PT870197E - Utilizacao de ressonancia magnetica nuclear para projectar ligandos para biomoleculas alvo - Google Patents

Description

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DESCR1CA0 "Utilização de ressonância magnética nuclear para projectar ligandos para biomoléculas alvo"

Campo técnico da invenção A presente invenção refere-se a um método para a utilização de análise espectral de correlação de RMN ’°N/1H bidimensionai para projectar ligandos que se ligam a uma biomolécula alvo.

Antecedentes da invenção

Uma das mais poderosas ferramentas para a identificação de novas pistas de drogas consiste na pesquisa aleatória de bases de dados de produtos naturais e químicos sintéticos para identificar compostos que se ligam a uma molécula alvo particular {i.e., a identificação de ligandos desse alvo). Utilizando este método, podem-se identificar ligandos pela sua capacidade para formar uma associação física com uma molécula alvo ou pela sua capacidade para alterar uma função de uma molécula alvo.

Quando se procura uma ligação química, uma molécula alvo é tipicamente exposta a um ou mais compostos que se suspeita serem ligandos e realizam-se ensaios para determinar se se formam complexos entre a molécula alvo e um ou mais desses compostos. Estes ensaios, tal como é bem conhecido na arte, testam alterações grosseiras na molécula alvo (e.g., alterações de tamanho, carga, mobilidade) que indicam a formação do complexo.

Quando se medem alterações funcionais, estabelecem-se condições de ensaio que permitem a medição de um evento biológico ou químico relacionado com a molécula alvo (e.g., reacção catalisada por uma enzima, activação de uma enzima mediada por receptores). Para identificar uma alteração, a função da molécula alvo é determinada antes e após a exposição aos compostos de teste.

Os ensaios físicos e funcionais existentes têm sido utilizados com sucesso para identificar novas pistas de drogas para utilização no projecto de compostos terapêuticos. Existem contudo limitações inerentes a esses ensaios que comprometem a sua exactidão, fiabilidade e eficiência. 2 86 207 ΕΡ 0 870 197/ΡΤ

Uma das desvantagens principais dos ensaios existentes relaciona-se com o problema dos "falsos positivos". Num ensaio funcional típico, um "falso positivo" é um composto que desencadeia o ensaio mas é um composto que não é eficaz a eliciar a resposta fisiológica desejada. Num ensaio físico típico, um "falso positivo" é um composto que, por exemplo, se fixa ao alvo mas de uma maneira não específica (e.g., ligação não específica). Os falsos positivos são particularmente prevalecentes e problemáticos quando se pesquisam maiores concentrações de ligandos putativos porque muitos compostos têm efeitos não específicos nestas concentrações.

De maneira semelhante, os ensaios existentes são afectados pelo problema dos "falsos negativos", que resulta quando um composto dá uma resposta negativa no ensaio mas o composto é realmente um ligando para o alvo. Os falsos negativos ocorrem tipicamente nos ensaios que utilizam concentrações de compostos de teste que são, ou muito elevadas (resultando em toxicidade) ou muito baixas em relação à constante de ligação ou de dissociação do composto ao alvo.

Outra desvantagem principal dos ensaios existentes é a quantidade limitada de informação proporcionada pelo próprio ensaio. Embora o ensaio possa identificar correctamente compostos que se ligam a, ou eliciam uma resposta de uma molécula alvo, estes ensaios tipicamente não proporcionam qualquer informação acerca dos seus locais de ligação específica sobre a molécula alvo ou relações de estrutura - actividade entre o composto a testar e a molécula alvo. A incapacidade para proporcionar qualquer informação deste tipo é particularmente problemática quando o ensaio de pesquisa está a ser utilizado para identificar pistas para estudos adicionais.

Foi recentemente sugerido que a cristalografia de raios-x pode ser utilizada para identificar os locais de ligação de solventes orgânicos em macromoléculas. Contudo, este método não pode determinar as afinidades de ligação relativas em diferentes locais no alvo. Apenas é aplicável a proteínas alvo muito estáveis que não desnaturam na presença de altas concentrações de solventes orgânicos. Adicionalmente, esta abordagem não é um método de pesquisa para testar rapidamente muitos compostos que são quimicamente diversos, mas está limitada ao mapeamento dos locais de ligação de apenas

86 207 ΕΡ Ο 870 197/ΡΤ 3 alguns solventes orgânicos devido ao longo tempo necessário para determinar as estruturas cristalinas individuais.

Os compostos são pesquisados para identificar pistas que possam ser utilizadas no projecto de novas drogas que alteram a função da biomolécula alvo. Estas novas drogas podem ser análogos estruturais de pistas identificadas ou podem ser conjugados de um ou mais destes compostos pista. Devido aos problemas inerentes aos métodos de pesquisa existentes, estes métodos são frequentemente de pouco auxílio no projecto de novas drogas.

Fesik, S.W. et al., Biochemicat Pharmacoiogy, 40. páginas 161-167 (1990) revelam a utilização de espectroscopia de RMN multidimensional para determinar estruturas tridimensionais de complexos enzima-inibidor, como auxílio no projecto de drogas. Meadows, R.P. et ai, Biochemistry, 32, páginas 754-765 (1993) revelam a utilização de espectroscopia de RMN heteronuclear multidimensional para determinar estruturas tridimensionais de complexos proteína-ligando. Sugere-se que a estrutura resolvida podia auxiliar na identificação de ligandos com actividade biológica melhorada. WO 91/10140 revela a utilização de espectroscopia de RMN homonuclear multidimensional para modelar estruturas tridimensionais de ligandos num complexo biológico ligando-receptor. Este documento revela que a estrutura resolvida do ligando pode ser utilizada para projectar e sintetizar ligandos miméticos.

Continua a haver uma necessidade de proporcionar meios novos, rápidos, eficientes, precisos e fiáveis de pesquisa de compostos, para identificar e projectar ligandos que se ligam especificamente a um alvo particular.

Breve sumário da invenção

No seu principal aspecto, a presente invenção proporciona um processo para o projecto e identificação de compostos que se ligam a uma determinada biomolécula alvo. Esse processo compreende os passos de: a) a identificação um primeiro ligando para a molécula alvo utilizando espectroscopia de correlação de RMN 15N/1H bidimensional; b) a identificação de um segundo ligando para a molécula alvo utilizando espectroscopia de correlação de RMN 15N/1H bidimensional; c) a formação de um complexo ternário através da ligação dos primeiro e segundo ligandos à molécula alvo; d) a determinação da estrutura tridimensional do complexo ternário e assim a orientação espacial dos 4 (jJL-- 86 207 ΕΡ Ο 870 1 97/ΡΤ

Jr**' primeiro e segundo ligandos na molécula alvo; e) a ligação dos primeiro e segundo ligandos para formar a droga, em que se mantém a orientação espacial do passo (d).

Este aspecto da presente invenção utiliza o processo de pesquisa por espectroscopia de correlação de RMN 15N/’H bidimensionai, tal como estabelecido adiante, para identificar um primeiro e subsequentes ligandos que se ligam à molécula alvo. Forma-se um complexo da molécula alvo e dois ou mais ligandos e a estrutura tridimensional desse complexo é determinada preferivelmente utilizando espectroscopia de RMN ou cristalografia de raios-x. Essa estrutura tridimensional é utilizada para determinar a orientação espacial dos ligandos, uns em relação aos outros e à molécula alvo.

Com base na orientação espacial, os ligandos são ligados uns aos outros para formar a droga. A selecção de um grupo de ligação apropriado é feita mantendo a orientação espacial dos ligandos uns em relação aos outros e à molécula alvo com base em princípios de informação relativa a ângulo de ligação e comprimento de ligação bem conhecidos na arte da química orgânica.

Assim, o aspecto do projecto molecular da presente invenção compreende a identificação de uma porção primeiro ligando para uma molécula alvo utilizando espectroscopia de correlação de RMN 15N/1H bidimensionai; a identificação de subsequentes porções ligando para a molécula alvo utilizando espectroscopia de correlação de RMN 15N/1H bidimensionai; a formação de um complexo das primeira e subsequentes porções ligando com a molécula alvo; a determinação da estrutura tridimensional do complexo e, assim, a orientação espacial das primeira e subsequentes porções ligando sobre a molécula alvo; e a ligação das primeira e subsequentes porções ligando para formar a droga para manter a orientação espacial das porções ligando. A identificação de subsequentes porções ligando pode ser realizada na ausência ou na presença do primeiro ligando (e.g., a molécula alvo pode-se ligar ao primeiro ligando antes de ser exposta aos compostos de teste para identificação do segundo ligando).

Os compostos químicos podem ser pesquisados quanto a ligação a uma determinada biomolécula alvo através de um processo que envolve os passos 5 86 207 ΕΡ Ο 870 197/ΡΤ de a) primeiro gerar um primeiro espectro de correlação de RMN 15N/1H bidimensional de uma molécula marcada com 15N; b) expor a molécula alvo marcada a um composto químico ou mistura de compostos químicos; c) em seguida, gerar um segundo espectro de correlação de RMN ^Ν^Η bidimensional da molécula alvo marcada que foi exposta ao composto ou mistura de compostos no passo (b); e d) comparar os referidos primeiro e segundo espectros de correlação de RMN 15Ν/Ή bidimensionais para determinar as diferenças entre os referidos primeiro e segundo espectros, identificando as diferenças a presença de um ou mais compostos que são ligandos e que se ligaram à molécula alvo.

Quando o processo pesquisa mais do que um composto no passo (b), ou seja, uma mistura de compostos, e quando existe diferença entre o primeiro espectro gerado a partir da molécula alvo sozinha e o gerado a partir da molécula alvo na presença da mistura, são realizados passos adicionais para identificar que composto ou compostos específicos contidos na mistura se ligam à molécula alvo. Estes passos adicionais compreendem os passos de e) expor a molécula alvo marcada com 15N individualmente a cada composto da mistura, f) gerar um espectro de correlação de RMN 15N/'H bidimensional da molécula alvo marcada que foi individualmente exposta a cada composto; e g) comparar cada espectro gerado no passo f) com o primeiro espectro gerado pela molécula alvo sozinha para determinar diferenças em quaisquer desses espectros comparados, identificando as diferenças a presença de um composto que é um ligando que se ligou à molécula alvo.

Como os valores dos desvios químicos dos sinais particulares de 15N/1H no espectro de correlação bidimensional correspondem a localizações específicas conhecidas de agrupamentos atómicos na molécula alvo {e.gos átomos de N-H da ligação amida ou peptídica de um determinado resíduo de aminoácido num polipéptido), o processo de pesquisa permite não apenas a identificação de que composto ou compostos se ligam a uma determinada molécula alvo, como também permite a determinação do local de ligação, em particular, do ligando sobre a molécula alvo.

A constante de dissociação, KD, para um determinado ligando e sua molécula alvo, pode ser determinada por este processo, se desejado, realizando os passos de a) gerar um primeiro espectro de correlação de RMN 15N/’H 6 86 207 ΕΡ 0 870 197/ΡΤ bidimensional de uma molécula alvo marcada com 15N; b) expor a molécula alvo marcada a várias concentrações de um ligando; c) gerar um espectro de correlação de RMN 15N/1H bidimensional a cada concentração de ligando no passo b); d) comparar cada espectro do passo c) com o primeiro espectro do passo a); e e) calcular a constante de dissociação entre a moiécula alvo e o ligando, a partir das diferenças, de acordo com a equação: KD = ([PIn - X) ([L]η - X)

X

Uma capacidade vantajosa do método de pesquisa é a sua capacidade para determinar a constante de dissociação de um ligando da molécula alvo na presença de uma segunda molécula já ligada ao ligando. Isto geralmente não é possível com métodos da arte anterior que empregam métodos analíticos de "química em molhado" de determinação da ligação de um ligando a um substrato molécula alvo. O processo de determinação da constante de dissociação de um ligando pode ser realizado na presença de um segundo ligando ligado. Em acordo, a molécula alvo marcada com 15N é ligada a esse segundo ligando antes da exposição desse alvo aos compostos de teste. A capacidade do método de pesquisa para determinar não apenas a existência de ligação entre um ligando e a moiécula alvo, mas também o local de ligação em particular, na presença de um segundo ligando ligado, permite a capacidade para projectar uma droga que compreende duas ou mais porções ligadas feitas dos ligandos.

Numa concretização preferida da presente invenção, a molécula alvo utilizada no processo de projecto molecular é um polipéptido. O polipéptido alvo é preferivelmente produzido numa forma recombinante a partir de uma célula hospedeira transformada com um vector de expressão que contém um polinucleótido que codifica o polipéptido, através da cultura da célula hospedeira transformada num meio que contém uma fonte assimilável de 15N tal que o polipéptido produzido recombinantemente fica marcado com 15N.

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Breve descricão dos desenhos

Nos desenhos que fazem parte do fascículo: A FIG. 1 mostra um espectro de correlação de 15N/1H do domínio de ligação a ADN de E2 de papilomavírus humano marcado uniformemente com 15N. O espectro (80 pontos complexos, 4 varrimentos/fid) foi obtido com uma amostra 0,5 mM de E2 em fosfato 20 mM (pH 6,5), ditiotreitol (DTT) 10 mM e óxido de deutério (D20) a 10%. A FIG. 2 mostra os espectros de correlação de 15N/1H do domínio de ligação a ADN de E2 de papilomavírus humano marcado uniformemente com 15N antes (contornos múltiplos finos) e após (contornos simples grossos) a adição de um composto de teste final. A concentração final de composto foi de 1,0 mM. Todas as outras condições são as descritas na FIG. 1. Estão indicados os resíduos seleccionados que apresentam alterações significativas após ligação. A FIG. 3 mostra os espectros de correlação de 15N/1H do domínio de ligação a ADN de E2 de papilomavírus humano uniformemente marcado com 15N antes (contornos múltiplos finos) e após (contornos simples grossos) da adição de um segundo composto de teste. A concentração final de composto foi de 1,0 mM. Todas as outras condições são as descritas na FIG. 1. Estão indicados os resíduos seleccionados que apresentam alterações significativas após ligação. A FIG. 4 mostra os espectros de correlação de 15N/1H do domínio catalítico de estromelisina marcada com 15N antes (contornos múltiplos finos) e depois (contornos simples grossos) da adição de um composto de teste. A concentração final de composto foi de 1,0 mM. Os espectros (80 pontos complexos, 8 varrimentos/fid) foram obtidos com uma amostra 0,3 mM de SCD em TRIS 20 mM (pH 7,0), CaCI2 20 mM e D20 a 10%. Estão indicados os resíduos seleccionados que apresentam alterações significativas após ligação. A FIG. 5 mostra os espectros de correlação de 15N/1 H do domínio de ligação a Ras de péptido RAF uniformemente marcado com 15N (resíduos 55-132) antes (contornos múltiplos finos) e depois (contornos simples grossos) da adição de um composto de teste. A concentração final de composto foi de 86 207 ΕΡ Ο 870 197/ΡΤ 8 /Ρ**' 1,0 mM. Os espectros (80 pontos complexos, 8 varrimentos/fid) foram obtidos com uma amostra 0,3 mM do fragmento de RAF em fosfato 20 mM (pH 7,0), DTT 10 mM, e D20 a 10%. Estão indicados os resíduos seleccionados que apresentam alterações significativas após ligação. A FIG. 6 mostra os espectros de correlação de 15N/1H de FKBP uniformemente marcada com 15N antes (contornos múltiplos finos) e depois (contornos simples grossos) da adição de um composto de teste. A concentração final de composto foi de 1,0 mM. Os espectros (80 pontos complexos, 8 varrimentos/fid) foram obtidos numa amostra 0,3 mM de FKBP em fosfato 50 mM (pH 6,5), NaCI 100 mM e D20 a 10%. Estão indicados os resíduos seleccionados que apresentam alterações significativas após ligação. A FIG. 7 mostra uma primeira representação da estrutura derivada por RMN do domínio de ligação a ADN de E2. Os dois monómeros do dímero simétrico estão orientados de topo para fundo, e os terminais C e N de cada monómero estão indicados (N e C para um monómero, N* e C* para o outro). Em fitas representam-se os resíduos que exibem alterações de desvios químicos significativas (Δδ(1Η)>0,04 ppm; (Δδ(15Ν)>0,1 ppm) após ligação a um primeiro composto de teste. Estes resíduos correspondem à hélice de reconhecimento de ADN de E2. Os resíduos seleccionados estão numerados para auxílio na visualização. A FIG. 8 mostra uma segunda representação da estrutura derivada por RMN do domínio de ligação a ADN de E2. Os dois monómeros do dímero simétrico estão orientados de topo para fundo, e os terminais C e N de cada monómero estão indicados (N e C para um monómero, N* e C* para o outro). Em fitas representam-se os resíduos que exibem alterações de desvios químicos significativas (Δδ(1Η)>0,04 ppm; (Δδ(15Ν)>0,1 ppm) após ligação a um segundo composto de teste. Estes resíduos estão principalmente localizados na região de interface do dímero. Os resíduos seleccionados estão numerados para auxílio na visualização. A FIG. 9 mostra uma representação da estrutura derivada por RMN do domínio catalítico da estromelisina. Estão indicados os terminais C e N. Em fitas representam-se os resíduos que exibem alterações de desvios químicos significativas (Δδ(1Η)>0,04 ppm; (Δδ(15Ν)>0,1 ppm) após ligação a um

86 207 ΕΡ 0 870 197/ΡΤ composto de teste. Estes fazem parte do local de ligação S1' ou estão espacialmente próximos deste local. Os resíduos seleccionados estão numerados para auxílio na visualização. A FIG. 10 mostra uma representação em fitas de um complexo ternário dos primeiro e segundo ligandos ligados ao domínio catalítico da estromelisina. A FIG. 11 mostra a correlação entre os dados de ligação de RMN e uma vista da estrutura tridimensional derivada por RMN de FKBP. A FIG. 12 mostra uma representação em fitas de um complexo ternário que envolve FKBP, um fragmento anáiogo a ascomicina, e um composto de benzanilida.

Descricão detalhada da invenção A presente invenção proporciona um método rápido e eficiente para o projecto de ligandos que se ligam a moléculas alvo terapêuticas.

Os ligandos são identificados através de testes à ligação de moléculas a uma molécula alvo {e.g., proteína, ácido nucleico, etc.) seguindo, com espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) as alterações nos desvios químicos da molécula alvo por adição dos compostos ligandos na base de dados. A partir de uma análise às alterações dos desvios químicos da molécula alvo em função da concentração de ligando, determinam-se também as afinidades de ligação dos ligandos para com as biomoléculas. A localização do local de ligação para cada ligando é determinada a partir de uma análise dos desvios químicos da biomolécula que variam por adição do ligando e a partir de efeitos nucleares de Overhauser (NOE) entre o ligando e a biomolécula. A informação acerca das relações estrutura/actividade entre ligandos identificados por este processo pode então ser utilizada para projectar novas drogas que servem como ligandos à molécula alvo. Por exemplo, quando são identificados dois ou mais ligandos para uma determinada molécula alvo,

86 207 ΕΡ Ο 870 197/ΡΤ forma-se um complexo desses ligandos e da molécula alvo. A orientação espacial dos ligandos uns em relação aos outros, bem como em relação à molécula alvo, é calculada a partir da estrutura tridimensional. Essa orientação espacial define a distância entre os locais de ligação dos dois ligandos e a orientação de cada ligando a esses locais.

Utilizando esses dados de orientação espacial, ligam-se então os dois ou mais ligandos uns aos outros para formar um novo ligando. A ligação é realizada de maneira a manter a orientação espacial dos ligandos uns em relação aos outros e à molécula alvo.

Existem numerosas vantagens dos processos de identificação e projecto à base de RMN da presente invenção. Em primeiro lugar, como um processo da presente invenção identifica ligandos através da medição directa da ligação à molécula alvo, o problema dos falsos positivos é significativamente reduzido. Como o presente processo identifica locais de ligação específica da molécula alvo, o problema dos falsos positivos resultante da ligação não específica de compostos à molécula alvo a altas concentrações é eliminado.

Em segundo lugar, o problema dos falsos negativos é significativamente reduzido pois o presente processo pode identificar compostos que se ligam especificamente à molécula alvo com uma vasta gama de constantes de dissociação. A constante de dissociação ou de ligação dos compostos pode realmente ser determinada com o presente processo.

Outras vantagens da presente invenção resultam da variedade e detalhe dos dados proporcionados acerca de cada ligando a partir dos processos de identificação e projecto.

Como a localização do ligando ligado pode ser determinada a partir de uma análise dos desvios químicos da molécula alvo que se alteram por adição do ligando e a partir dos efeitos nucleares de Overhauser (NOE) entre o ligando e a biomolécula, a ligação de um segundo ligando pode ser medida na presença de um primeiro ligando que esteja já ligado ao alvo. A capacidade de identificar simultaneamente locais de ligação de diferentes ligandos permite a um perito 1) definir ligação cooperativa positiva e negativa entre os ligandos e 2) o projecto de novas drogas através da ligação de dois ou mais ligandos a um único 11 86 207 ΕΡ Ο 870 197/ΡΤ composto enquanto mantendo uma orientação correcta dos ligandos uns em relação aos outros e aos seus locais de ligação.

Adicionalmente, se existirem múltiplos locais de ligação, a afinidade relativa de porções de ligação individuais para os diferentes locais de ligação pode ser medida a partir de uma análise das alterações dos desvios químicos da molécula alvo em função da concentração adicionada do ligando. Pesquisando simultaneamente numerosos análogos estruturais de um determinado composto, proporcionam-se relações detalhadas de estrutura/actividade acerca dos ligandos.

Em parte, a presente invenção proporciona um processo de pesquisa de compostos para identificar ligandos que se ligam a uma molécula alvo específica. Esse processo compreende os passos de: a) gerar um primeiro espectro de correlação de RMN 15N/1H bidimensional de uma molécula marcada com 15N; b) expor a molécula alvo marcada a um ou mais compostos c) gerar um segundo espectro de correlação de RMN 15N/’H bidimensional da molécula alvo marcada que foi exposta aos compostos no passo (b); e d) comparar os primeiro e segundo espectros para determinar se existem diferenças entre os dois espectros, diferenças essas que indicam a presença de um ou mais ligandos que se ligaram à molécula alvo.

Quando um processo da presente invenção pesquisa mais do que um composto no passo (b) e quando é observada uma diferença entre os espectros, são realizados passos adicionais para identificar que composto específico se liga às moléculas alvo. Esses passos adicionais compreendem gerar um espectro de correlação de RMN 15N/1H bidimensional para cada composto individual e comparar cada espectro com o primeiro espectro para determinar se existem diferenças em qualquer desses espectros comparados, diferenças essas que indicam a presença de um ligando que se tenha ligado à molécula alvo.

Pode ser utilizada qualquer molécula alvo marcada com 15N num processo da presente invenção. Devido à importância das proteínas na química médica, um polipéptido é uma molécula alvo preferida. A molécula alvo pode ser marcada com 15N utilizando qualquer meio bem conhecido na arte. Numa concretização preferida, a molécula alvo é preparada na forma recombinante utilizando células hospedeiras transformadas. Numa concretização 12 86 207 ΕΡ 0 870 197/ΡΤ especialmente preferida, a molécula alvo é um polipéptido. Pode-se utilizar qualquer polipéptido que origine um espectro de RMN de alta resolução e possa ser parcial ou uniformemente marcado com 15N. A preparação de moléculas polipeptídicas alvo uniformemente marcadas com 15N exemplificativas é apresentada adiante nos Exemplos.

Um meio preferido para a preparação de quantidades adequadas de poiipéptidos uniformemente marcados com 15N consiste em transformar uma célula hospedeira com um vector de expressão que contém um polinucleótido que codifica esse polipéptido e efectuar a cultura da célula transformada num meio de cultura que contém fontes assimiláveis de 15N. As fontes assimiláveis de 15N são bem conhecidas na arte. Uma destas fontes preferida é 15NH4CI.

Os meios para preparar vectores de expressão que contêm polinucleótidos que codificam poiipéptidos específicos são bem conhecidos na arte. De uma maneira semelhante, os meios para transformar células hospedeiras com aqueles vectores e os meios para a cultura dessas células transformadas de modo a que o polipéptido seja expresso, são também conhecidos na arte. O processo de pesquisa inicia-se com a produção ou obtenção de um espectro de correlação de RMN 15N/1H bidimensional da molécula alvo marcada. Os meios para gerar espectros de correlação de RMN ,5N/'H bidimensionais são bem conhecidos na arte [Veja-se, e.g., D.A. Egan, et a!., Biochemistry, 32:8, páginas 1920-1927 (1993); Bax, A., Grzesiek, S., Acc. Chem. Res., 26:4, páginas 131-138 (1993)].

Os espectros de RMN que são tipicamente registados no procedimento de pesquisa da presente invenção são espectros de correlação quântica simples heteronuclear (HSQC) de 15N/1H bidimensional. Como os sinais de 15N/1H correspondentes às amidas do esqueleto das proteínas são usualmente bem resolvidos, as alterações dos desvios químicos das amidas individuais são facilmente monitorizadas.

Ao gerar estes espectros, o sinal grande da água é suprimido por gradientes de destruição. Para facilitar a obtenção dos dados de RMN de um grande número de compostos {e.g., uma base de dados de compostos

86 207 ΕΡ 0 870 197/ΡΤ orgânicos pequenos sintéticos ou de ocorrência natural), emprega-se um permutador de amostras. Utilizando um permutador de amostras podem-se operar sem acompanhamento um total de 60 amostras. Assim, utilizando os parâmetros de aquisição típicos (4 varrimentos por decaimento de indução livre (fid - "free induction decay")), podem-se obter 100-120 espectros HSQC num período de 24 horas.

Para facilitar o processamento dos dados de RMN, utilizam-se programas de computador para transferir e processar automaticamente os múltiplos conjuntos de dados de RMN bidimensionais, incluindo uma rotina para fasear automaticamente os dados de RMN bidimensionais. A análise dos dados pode ser facilitada pela formatação dos dados de modo a que os espectros de HSQC individuais sejam rapidamente visualizados e comparados com o espectro de HSQC da amostra de controlo contendo apenas o veículo para o composto adicionado (DMSO), mas sem composto adicionado. As descrições detalhadas dos meios para gerar estes espectros de correlação de 15Ν/Ή bidimensionais são apresentadas adiante nos Exemplos. É mostrado na FIG. 1 um espectro de correlação de RMN 15N/1H bidimensional representativo de uma molécula alvo (polipéptido) marcada com 15N (o domínio de ligação a ADN da proteína E2).

Após a obtenção do primeiro espectro, expõe-se a molécula alvo marcada a um ou mais compostos de teste. Quando se pretende testar mais do que um composto de teste simultaneamente, prefere-se utilizar uma base de dados de compostos tais como uma pluralidade de pequenas moléculas. Estas moléculas são tipicamente dissolvidas em dimetilsulfóxido perdeuterado. Os compostos na base de dados podem ser adquiridos a vendedores ou criados de acordo com as necessidades.

Os compostos individuais podem ser seleccionados inter alia com base no tamanho (peso molecular = 100-300) e na diversidade molecuiar. Os compostos na colecção podem ter diferentes formatos (e.g., anéis aromáticos planares, anéis alifáticos dobrados, cadeias alifáticas lineares e ramificadas com ligações simples, duplas ou triplas) e diversos grupos funcionais (e.g., ácidos carboxílicos, ésteres, éteres, aminas, aldeídos, cetonas e vários anéis 14 86 207 ΕΡ Ο 870 197/ΡΤ heterocíclicos) para maximizar a possibiiidade de identificar compostos que interagem com locais de ligação amplamente diversos. O processo de pesquisa por RMN utiliza concentrações de ligando que variam de cerca de 0,1 a cerca de 10,0 mM. Nestas concentrações, os compostos que são ácidos ou básicos podem alterar significativamente o pH de soluções de proteínas tamponadas. Os desvios químicos são sensíveis a alterações de pH bem como a interacções de ligação directa, e podem portanto ser observadas alterações de desvios químicos "falsos positivos", que não são o resultado de ligação de ligandos mas de alterações de pH. É assim necessário assegurar que o pH da solução tamponada não se altera por adição do ligando. Um meio para controlar o pH é adiante estabelecido.

Os compostos são armazenados a 263°K em soluções de reserva 1,0 e 0,1 M em dimetilsulfóxido (DMSO). Isto é necessário devido à limitada solubilidade dos ligandos em solução aquosa. Não é possível ajustar directamente o pH da solução em DMSO. Em adição, o HCI e o NaOH formam sais insolúveis em DMSO, pelo que têm que ser utilizados ácidos e bases alternativos. Verificou-se que a abordagem seguinte resulta num pH estável.

Diluem-se de 1:10 em fosfato 50 mM, pH 7,0, as soluções de reserva 1,0 M em DMSO. Mede-se o pH dessa solução alíquota diluída. Se o pH da alíquota estiver inalterado (i.e., permanecer a 7,0), faz-se uma solução de trabalho diluindo a solução de reserva em DMSO de 1:10 para preparar uma solução 0,1 M e armazena-se essa solução.

Se o pH da alíquota diluída for inferior a 7,0, adiciona-se etanolamina à solução de reserva 1,0 M em DMSO, dilui-se então essa solução de reserva de 1:10 com tampão fosfato para preparar outra alíquota e verifica-se novamente o pH da alíquota.

Se o pH da alíquota diluída for superior a 7,0 adiciona-se ácido acético à solução de reserva em DMSO 1,0 M, dilui-se então essa solução de reserva de 1:10 com tampão fosfato para preparar outra alíquota e verifica-se novamente o pH da alíquota.

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ΕΡ 0 870 197/PT A etanolamina e o ácido acético são solúveis em DMSO e adicionam-se os equivalentes correctos para assegurar que após transferência para tampão aquoso, o pH permanece inalterado. 0 ajustamento do pH é um processo interactivo, repetido até se obter o resultado desejado.

Note-se que este procedimento é realizado em diluições de 1:10 de soluções de reserva 1,0 M (ligando 100 mM) para assegurar que não se observam alterações de pH nas concentrações menores utilizadas nas experiências (0,1 a 10 M) ou em sistemas tampão diferentes/mais fracos.

Após exposição da molécula alvo marcada com 15N a um ou mais compostos de teste, gera-se um segundo espectro de correlação de RMN 15N/1H bidimensional. Esse segundo espectro é gerado da mesma maneira que se descreveu atrás. Os primeiro e segundo espectros são então comparados para determinar se existem quaisquer diferenças entre os dois espectros. As diferenças nos espectros de correlação de RMN ^Ν/’Η bidimensionais que indicam a presença de um ligando correspondem a locais marcados com 15N na molécula alvo. Essas diferenças são determinadas utilizando procedimentos Standard bem conhecidos na arte.

Como exemplo, as FIG. 2, 3, 4, 5 e 6 mostram comparações de espectros de correlação antes e após a exposição de várias moléculas alvo a vários compostos de teste. Pode-se encontrar adiante, nos Exemplos 2 e 3, uma descrição detalhada de como estes estudos são realizados.

Os sinais particulares num espectro de correlação de RMN ^Ν/’Η bidimensional correspondem a átomos de azoto e protões específicos na molécula alvo (e.g., amidas particulares dos resíduos de aminoácido na proteína). Como exemplo, pode-se observar da FIG. 2 que os desvios químicos numa correlação de 15N/’H bidimensional do domínio de ligação a ADN de E2 exposto a um composto de teste ocorreram nas posições dos resíduos 15 (115), 21 (Y21), 22 (R22) e 23 (L23).

Pode-se observar da FIG. 2 que a ligação do ligando envolveu o resíduo isoleucina (lie) na posição 15, o resíduo tirosina (Tyr) na posição 21, o resíduo arginina (Arg) na posição 22 e o resíduo leucina (Leu) na posição 23. Assim, um

86 207 ΕΡ Ο 870 197/ΡΤ 16 processo da presente invenção também pode ser utilizado para identificar o local de ligação específica entre um ligando e a molécula alvo. A região da proteína que é responsável pela ligação aos compostos individuais é identificada a partir dos sinais das amidas particulares que se alteram após a adição dos compostos. Estes sinais são atribuídos aos grupos amida individuais da proteína por procedimentos Standard utilizando uma variedade de experiências de RMN pluridimensionais heteronucleares bem estabelecidas.

Para identificar moléculas que se ligam mais fortemente à proteína, as moléculas são seleccionadas para testes com base nas relações estrutura/actividade obtidas da pesquisa inicial e/ou na informação estrutural sobre as pistas iniciais quando ligadas à proteína. Como exemplo, a pesquisa inicial pode resultar na identificação de ligandos, todos contendo um anel aromático. O segundo ciclo de pesquisa utilizaria então outras moléculas aromáticas como compostos de teste.

Tal como aqui adiante se descreve no Exemplo 2, um ensaio de pesquisa inicial à ligação ao domínio catalítico de estromelisina identificou dois compostos biarilo como ligandos. O segundo ciclo de pesquisa utilizou assim uma série de derivados biarilo como compostos de teste. O segundo conjunto de compostos de teste é iniciaimente pesquisado numa concentração de 1 mM, e as constantes de ligação são medidas para aqueles que apresentam afinidade. As melhores pistas que se ligam à proteína são então comparadas com os resultados obtidos num ensaio funcional. Os compostos que são pistas adequadas são quimicamente modificados para produzir análogos com o objectivo de identificar um novo agente farmacêutico. O presente método proporciona também um processo para a determinação da constante de dissociação entre uma molécula alvo e um ligando que se liga a essa molécula alvo. Esse processo compreende os passos de: a) gerar um espectro de correlação de RMN 15N/1H bidimensional de uma molécula alvo marcada com 15N; b) titular a molécula alvo marcada com várias concentrações de um ligando; c) gerar um espectro de correlação de RMN '5N/1H bidimensional de cada concentração de ligando do passo (b); d) comparar 17 86 207 ΕΡ 0 870 197/ΡΤ cada espectro do passo (c) tanto com o primeiro espectro do passo (a) como com todos os outros espectros do passo (c) para quantificar diferenças nesses espectros em função das alterações na concentração de ligando; e e) calcular a constante de dissociação (KD) entre a molécula alvo e o ligando a partir dessas diferenças.

Devido à sua importância na química médica, uma molécula alvo preferida para utilizar neste processo é um polipéptido. Numa concretização preferida, um processo para determinação da constante de dissociação de um ligando pode ser realizado na presença de um segundo ligando. De acordo com esta concretização, a molécula alvo marcada com 15N é ligada a esse segundo ligando antes da exposição desse alvo aos compostos de teste.

As constantes de dissociação ou de ligação são medidas seguindo os desvios químicos de 15N/’H da proteína em função da concentração de ligando. Mistura-se uma concentração conhecida ([P0]} da molécula alvo com uma concentração conhecida ([Lc]) de um ligando previamente identificado e obtém-se o espectro de correlação de 15N/1H bidimensional. Deste espectro obtêm-se os valores dos desvios químicos observados (§obs). Repete-se o processo para várias concentrações do ligando até ao ponto de saturação da molécula alvo, quando possível, caso em que é medido o valor de desvio químico limitante para a saturação (§sat).

Nas situações em que se atinge a saturação da molécula alvo, a constante de dissociação para a ligação de um ligando particular à molécula alvo é calculada utilizando a fórmula: K0 = UP]q - X) ([L]n - x) x onde [P]0 é a concentração molar total da molécula alvo; [L]0 é a concentração molar total de ligando; e x é a concentração molar das espécies ligadas. O valor de x é determinado a partir da equação: * — frobs ~ Aliv/re Δ

86 207 ΕΡ 0 870 197/ΡΤ 18 onde Ôlivre é o desvio químico das espécies livres; ôobs é o desvio químico observado; e Δ é a diferença entre o valor do desvio químico limitante para a saturação (ôsat) e o valor do desvio químico da molécula alvo isenta de ligando (Ò|jvre) A constante de dissociação é então determinada fazendo variar o seu valor até se obter o melhor ajustamento aos dados observados utilizando métodos estatísticos Standard de ajustamento de curvas. No caso em que ôsat não é conhecido directamente, tanto KD como ô3a, são variados e submetidos ao mesmo procedimento de ajustamento de curvas. A utilização do processo atrás descrito para determinar a afinidade de dissociação ou de ligação de vários ligandos a várias moléculas alvo é descrita adiante nos Exemplos 2 e 3.

As moléculas alvo, os meios para gerar os espectros e os meios para a comparação dos espectros, preferidos, são os mesmos que atrás de estabeleceu.

No seu aspecto principal, a presente invenção proporciona um processo para o projecto de novos ligandos que se ligam a uma molécula alvo específica por ligação conjunta de duas ou mais moléculas que se ligam à molécula alvo. 0 passo inicial num processo de projecto é a identificação de dois ou mais ligandos que se ligam à molécula alvo específica. A identificação desses ligandos é realizada utiiizando espectroscopia de correlação de RMN ^Ν/’Η bidimensional como atrás exposto.

Uma vez identificados dois ou mais ligandos como se ligando à molécula alvo em locais diferentes, forma-se um complexo entre a molécula alvo e os ligandos. Quando existem dois ligandos, esse complexo é um complexo ternário. Formam-se complexos quaternários e outros quando existem três ou mais ligandos.

Formam-se os complexos misturando a molécula alvo simultânea ou sequencialmente com os vários ligandos, sob circunstâncias que permitam que 19 19 86 207 ΕΡ 0 870 197/ΡΤ

ÍÍT TF**?' esses ligandos se liguem ao alvo. Os meios para a determinação dessas condições são bem conhecidos na arte.

Uma vez formado esse complexo, determina-se a sua estrutura tridimensional. Pode ser utilizado qualquer meio de determinação da estrutura tridimensional. Estes métodos são bem conhecidos na arte. Os métodos exemplificativos e preferidos são RMN e cristalografia de raios-x. A utilização de RMN de ressonância dupla e tripla tridimensional para determinar a estrutura tridimensional de dois ligandos ligados ao domínio catalítico da estromelisina é descrita em detalhe no Exemplo 4.

Uma análise da estrutura tridimensional revela a orientação espacial dos ligandos em relação uns aos outros bem como à conformação da molécula alvo. Primeiro, a orientação espacial de cada ligando em relação à molécula alvo permite a identificação das porções do ligando directamente envolvidas na ligação (i.e., as porções que interactuam com o locai de ligação do alvo) e as porções de cada ligando que se projectam para fora a partir do local de ligação, porções estas que podem ser utilizadas em subsequentes procedimentos de ligação.

Em segundo lugar, os dados de orientação espacial são utilizados para mapear as posições de cada ligando em relação uns aos outros. Por outras palavras, podem ser calculadas distâncias discretas entre os ligandos espacialmente orientados.

Em terceiro lugar, os dados de orientação espacial definem também as relações tridimensionais entre os ligandos e o alvo. Assim, em adição ao cálculo das distâncias absolutas entre ligandos, podem ser determinadas também as orientações angulares desses ligandos. O conhecimento das orientações espaciais dos ligandos e do alvo é então utilizado para seleccionar ligantes para ligar dois ou mais ligandos conjuntamente numa única entidade que contém todos os ligandos. 0 projecto dos ligantes baseia-se nas distâncias e na orientação angular necessárias para manter cada uma das porções de ligando da entidade única na orientação correcta em relação ao alvo. 20 86 207 ΕΡ 0 870 197/ΡΤ A conformação tridimensional de ligantes adequados é bem conhecida ou é prontamente determinável por um perito na arte. Embora seja teoricamente possível ligar dois ou mais ligandos conjuntamente ao longo de qualquer gama de distâncias e projecções tridimensionais, na prática, preferem-se certas limitações de distância e projecção. Numa concretização preferida, os ligandos estão separados de uma distância inferior a cerca de 15Angstrom (Â), mais preferivelmente inferior a cerca de 10 Á e, ainda mais preferivelmente, inferior a cerca de 5 Â.

Uma vez identificado um grupo ligante adequado, os ligandos são ligados a esse ligante. Os meios para a ligação de ligandos são bem conhecidos na arte e dependem da estrutura química do ligando e do próprio grupo de ligação. Os ligandos são ligados uns aos outros utilizando as porções do ligando que não estão directamente envolvidas na ligação à molécula alvo. É apresentada seguidamente, no Exemplo 4, uma descrição detalhada do projecto de uma droga que inibe a actividade proteolítica da estromelisina, droga esta que foi projectada utilizando um processo da presente invenção.

Os Exemplos que se seguem ilustram concretizações preferidas da presente invenção e não limitam de nenhum modo a descrição e as reivindicações.

Exemplo 1

Preparação de moléculas alvo uniformemente marcadas com 15N A. Estromelisina A estromelisina humana é uma proteína de 447 aminoácidos que se crê estar envolvida na degradação proteolítica da cartilagem. Crê-se que a proteólise da cartilagem resulta na perda degradativa de cartilagem de articulações e no resultante prejuízo da função da articulação observada tanto na osteoartrite como na artrite reumatóide. A proteína possui uma série de domínios incluindo domínios N-terminais latentes e de propéptido, um domínio C-terminal homólogo à homopexina e um domínio catalítico interno.

Estudos mostraram que a remoção da pro-sequência N-terminal de aproximadamente oitenta aminoácidos ocorre para converter a pro-enzima na enzima madura de 45 kDa. Adicionaimente, estudos mostraram que o domínio

86 207 ΕΡ 0 870 1 97/ΡΤ homólogo de homopexina C-terminal não é necessário para a dobragem correcta do domínio catalítico ou para a interacção com um inibidor. (Veja-se, e.g., A.l. Marcy, Biochemistry, 30: 6476-6483 (1991). Assim, o segmento interno de 81-256 resíduos de aminoácido da estromelisina foi seleccionado como o fragmento da proteína para utilização na identificação de compostos que se ligam a, e têm potencial para actuar como inibidores de estromelisina.

Para empregar o método da presente invenção, foi necessário preparar o fragmento 81-256 (SEQIDNO:1) da estromelisina em que o esqueleto peptídico foi isotopícamente enriquecido com 15N. Isto foi realizado inserindo um plasmídeo que codificava para a produção do fragmento da proteína numa estirpe de E. coli e fazendo o crescimento da estirpe bacteriana geneticamente modificada num meio de cultura limitante enriquecido com 15NH4CI e 15C-giucose. 0 fragmento da proteína enriquecido isotopícamente foi isolado a partir do meio de cultura, purificado e subsequentemente foi utilizado como base para a avaliação da ligação de compostos de teste. Os procedimentos para estes processos são descritos adiante.

Cresceram-se fibroblastos de pele humana (ATCC n°. CRL 1507) e induziram-se utilizando o procedimento descrito por Clark et a/., Archiv. Biochem. and Biophys., 241:36-45 (1985). Isolou-se o ARN total a partir de 1 g de células utilizando um estojo de sistema de isolamento de ARN total Promega RNAgents® (Cat.#Z5110, Promega Corp., 2800 Woods Hollow Road, Madison, Wl 5371 1 -5399), seguindo as instruções do fabricante. Desnaturou-se pelo calor uma porção de 1 pg do ARN, a 80°C durante cinco minutos, e depois submeteu-se a PCR com transcriptase inversa utilizando um estojo de PCR para ARN GeneAmp® (Cat.#N808-001 7, Applied Biosystems/Perkin-Elmer, 761 Main Avenue, Norwalk, CT 6859-0156) seguindo as instruções do fabricante.

Realizou-se a PCR nidificada utilizando primeiro os iniciadores (A) GAAATGAAGAGTCTTCAA (SEQ ID N0:3) e (B) GCGTCCCAGGTTCTGGAG (SEQ ID NO:4) e trinta e cinco ciclos de 94°C, dois minutos; 45°C, dois minutos; e 72°C três minutos. Isto foi seguido por reamplificação com os iniciadores internos (C) ATACCATGGCCTATCCAT TGGATGGAGC (SEQ ID N0:5) e (D) ATAGGATCCTTAGGTCTCAGGGGA GTCAGG 22 86 207 ΕΡ 0 870 197/ΡΤ (SEQ ID ΝΟ:6) utilizando trinta ciclos sob as mesmas condições que se descreveram imediatamente acima para gerar um ADN codificante para os resíduos de aminoácido 1-256 da estromelisina humana. O fragmento de PCR foi então clonado no vector de clonagem de PCR pT7Blue(R) (Novagen, Inc., 597 Science Drive, Madison, Wl 53711) de acordo com as instruções do fabricante. O plasmídeo resultante foi cortado com Ncol e BamHI e o fragmento de estromelisina foi subcionado no vector de expressão da Novagen pET3d (Novagen, Inc., 597 Science drive, Madison, Wl 53711), novamente utilizando as instruções do fabricante.

Uma construção de expressão de estromelisina madura codificando para os resíduos de aminoácido 81-256 mais uma metionina de iniciação, foi gerada a partir da construção de expressão de 1-256 por amplificação por PCR. O fragmento resultante da PCR foi primeiro clonado no vector pT7Blue(R) da Novagen e depois subcionado no vector pET3d da Novagen, utilizando as instruções do fabricante da maneira acima descrita, para produzir o plasmídeo (pETST-83-256). Este plasmídeo final é idêntico ao descrito por Qi-Zhuang et ai., Biochemistry, 31: 1 1231-1 1235 (1992) com a excepção de que este codifica para uma sequência peptídica que começa dois aminoácidos antes, na posição 81 na sequência da estromelisina humana. 0 plasmídeo pETST-83-256 foi transformado na estirpe BL21 (DE3)/pLysS de E. coli (Novagen, Inc., 597 Science Drive, Madison, Wl 5371 1) de acordo com as instruções do fabricante para gerar uma estirpe de expressão, BL21 (DE3)/pLysS/pETST-255-1.

Preparou-se um meio para pré-cultura dissolvendo 1,698 g de Na2HP4*7H20, 0,45 g de KH2P04, 0,075 g de NaCI, 0,150 g de 15NH4CI, 0,300 de 13C-glucose, 300 ul de solução aquosa de MgS04 1M e 1 5 μΙ de solução aquosa de CaCI2 em 1 50 ml de água desionizada. A solução resultante do meio de pré-cultura foi esterilizada e transferida para um balão estéril de 500 ml com chicanas. Imediatamente antes da inoculação do meio de pré-cultura com a estirpe bacteriana, adicionaram-se ao conteúdo do balão 150 μΙ de uma solução contendo 34 mg/ml de cloranfenicol em etanol a 100% e 1,5 ml de uma solução contendo 20 mg/ml de ampicilina.

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Inoculou-se então ο conteúdo do balão com 1 ml de glicerol de reserva de E. coli geneticamente modificada, estirpe BL21 (DE3)/pLysS/pETST-255-1. Agitou-se o conteúdo do balão (225 rpm) a 37°C até se observar uma densidade óptica de 0,65.

Preparou-se um meio nutriente para fermentação dissolvendo 11 3,28 g de Na2HP4*7H20, 30 g de KH2P04, 5 g de NaCl e 10 ml de agente antiespumante DF-60 a 1% em 9604 ml de água desionizada. Colocou-se esta solução num fermentador New Brunswick Scientific Micros (Edison, NJ) e esterilizou-se a 121°C durante 40 minutos.

Imediatamente antes da inoculação do meio de fermentação adicionaram-se os seguintes componentes pré-esterilizados ao conteúdo do vaso de fermentação: 100 ml de uma solução aquosa a 10% de 15NH4CI, 100 ml de uma solução aquosa a 10% de 13C-glucose, 20 ml de uma solução aquosa 1M de MgS04, 1 ml de uma solução aquosa 1M de CaCI2, 5 ml de uma solução aquosa de cloridrato de tiamina (10mg/ml), 10 ml de uma solução contendo 34 mg/ml de cloranfenicol em etanol a 100% e 1,9 g de ampicilina dissolvida na solução de cloranfenicol. Ajustou-se o pH da solução resultante a pH 7,00 por adição de uma solução aquosa 4 N de H2S04.

Adicionou-se a pré-cultura de E. coli, estirpe BL21 (DE3)/pLysS/pETST-255-1, do procedimento em baião agitado acima descrito, ao conteúdo do fermentador e deixou-se prosseguir o crescimento das células até se atingir uma densidade óptica de 0,48. Durante este processo, manteve-se o conteúdo do fermentador, automaticamente, a pH 7,0 por adição de H2S04 4N ou KOH 4N, conforme necessário. O teor de oxigénio dissolvido no conteúdo do fermentador foi mantido acima de 55% de saturação de ar através de uma volta em cascada que aumentava a velocidade da agitação quando o teor de oxigénio dissolvido baixava abaixo de 55%. O ar era alimentado ao conteúdo do fermentador a 7 litros Standard por minuto (SLPM) e a temperatura da cultura foi mantida a 37°C ao longo de todo o processo.

Recolheram-se as células por centrifugação a 17 000 x g durante 10 minutos a 4°C e recolheram-se as peletes de céluias resultantes e armazenaram-se a -85°C. O rendimento de células húmidas foi de 3,5 g/l. A análise das fracções solúvel e insolúvel dos lisados celulares por electroforese 24 86 207 ΕΡ 0 870 197/ΡΤ em gel de dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE) revelou que aproximadamente 50% da 15N-estromelisina se encontrava na fase solúvel. 0 fragmento de estromelisina marcado isotopicamente preparado como acima descrito foi purificado empregando uma modificação da técnica descrita por Ye, et a!., Biochemistry, 31:11 231-11 235 (1 992).

Suspenderam-se as células recolhidas em tampão Tris-HCI 20 mM (pH 8,0) solução de azida de sódio contendo 1 mM de MgCI2, 0,5 mM de ZnCI2, 25 unidades/ml de enzima Benzonase® e uma mistura inibidora feita de fluoreto de 4-(2-aminoetil)benzenossulfonilo ("AEBSF"), Leupeptin®, Aprotinin® e Pepstatin® (todas em concentrações de 1 qg/ml. A AEBSF, a Leupeptin®, a Aprotinin® e a Pepstatin® estão disponíveis de American International Chemical, 1 7 Strathmore Road, Natick, MA 01760). A mistura resultante foi suavemente agitada durante uma hora e depois arrefecida a 4°C. Submeteram-se então as células a ultra-sons para ruptura utilizando um ciclo de trabalho de 50%. O lisado resultante foi centrifugado a 1 4 000 rpm durante 30 minutos e a pelete da fracção insolúvel foi congelada a -80°C para processamento subsequente (ver adiante).

Adicionou-se sulfato de amónio sólido ao sobrenadante até ao ponto de 20% de saturação e a solução resultante foi carregada sobre uma coluna de 700 ml de fenil sepharose de fluxo rápido ("Q-Sepharose FF") (Pharmacia Biotech., 800 Centennial Ave., P.O. Box 1327, Piscataway, NJ 08855). Antes da carga, a coluna de Sepharose foi equilibrada com tampão Tris-HCI 50 mM (pH 7,6 a 4°C), CaCI2 5 mM e (NH4)2S04 1 M. Eluiu-se a coluna carregada com um gradiente linear de concentrações decrescentes de (NH4)2S04 aquoso (desde 1 até 0 M) e concentrações crescentes de CaCI2 aquoso (desde 5 a 20 mM) em tampão Tris-HCI a pH 7,6.

As fracções activas de eluado foram recolhidas e concentradas num Amicon de células agitadas (Amicon, Inc., 72 Cherry Hill Drive, Beverly, MA 01915). A amostra concentrada foi dialisada durante a noite no tampão de partida utilizado com a coluna Q-Sepharose FF, Tris-HCI 50 mM (pH 8,2 a 4°C) com CaCI2 10 mM.

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Carregou-se então a amostra dialisada na coluna Q-Sepharose FF e eluiu-se com um gradiente linear compreendendo o tampão de partida e NaCI 200 mM. A fracção solúvel purificada do fragmento de estromelisina marcado isotopicamente foi concentrado e armazenado a 4°C. A pelete foi solubilizada em. guanidina-HCI 8 Μ. A solução foi centrifugada durante 20 minutos a 20 000 rpm e o sobrenadante foi adicionado gota a gota a um tampão de dobragem compreendendo Tris-HCI 50 mM (pH 7,6); CaCI2 10 mM, ZnCI2 0,5 mM e o cocktail inibidor de AEBSF, Leupeptin®, Aprotinin® e Pepstatin® (todos em concentrações de 1 ,ug/ml). 0 volume de tampão de dobragem era dez vezes o do sobrenadante. A mistura de sobrenadante e tampão de dobragem foi centrifugada a 20 000 rpm durante 30 minutos. O sobrenadante desta centrifugação foi armazenado a 4°C e a pelete foi submetida duas vezes aos passos descritos acima de solubilização em guanidina-HCI, redobragem em tampão e centrifugação. Os sobrenadantes finais de cada uma das três centrifugações foram combinados e adicionou-se sulfato de amónio sólido até ao ponto de 20% de saturação. A solução resultante assim derivada da fracção insolúvel foi submetida a purificação em fenil-Sepharose e Q-Sepharose como descrito acima para a fracção solúvel.

As fracções solúvel e insolúvel purificadas foram combinadas para produzir cerca de 1,8 mg de fragmento de estromelisina 81-256, marcado isotopicamente, purificado, por grama de pasta de células original. B. Inibidores de E2 de vírus de papiloma humano (HPV)

Os vírus de papiloma são uma família de pequenos vírus de ADN que causam verrugas genitais e carcinomas cervicais. A proteína E2 de HPV regula a transcrição virai e é necessária para a repiicação virai. Assim, as moléculas que bloqueiam a ligação de E2 ao ADN podem ser agentes terapêuticos úteis contra o HPV. A proteína foi escolhida como alvo em vez do ADN pois espera-se encontrar agentes com maior selectividade que se ligam à proteína do que os que se ligam ao ADN. O domínio de ligação ao ADN da E2 do vírus do papiloma humano foi clonado a partir do ADN de comprimento completo que codifica para a E2

86 207 ΕΡ 0 870 197/ΡΤ utilizando PCR e superexpresso em bactérias utilizando o sistema de expressão de T7. Isolou-se proteína uniformemente marcada com 15N a partir de bactérias em crescimento num meio mínimo contendo cloreto de amónio marcado com 15N. A proteína foi purificada a partir dos lisados das células bacterianas utilizando uma coluna de S-Sepharose FastFlow pré-equilibrada com tampão (Tris 50 mM, NaCI 100 mM, EDTA 1 mM, pH = 8,3).

Eluiu-se a proteína com um gradiente linear de 100-500 mM de NaCI em tampão, reuniu-se e aplicou-se numa coluna Mono-S a um pH = 7,0. Eluiu-se a proteína com um gradiente salino (100-500 mM), concentrou-se até 0,3 mM e permutou-se para TRIS (50 mM, solução H20/D20 (9/1) tamponada pH = 7,0 contendo azida de sódio (0,5%).

C. RAF

Preparou-se domínio de ligação a Ras uniformemente marcado com 15N da proteína RAF, como descrito em Emerson et aí., Biochemistry, 34 (21):6911-6918 (1995).

D. FKBP

Preparou-se proteína de ligação a FK (FKBP) humana recombinante uniformemente marcada com 15N, como descrito em Logan, et ai, J. Mol. BioL, 236:637-648 (1994).

Exemplo 2

Pesquisa de compostos utilizando análise espectral de correlação de RMN —N/1H bidimensional

Preparou-se o domínio catalítico de estromelisina de acordo com os procedimentos do Exemplo 1. As soluções de proteína utilizadas no ensaio de pesquisa continham o domínio catalítico de estromelisina uniformemente marcado com 15N (0,3 mM), ácido aceto-hidroxâmico (500 mM), CaCI2 (20 mM) e azida de sódio (0,5%) numa solução tamponada TRIS em H20/D20 (9/1) (50 mM, pH = 7,0).

Os espectros de RMN 15Ν/Ή bidimensionais foram gerados a 29°C num espectrómetro de RMN Bruker AMX500 equipado com uma sonda de ressonância tripla e permutador de amostras Bruker. Os espectros HSQC de ^Ν/’Η foram obtidos na forma de 80 x 1024 pontos complexos utilizando 27 & 86 207 ΕΡ 0 870 197/ΡΤ larguras de varrimento de 2000 Hz (^Ν,ΐ1) e 8333 Hz (1H, t2). Empregou-se um atraso de 1 segundo entre varrimentos e 8 varrimentos por decaimento de indução livre (fid) na recolha de dados. Todos os espectros de RMN foram processados e analisados em computadores Silicon Graphics utilizando software escrito internamente.

Obteve-se um primeiro espectro de correlação de RMN 15N/1H bidimensional para a molécula alvo de estromelisina marcada com 15N como anteriormente descrito. O alvo de estromelisina foi então exposto a uma base de dados de compostos de teste. Foram preparadas soluções de reserva dos compostos a 100 mM e 1 M. Em adição, preparou-se uma biblioteca de combinação que continha 8-10 compostos por amostra a uma concentração de 100 mM de cada composto. O pH da solução de reserva 1 M foi ajustado com ácido acético e etanolamina de modo a que não fosse observada alteração do pH após uma diluição de 1/10 com uma solução tamponada com fosfato 100 mM (pH = 7,0). É importante ajustar o pH pois pequenas alterações de pH podem alterar os desvios químicos das biomoléculas e complicar a interpretação dos dados de RMN.

Os compostos da base de dados foram seleccionados com base no tamanho (peso molecular = 100-300) e na diversidade molecular. As moléculas na colecção tinham diferentes formas [e.g., um anel ou anéis aromáticos planares, um anel ou anéis alifáticos dobrados, cadeias alifáticas lineares ou ramificadas com ligações simples, duplas ou triplas) e diversos grupos funcionais [e.g., ácidos carboxílicos, ésteres, éteres, amínas, aldeídos, cetonas e vários anéis heterocíclicos) para maximizar a possibilidade de identificação do composto que interage com locais de ligação amplamente diversos.

Prepararam-se as amostras de RMN por adição de 4 μΙ da solução de reserva em DMSO das misturas de compostos que continham cada composto a uma concentração de 100 mM a 0,4 ml de solução tamponada H20/D20 (9/1) da proteína uniformemente marcada com 15N. A concentração final de cada um dos compostos na amostra de RMN foi de cerca de 1 mM. 86 207 ΕΡ 0 870 197/ΡΤ 28

Numa pesquisa inicial, encontraram-se dois compostos que se ligam ao domínio catalítico da estromelisina. Ambos estes compostos contêm uma porção biariio. Com base nestes sucessos iniciais, testaram-se compostos estruturalmente semelhantes contra a estromelisina. A estrutura destes compostos de biariio é representada pela estrutura I que segue. (Veja-se a tabela 1 para as definições de Rt-R3 e A,-A3).

I

No segundo ciclo de pesquisa, ensaiou-se a ligação tanto na presença como na ausência de quantidades saturantes de ácido aceto-hidroxâmico (500 mM).

Verificou-se que muitos dos compostos de biariio se ligam ao domínio catalítico de estromelisina. A FIG. 4 mostra um espectro de correlação de RMN 15N/1H bidimensional representativo antes de depois da exposição da estromelisina a um composto de biariio de teste. Pode-se observar da FIG. 4 que o composto provocou desvios químicos de locais de 15N tais como os designados por W1 24, T1 87, A1 99 e G204.

Estes locais correspondem a um resíduo triptofano (Trp) na posição 124, treonina (Thr) na posição 187, alanina (Ala) na posição 199 e glicina (Gly) na posição 204 de SEQ ID NO:1. A FIG. 9 mostra a correlação entre os dados de ligação de RMN e uma vista da estrutura tridimensional derivada por RMN do domínio catalítico de estromelisina. A capacidade para localizar o local de ligação específica de um ligando particular é uma vantagem da presente invenção.

Alguns compostos apenas se ligam à estromelisina na presença de ácido hidroxâmico. Assim, a afinidade de ligação de alguns compostos foi melhorada na presença do ácido hidroxâmico (i.e., cooperativa). Estes resultados exemplificam outra capacidade importante do presente ensaio de pesquisa: a

86 207 ΕΡ 0 870 197/ΡΤ 29 capacidade de identificar compostos que se iigam à proteína na presença de outras moléculas.

Testaram-se vários compostos de biarilo com a estrutura I quanto à ligação a estromelisina a diferentes concentrações. Os espectros 15N/1H gerados para cada concentração foram avaliados para quantificar diferenças nos espectros em função da concentração de composto. A partir destas diferenças, calculou-se uma constante de ligação ou de dissociação (KD), utilizando procedimentos Standard bem conhecidos na arte. Os resultados deste estudo são apresentados na Tabela 1. Os valores para R1-R3 e A1-A3 na Tabela 1 referem-se às correspondentes posições na estrutura I, anterior.

Tabela 1

Composto N°. R1 R2 R3 Α1 A2 A3 KD(mM) I 1 H OH H c í c c 1,1 2 CH20H H H c | c c 3,2 3 Br H OH c c c 1,3 j 4 H H H N N c 1,6 5 CHO H H C i c c 1,7 j 6 och3 NH2 H c C c 0,4 7 H H H N c c 0,2 8 OCOCH3 H H C c c 0,3 9 OH H OH C c c 0,01 10 H H H N c N 0,4 11 OH H H C c C 0,3 12 OH H CN C c c 0,01

Os dados na Tabela 1 mostram a utilidade de um processo da presente invenção na determinação das constantes de dissociação ou de ligação entre um ligando e uma molécula alvo.

Outra vantagem de um ensaio de pesquisa de RMN da presente invenção é a capacidade para correlacionar desvios químicos observados nos espectros de correlação de RMN 15N/’H bidimensionais com outros espectros ou 86 207 ΕΡ 0 870 197/ΡΤ 30

projecções da configuração da molécula alvo. Os resultados de uma tal correlação representativa são apresentados na FIG. 9, que representa regiões dentro do polipéptido às quais a ligação com a molécula substrato é mais provável. Nesta Figura as regiões de ligação aparente na estromelisina são apresentadas para o composto 1 (da Tabela 1).

Pesquisaram-se compostos da base de dados de maneira semelhante quanto à ligação ao domínio de ligação a ADN da proteína E2. Esses compostos tinham a estrutura II que se segue, onde R1-R4 e A são definidos na Tabela 2.

Π

As experiências de RMN foram realizadas a 29°C num espectrómetro de RMN Bruker AMX500 equipado com uma sonda de ressonância tripla e um permutador de amostras Bruker. Os espectros de HSQC ^Ν/’Η foram obtidos na forma de pontos complexos 80 x 1024 utilizando larguras de varrimento de 2000 Hz ('5N, 11) e 8333 Hz (Ή, t2). Empregaram-se na recolha de dados, um atraso de 1 segundo entre varrimentos e 4 varrimentos por decaimento de indução livre. Todos os espectros de RMN foram processados e analisados em computadores Silicon Graphics.

As FIG. 2 e 3 apresentam espectros de correlação de RMN 15N/1H bidimensionais representativos antes e depois da exposição do domínio de ligação a ADN de E2 a um primeiro e a um segundo compostos de teste, respectivamente.

Pode-se observar da FIG. 2 que o primeiro composto de teste provocou desvios químicos de locais de 15N tais como os designados por 11 5, V21, R22 e L23. Esses locais correspondem a um resíduo isoleucina (ile) na posição 15, um resíduo tirosina (Tyr) na posição 21, um resíduo arginina (Arg) na posição 22 e um resíduo leucina (Leu) na posição 23 de SEQ ID NO:6. 31 86 207

ΕΡ 0 870 1 97/PT

Pode-se observar da FIG. 3 que o segundo composto de teste provocou desvios químicos nos locais de 15N particulares designados por I6, G11, H38 e T52. Esses locais correspondem a um resíduo isoleucina (lie) na posição 6, um resíduo glicina (Gly) na posição 11, um resíduo histidina (His) na posição 38 e um resíduo treonina (Thr) na posição 52 de SEQ ID NO:6.

As FIG. 7 e 8 apresentam a correlação entre os dados de ligação de RMN e uma vista da estrutura tridimensional derivada por RMN do domínio de ligação a ADN de E2. Vários compostos estruturalmente semelhantes provocaram desvios químicos dos sinais da proteína quando pesquisados a uma concentração de 1 mM. Verificou-se que dois conjuntos distintos de ressonâncias de amidas se alteravam após a adição dos compostos: um conjunto de sinais correspondente a amidas localizadas no corpo β formado entre os dois monómeros e um segundo conjunto correspondente a amidas localizadas próximo do local de ligação a ADN.

Por exemplo, os compostos contendo dois anéis fenilo com um ácido carboxílico ligado ao carbono que liga os dois anéis apenas provocou alterações de desvios químicos para as amidas no local de ligação a ADN. Em contraste, compostos contendo benzofenonas e fenoxifenilo apenas se ligam ao corpo β. Outros compostos provocaram alterações de desvios químicos em ambos os conjuntos de sinais mas desviaram os sinais em cada conjunto diferentes distancias, sugerindo a presença de dois locais de ligação distintos.

Monitorizando as alterações de desvios químicos em função da concentração de ligando, mediram-se também as constantes de ligação para os dois locais de ligação. Os resultados destes estudos estão resumidos abaixo na Tabela 2. 32 86 207 ΕΡ 0 870 1 97/ρχ

Tabela 2

Comp. N°. A R, r2 r3 r4 AON KD{mM) Corpo-β KD(mM) Ensaio de ligação de filtro 13 co H- H H OH >50 0,6 - 14 0 H H H ch2oh >50 2,0 - 15 _a H H COO H 2,0 >50 + 16 Cl Cl COO H 0,1 >50 + 17 H H CH2COO H 4,2 4,9 + 18 H H CH = HCOO H 1,2 6,2 + 19 0 H H CH2CH2CH(CH3)- ch2coo H 0,5 7 0,2 + 20 0 H H coch2ch2coo H 2,7 4,8 + a um traço (-) em A indica sem nenhum átomo (i.e., ligação bifenilo)

Preparou-se o domínio de ligação a Ras uniformemente marcado com 15N da proteína RAF, como descrito no Exemplo 1, e pesquisou-se utilizando análise espectral de correlação de RMN 15N/1H bidimensional de acordo com os procedimentos de RMN descritos acima. Os resultados de um estudo representativo são apresentados na FIG. 5, que representa espectros de correlação de RMN 15N/1H bidimensionais tanto antes como depois da exposição a um composto de teste.

Preparou-se FKBP uniformemente marcada com 15N como descrito no Exemplo 1 e pesquisou-se utilizando análise espectral de correlação de RMN ^Ν/’Η bidimensional de acordo com os procedimentos de RMN acima descritos. Os resultados de um estudo representativo estão apresentados na FIG. 6 que representa espectros de correlação de RMN 15N/'H bidimensionais tanto antes como depois da exposição a um composto de teste.

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Exemplo 3

Comparação de ensaios de RMN, enzimáticos, de ligação a filtros e de pesquisa em gel

Realizaram-se estudos para comparar constantes de ligação de ligandos a várias biomoléculas, determinadas pelo método do RMN da presente invenção, com resultados similares obtidos com métodos da arte anterior.

Num primeiro estudo, determinaram-se as constantes de ligação, tanto pelo método do RMN da presente invenção como por um ensaio enzimático da arte anterior. A molécula alvo era o domínio catalítico de estromelisina preparado de acordo com os procedimentos do Exemplo 1. As constantes de ligação de RMN, KD, foram calculadas utilizando espectroscopia de correlação de RMN 15N/nH bidimensional, como descrito no Exemplo 2. Os valores de K0 assim obtidos foram comparados com uma constante de inibição K,, conforme determinada num ensaio enzimático. 0 ensaio enzimático mediu a taxa de clivagem de um substrato fluorogénico seguindo o aumento de fluorescência após clivagem do péptido que provoca uma separação entre o fluoróforo e o extintor. A actividade enzimática foi medida utilizando uma matriz de diferentes concentrações de ácido aceto-hidroxâmico e compostos de biarilo. O ensaio é uma modificação do método descrito por H. Weingarten, et ai, em Anal. Biochem., 147:437-440 (1985) empregando as propriedades do substrato fluorogénico descritas por E. Matayoshi et a!., em Science: 247: 954-958 (1990).

Utilizaram-se oito concentrações de ácido aceto-hidroxâmico que variaram de 0,0 a 1,0 M, e utilizaram-se seis concentrações de composto, resultando um total de 48 pontos. A concentração de cada composto variou devido à solubilidade e à potência.

Todas as medições de RMN foram realizadas na presença de 500 mM de ácido aceto-hidroxâmico, excepto na titulação do próprio ácido aceto-hidroxâmico. As constantes de dissociação foram obtidas a partir da dependência das alterações de desvios químicos observadas após o ligando adicionado. As constantes de inibição foram obtidas a partir dos dados de inibição utilizando procedimentos Standard.

86 207 ΕΡ 0 870 197/ΡΤ 34

Os resultados destes estudos estão resumidos abaixo na Tabela 3 que apresenta a comparação das constantes de dissociação (KD) calculadas por RMN com as constantes de inibição medidas no ensaio enzimático (K,) utilizando um substrato fluorogénico.

Tabela 3 Composto N°. RMN KD (mM) Ensaio K, (mM) 4 1,6 7,4 7 0,17 0,32 9 0,16 0,70 10 0,40 1,8 12 0,02 0,11 Ácido aceto-hidroxâmico 17,0 21,1

Os dados na Tabela 3 mostram que um processo de RMN da presente invenção proporciona um modo rápido, eficiente e preciso para determinar constantes de dissociação ou de ligação de ligandos a moléculas alvo. A comparação das constantes de ligação determinadas pelos dois métodos resulta na mesma ordem de potências dos compostos testados. Ou seja, embora os valores para um determinado substrato, determinados pelos dois métodos, não sejam iguais, são proporcionais um ao outro.

Num segundo estudo, os resultados para a ligação do domínio de ligação a ADN de E2 ao seu ADN alvo foram obtidos por métodos da arte anterior e comparados com resultados obtidos pelo método da presente invenção. 0 alvo foi o domínio de ligação a ADN de E2, preparado de acordo com os procedimentos do Exemplo 1. Os ensaios de pesquisa por RMN e os processos de RMN para a determinação das constantes de dissociação do ligando foram realizados como acima descrito no Exemplo 2. A constante de ligação obtida pelo processo de RMN foi comparada com os resultados de um ensaio físico, de ligação a filtros, que mediu a ligação de ADN ao alvo. O ensaio de ligação a filtros de elevado rendimento foi realizado utilizando E2, preparada de acordo com o Exemplo 2 anterior. A construção de ADN marcada com 33P compreendia um plasmídeo de 10 329 pares de bases

86 207 ΕΡ 0 870 197/ΡΤ 35 formado por inserção do genoma de HPV-11, contendo três locais de ligação a E2 de alta afinidade e um de baixa afinidade, no plasmídeo PSP-65 (Promega, Madison, Wl).

As afinidades de ligação nos diferentes locais, determinadas por RMN, foram comparadas para um subconjunto dos compostos quanto a inibição da ligação de E2 ao ADN, medida no ensaio de ligação a filtros. Tal como apresentado na Tabela 2 anterior, as actividades determinadas no ensaio de ligação a filtros correlacionavam-se com as afinidades de ligação calculadas a partir das amidas do local de ligação a ADN mas não com as afinidades medidas para o local no corpo β. Isto está consistente com as localizações relativas de cada local.

Num estudo alternativo, fez-se uma comparação dos resultados de ligação determinados por RMN, com resultados semelhantes obtidos através de um ensaio de desvios em gel da arte anterior utilizando técnicas bem conhecidas na arte. O ensaio de desvios em gel foi realizado utilizando uma proteína de fusão GST que continha a E2 de comprimento completo e um fragmento de ADN de 62 pares de bases marcado com 33P contendo dois locais de ligação de E2. O método identificou numerosos compostos que originaram resultados positivos no ensaio de desvios em gel. Crê-se contudo que alguns destes resultados positivos são devidos a ligação ao ADN pois nestes casos não se observou ligação à proteína E2 utilizando o método de RMN da presente invenção. Mostrou-se que estes compostos se ligavam de facto a ADN e não a E2, como evidenciado por alterações nos desvios químicos do ADN e não da proteína, após adição dos compostos. Estes dados mostram que ainda outra vantagem da presente invenção consiste na capacidade de minimizar a ocorrência de falsos positivos.

Exemplo 4

Proiecto de um inibidor potente, não peptídico, de estromelisina Realizaram-se estudos para projectar novos ligandos que se ligam ao domínio catalítico de estromelisina. Como a estromelisina sofre autólise, pensou-se num inibidor que bloqueasse a degradação da estromelisina. Esse

86 207 ΕΡ 0 870 197/ΡΤ 36 inibidor facilitaria a pesquisa de outros potenciais ligandos que se ligam a outros locais na enzima.

Os critérios utilizados na selecção de compostos na pesquisa de outros locais de ligação basearam-se principalmente no tamanho do ligando. Pensou-se no mais pequeno ligando que tivesse solubilidade suficiente para saturar (>98% de ocupação da enzima) e inibir a enzima. A clonagem, a expressão e a purificação do domínio catalítico da estromelisina foram realizadas utilizando os procedimentos descritos no Exemplo 1 . Um passo inicial no projecto do novo ligando foi a identificação de um primeiro ligando que se liga à estromelisina alvo. Esta identificação foi realizada de acordo com um processo de pesquisa de correlação de RMN 15N/’H bidimensional como descrito atrás.

Pesquisou-se uma variedade de ácidos hidroxâmicos de fórmula geral R-(CO)NHOH quanto à ligação a estromelisina, utilizando os procedimentos apresentados no Exemplo 2. Dos compostos testados, o ácido aceto-hidroxâmico [CH3(CO)NHOH] foi o que melhor satisfez os critérios de selecção: tinha uma afinidade de ligação para a estromelisina de 17 mM e tinha boa solubilidade em água. A uma concentração de 500 mM, o ácido aceto-hidroxâmico inibiu a degradação da enzima, permitindo a pesquisa de outros potenciais ligandos. O segundo passo no processo de projecto foi a identificação de um segundo ligando que se liga à estromelisina alvo num local diferente do local de ligação do ácido aceto-hidroxâmico. Isto foi realizado pesquisando compostos quanto à sua capacidade para ligar estromelisina na presença de quantidades saturantes de ácido aceto-hidroxâmico. Os detalhes dos procedimentos e os resultados deste segundo passo de identificação estão apresentados atrás no Exemplo 2. O composto identificado como um segundo ligando a partir destes estudos e utilizado nos subsequentes passos do projecto foi o composto designado por Composto #4 na Tabela 1 (veja-se o Exemplo 2). 86 207 ΕΡ 0 870 197/ΡΤ 37

Ο passo seguinte no processo de projecto foi a construção de um complexo ternário da estromelisina alvo, do primeiro ligando e do segundo ligando. Isto foi realizado expondo a estromelisina alvo aos dois ligandos sob condições que resultaram na formação do complexo. A estrutura tridimensional do complexo ternário foi então determinada utilizando espectroscopia de RMN como atrás descrito.

As ressonâncias do esqueleto de Ή, 13C e 15N de estromelisina no complexo ternário foram atribuídas a partir de uma análise de vários espectros de RMN de ressonância tripla e dupla a 3D (A. Bax, et a!., Acc. Chem. Res., 26:131-138 (1993)). As ressonâncias de C“ de sistemas de spin adjacentes foram identificadas a partir de uma análise de HNCA tridimensional (3D) (L. Kay, et aí., J. Magn. Reson., 89:496-514 (1990)) e espectros de HN(CO)CA (A. Bax, et ai, J. Bio. RMN, 1:99 (1991)) registados com larguras espectrais idênticas de 1773 Hz (35,0 ppm), 3788 Hz (30,1 ppm) e 8333 Hz (16,67 ppm) nas dimensões de F1(15N), F2(13C) e F3(1H), respectivamente. A matriz de dados foi de 38(t1 )x48(t2)x1024(t3) pontos complexos para o espectro de HNCA e de 32(t 1 )x40(t2)x1024(t3) pontos complexos para o espectro de HN(CO)CA. Ambos os espectros foram obtidos com 16 varrimentos por incremento. Recolheu-se um espectro 3D de CBCA(CO)NH (S. Grzesiek, et ai, J. Am. Chem. Soc., 114: 6261-6293 (1992) com 32(t1, 15N)x48(t2, 13C)x1024(t3, ΊΗ) pontos complexos e 32 varrimentos por incremento. As larguras espectrais foram de 1773 Hz (35,0 ppm), 7575,8 (60,2 ppm) e 8333 Hz (16,67 ppm) nas dimensões de 15N, 13C e 1H'respectivamente.

Para todos os três espectros, a frequência do transportador de 1H foi regulada para a ressonância da água e a frequência do transportador de 15N foi a 119,1 ppm. A frequência do transportador de 3C foi regulada para 55,0 ppm nas experiências de HNCA e HN(CO)CA, e para 46,0 ppm na experiência de CBCA(CO)NH.

As determinações do esqueleto foram confirmadas a partir de uma análise dos picos cruzados observados num espectro 3D de NOESY-HSQC separado de ’5N e um espectro 3D de HNHA-J. O espectro 3D de NOESY-HSQC separado de ’5N (S. Fesik, et al., J. Magn. Reson., 87: 588-593 (1988)); D. Marion, et ai, J. Am. Chem. Soc., 111: 1515-1517 (1989)) foi recolhido com um tempo de 38 86 207 ΕΡ 0 870 197/ΡΤ mistura de 80 ms. Recoiheram-se um total de 68(t1, 15N)x96(t2, ’H)x1024(t3, ’H) pontos complexos com 16 varrimentos por incremento, e as larguras espectrais foram de 1773 Hz (35,0 ppm) para a dimensão de 15N, 6666,6 Hz (t2, 1H, 13,3 ppm) e 8333 Hz (16,7 ppm) para a dimensão de ’Η. O espectro 3D de HNHA-J (G. Vuister, et aL, J. Am. Chem. Soc., 115: 7772-7777 (1993)), que foi também utilizado para obter as constantes de acoplamento 3J-HNHa, foi obtido com 35(t 1, l3N)x64(t2, lH)x1024(t3, 1H) pontos complexos e 32 varrimentos por incremento. As larguras espectrais e as frequências dos transportadores foram idênticas às do espectro de NOESY-HSQC separado de 15N. Vários dos sinais de H13 foram determinados utilizando a experiência do HNHB. As larguras varridas foram as mesmas que no espectro de NOESY-HSQC separado de 15N que foi obtido com 32(t1, 15N)x96(t2, 1Η)1024(ΐ3, Ή) pontos complexos.

Os desvios químicos de Ή e 13C foram determinados para praticamente todas as ressonâncias das cadeias laterais. Foi obtido um espectro 3D de HCCH-TOCSY (L. Kay, et a!., J. Magn. Reson., 101b: 333-337 (1993)) com um tempo de mistura de 13 ms utilizando a sequência DIPSI-2 (S. Rucker, et a!., Mol. Phys., 68: 509 (1989)) para a mistura isotrópica de 13C. Recolheram-se um total de 96(t1, 13C)x96(t2, 1H)x1024(t3, 1H) pontos de dados complexos com 16 varrimentos por incremento utilizando uma largura espectral de 10638 Hz (70,8 ppm, w1), 4000 Hz (6,67 ppm, w2) e 4844 (8,07 ppm, w3). As posições dos transportadores foram 40 ppm, 2,5 ppm e à frequência da água, para as dimensões de 3C, 1H detectado indirectamente, e 1H observado, respectivamente.

Realizou-se outro estudo de HCCH-TOCSY 3D com o transportador de l3C a 122,5 ppm para determinar os resíduos aromáticos. Os espectros foram recolhidos com 36(t1, 13C)x48(t2, 1Η)χ1024(ΐ3, ’H) pontos complexos com larguras espectrais de 5263 Hz (35,0 ppm, w1), 3180 Hz (5,30 ppm, w2) e 10 000 (16,7 ppm, w3). As posições dos transportadores foram 122,5 ppm, 7,5 ppm e à frequência da água para as dimensões de 13C, 3H detectado indirectamente e Ή observado, respectivamente.

Registou-se um espectro 3D de NOESY-HMQS separado de 13C (S. Fesik, et ai, J. Magn. Reson., 87: 588-593 (1988)); D. Marion, et aL, J. Am. Chem.

86 207 ΕΡ 0 870 197/ΡΤ 39

Soc., 111: 1515-1517 (1989)), utilizando um tempo de mistura de 75 ms. Recolheram-se um total de 80(t1, 13C)x72(t2, 1H)x1024(t3, 1H) pontos de dados complexos com 16 varrimentos por incremento ao longo de larguras espectrais de 10638 Hz (70,49 ppm, w1), 6666,6 Hz (13,3 ppm, w2) e 8333,3 Hz (16,67 ppm, w3). As frequências do transportador de Ή foram reguladas para a ressonância da água e a frequência do transportador de 13C foi colocada a 40,0 ppm.

As determinações estereoespecíficas de grupos metilo dos resíduos valina e leucina foram obtidas utilizando uma abordagem biossintética (Neri, et a/., Biochem, 28: 7510-7516 (1989)) com base no padrão de acoplamento de uma ligação 13C-13C observado num espectro de HSQC de 1H,l3C de alta resolução (G. Bodenhausen, et ai., J. Chem. Phys. Lett., 69: 185-189 (1980)) de uma amostra de proteína marcada fraccionalmente com 13C. O espectro foi obtido com 200(13C, t1 )x2048(1H, t2) pontos complexos ao longo de larguras espectrais de 5000 Hz (39,8 ppm, 13C) e 8333 Hz (16,7 ppm, 1H). As posições dos transportadores foram de 20,0 ppm para a dimensão de 13C e à frequência da água para a dimensão de 1H.

Para detectar NOE entre os dois ligandos e a proteína, recolheu-se um espectro 3D NOESY editado para 13C, filtrado para 13C. O esquema de pulsos consistiu numa sequência dupla de filtros de 13C (A. Gemmeker, et ai., J. Magn. Reson., 96: 199-204 (1992)) encadeada com uma sequência de NOESY-HMQC (S. Fesik, et ai., J. Magn. Reson., 87: 588-593 (1988)); D. Marion, et ai., J. Am. Chem. Soc., 111: 1515-1517 (1989)). Registou-se o espectro com um tempo de mistura de 80 ms e um total de 80(t1, 13C)x80(t2, 1H)x1024(t3, 1H) pontos complexos com 16 varrimentos por incremento. As larguras espectrais foram de 8865 Hz (17,73 ppm, w1), 6667 Hz (13,33 ppm, w2) e 8333 Hz (16,67 ppm, w3), e as posições dos transportadores foram 40,0 ppm para a dimensão do carbono e a frequência da água para ambas as dimensões do protão.

Para identificar grupos amida que permutaram lentamente com o solvente, registou-se uma série de espectros de HSQC 1H,15N (G. Bodenhausen, et ai., J. Chem. Phys. Lett., 69: 185-189 (1980)) a 25°C, a intervalos de 2 h após a proteína ter permutado para D20. A obtenção do primeiro espectro de HSQC iniciou-se 2 h após a adição de D20.

86 207 ΕΡ Ο 870 197/ΡΤ

Todos os espectros de RMN foram registados a 25°C num espectrómetro de RMN Bruker AMX500 ou AMX600. Os dados de RMN foram processados e analisados em computadores Silicon Graphics. Em todas as experiências de RMN, os gradientes de campos pulsados foram aplicados onde apropriado como descrito (A. Bax, et a!., J. Magn. Reson., 99: 638 (1992)) para produzir a supressão do sinal do solvente e os artefactos espectrais. A detecção de quadratura em dimensões indirectamente detectadas foi realizada utilizando o método States-TPPI (D. Marion, et ai, J. A_m. Chem. Soc., 111: 1515-1517 (1989)). Foi empregue previsão linear como descrito (E. Olejniczak et ai, J. Magn. Reson., 87: 628-632 (1990)). A estrutura tridimensional calculada do complexo ternário foi então utilizada para definir a orientação espacial dos primeiro e segundo ligandos, um em relação ao outro, bem como em relação à molécula de estromelisina alvo.

As restrições de distâncias derivadas dos dados de NOE foram classificadas em seis categorias com base na intensidade do pico cruzado de o NOE e foi-lhes atribuídas um ligação inferior de 1,8 A e ligações superiores de 2,5 Â, 3,0 A, 3,5 A, 4,0 A, 4,5 A e 5 Â, respectivamente. As restrições para os ângulos de torção φ foram calculadas a partir das constantes de acoplamento 3JHNHa medidas a partir do espectro 3D de HNHA-J (G. Vuister, et ai, J. Am. Chem. Soc., 115: 7772-7777 (1993)). 0 ângulo φ foi restrito a 120%±40% para 3JHNHa>8,5 Hz e 60%±40% para 3JHNHa<5 Hz.

As ligações de hidrogénio, identificadas para amidas que permutavam lentamente com base em estruturas iniciais, foram definidas por duas restrições: 1,8-2,5 Á para a distância H-0 e 1,8-3,3 Á para a distância N-O. As estruturas foram calculadas com o programa X-PLOR 3.1 (A. Brunger, "XPLOR 3.1 Manual", Yale University Press, New Haven, 1992) em computadores Silicon Graphics, utilizando uma abordagem de hibridação simulada pela geometria da distância híbrida (M. Nilges, et ai, FEBS Lett., 229: 317-324 (1988)).

Dos dados de NOE calcularam-se um total de 1032 restrições de distância inter-protões aproximadas. Em adição, do espectro 3D de NOESY editado para 13C, filtrado para 12C, calcularam-se 21 restrições de distância 41 86 207 ΕΡ 0 870 197/ΡΤ intermolecular não ambíguas. Das 1032 restrições de NOE que envolvem a proteína, 341 eram intra-resíduos, 410 eram sequenciais ou de curto alcance entre resíduos separados na sequência primária por menos de cinco aminoácidos, e 281 eram resíduos de longo alcance envolvendo resíduos separados por pelo menos cinco resíduos.

Em adição às restrições de distância de NOE, incluíram-se 14 restrições de ângulo de diedro φ nos cálculos da estrutura que eram derivados das constantes de acoplamento de três ligações (3JHNHa) determinadas a partir de um espectro de HNHA-J (G. Viioster, et a/., J. Am. Chem. Soc., 115: 7772-7777 (1993)). As restrições experimentais incluíram também 120 restrições de distância correspondentes a 60 ligações de hidrogénio. As amidas envolvidas nas ligações de hidrogénio foram identificadas com base na sua taxa de permuta caracteristicamente lenta e nos parceiros de ligações de hidrogénio de estruturas de RMN iniciais calculadas sem as restrições de ligações de hidrogénio. O número total de restrições calculadas experimentalmente, não redundantes, foi de 11 66.

As estruturas estavam em excelente acordo com as restrições experimentais de RMN. Não haviam violações de distâncias superiores a 0,4 Â, nem violações de ângulo de diedro superiores a 5 graus. Em adição, a energia simulada para o termo de repulsão de van der Waals foi pequeno, indicando que as estruturas estavam destituídas de maus contactos interatómicos.

As estruturas de RMN exibiram também boa geometria de ligações covalentes, como indicado por pequenos desvios de comprimentos de ligação e ângulos de ligação em relação aos correspondentes parâmetros idealizados. 0 desvio quadrado médio da raiz atómica média das 8 estruturas para os resíduos 93-247 em relação às coordenadas médias foi de 0,93 Á para átomos do esqueleto (Ca, N e C') e 1,43 Â para todos os átomos que não hidrogénio.

Apresenta-se na Fig. 10 uma representação em fita do complexo ternário que envolve a estromelisina, ácido aceto-hidroxâmico (primeiro ligando) e o segundo ligando. A estrutura é muito semelhante à dobragem global de outras metaloproteinases da matriz e consiste numa folha β de cinco cadeias e três hélices a.

86 207 ΕΡ 0 870 197/ΡΤ Ο zinco catalítico foi localizado na bolsa de ligação. Estava coordenado com três histidinas e os dois átomos de oxigénio do ácido aceto-hidroxâmico. Localizou-se um grupo biarilo do segundo ligando na bolsa S1' entre a segunda hélice e a dobra formada pelos resíduos 218-223. Esta bolsa profunda e estreita é revestida por resíduos hidrófobos-que fazem contactos favoráveis com o ligando.

Com base na estrutura tridimensional do complexo ternário, como determinada acima e nas relações de estrutura/actividade observadas para a ligação a estromelisina dos análogos estruturais do segundo ligando {i.e., outros compostos de biarilo), foram projectadas novas moléculas que ligaram em conjunto o ácido aceto-hidroxâmico a biarilos.

Tal como mostrado na Tabela 4 seguinte, os biarilos iniciais escolhidos continham um ligante de oxigénio e a ausência ou a presença de CN em posição para em relação à ligação do biarilo. Os ligantes iniciais continham comprimentos variáveis de unidades de metileno. Os meios para a ligação de compostos com ligantes possuindo vários comprimentos de unidades de metileno são bem conhecidos na arte.

Tabela 4

R

86 207

ΕΡ 0 870 197/PT 43

Inibição do X R Estromelisina composto 21 (CH2}2 H 0,31 μΜ 22 (CH2)3 H 110 μΜ 23 {ch2)4 H 38%@1 ΟΟμΜ 24 (ch2)5 H 43%@1 ΟΟμΜ i 25 • (CH2)2 CN 0,025 μΜ 26 (CH2)3 CN 3,4 μΜ 27 (CH2)4 CN 3,5 μΜ 28 (CH2)5 CN 1,7 μΜ

Tal como esperado com base na melhor ligação dos biarilos substituídos com CN a estromelisina, os derivados de CN exibiram melhor inibição de estromelisina. 0 composto que exibiu a melhor inibição de estromelisina continha um ligante com duas unidades metileno. A presente invenção foi descrita com referência a concretizações preferidas. Estas concretizações não são de modo algum limitantes das reivindicações e da descrição. Um perito na arte pode prontamente conceber alterações, modificações e mudanças nestas concretizações que não se afastem do âmbito da presente invenção tal como definido pelas reivindicações.

Exemplo 5

Proiecto de novos inibidores potentes de FKBP

Realizaram-se estudos para projectar novos ligandos que se ligaram a proteína de ligação a FK (FKBP). A clonagem, a expressão e a purificação de FKBP foram realizadas como atrás descrito no Exemplo 1. Um passo inicial no projecto do novo ligando foi a identificação de um primeiro ligando que se liga à FKBP alvo. Esta identificação foi realizada de acordo com um processo de pesquisa de correlação de RMN ^Ν/’Η bidimensional como atrás descrito.

Pesquisaram-se uma variedade de fragmentos e análogos de baixo peso molecular de vários imunossupressores potentes conhecidos (i.e., ascomicina, 86 207 ΕΡ 0 870 197/ΡΤ 44

rapamicina) quanto à ligação a FKBP, utilizando os procedimentos descritos no Exemplo 2. Dos compostos testados, o composto 29, seguinte,

och3 och3 foi o que melhor satisfez os critérios de selecção: tinha uma afinidade de ligação para a FKBP de 2 μΜ (medida por fluorescência pelos métodos conhecidos na arte) e saturava a proteína (>98% de ocupação dos locais de ligação) a concentrações de ligando de 1 mM. O segundo passo no processo de projecto foi a identificação de um segundo ligando que se liga à FKBP alvo num local diferente do local de ligação do composto 29. Isto foi realizado por pesquisa de compostos quanto à sua capacidade para se ligar a FKBP na presença de quantidades saturantes do análogo do fragmento de ascomicina (composto 29). Os detalhes dos procedimentos para este segundo passo de identificação estão descritos no Exemplo 2.

Numa pesquisa inicial, encontrou-se um composto que continha uma porção benzaniiida. Com base neste sucesso iniciai, obtiveram-se compostos estruturalmente semelhantes que se testaram contra a FKBP. A estrutura destes compostos de benzaniiida é representada pela estrutura III que se segue (veja-se a Tabela 5 para as definições de R,-R4).

Q

m 45 86 207 ΕΡ 0 870 197/ΡΤ

No segundo ciclo de pesquisa, ensaiou-se a ligação tanto na presença como na ausência de quantidades saturantes de composto 29 (1 mM).

Desenvolveu-se uma relação estrutura-actividade para estes compostos de difenilamida como estabelecida na Tabela A. A Fig. 6 apresenta um espectro de correlação 15N/1H bidimensional representativo antes e depois da exposição de FKBP a um composto de difenilamida de teste. Pode-se observar da Fig. 6 que o composto provocou desvios químicos de locais de 15N tais como os designados por I50, Q53, E54 e V55. Estes locais correspondem a uma isoleucina (lie) na posição 50, uma glutamina (Gin) na posição 53, um glutamato (Glu) na posição 54 e uma valina (Vai) na posição 55 de SEQ ID NO:7. A Figura 11 apresenta a correlação entre os dados de ligação de RMN e uma vista da estrutura tridimensional derivada por RMN da FKBP. A capacidade para localizar o local de ligação específica de um determinado ligando é uma vantagem da presente invenção.

Alguns compostos apenas se ligam a FKBP na presença de composto 29. Assim, a afinidade de ligação de alguns compostos foi melhorada na presença do composto 29. Estes resultados exemplificam ainda outra importante capacidade do presente ensaio de pesquisa que é a capacidade de identificar compostos que se ligam à proteína na presença de outras moléculas.

Testaram-se vários compostos de benzanilida quanto à ligação a FKBP em múltiplas concentrações de ligando. Os espectros de correlação 15N/1H gerados a cada concentração foram avaliados para quantificar as diferenças nos espectros em função da concentração de composto. Calculou-se uma constante de ligação ou de dissociação (Kd), utilizando procedimentos Standard bem conhecidos na arte a partir destas diferenças. Os resultados deste estudo estão apresentados na Tabela 5. Os valores de R1-R4 na Tabela 5 referem-se às correspondentes posições na estrutura III anterior. 46 86 207 ΕΡ 0 870 197/ΡΤ

Tabela 5

Composto n°. R1 R2 - R3 R4 Kd (mM) 30 OH OH H H 0,8 31 H H OH H 1,4 32 j H H H OH 0,5 ! 33 OH H H OH 0,1 | 34 OH H H H 0,6 35 OH H ch3 OH 0,5 | 36 I H H H H >5,0 37 H OH H H >5,0

Os dados na Tabela 5 mostram a utilidade de um processo da presente invenção na determinação das constantes de dissociação ou de ligação entre um ligando e uma molécula alvo. O passo seguinte no processo de projecto foi construir um complexo ternário da FKBP alvo, o primeiro ligando e o segundo ligando. Isto foi realizado expondo a FKBP alvo aos dois ligandos sob condições que resultaram na formação do complexo. A localização e a orientação dos ligandos foram determinadas como se descreve adiante.

As ressonâncias de 1H, 13C e 15N da FKBP no complexo ternário foram determinadas a partir de uma análise de vários espectros 3D de RMN de ressonância dupla e tripla. O processo de avaliação foi auxiliado por atribuições conhecidas da FKBP quando complexada com ascomicina (R. Xu, et a!., Biopolymers, 33: 535-550, 1993). Identificaram-se ressonâncias no esqueleto de 15N/1H e nas cadeias laterais de 1H, a partir de uma análise de espectros tridimensionais (3D) de HC(CO)NH registados com larguras espectrais de 2000 Hz (39,5 ppm), 6250 Hz (12,5 ppm) e 8333 Hz (16,7 ppm) nas dimensões Fn (15N), F2(1H) e Ρ3(ΊH), respectivamente, e com uma matriz de dados de 46(t1) x 80(t2) x 1024(t3) pontos complexos e 16 varrimentos por incremento. Identificaram-se ressonâncias de Cu e na cadeia lateral de 1H e 13C, a partir de uma análise de espectros 3D de HCCH-TOCSY (L. Kay, et a!., J. Magn. Reson., 101b: 333-337 (1993) registados com larguras espectrais de 7541,5 Hz (60,0 ppm), 6250 Hz (12,5 ppm) e 8333 Hz (16,7 ppm) nas 47 86 207 ΕΡ Ο 870 197/ΡΤ dimensões F,(13C), F2(1H) e F3(1H), respectivamente, e com uma matriz de dados de 48(t1) x 64(t2) x 1024(t3) pontos complexos e 16 varrimentos por incremento. Os NOE intermoleculares entre o ligando e a FKBP foram obtidos a partir de uma análise de um espectro 3D de NOESY editado para 13C, filtrado para 12C. O esquema de pulsos consistiu em uma sequência dupla de filtros de 1 3C (A. Gemmecker, et a!., J. Magn. Reson., 96: 199-204, 1992) encadeada com uma sequência NOESY-HMQC (S. Fesik, et a!., J. Am. Chem. Soc., 111: 1515-1517, 1989). 0 espectro foi registado com um tempo de mistura de 350 ms e um total de 46(t1, 13C) x 64(t2, ΊΗ) x 1024{t3, ’Η) pontos complexos e 16 varrimentos por incremento. Utilizaram-se larguras espectrais de 7541,5 Hz (60,0 ppm), 6250 Hz (12,5 ppm) e 8333 Hz (16,7 ppm) nas dimensões F^^C), F2(1H) e F3(1H), respectivamente.

Em todos os espectros, a frequência do transportador de 15N foi regulada para 117,4 ppm, a frequência do transportador de 13C foi regulada para 40.0 ppm e a frequência do transportador de Ή foi regulada para a ressonância da água. Todos os espectros foram registados a 303 K num espectrómetro de RMN Bruker AMX500. Os dados de RMN foram processados e analisados em computadores Silicon Graphics. Em todas as experiências de RMN aplicaram-se gradientes de campo pulsado onde apropriado como descrito (A. Bax, et ai, J. Magn. Reson., 99: 638, 1992) para produzir a supressão do sinal do solvente e os artefactos espectrais. A detecção de quadratura na dimensão detectada indirectamente foi realizada utilizando o método States-TPPI (D. Marion, et ai, J. Am. Chem. Soc., 87: 1515-1517, 1989). Empregou-se previsão linear como descrito (E. Olejniczak, et ai, J. Magn. Reson., 87: 628-632, 1990).

As restrições de distâncias derivadas dos dados de NOE foram classificadas em três categorias com base na intensidade do pico cruzado de NOE e foi-lhes atribuídas um ligação inferior de 1,8 À e ligações superiores de 3.0 Â, 4,0 Á, e 5,0 Λ. Utilizaram-se um total de 17 restrições de distâncias intermoleculares entre a proteína e o composto 33 e 10 restrições de distâncias intermoleculares entre a proteína e o composto 29, para definir a localização e a orientação dos compostos quando ligados a FKBP utilizando as coordenadas tridimensionais conhecidas para a estrutura da proteína FKBP. Apresenta-se na Figura 1 2 uma representação em fita do complexo ternário que envolve FKBP, um análogo do fragmento de ascomicina (composto 29) e um composto de benzanilida (composto 33).

86 207 ΕΡ Ο 870 197/ΡΤ 48

Com base na estrutura tridimensional do complexo ternário, como determinada acima e nas relações de estrutura/actividade observadas para a ligação a FKBP dos análogos estruturais do segundo composto, foram projectadas novas moléculas que ligaram o análogo do fragmento de ascomicina ao composto de benzaniiida. Este composto, apresentado abaixo,

IV tem uma afinidade de 19 nM para a FKBP como determinada por titulações de fluorescência. Isto representa um aumento de 100 vezes na potência em relação ao análogo do fragmento de ascomicina (composto 29) sozinho (Kd = 2 μΜ).

Tal como mostrado pelos exemplos não limitantes anteriores, a presente invenção refere-se a um processo para o projecto de um ligando de alta afinidade para uma determinada molécula alvo, compreendendo a) a identificação, pelos processos de pesquisa aqui descritos, de pelo menos dois ligandos que se ligam a locais de ligação distintos na molécula alvo utilizando espectroscopia de RMN multidimensional; b) a formação de pelo menos um complexo ternário por exposição dos pelo menos dois ligandos à molécula alvo; c) a determinação da estrutura tridimensional do complexo e assim da orientação espacial dos pelo menos dois ligandos na molécula alvo; e 49 86 207 ΕΡ 0 870 1 97/ΡΤ d) a utilização da orientação espacial determinada no passo c) para projectar o ligando de alta afinidade que se assemelha estruturalmente a uma combinação dos pelo menos dois ligandos que se ligam a locais distintos na molécula alvo. Preferivelmente, o ligando de alta afinidade projectado no processo anterior serve como, ou é a base para, uma droga que se liga a uma determinada molécula alvo e realiza, in vitro e ín vivo, um efeito terapêutico direccionado em mamíferos, incluindo seres humanos, com necessidade deste tratamento. 0 processo refere-se também ao projecto de um ligando de alta afinidade para uma determinada molécula alvo compreendendo: a) a identificação de um primeiro ligando para a molécula alvo utilizando espectroscopia de RMN multidimensional; b) a identificação de um segundo ligando para a molécula alvo utilizando espectroscopia de RMN multidimensional em que o segundo ligando pode ser igual ou diferente do primeiro ligando e em que o segundo ligando se liga a um local na molécula alvo diferente do do primeiro ligando; c) a formação de um complexo ternário por ligação do primeiro e do segundo ligandos à molécula alvo; d) a determinação da estrutura tridimensional do complexo e assim da orientação espacial do primeiro ligando e do segundo ligando na molécula alvo; e e) o projecto do ligando em que a orientação espacial do passo d) é mantida.

No processo acima descrito, os primeiro e segundo ligandos podem ter a estrutura ou fórmuia molecular idêntica em que a porção se liga a pelo menos dois locais de ligação na molécula alvo. O ligando que é baseado na combinação estrutural dos primeiro e segundo ligandos serve então como uma pista de droga ou droga após a síntese desse composto combinado e avaliação nos ensaios biológicos apropriados. A síntese do ligando combinado, do ligando de alta afinidade, da pista de droga ou da droga é conseguida através de meios sintéticos ou biológicos. Conceptualmente, como indicado em todo o fascículo, os primeiro e segundo ligandos são ligados (juntos) por átomos de carbono, heteroátomos, ou uma sua combinação, para formar o ligando ou a pista de droga. Os processos aqui descritos incluem, evidentemente, sínteses do ligando

86 207 ΕΡ 0 870 197/ΡΤ 50 de alta afinidade por meios lineares ou não lineares (convergentes) que por último produzem os primeiro, segundo ou mais ligandos ligados (combinados).

Os primeiro e segundo ligandos podem também ter diferentes estruturas moleculares e cada um dos ligandos pode ou não ligar-se ao outro (distinto) local de ligação na molécula alvo.

Com maior detalhe, o processo da invenção refere-se também ao projecto de um ligando de alta afinidade para uma determinada molécula alvo, compreendendo a) a preparação de uma molécula alvo isotopicamente marcada em que a referida molécula é enriquecida com um isótopo detectável por RMN; b) a produção de espectros de RMN multidimensionais da molécula alvo marcada isotopicamente; c) a pesquisa da molécula alvo isotopicamente marcada por exposição da molécula alvo a uma pluralidade de compostos para identificar por espectroscopia de RMN multidimensional, pelo menos um primeiro e um segundo ligandos que se ligam a locais distintos na molécula alvo; d) a formação de pelo menos um complexo ternário por exposição dos pelo menos primeiro e segundo ligandos à molécula alvo isotopicamente marcada; e) a determinação da orientação espacial dos pelo menos primeiro e segundo ligandos na molécula alvo isotopicamente marcada; f) a utilização da orientação espacial determinada no passo e) para projectar o ligando de alta afinidade com base na combinação dos pelo menos primeiro e segundo ligandos. Evidentemente, podem-se combinar uma pluralidade de ligandos (1 +n) para formar um ligando de alta afinidade que tem a orientação espacial dos 1 +n (n= 1-00) ligandos combinados. Após o projecto do ligando de alta afinidade, o processo pode ainda incluir o passo f) de preparação do ligando de alta afinidade por meios sintéticos ou biológicos. Os pelos menos dois ligandos (primeiro e segundo ligandos) podem ser ligados por átomos de carbono {e.g., por unidades de metileno ou alquileno) ou por heteroátomos (e.g., por azoto, oxigénio, enxofre) ou por outros átomos que mantêm ou aproximam a orientação espacial dos 1 4-n ligandos à molécula alvo. Dependendo dos ligandos, as moléculas podem também ser combinadas ou juntas (ligadas) directamente umas às outras sem interveniência de unidades ligantes de alquileno ou heteroátomos. O ligando de alta afinidade produzido a 51 86 207 ΕΡ 0 870 197/ΡΤ partir dos 1 +η ligandos combinados apresenta preferivelmente um aumento da potência de ligação à molécula alvo em relação a qualquer um dos 1 +n ligandos. A presente invenção inclui portanto ligandos de alta afinidade projectados pelos processos aqui apresentados em que o referido ligando de alta afinidade tem um aumento na potência de ligação (Kd) para a determinada molécula alvo em relação aos pelo menos dois ligandos que se ligam a locais distintos na determinada molécula alvo. A presente invenção refere-se também a um método para a identificação de ligandos de alta afinidade utilizando relações de estrutura-actividade obtidas a partir de ressonância magnética nuclear em que o referido método compreende a construção de um ligando de alta afinidade que se liga a um sublocal da molécula alvo por: i) pesquisa de compostos de baixo peso molecular (<450 u) que se ligam a um sublocal 1 da molécula alvo; ii) pesquisa de análogos preparados a partir dos resultados iniciais no passo i) para optimizar a ligação ao sublocal 1 ; iii) a pesquisa de compostos de baixo peso molecular (<450 u) e correspondentes análogos que se ligam a um local de ligação próximo, o sublocal 2, da molécula alvo, utilizando espectroscopia de RMN multidimensional, para medir a afinidade de ligação; em que, após os passos (i)-(iii), são gerados fragmentos pista; iv) a combinação dos fragmentos pista gerados a partir dos passos i)-iii) para projectar um ligando de alta afinidade. A combinação pode ser conseguida por meios sintéticos ou biológicos. Os meios sintéticos incluem síntese orgânica do ligando combinado. Os meios biológicos incluem fermentação ou produção do ligando combinado através de um veículo ou sistema celular. Preferivelmente, a moiécula alvo é um polipéptido. A presente invenção refere-se também ao método, tal como atrás descrito, em que a combinação de fragmentos produz um ligando com uma potência de ligação superior (Kd) à dos fragmentos individuais para a molécula alvo. 52 86 207 ΕΡ 0 870 197/ΡΤ ί/"

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: Fesik, Stephen W.

Hajduk, Philip J. Olejniczak, Edward T. (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Utilização de Ressonância Magnética Nuclear para projectar ligandos para biomoléculas alvo (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 7 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) DESTINATÁRIO: Steven F. Weinstock,

Dep. 377 AP6D, Abbott Laboratories (B) RUA: 100 Abbott Park Road (C) CIDADE: Abbott Park (D) ESTADO: Illinois

(E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL: 60064 (vi) FORMA LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: disquete

(B) COMPUTADOR: compatível com PC IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SUPORTE LÓGICO: Patentln Release #1.0, Versão #1.30 (vi) DADOS DO PRESENTE PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: (C) CLASSIFICAÇÃO: (viii) INFORMAÇÃO SOBRE REPRESENTANTE/AGENTE: (A) NOME: Anand, Mona (B) NÚMERO DE REGISTO: 34537 (ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: (847) 937-4559

86 207 ΕΡ 0 870 197/ΡΤ 53 (Β) TELEFAX: (847) 938-2623 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N0:1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 174 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:1:

Phe Arg Thr Phe Pro Gly Ile Pro Lys Trp Arg Lys Thr His Leu Thr 1 5 10 15 Lys Arg Ile Vai Asn Tyr Thr Pro Asp Leu Pro Lys Asp Ala Vai Asp 20 25 30 Ser Ala Vai Glu Lys Ala Leu Lys Vai Trp Glu Glu Vai Thr Pro Leu 35 40 45 Thr Phe Ser Arg Leu Tyr Glu Gly Glu Ala Asp Ile Met Ile Ser Phe 50 55 60 Ala Vai Arg Glu His Gly Asp Phe Tyr Pro Phe Asp Gly Pro Gly Asn 65 70 75 80 Vai Leu Ala His Ala Tyr Ala Pro Gly Pro Gly Ile Asn Gly Asp Ala 85 90 95 His Phe Asp Asp Asp Glu Gin Trp Thr Lys Asp Thr Thr Gly Thr Asn 100 105 110 Leu Phe Leu Vai Ala Ala His Glu Ile Gly His Ser Leu Gly Leu Phe 115 120 125 His Ser Ala Asn Thr Glu Ala Leu Met Tyr Pro Leu Tyr His Ser Leu 130 135 140 Thr Asp Leu Thr Arg Phe Arg Leu Ser Gin Asp Asp Ile Asn Gly Ile 145 150 155 160 Gin Ser Leu Tyr Gly Pro Pro Pro Asp Ser Pro Glu Thr Pro 165 170 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 83 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido

86 207 ΕΡ 0 870 197/ΡΤ 54 (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:2:

Met Ala Thr Thr Pro Ile Ile His Leu Lys Gly Asp Ala Asn Ile Leu 1 5 10 15 Leu Cys Leu Arg Tyr Arg Leu Ser Lys Tyr Lys Gin Leu Tyr Glu Gin 20 25 30 Vai Ser Ser Thr Trp His Trp Thr Cys Thr Asp Gly Lys His Lys Asn 35 40 45 Ala Ile Vai Thr Leu Thr Tyr Ile Ser Thr Ser Gin Arg Asp Asp Phe 50 55 60 Leu Asn Thr Vai Lys Ile Pro Asn Thr Vai Ser Vai Ser Thr Gly Tyr 65 70 75 80 Met Thr Ile (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:3: GAAATGAAGA GTCTTCAA 18 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples

86 207 ΕΡ 0 870 197/ΡΤ 55 (D) TOPOLOGIA: linear (Π) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:4: GCGTCCCAGG TTCTGGAG 18 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 28 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:5: ATACCATGGC CTATCCATTG GATGGAGC 28 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:6:

ATAGGATCCT

TAGGTCTCAG

GGGAGT CAGG 30 56 86 207 ΕΡ 0 870 197/ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N0:7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 107 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N0:7:

Gly Vai Gin Vai Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro 1 5 10 15 Lys Arg Gly Gin Thr Cys Vai Vai His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp 20 25 30 Gly Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe 35 40 45 Met Leu Gly Lys Gin Glu Vai Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Vai Ala 50 55 60 Gin Met Ser Vai Gly Gin Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr 65 70 75 80 Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr 85 90 95 Leu Vai Phe Asp Vai Glu Leu Leu Lys Leu Glu 100 105

Lisboa, 22. ABOl 2001

Por ABBOTT LABORATORIES - O AGENTE OFICIAL

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Claims (15)

1. 86 207 ΕΡ 0 870 197/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Processo para o projecto de um ligando para uma determinada molécula alvo, compreendendo: a) a identificação de pelo menos dois ligandos para a molécula alvo que se ligam a locais distintos sobre a molécula alvo utilizando espectroscopia de RMN multidimensionai; b) a formação de pelo menos um complexo ternário por exposição dos pelo menos dois ligandos à molécula alvo; c) a determinação da estrutura tridimensional do complexo e a orientação espacial dos pelo menos dois ligandos sobre a molécula alvo; e d) a utilização da orientação espacial determinada no passo c) para projectar o ligando.
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1 em que o passo a) compreende: i) preparar uma molécula alvo isotopicamente marcada em que a referida molécula é enriquecida com um isótopo detectável por RMN; ii) gerar um espectro de RMN multidimensionai da molécula alvo isotopicamente marcada; e iii) pesquisar a molécula alvo isotopicamente marcada por exposição da molécula alvo a uma pluralidade de compostos para identificar por espectroscopia de RMN multidimensionai os referidos pelo menos dois ligandos; e o referido ligando é projectado com base na combinação dos pelo menos dois ligandos.
3. 3. Processo de acordo com a reivindicação 2 compreendendo ainda, após o referido projecto do ligando, preparar o ligando por meios sintéticos.
4. 4. Processo de acordo com a reivindicação 1 em que os referidos pelo menos dois ligandos são um primeiro e um segundo ligandos, sendo o segundo ligando iguai ou diferente do primeiro ligando, e se forma um complexo ternário no passo b).
5. 5. Processo de acordo com a reivindicação 4 em que o primeiro ligando é diferente do segundo ligando. 86 207 ΕΡ 0 870 197/ΡΤ 2/3
6. 6. Processo de acordo com a reivindicação 4 para o projecto de uma droga que serve como um ligando para uma determinada molécula alvo em que os referidos primeiro e segundo ligandos são cada um identificados no passo a) utilizando espectroscopia de correlação de RMN ,5N/1H bidimensional, e os referidos primeiro e segundo ligandos são ligados para formar a droga, na qual é mantida a orientação espacial do passo c).
7. 7. Processo de acordo com a reivindicação 6 em que a identificação do primeiro ligando é realizada gerando um primeiro espectro de correlação de RMN 15N/1H bidimensional de uma molécula alvo uniformemente marcada com 15N, expondo a molécula alvo marcada a um ou mais compostos químicos, gerando um espectro de correlação de RMN 1oN/1H bidimensional separado para cada um dos compostos, e comparando cada espectro com o primeiro espectro para determinar se existem diferenças entre esses espectros, diferenças essas que indicariam a presença de um primeiro ligando que se tenha ligado à molécula alvo.
8. 8. Processo de acordo com a reivindicação 6 em que a identificação do segundo ligando é realizada gerando um primeiro espectro de correlação de RMN 15N/1H bidimensional de uma molécula alvo uniformemente marcada com ’5N, expondo a molécula alvo marcada a um ou mais compostos químicos, gerando um espectro de correlação de RMN 15N/'H bidimensional separado para cada um dos compostos, e comparando cada espectro com o primeiro espectro para determinar se existem diferenças entre esses espectros, diferenças essas que indicariam a presença de um segundo ligando que se tenha ligado à molécula alvo.
9. 9. Processo de acordo com a reivindicação 6 em que o passo b) é realizado na presença do referido primeiro ligando.
10. 10. Processo de acordo com a reivindicação 7 ou 8 em que as diferenças nos espectros de correlação de RMN 15N/1H bidimensional são desvios químicos em locais particulares marcados com 15N na molécula alvo e desvios químicos nos protões ligados a esses locais marcados com ’5N, 86 207 ΕΡ 0 870 197/ΡΤ 3/3
11. 11. Processo de acordo com a reivindicação 6 em que a estrutura tridimensional do complexo ternário é determinada utilizando espectroscopia de RMN ou cristalografia de raios-x.
12. 12. Processo de acordo com a reivindicação 6 em que a molécula alvo é um polipéptido.
13. 13. Método para a identificação de ligandos para moléculas alvo utilizando relações de estrutura-actividade obtidas a partir de ressonância magnética nuclear, compreendendo: i) a pesquisa de compostos possuindo um peso molecular inferior a 450 u que se ligam a um subiocal 1 de uma determinada molécula alvo utilizando RMN multidimensional para medir a afinidade de ligação; ii) a pesquisa de análogos preparados a partir dos resultados de ligação obtidos no passo i) para optimizar a ligação de um primeiro fragmento à molécula alvo; iii) a pesquisa de compostos e análogos correspondentes que se ligam a um locai de ligação próximo, o subiocal 2, da molécula alvo utilizando RMN multidimensional para medir a afinidade de ligação para optimizar a ligação de um segundo fragmento à molécula alvo; e iv) a combinação dos primeiro e segundo fragmentos para projectar um ligando.
14. 14. Método de acordo com a reivindicação 13 em que a molécula alvo é uma proteína.
15. 15. Método de acordo com a reivindicação 13 em que o ligando possui uma potência de ligação superior para com a molécula alvo do que os seus fragmentos. Lisboa, 22. AGO. 2001 Por ABBOTT LABORATORIES