit dem Programm X-PLOR 3.1 (A. Brünger, "XPLOR 3.1 Manual," Yale University Press, New Haven, 1992.) auf Silicon Graphics-Computern unter Verwendung einer Hybridabstandsgeometriesimulierten Reassoziierungsannäherung berechnet (M. Nilges, et al., FEBS Lett., 229: 317-324 (1988)).
Insgesamt 1032 angenäherte Zwischenprotonabstandsbeschränkungen wurden aus den NOE-Daten abgeleitet. Zusätzlich wurden 21 unzweideutige Zwischenmolekülabstandsbeschränkungen aus einem 3D 12C-gefilterten, 13C-editierten NOESY-Spektrum abgeleitet. Von den 1032 NOE-Beschränkungen, die das Protein betreffen, waren 341 Intrareste, 410 waren sequentiell oder kurz zwischen Resten, die in der Primärsequenz durch weniger als fünf Aminosäuren getrennt waren, und 281 waren lang und betrafen Reste, die durch mindestens fünf Reste getrennt waren.
Zusätzlich zu den NOE-Abstandsbeschränkungen wurden 14 zweikantige F-Winkelbeschränkungen in die Strukturberechnungen einbezogen, die von den Dreifach-Bindungskopplungskonstanten (³JHNHa), bestimmt aus einem HNHA-J-Spektrum (G. Viioster, et al., J. Am. Chem. Soc., 115: 7772-7717 (1993)), abgeleitet wurden. Die experimentellen Beschränkungen umfassten auch 120 Abstandsbeschänkungen, die mit 60 Wasserstoffbrückenbindungen korrespondierten. Die an Wasserstoffbrückenbindungen beteiligten Amide wurden auf der Basis ihrer charakteristisch langsamen Austauschrate identifiziert, und die Wasserstoffbrückenbindungspartner aus anfänglichen NMR-Strukturen ohne die Wasserstoffbrückenbindungsbeschränkungen berechnet. Die Gesamtzahl nicht-redundanter, experimentell hergeleiteter Beschränkungen war 1166.
Die Strukturen waren in hervorragender Übereinstimmung mit den NMR-experimentellen Beschränkungen. Es gab keine Abstandsübertretungen größer als 0,4 Å, und keine zweikantige Winkelübertretungen größer als 5 Grad. Des weiteren war die simulierte Energie für den van-der-Waals-Abstoßungsausdruck gering, wodurch angezeigt wurde, dass die Strukturen frei von ungünstigen Zwischenatomkontakten waren.
Die NMR-Strukturen zeigten auch eine gute kovalente Bindungsgeometrie, wie durch kleine Bindungslängen- und Bindungswinkelabweichungen von den entsprechenden idealisierten Parametern angezeigt wurde. Die mittlere atomare quadratische Abweichung der 8 Strukturen für Reste 93-247 von den mittleren Koordinaten war 0,93 Åfür Hauptkettenatome (C^a, N und C') und 1,43 Å für alle Nichtwasserstoffatome.
Das Banddiagramm des ternären Komplexes, der Stromelysin, Acetohydroxamsäure (der erste Ligand) und den zweiten Liganden betrifft, ist in 10 dargestellt. Die Struktur ist sehr ähnlich zu der globalen Faltung anderer Matrixmetalloproteinasen und besteht aus fünf gestreckten b-Faltblättern und drei a-Helices.
Das katalytische Zink wurde in den Bindungstaschen gefunden. Es wurde mit drei Histidinen und den zwei Sauerstoffatomen von Acetohydroxamsäure koordiniert. Eine Biarylgruppe des zweiten Liganden wurde in der S1'-Tasche zwischen der ersten Helix und der von den Resten 218-223 gebildeten Schleife lokalisiert. Diese tiefe und enge Tasche ist mit hydrophoben Resten gesäumt, die gute Kontakte mit dem Liganden bilden.
Auf Basis der dreidimensionalen Struktur des ternären Komplexes, die wie oben bestimmt wurde, und den Struktur-/Wirksamkeits-Beziehungen, die für die Bindung von Strukturanaloga des zweiten Liganden (d.h. anderer Biarylverbindungen) an Stromelysin beobachtet wurden, wurden neue Moleküle gestaltet, die die Acetohydroxamsäure mit Biarylen verbanden.
Wie in Tabelle 4 unten angegeben, enthielten die anfänglich gewählten Biaryle ein Sauerstoffverbindungsstück und CN fehlte in Parastellung zu der Biarylverbindung oder war vorhanden. Anfangsverbindungsstücke enthielten verschiedene Längen von Methyleneinheiten. Mittel zum Verbinden von Verbindungen mit Verbindungsstücken mit verschiedenen Längen von Methyleneinheiten sind auf dem Gebiet gut bekannt.
Wie ausgehend von der besseren Bindung der CN-substituierten Biaryle an Stromelysin erwartet, zeigten die CN-Derivate bessere Stromelysininhibition. Die Verbindung, die die beste Inhibition von Stromelysin zeigte, enthielt ein Verbindungsstück mit zwei Methyleneinheiten.
Die vorliegende Erfindung wurde unter Bezugnahme auf bevorzugte Ausführungsformen beschrieben. Diese Ausführungsformen stellen jedoch in keiner Weise eine Einschränkung der Ansprüche und Spezifikationen dar. Ein Durchschnittfachmann auf dem Gebiet wird sich schnell Änderungen, Modifikationen und Abänderungen dieser Ausführungsformen vorstellen können, die nicht von dem Umfang der vorliegenden Erfindung abweichen, der durch die Ansprüche definiert wird.
Beispiel 5
Gestaltung wirksamer, neuer Inhibitoren von FKBP Es wurden Untersuchungen zur Gestaltung neuer Liganden durchgeführt, die an FK-Bindungsprotein (FKBP) banden.
Die Klonierung, Expression und Reinigung von FKBP wurde wie in Beispiel 1 dargelegt erreicht. Ein Anfangsschritt bei der Gestaltung des neuen Liganden war die Identifikation eines ersten Liganden, der an das FKBP-Ziel band. Diese Identifikation wurde gemäß eines wie oben offenbarten zweidimensionalen ¹⁵N/¹H-NMR-Korrelations-Screening-Verfahrens ausgeführt.
Eine Vielzahl niedermolekularer Fragmente und Analoga mehrerer bekannter wirksamer Immunosuppressionsmittel (d.h. Ascomycin, Rapamycin) wurden auf Bindung an FKBP unter Verwendung der Prozeduren, wie sie in Beispiel 2 dargelegt wurden, gescreent. Von den getesteten Verbindungen befriedigte Verbindung 29 unten
die Auswahlkriterien am besten: sie hatte eine Bindungsaffinität für FKBP von 2 μM (gemessen durch Fluoreszenz nach den auf dem Gebiet bekannten Verfahren) und sättigte das Protein (> 98% Belegung der Bindungsstelle) bei Liganenkonzentrationen von 1 mM.
Der zweite Schritt in dem Gestaltungsverfahren war die Identifikation eines zweiten Liganden, der an das Ziel FKBP an einer anderen Stelle als der Bindungsstelle von Verbindung 29 band. Dies wurde erreicht durch Screening von Verbindungen auf ihre Fähigkeit, an FKBP in Gegenwart von Sättigungsmengen des Ascomycinfragmentanalogs (Verbindung 29) zu binden. Einzelheiten zu Prozeduren für diesen zweiten Identifikationsschritt sind in Beispiel 2 dargelegt.
In einem Anfangsscreening wurde eine Verbindung gefunden, die eine Benzanilidkomponente enthielt. Ausgehend von diesem ersten Treffer wurden strukturell ähnliche Verbindungen erhalten und gegen FKBP getestet. Die Struktur dieser Benzanilidverbindungen wird durch die Struktur III, unten, dargestellt (Definitionen für R₁-R₄ siehe Tabelle 5).
In der zweiten Screening-Runde wurde auf Bindung sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit einer Sättigungsmenge von Verbindung 29 (1 mM) untersucht.
Eine Struktur-/Wirksamkeits-Beziehung wurde für diese Diphenylamidverbindungen wie in Tabelle 5 dargelegt entwickelt. 6 zeigt ein repräsentatives zweidimensionales ¹⁵N/¹H-Korrelationsspektrum, bevor und nachdem FKBP einer Diphenylamidtestverbindung ausgesetzt wurde. Aus 6 ist ersichtlich, dass die Verbindung chemische Verschiebungen von ¹⁵N-Stellen, wie die als I50, Q53, E54 und V55 bezeichneten Stellen, verursachte. Diese Stellen korrespondieren mit einem Isoleucin (Ile) an Position 50, einem Glutamin (Gln) an Position 53, einem Glutamat (Glu) an Position 54 und einem Valin (Val) an Position 55 von SEQ-ID-Nr. 7. 11 zeigt die Korrelation zwischen den NMR-Bindungsdaten und eine Ansicht der NMR-abgeleiteten dreidimensionalen Struktur von FKBP. Die Fähigkeit, die spezifische Bindungsstelle eines bestimmten Liganden zu lokalisieren, ist ein Vorteil der vorliegenden Erfindung.
Einige Verbindungen banden nur an FKBP in Gegenwart von Verbindung 29. Somit war die Bindungsaffinität einiger Verbindungen in Gegenwart von Verbindung 29 gesteigert. Diese Ergebnisse veranschaulichen noch eine weitere bedeutende Möglichkeit des vorliegenden Sreening-Assays, nämlich die Fähigkeit, Verbindungen zu identifizieren, die an das Protein in Gegenwart anderer Moleküle binden.
Verschiedene Benzanilidverbindungen wurden auf die Bindung an FKBP bei mehreren Ligangenkonzentrationen getestet. Die bei jeder Konzentration erzeugten ¹⁵N/¹H-Korrelationsspektren wurden ausgewertet, um Unterschiede in diesen Spektren als eine Funktion der Verbindungskonzentration zu quantifizieren. Eine Bindungs- oder Dissoziationskonstante (Kd) wurde unter Verwendung von auf dem Gebiet gut bekannten Standardverfahren aus diesen Unterschieden berechnet. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in Tabelle 5 dargestellt. Die Angaben für R₁-R₄ in Tabelle 5 beziehen sich auf die entsprechenden Positionen in der Struktur III, oben. Tabelle 5
Die Daten in Tabelle 5 zeigen die Nützlichkeit eines Verfahrens der vorliegenden Erfindung für die Bestimmung von Dissoziations- oder Bindungskonstanten zwischen einem Liganden und einem Zielmolekül.
Der nächste Schritt in dem Gestaltungsprozess war der, einen ternären Komplex aus dem Ziel FKBP, dem ersten Liganden und dem zweiten Liganden zu konstruieren. Dies wurde erreicht, indem das FKBP-Ziel den zwei Liganden ausgesetzt wurde unter Bedingungen, die zur Komplexbildung führten. Die Position und Anordnung der Liganden wurde dann wie unten beschrieben bestimmt.
Die ¹H-, ¹³C- und ¹⁵N-Resonanzen von FKBP in dem ternären Komplex wurden durch eine Analyse mehrerer 3D-Doppel- und Dreifachresonanz-NMR-Spektren zugeordnet. Das Zuordnungsverfahren wurde unterstützt durch bekannte Zuordnungen von FKBP, wenn es mit Ascomycin einen Komplex bildet (R. Xu, et al., Biopolymers, 33: 535-550, 1993). ¹H-Seitenketten- und ¹⁵N/¹H-Hauptkettenresonanzen wurden durch eine Analyse dreidimensionaler (3D) HC(CO)NH-Spektren identifiziert, die mit Spektralweiten von 2000 Hz (39,5 ppm), 6250 Hz (12,5 ppm) und 8333 Hz (16, 7 ppm) in den Dimensionen F₁ (¹⁵N), F₂ (¹H) bzw. F₃ (¹H) und mit einer Datenmatrix von 46(t1) × 80(t2) × 1024(t3) Komplexpunkten und 16 Abtastungen pro Inkrement aufgezeichnet wurden. ¹H- und ¹³C-Seitenketten- und C^a-Resonanzen wurden durch eine Analyse von 3D HCCH-TOCSY-Spektren identifiziert (L. Kay, et al., J. Maan. Reson., 101b: 333-337, 1993), die mit Spektralweiten von 7541,5 Hz (60,0 ppm), 6250 Hz (12,5 ppm) und 8333 Hz (16, 7 ppm) in den Dimensionen F₁(¹³C), F₂ (¹H) bzw. F₃ (¹H) und mit einer Datenmatrix von 48(t1) × 64(t2) × 1024(t3) Komplexpunkten und 16 Abtastungen pro Inkrement aufgezeichnet wurden. Zwischenmolekulare NOEs zwischen dem Liganden und FKBP wurden durch eine Analyse eines 3D ¹²C-gefilterten, ¹³C-editierten NOESY-Spektrums erhalten. Das Pulsschema bestand aus einer doppelten ¹³C-Filtersequenz (A. Gemmeker, et al., J. Maan. Reson., 96: 199-204 (1992)), verknüpft mit einer NOESY-HMQC-Sequenz (S. Fesik, et al., J. Maan. Reson., 87: 588-593 (1988)); D. Marion, et al., J. Am. Chem. Soc., 111: 1515-1517 (1989)).
Das Spektrum wurde mit einer Mischzeit von 350 ms und insgesamt 46 (t₁, ¹³C) × 64 (t₂, ¹H) × 1024 (t₃, ¹H) Komplexpunkten und 16 Abtastungen pro Inkrement aufgezeichnet. Spektralweiten von 7541,5 Hz, (60,0 ppm), 6250 Hz (12,5 ppm) und 8333 Hz (16,7 ppm) wurden in den Dimensionen F₁ (¹³C), F₂ (¹H) bzw. F₃ (¹H) verwendet.
In allen Spektren war die ¹⁵N-Trägerfrequenz auf 117,4 ppm eingestellt, die ¹³C-Trägerfrequenz war auf 40,0 ppm eingestellt und die ¹H-Trägerfrequenz war auf die Wasserresonanz eingestellt. Alle Spektren wurden bei 303 K auf einem Bruker AMX500 NMR-Spektrometer aufgezeichnet. Die NMR-Daten wurden auf Silicon Graphics-Computern verarbeitet und analysiert. In allen NMR-Experimenten wurden dann, wenn es geeignet war, gepulste Feldgradienten angewendet wie beschrieben (A. Bax, et al., J. Maan. Reson., 99: 638 (1992)), um die Unterdrückung des Lösungsmittelsignals und spektraler Kunstprodukte zu gewähren. Quadraturdetektion in der indirekt detektierten Dimension wurde erreicht unter Verwendung des States-TPPI-Verfahrens (D. Marion, et al., J. Am. Chem. Soc., 87: 1515-1517 (1989)). Lineare Vorhersage wurde eingesetzt wie beschrieben (E. Olejniczak, et al., J. Maan. Reson., 87: 628-632 (1990)).
Abstandsbeschränkungen, abgeleitet von den NOE-Daten, wurden in drei Kategorien auf der Basis der NOE-Kreuzpeakintensität und mit einer Untergrenze von 1,8 Å und Obergrenzen von 3,0 Å, 4,0 Å und 5,0 Å klassifiziert. Insgesamt wurden 17 zwischenmolekulare Abstandsbeschränkungen zwischen dem Protein und Verbindung 33 und 10 zwischenmolekulare Abstandsbeschränkungen zwischen dem Protein und Verbindung 29 verwendet, um die Position und die Anordnung der Verbindungen zu definieren, wenn sie an FKBP gebunden waren, unter Verwendung bekannter dreidimensionaler Koordinaten für die FKBP-Proteinstruktur. Ein Banddiagramm des ternären Komplexes, der FKBP, ein Fragmentanalog von Ascomycin (Verbindung 29) und eine Benzanilidverbindung (Verbindung 33) umfasst, ist in 12 dargestellt.
Ausgehend von der dreidimensionalen Struktur des ternären Komplexes, wie oben definiert, und der Struktur-Wirksamkeits-Beziehungen, die für die Bindung von Strukturanaloga der zweiten Komponente an FKBP beobachtet wurden, wurde ein neues Molekül gestaltet, welches das Ascomycin-Fragmentanalog mit der Benzanilidverbindung verbindet. Diese Verbindung, unten dargestellt,
hat eine Affinität für FKBP von 19 nM, wie durch Fluoreszenztitrationen bestimmt wurde. Das ist eine 100-fache Zunahme der Wirksamkeit gegenüber dem Ascomycin-Fragmentanalog (Verbindung 29) allein (Kd = 2 μM).
Wie durch die obigen nicht einschränkenden Beispiele dargelegt wurde, betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Gestaltung eines Liganden mit hoher Affinität für ein gegebenes Zielmolekül, das folgendes umfasst:

a) Identifizieren von mindestens zwei Liganden, die an unterschiedliche Bindungsstellen des Zielmoleküls binden, mit den hier beschriebenen Screening-Verfahren unter Verwendung zweidimendionaler ¹⁵N/¹H NMR-Spektroskopie;
b) Bilden eines mindestens ternären Komplexes, indem die mindestens zwei Liganden dem Zielmolekül ausgesetzt werden;
c) Bestimmen der dreidimensionalen Struktur des Komplexes und somit der räumlichen Anordnung der mindestens zwei Liganden auf dem Zielmolekül; und
d) Verwenden der in Schritt c) bestimmten räumlichen Anordnung, um den neuen Liganden durch das Verknüpfen miteinander der zwei Liganden zu gestalten, der strukturell einer Kombination von den mindestens zwei Liganden ähnelt, die an unterschiedliche Stellen auf dem Zielmolekül binden. Vorzugsweise dient der hoch affine Ligand, der in dem oberen Verfahren gestaltet wird, als Basis oder ist die Basis für einen Arzneistoff, der an ein gegebenes Zielmolekül bindet und, in vitro und in vivo, eine gezielte therapeutische Wirkung bei Säugetieren einschließlich Menschen leistet, die einer Behandlung damit bedürfen.

Das Verfahren betrifft auch die Gestaltung eines Liganden mit hoher Affinität für ein gegebenes Zielmolekül, das folgendes umfasst:

a) Identifizieren eines ersten Liganden für das Zielmolekül unter Verwendung zweidimendionaler ¹⁵N/¹H NMR-Spektroskopie;
b) Identifizierung eines zweiten Liganden für das Zielmolekül unter Verwendung zweidimendionaler ¹⁵N/¹H NMR-Spektroskopie, worin der zweite Ligand der gleiche oder ein anderer als der erste Ligand sein kann, und worin der zweite Ligand an eine anderen Stelle auf dem Zielmolekül als der erste Ligand bindet;
c) Bilden eines ternären Komplexes, indem der erste und der zweite Ligand an das Zielmolekül gebunden wird;
d) Bestimmen der dreidimensionalen Struktur des Komplexes und somit der räumlichen Anordnung des ersten Liganden und des zweiten Liganden auf dem Zielmolekül; und
e) Gestalten des Liganden, worin die räumliche Anordnung von Schritt d) erhalten bleibt.

In dem oben beschriebenen Verfahren können der erste und der zweite Ligand die identische Molekülstruktur oder Formel haben, worin die Komponente an mindestens zwei Bindungsstellen auf dem Zielmolekül bindet. Der Ligand, der auf der strukturellen Kombination des ersten und zweiten Liganden basiert, dient dann als eine Leitsubstanz für ein Arzneimittel oder als ein Arzneimittel nach konkreter Synthese dieser kombinierten Verbindung und deren Beurteilung in den geeigneten biologischen Assays. Die Synthese des kombinierten Liganden, des hoch affinen Liganden, der Arzneimittel-Leitsubstanz oder des Arzneimittels wird durch synthetische oder biologische Mittel erreicht. Begrifflich sind, wie über die gesamte Spezifikation hinweg angezeigt, der erste und der zweite Ligand miteinander über Kohlenstoffatome, Heteroatome oder eine Kombination hieraus verbunden (gebunden), um den Liganden oder die Arznei-Leitsubstanz zu bilden. Die hierin beschriebenen Verfahren umfassen selbstverständlich Synthesen des hoch affinen Liganden durch lineare oder nicht-lineare (konvergente) Mittel, bei denen letztendlich die verbundenen (kombinierten) ersten, zweiten oder mehr Liganden hergestellt werden.
Der erste und der zweite Ligand können auch unterschiedliche Molekülstrukturen aufweisen, und einer der Liganden kann an die andere (unterschiedliche) Bindungsstelle auf dem Zielmolekül binden.
Ausführlicher betrifft das Verfahren der Erfindung auch die Gestaltung eines Liganden mit hoher Affinität für ein gegebenes Zielmolekül, das folgendes umfasst:

a) Herstellen eines isotopenmarkierten Zielmoleküls, worin das Molekül mit einem nachweisbaren NMR-Isotop angereichert ist;
b) Erzeugen eines zweidimendionalen ¹⁵N/¹H NMR-Spektrums des isotopenmarkierten Zielmoleküls;
c) Screening des isotopenmarkierten Zielmoleküls, indem das Zielmolekül einer Vielzahl von Verbindungen ausgesetzt wird, um durch zweidimendionale ¹⁵N/¹H NMR-Spektroskopie mindestens einen ersten und einen zweiten Liganden zu identifizieren, die an unterschiedliche Stellen auf dem Zielmolekül binden;
d) Bilden eines mindestens ternären Komplexes, indem der erste und der zweite Ligand dem isotopenmarkierten Zielmolekül ausgesetzt wird;
e) Bestimmen der räumlichen Anordnung des mindestens ersten und zweiten Liganden auf dem isotopenmarkierten Zielmolekül;
f) Verwenden der in Schritt e) bestimmten räumlichen Anordnung, um den hoch affinen Liganden basierend auf der Kombination von dem mindestens ersten und zweiten Liganden zu gestalten. Selbstverständlich kann eine Vielzahl von Liganden (1 + n) kombiniert werden, um einen hoch affinen Liganden zu bilden, der die räumliche Anordnung der 1 + n (n = 1 – ¥) kombinierten Liganden hat. Nachdem der hoch affine Ligand gestalten worden ist, kann das Verfahren ferner den Schritt f) Herstellen des hoch affinen Liganden durch synthetische oder biologische Mittel umfassen. Die mindestens zwei Liganden (erster und zweiter Ligand) können über Kohlenstoffatome (z.B. über Methylen- oder Alkyleneinheiten) oder über Heteroatome (z.B. über Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel) oder über andere Atome verbunden werden, die die räumliche Anordnung der 1 + n Liganden auf dem Zielmolekül beibehalten. Je nach Liganden können die Moleküle auch direkt miteinander kombiniert oder gebunden (verbunden) werden, ohne dazwischenliegende Alkylen- oder Heteroatom-Verbindungseinheiten. Der aus den 1 + n kombinierten Liganden hergestellte hoch affine Ligand zeigt vorzugsweise eine Zunahme der Bindungswirksamkeit zu dem Zielmolekül im Vergleich zu allen anderen 1 + n Liganden. Die vorliegende Erfindung umfasst daher hoch affine Liganden, die durch die hier dargestellten Verfahren gestaltet werden, worin der hoch affine Ligand eine Zunahme der Bindungswirksamkeit (Kd) zu dem gegebenen Zielmolekül aufweist gegenüber der Bindungswirksamkeit der mindestens zwei Liganden, die an unterschiedlichen Stellen auf dem gebebenen Zielmolekül binden.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Aufdecken hoch affiner Liganden unter Verwendung von Struktur/Wirksamkeits-Beziehungen, die durch kernmagnetische Resonanz erhalten wurden, worin das Verfahren das Konstruieren eines hoch affinen Liganden aus Liganden umfasst, die an eine Teilbindungsstelle eines Zielmoleküls binden, durch:

i) Screening niedermolekularer Verbindungen mit einem Molekulargewicht von 100–300 u, die an eine Teilbindungsstelle 1 des Zielmoleküls binden;
ii) Screening von Analoga, die aus den in Schritt i) erhaltenen Anfangsergebnissen hergestellt werden, um die Bindung an Teilbindungsstelle 1 zu optimieren;
iii) Screening auf niedermolekulare Verbindungen mit einem Molekulargewicht von 100–300 u und entsprechende Analoga, die an eine in der Nähe gelegene Bindungsstelle, Teilbindungsstelle 2 des Zielmoleküls, binden, unter Verwendung zweidimensionaler ¹⁵N/¹H NMR-Spektroskopie, um die Bindungsaffinität zu messen; worin nach den Schritten (i)–(iii) Leitsubstanzfragmente erzeugt sind;
iv) Kombinieren von in den Schritten (i)–(iii) erzeugten Leitsubstanzfragmenten, um einen hoch affinen Liganden zu gestalten. Die Kombination kann durch synthetische oder biologische Mittel erreicht werden. Zu den synthetischen Mitteln gehört die organische Synthese des kombinierten Liganden. Zu den biologischen Mitteln gehören Fermentation, oder Erzeugung des kombinierten Liganden über ein zelluläres Hilfsmittel oder System. Vorzugsweise ist das Zielmolekül ein Polypeptid. Die vorliegende Erfindung betrifft auch das wie oben wiedergegebene Verfahren, worin durch Kombination von Fragmenten ein Ligand mit einer höheren Bindungswirksamkeit (Kd) als die der einzelnen Fragmente zu dem Zielmolekül hergestellt wird.

Claims

Verfahren zur Gestaltung eines neuen Liganden für ein gegebenes Zielmolekül, das folgendes umfaßt: a) Identifizieren von mindestens zwei Liganden zu dem Zielmolekül, die an unterschiedliche Stellen des Zielmoleküls binden, unter Verwendung von zweidimendionaler ¹⁵N/¹H NMR Spektroskopie; b) Bilden von mindestens einem ternären Komplex, indem die mindestens zwei Liganden dem Zielmolekül ausgesetzt werden; c) Bestimmen der dreidimensionalen Struktur des Komplexes und der räumlichen Anordnung der mindestens zwei Liganden auf dem Zielmolekül; und d) Verwenden der in Schritt c) bestimmten räumlichen Anordnung, um den neuen Liganden zu gestalten, durch das Verknüpfen miteinander der mindestens zwei Liganden.
Verfahren nach Anspruch 1, worin Schritt a) folgendes umfaßt: i) Herstellen eines isotopenmarkierten Zielmoleküls, worin das Molekül mit einem NMR-detektierbaren Isotop angereichert ist; ii) Erzeugen eines zweidimendionalen ¹⁵N/¹H NMR-Spektrums des isotopenmarkierten Zielmoleküls; und iii) Screening des isotopenmarkierten Zielmoleküls, indem das Zielmolekül einer Vielzahl von Verbindungen ausgesetzt wird, um durch zweidimendionale ¹⁵N/¹H NMR-Spektroskopie die mindestens zwei Liganden zu identifizieren; und der neue Ligand wird basierend auf der Kombination der mindestens zwei Liganden gestaltet.
Verfahren nach Anspruch 2, das, dieser Gestaltung des neuen Liganden folgend, weiter die Herstellung des neuen Liganden mit synthetischen Mitteln umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die mindestens zwei Liganden ein erster und ein zweiter Ligand sind, wobei der zweite Ligand gleich oder verschieden ist wie der erste Ligand, und in Schritt b) wird ein ternärer Komplex gebildet.
Verfahren nach Anspruch 4, worin sich der erste Ligand vom zweiten Ligand unterscheidet.
Verfahren nach Anspruch 4 zur Gestaltung eines Arzneistoffs, der als ein neuer Ligand für ein gegebenes Zielmolekül dient, worin die ersten und zweiten Liganden jeweils in Schritt a) unter Verwendung von zweidimendionaler ¹⁵N/¹H NMR Korrelationsspektroskopie identifiziert werden, und die ersten und zweiten Liganden sind verbunden, um den Arzneistoff zu bilden, worin die räumliche Anordnung von Schritt c) beibehalten wird.
Verfahren nach Anspruch 6, worin die Identifizierung des ersten Liganden erreicht wird durch Erzeugen eines ersten zweidimensionalen ¹⁵N/¹H NMR Korrelationsspektrums eines einheitlich ¹⁵N-markierten Zielmoleküls, Aussetzen des markierten Zielmoleküls einer oder mehreren chemischen Verbindungen, Erzeugen eines getrennten zweidimensionalen ¹⁵N/¹H NMR Korrelationsspektrums für jede der Verbindungen, und Vergleichen von jedem Spektrum mit dem ersten Spektrum, um festzustellen, ob es in diesen Spektren Unterschiede gibt, wobei die Unterschiede die Anwesenheit eines ersten Liganden anzeigen würden, der an das Zielmolekül gebunden hat.
Verfahren nach Anspruch 6, worin die Identifizierung des zweiten Liganden erreicht wird, indem ein erstes zweidimensionales ¹⁵N/¹H NMR Korrelationsspektrum eines einheitlich ¹⁵N-markierten Zielmoleküls erzeugt wird, wobei das markierte Zielmolekül einer oder mehreren chemischen Verbindungen ausgesetzt wird, wobei ein getrenntes zweidimensionales ¹⁵N/¹H NMR Korrelationsspektrum für jede der Verbindungen erzeugt wird, und jedes Spektrum mit dem ersten Spektrum verglichen wird, um festzustellen, ob es in diesen Spektren Unterschiede gibt, wobei die Unterschiede die Anwesenheit eines zweiten Liganden anzeigen würden, der an das Zielmolekül gebunden hat.
Verfahren nach Anspruch 6, worin Schritt b) in Anwesenheit des ersten Liganden durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, worin die Unterschiede in den zweidimensionalen ¹⁵N/¹H NMR Korrelationsspektren chemische Shifts sind an bestimmten ¹⁵N-markierten Stellen im Zielmolekül und chemische Shifts in Protonen, die an diese ¹⁵N-markierten Stellen angeheftet sind.
Verfahren nach Anspruch 6, worin die dreidimensionale Struktur des ternären Komplexes unter Verwendung von NMR-Spektroskopie oder Röntgenkristallographie bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 6, worin das Zielmolekül ein Polypeptid ist.
Verfahren zur Erkennung von Liganden für Zielmoleküle unter Verwendung von Struktur-Wirksamkeits-Beziehungen, die aus kernmagnetischer Resonanz erhalten werden, das folgendes umfaßt: i) Screening von Verbindungen mit einem Molekulargewicht von 100 bis 300, die an eine Unterseite 1 eines gegebenen Zielmoleküls binden, wobei zweidimendionale ¹⁵N/¹H NMR zur Messung der Bindungsaffinität verwendet wird; ii) Screening von Analoga, hergestellt aus den Bindungsergebnissen, die in Schritt i) erhalten wurden, um die Bindung eines ersten Fragments an das Zielmolekül zu optimieren; iii) Screening für Verbindungen und entsprechende Analoga, die an eine in der Nähe gelegene Bindungsstelle, Unterseite 2, des Zielmoleküls binden, wobei zweidimendionale ¹⁵N/¹H NMR zur Messung der Bindungsaffinität verwendet wird, um die Bindung eines zweiten Fragments an das Zielmolekül zu optimieren; und iv) Kombinieren des ersten und zweiten Fragments, um einen Liganden zu entwerfen.
Verfahren nach Anspruch 13, worin das Zielmolekül ein Protein ist.
Verfahren nach Anspruch 13, worin der Ligand ein höheres Bindungspotential an das Zielmolekül hat als die Fragmente davon.