KR100888805B1 - 특정 아미노산이 표지된 단백질과 1ｄ ｎｍｒ 기법을이용하여 단백질의 활성 부위에 결합하는 화합물을검색하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 특정 아미노산이 표지된 단백질을 이용하여 1D NMR에 의해 단백질 활성 부위에 결합하는 화합물을 검색하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 1) 특정 아미노산이 ¹⁵N으로 표지된 표적 단백질을 제조하고 1D NMR 스펙트럼을 측정하는 단계; 2) 표적 단백질-활성부위 결합이 알려진 화합물 또는 표적 단백질-기질 유사체 결합 실험을 통해 활성 부위 신호를 결정하는 단계; 및 3) 화합물 라이브러리를 이용한 단백질-화합물 결합 실험을 통해 활성 부위 신호의 변화를 나타낸 화합물을 선별하는 단계를 포함하는, 표적 단백질의 활성부위에 결합하는 화합물을 확인 또는 검색하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 검색방법은 의약 발굴에 소모되는 시간과 비용을 절감하여 기존의 의약 디자인 방법보다 간편하므로 신약 개발을 위한 후보물질의 검색에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

특정 아미노산이 표지된 단백질과 1Ｄ ＮＭＲ 기법을 이용하여 단백질의 활성 부위에 결합하는 화합물을 검색하는 방법{METHOD FOR SCREENING COMPOUND BINDING TO THE ACTIVE SITE OF TARGET PROTEIN BY USING PROTEIN LABELED ON SPECIFIC AMINO ACIDS AND 1D NMR TECHNIQUE}

도 1은 본 발명의 대장균 발현벡터 pET21b로 형질전환된 대장균을 배양하여 얻은 세포 침전물로부터 PPAR 알파(Peroxisome Proliferative Activated Receptor alpha) 단백질을 정제한 후 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 수행한 결과이고,

도 2는 PPAR 알파의 스펙트럼을 각각 나타낸 것으로,

도 2 (a): 모든 아미노산이 ¹⁵N으로 표지된 단백질의 스펙트럼;

도 2 (b): 이소로이신(Isoleucine)만이 ¹⁵N으로 표지된 단백질의 스펙트럼이고,

도 3은 표적 단백질인 PPAR 알파에 활성부위 결합이 알려진 화합물을 결합시켰을 때의 NMR 신호 변화를 통해 단백질의 활성 부위를 조사한 결과로,

도 3 (a): ¹⁵N 이소로이신으로 표지된 PPAR 알파의 스펙트럼;

도 3 (b): ¹⁵N 이소로이신으로 표지된 PPAR 알파에 활성부위 결합이 알려진 화합물을 결합시켰을 때의 스펙트럼이고,

도 4는 도 3으로부터 확인된 PPAR 알파의 활성 부위 신호를 이용하여 이에 결합하는 화합물을 결정하는 과정으로,

도 4 (a): ¹⁵N 이소로이신으로 표지된 PPAR 알파의 스펙트럼;

도 4 (b): ¹⁵N 이소로이신으로 표지된 PPAR 알파에 화합물을 결합시켰을 때의 스펙트럼이고,

도 5는 본 발명의 대장균 발현벡터 pQE30srtA (N66)로 형질전환된 대장균을 배양하여 얻은 세포 침전물로부터 소테이즈(sortase) srtN66 단백질을 정제한 후 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 수행한 결과이고,(레인 2이 라이신(Lysine), 레인 3이 발린(Valine)으로 표지한 소테이즈)

도 6은 소테이즈의 활성 부위 신호를 이용하여 이에 결합하는 화합물을 결정하는 과정으로,

도 6 (a): ¹⁵N 라이신으로 표지된 소테이즈의 스펙트럼;

도 6 (b): ¹⁵N 라이신으로 표지된 소테이즈에 화합물을 결합시켰을 때의 스펙트럼이고,

도 7은 소테이즈의 활성 부위 신호를 이용하여 이에 결합하는 화합물을 결정하는 과정으로,

도 7 (a): ¹⁵N 발린으로 표지된 소테이즈의 스펙트럼;

도 7 (b): 소테이즈에 화합물을 결합시켰을 때의 스펙트럼이다.

본 발명은 특정 아미노산이 표지된 단백질을 이용하여 1D NMR에 의해 단백질 활성 부위에 결합하는 화합물을 검색하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 1) 특정 아미노산이 ¹⁵N으로 표지된 표적 단백질을 제조하고 1D NMR 스펙트럼을 측정하는 단계; 2) 표적 단백질-활성부위 결합 화합물 또는 표적 단백질-기질 유사체 결합 실험을 통해 활성 부위 신호를 결정하는 단계; 및 3) 화합물 라이브러리를 이용한 단백질-화합물 결합 실험을 통해 활성 부위 신호의 변화를 나타낸 화합물을 선별하는 단계를 포함하는, 단백질의 활성부위에 결합하는 화합물을 확인 또는 검색하는 방법에 관한 것이다.

과거의 전통적인 신약 개발 방법은 특정 약효를 보이는 각 화합물을 개별적으로 합성하고, 그 화합물의 효능과 특성을 확인하는 방법으로 진행되었다. 그런데, 최근의 로봇 합성(robotic synthesis), 순열 조합 화학(combinatorial chemistry) 및 고효율 스크리닝(high throughput screening) 등의 새로운 기술들이 선진 제약 기업에서 널리 받아들여짐에 따라 연구자들이 다루어야 하는 화합물의 수가 현격히 증가하게 되었다. 다시 말하면, 구조적으로 다양한 화합물 라이브러리(compound library)를 사용하여 단시간에 효과적으로 신약 후보 물질을 발굴하는 방법이 선호되고 있다는 것이다. 이러한 경향은 특히 최근의 유전체 연구 활성화로 인하여, 다수의 질환 표적 단백질의 발굴이 가속화됨에 따라서 그 중요성을 더해가고 있다.

이를 위하여, 주로 사용되는 신약 개발 방법은 합성 화합물이나 천연물 라이브러리를 스크리닝하여 표적 분자와 활성 부위에 결합하여 그 기능을 조절하는 리간드(ligand)를 찾아내는 것이다. 이때, 각 화합물이 표적 분자에 결합하는지 여부는 표적 분자의 크기, 운동성 등을 관측하여 확인하거나, 효소 활성이나 수용체(receptor) 활성 등을 측정하여 표적 분자의 생물학적 또는 화학적 기능을 평가하게 된다. 전자의 경우는 물리적인 평가 또는 친화도(affinity) 평가이며, 후자의 경우는 기능 평가에 해당한다. 기존의 친화도 평가나 기능 평가는 이미 신약 발굴 연구에 성공적으로 사용되고 있으나, 이러한 평가 방법이 가지는 본질적인 성질로 인하여 정확성, 신뢰성 및 효율성의 한계가 지적되고 있다.

기존의 분석 방법의 가장 주된 단점 중 하나는 위양성(false positive) 문제이다. 전형적인 기능 분석에서 위양성이란 특정 화합물이 분석 결과로는 양성 반응을 나타내지만, 실질적으로 기대하는 생리적 활성을 나타내지 못하는 경우를 말한다. 전형적인 물리적 분석에서 위양성이란 화합물이 표적 분자에 결합하지만 비특이적으로 결합하는 경우를 말한다. 비특이적 결합 위양성(non-specific binding false positive)은 특히 리간드의 농도가 높을 때, 리간드의 비특이적 효과가 증대 함으로써 심해지고 문제를 일으키게 된다. 또한, 기존의 분석 방법에는 위음성(false negative) 문제도 있을 수 있는데, 이 경우는 화합물이 실제 표적 분자의 리간드임에도 불구하고 음성 반응을 나타내는 경우이다. 위음성은 대개 화합물의 농도가 너무 높아 독성을 나타내거나, 결합 및 해리 상수보다 너무 낮은 경우에 발생한다.

기존의 분석 방법의 또 다른 단점은 분석 결과로부터 제공되는 정보의 한계이다. 분석에 의하여 표적 분자에 결합하여 반응을 나타내는 화합물을 판별할 수 있다 하더라도 이러한 방법으로는 화합물의 특정 결합 부위나, 구조-활성 관계를 밝히는 데에는 한계가 있다. 따라서, 스크리닝 분석을 수행하더라도 연구를 진행하기 위해서는 이러한 정보가 추가로 필요하게 된다. X-선 결정화(X-ray crystallography)를 이용하여 표적 분자에 대한 유기 용매(organic solvent)의 결합 부위를 밝히는 것이 가능하게 되었으나, 상기 방법은 표적의 여러 부위에 대한 상대적인 결합 세기를 알려주지는 못한다. 또한, 이 방법은 고농도의 유기 용매에 노출되어도 변성되지 않는 매우 안정된 단백질에 대해서만 적용할 수 있을 뿐만 아니라 구조적으로 다양한 여러 가지 화합물을 스크리닝하는 방법으로는 사용할 수 없고, 몇 가지 유기 용매에 대한 결합 부위를 계획(mapping)하는 것으로 제한되며 각 결정 구조를 해석하기 위해서는 많은 시간이 소요되는 문제점이 제기되고 있다.

화합물 스크리닝을 통하여 표적 분자의 기능을 조절하는 신약 디자인에 사용될 선도 물질(lead compound)을 발굴할 수 있으며, 이러한 선도 물질의 구조적 유사체나 둘 이상의 선도 물질의 결합체 등이 신약 후보 물질로 사용될 수 있다. 그 러나, 기존의 스크리닝 방법은 전술한 바와 같은 방법 자체의 본질적인 문제점으로 인하여 현재까지 신약 디자인에 크게 도움을 주지 못하는 측면이 있다. 따라서, 빠르고 효율적이면서 정확하고 신뢰할 만한 새로운 화합물의 검색방법이 요구되고 있다.

한편, 근래 구조 생물학의 발전으로 인하여 X-선 결정화나 NMR을 이용한 구조 연구를 통하여 질병 치료 목적상 표적이 되는 단백질이나 단백질/리간드 복합체의 입체 구조를 원자 수준에서 밝히는 것이 가능하게 되었고, 이러한 시도는 의약 개발을 목적으로 하는 연구 기관의 필수적인 기능이 되었다. 특히, X-선 결정화나 NMR을 통해 실험적으로 규명된 입체 구조를 이용하여, 컴퓨터를 이용한 가상 공간에서 이들 단백질의 활성 부위에 결합하는 화합물을 검색하는 방법이 많이 사용되게 되었다. 이 경우에는 개개의 화합물을 하나씩 합성하여 효능을 확인하는 방법으로는 상상할 수 없을 정도로 훨씬 많은 수의 다양한 화합물을 단시간에 검색하는 것이 가능하므로 시간과 인력을 절약하는 장점이 있다.

반면에 가상 공간에서의 결합 실험은 컴퓨터를 이용한 연결(docking) 실험으로서, 실제로 사용되는 용액 내에서 결합 실험의 모든 조건을 다 만족시키기 어려운 면이 있다. 즉, 결합에 필요한 주요 잔기(key moiety)를 발굴하는 데는 유용하나, 실제로 그 화합물을 합성하였을 때 활성 부위에 특이적으로 결합하는지 여부는 실험적으로 확인해 보아야 한다. 이를 실험적으로 확인하는 방법으로는 효소 활성을 측정하는 효소 분석 방법(enzyme assay)이나 물리적 결합을 확인하는 물리적 분석 방법이 있다.

이러한 경우의 화합물 확인은 화합물들의 구조적인 다양성 및 비교적 분자량이 작은 주요 잔기에 의한 결합을 전제로 하기 때문에, 결합을 보이는 화합물의 친화력이 수십 μM 정도의 약한 결합인 경우가 대부분이다. 이렇게 친화력이 약한 초기의 결합 화합물을 발굴하기 위해서는 수십 내지 수백 μM 정도의 약한 친화력으로 표적 단백질의 활성부위에 결합하는 화합물을 효과적으로 찾아내는 방법이 필요하다. NMR을 이용한 화합물 결합 검색은 통상적인 효소 분석으로는 거의 식별할 수 없는 정도의 약한 친화력(수십 μM ~ 수 mM)도 효과적으로 식별함으로써, 결합에 필요한 정보를 얻을 수 있다는 특징을 갖는다. 따라서, 검색하는 화합물도 완성된 크기의 화합물이 아닌 작은 화합물을 사용하여 검색할 수가 있고, 이것은 검색해야 할 화합물의 숫자가 상대적으로 적어도 된다는 장점을 갖는다. 또한, 이렇게 해서 선택된 두 세 화합물을 연결시킴으로써 강력한 친화력을 가진 새로운 화합물을 디자인하기에 적합할 뿐만 아니라 단백질의 NMR 신호들이 할당(assign)된 경우에는 복합체 구조까지 구하여 디자인에 응용할 수 있다는 등의 중요한 장점을 갖는다.

NMR을 이용한 화합물 검색 및 의약 디자인의 개념은 미국의 애보트(Abbott)사의 슈커(Shuker, S. B.) 등이 ¹⁵N으로 균일하게 표지된 단백질을 사용하여 상기 단백질의 활성 부위에 결합하는 화합물을 찾아내는 방법을 제안하고, 이것을 NMR에 의한 SAR이라고 명명하였다(Shuker, S. B. 등, Science, 274: 1531-1534(1996)). 이들은 활성 부위의 결합 포켓(pocket)이 두 개 이상일 경우, 각 포켓의 화합물을 연결시키는 방법으로 상승 효과를 볼 수 있음을 보여 주었다(Shuker, S. B. 등, Science, 274: 1531-1534(1996); Olejniczak, E. T. 등, J. Am. Chem. Soc., 119: 5828-5832(1997)). 노바티스(Novartis)사의 린(Lin, M.) 등은 용액 내에서의 확산 속도 차이를 이용하여 화합물의 혼합 상태에서 단백질에 결합하는 화합물을 발굴하는 방법을 개발하였고(Lin, M. 등, J. Org. Chem., 62: 8930-8931(1997) 및 Chen, A 및 Shapiro, M. J., J. Am. Chem. Soc., 120: 10258-10259(1998)), 해즈덕(Hajduk, P. J.) 등은 분자량이 작은 화합물과 단백질 결합체의 이완(relaxation) 속도의 차이를 이용하여 화합물을 검색할 수 있음을 보여 주었다(Hajduk, P. J., Olejniczak, E. T. 및 Fesik, S. W., J. Am. Chem. Soc., 119: 12257-12261(1997b)). 또한, 메이어(Meyer, B.) 등은 TRNOE(transferred NOE)를 이용한 방법으로 화합물의 혼합상태에서 단백질에 결합한 화합물을 검색하고 이를 생물 친화성 NMR(Bio-affinity NMR)이라고 명명하였다(Meyer, B. 및 Peters, T., Eur. J. Biochem., 246: 705-709(1997)).

상기와 같은 방법은 작은 절편(small fragment)으로 구성된 화합물 라이브러리로부터 표적 단백질에 결합하는 활성 화합물을 찾아내고, 그 구조적인 특성을 정리함으로써 의약 후보물질의 고안(drug candidate design)에 필요한 정보를 제공한다는 개념이다. NMR을 이용한 이러한 접근 방법은 각각 그 특성 및 장단점이 있으나 모두 친화도를 이용한 스크리닝으로 혼합 화합물로부터 다수의 화합물을 스크리닝할 수 있다는 공통점을 가지므로, 이들을 NMR을 이용한 친화도-기초 화합물 스크리닝(affinity-based compound screening)이라고 할 수 있다.

본 발명자들은 1D NMR을 사용하는 경우에는 2D NMR을 사용하는 경우에 비해 보다 더 낮은 농도의 단백질에서, 보다 더 짧은 시간에 표적 단백질에 결합하는 화합물의 스크리닝을 수행할 수가 있어, 대량 스크리닝에 유리하다는 장점이 있음을 인지하고, 보다 간편하고 효율적인 화합물 검색방법을 1D NMR을 이용하여 확립하고자 예의 연구 노력한 결과, 특정 아미노산의 1D NMR 신호만 표시하는 표지 방법을 사용하여 분자량이 큰 단백질의 NMR 스펙트럼을 훨씬 간소화시켜 활성 부위 신호를 용이하게 결정할 수 있고, 효소 단백질의 기질과 서열이 동일한 펩티드나 펩티드 유사체를 이용하여 단백질 전체의 주요 신호를 할당하지 않더라도 쉽게 활성 부위의 NMR 신호를 결정할 수 있는 새로운 검색방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 1D NMR을 이용하여 목적 단백질의 활성 부위에 결합하는 화합물을 보다 간편하고 효율적으로 검색하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 특정 아미노산이 표지된 단백질과 1D NMR을 이용한 단백질 활성 부위 결합 화합물의 검색방법을 제공한다.

본 발명자들은 특정 아미노산이 표지된 단백질 및 기질 유래의 펩티드 또는 펩티드 유사체를 사용하여 단백질의 활성 부위에 해당하는 NMR 신호를 결정하고, 이들의 정보를 이용한 화합물 검색으로 목적 단백질의 활성 부위에 결합하는 화합물을 확인하는 검색방법을 개발하였다.

본 발명의 검색방법은

1) 특정 아미노산이 ¹⁵N으로 표지된 표적 단백질을 제조하고 1D NMR 스펙트럼을 측정하는 단계;

2) 표적 단백질-활성부위 결합 화합물 또는 표적 단백질-기질 유사체 결합 실험을 통해 활성 부위 신호를 결정하는 단계; 및

3) 화합물 라이브러리를 이용한 단백질-화합물 결합 실험을 통해 활성 부위 신호의 변화를 나타낸 화합물을 선별하는 단계를 포함한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

상기 검색방법을 단계별로 설명하면, 단계 1)에서는 특정 아미노산이 ¹⁵N으로 표지된 단백질을 제조하고, 이들 단백질의 1D NMR 스펙트럼을 측정하여 단백질의 NMR 신호가 간소화된 스펙트럼을 얻는다.

상기에서 표지될 수 있는 아미노산은 20여종의 모든 아미노산을 대상으로 사용할 수 있으나, 목적하는 단백질의 활성부위의 아미노산 서열에 대한 정보가 있을 경우에는 해당 아미노산만을 표지하는 것이 바람직하다.

목적하는 표적 단백질로는 효소, 수용체 및 단백질-단백질, 단백질-핵산의 상호작용 복합체 등이 사용될 수 있다.

특정 아미노산이 ¹⁵N으로 표지된 표적 단백질은 표적 단백질을 생산하는 유전 자 재조합 미생물의 배양시 배지에 ¹⁵N으로 표지된 아미노산이나 아미노산 전구체를 첨가하여 표적 단백질을 발현 정제하여 제조할 수 있다.

본 발명에서는 바람직한 실시양태 중 하나로서 이소로이신이 ¹⁵N으로 표지된 PPAR 알파 단백질을 사용하였는데, 모든 아미노산이 ¹⁵N으로 표지된 단백질의 NMR 스펙트럼에 비하여 검출 신호가 간소화되어 활성 부위의 결정이 용이하다(도 2 참조).

단계 2)에서는 표적 단백질 활성부위에 결합하는 것으로 알려진 화합물이나 기질 유사체를 결합시킨 후 1D NMR 스펙트럼을 측정하여, 단계 1)에서 측정한 스펙트럼과 비교하는 방법으로 활성부위 신호를 결정한다. 상기 화합물 또는 기질 유사체는 표적 단백질의 활성 부위에 결합하도록 고안되었기 때문에 아미노산이 ¹⁵N으로 표지된 표적 단백질의 스펙트럼과 상기 화합물 또는 기질 유사체가 결합된 표적 단백질의 스펙트럼을 비교하게 되면, 상기 화합물 또는 기질 유사체가 결합된 부분의 신호는 스펙트럼에서 축소, 제거되거나 위치가 이동하여 나타난다. 따라서, 이러한 NMR 신호 상의 변화된 부분이 표적 단백질의 활성 부위를 나타내는 것이다.

단계 3)에서는 먼저 효소 반응 메커니즘 또는 가상 스크리닝(Virtual screening) 등의 정보를 토대로 표적 단백질의 활성 부위에 결합할 가능성이 높다고 판단되는 화합물을 선별하여 수집한다. 수집된 화합물을 표적 단백질 용액에 혼합하여 결합 반응을 수행한 후 1D NMR 스펙트럼을 측정하여 비교함으로써 단계 2)에서 결정된 활성 부위 신호에 영향을 주는 화합물을 선별한다. 즉, 화합물들을 표적 단백질과 혼합한 후 이들의 NMR 스펙트럼을 아미노산이 ¹⁵N으로 표지된 표적 단백질의 스펙트럼과 비교하여 활성 부위 신호가 사라지거나 축소된 스펙트럼을 나타내는 화합물을 선별하는 것이다. 이 과정은 시간을 단축하기 위하여 5 내지 10종의 혼합 화합물을 대상으로 하여 실험할 수 있다.

상기 방법을 통해 결합이 확인된 화합물들을 이용하여 바로 신약 후보물질의 설계에 사용될 수 있도록 디자인할 수 있으며, 생리활성이 수 uM 대에 이르는 화합물들은 단백질/선도 화합물 결합체의 X-선 구조를 결정한 후 본격적인 최적화 과정에 들어가게 된다.

본 발명은 또한 상기 단계에서 단계 1) 및 3)만을 포함하여 특정 아미노산이 ¹⁵N으로 표지된 표적 단백질을 제조하고 1D NMR 스펙트럼을 측정한 후 화합물 라이브러리를 이용한 단백질-화합물 결합 실험을 통해 표적 단백질에 결합하는 화합물을 선별하는 방법을 제공한다. 이 방법은 대상 화합물이 표적 단백질의 활성 부위에 결합하는지 여부는 제공하지 못하지만 일차적으로 수많은 화합물 라이브러리로부터 표적 단백질에 결합하는 화합물을 확인 또는 검색하는데 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 검색방법은 특정 아미노산의 NMR 신호만 표시하는 표지 방법을 사용하기 때문에 분자량이 큰 단백질의 NMR 스펙트럼 신호를 훨씬 간소화시켜 활성 부위 신호를 용이하게 결정할 수 있다. 또한, 효소 단백질의 활성부위 결합이 알려진 화합물이나, 기질과 서열이 유사한 펩티드 또는 펩티드 유사체를 이용하기 때문에 단백질 전체의 신호를 규명하지 않더라도 활성 부위의 NMR 신호를 용이하게 결정할 수 있다. 따라서, 본 발명의 검색방법은 의약 후보물질의 개발에 소모되는 비용과 시간을 절감하여 기존의 의약 디자인 방법보다 간편하므로 신약 개발을 위한 후보물질의 검색에 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 특정 아미노산이 ¹⁵ N으로 표지된 단백질의 제조

(1) 이소로이신이 ¹⁵N으로 표지된 PPAR 알파의 제조

PPAR 알파의 N 말단에서 10개의 아미노산이 결손된, 11번 아미노산부터 468번 아미노산까지를 표적 단백질로 하고 PPAR 알파 유전자를 얻기 위하여 인간 간 cDNA 라이브러리(human liver cDNA library; Clontech사, 미국)의 DNA를 주형으로 하고 프라이머 5'-AATTGGATCCCTCTCCCCACTCGAGGCCGGC-3'(서열번호 1) 및 5'-TTAAGTCGACTCAGTACATGTCCCTGTAGATCTCCTGCAG-3'(서열번호 2)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 이로부터 합성된 PPAR 알파를 플라스미드 pET21b(Novagen사, 미국)의 BamHI-SalI 부위에 클로닝하여 발현벡터 pETPPARa를 제작하였고 이를 대장균 BL21(DE3)(Novagen사, 미국)에 형질전환시킨 후 M9 최소배지(minimal medium)에서 배양하였다. 이때, 배지에는 20여종의 아미노산을 50 mM로 첨가하되, 이소로이신을 ¹⁵N으로 표지하기 위하여 ¹⁵N으로 표지된 이소로이신을 200 ㎎/ℓ 농도로 첨가하였다.

상기에서 얻은 재조합 플라스미드에 클로닝된 PPAR 알파 유전자의 염기서열 확인은 생거 등(Sanger, F. 등, PNAS U.S.A., 74: 5463(1977))의 방법에 따라 Big-Dye Cycle Sequencing System(Applied Biosystems사, 미국)을 이용하여 수행하였고 ABI 377 DNA 염기서열 분석기에 의해 분석하였다.

재조합 형질전환체로부터 단백질의 생성 여부는 통상적으로 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동이나 웨스턴 블롯팅 분석으로 확인하였다. 배양시 세포 농도가 일정한 수준(600㎚에서의 흡광도가 0.5 내지 1.0)에 이르렀을 때, IPTG(isopropyl-β-D-galactopyranoside)를 첨가하여 표적 단백질의 발현을 유도하였다. 이와 같이 하여 PPAR 알파가 발현된 대장균 형질전환 세포 배양액 2ℓ를 원심 분리기를 이용하여 6,000rpm에서 10분간 원심 분리하여 대장균 세포 침전물을 수거하였다. 상기 세포 침전물을 40mM Tris(pH 7.5), 150mM 염화나트륨, 20mM DTT, 5% 글리세롤을 포함하는 완충용액에 현탁시킨 후 얼음 중탕에서 초음파 분쇄기(Sonic Dismembrator, Fisher사, 미국)를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 상기 용액을 원심분리기로 16,000rpm에서 30분간 원심 분리한 후 그 상층액을 다음 과정에 이용하였다.

상기에서 얻은 상층액을 상기 완충용액으로 미리 평형된 니켈-니트릴로트리아세트산(Ni-NTA) 칼럼(Pharmacia사)에 결합시킨 후 0 내지 0.5 M 이미다졸 농도 구배를 이용하여 용출하였다. 이로부터 얻은 용출액을 SDS-PAGE로 분리하여 PPAR 알파 단백질 부분만 모은 후 다음 과정에 이용하였다. 상기에서 얻은 PPAR 알파 단백질 부분을 5㎖ 가량으로 농축한 후 40mM Tris(pH 7.5), 150mM 염화나트륨, 20mM DTT, 5% 글리세롤을 포함하는 완충액으로 평형된 겔 여과 칼럼(gel filtration column, Superdex 75, 26/60, Pharmacia사)에 주입시킨 후 단백질의 분자량에 따라 분리하여 전기영동으로 확인하고 이로부터 PPAR 알파 단백질 부분만 회수하였다(도 1 참조).

(2) 라이신이 ¹⁵N으로 표지된 소테이즈의 제조

스타필로코커스 아우레우스에서 유래한 소테이즈의 N 말단에서 65개의 아미노산이 결손된 도메인 SrtN66을 표적 단백질로 하고 소테이즈 코딩 유전자를 얻기 위하여 스타필로코커스 아우레우스(ATCC 6538P)의 DNA를 주형으로 하고 프라이머 5'-GGCCGGATCCCCGAAAGATAAATCGAAAGTGGCAGGCTAT-3'(서열번호 3) 및 5-'GGCCGTCGACTTATTTGACTTCTGTAGCTACAAAGATTTTA-3'(서열번호 4)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 이로부터 합성된 소테이즈 유전자를 플라스미드 pQE30(Quiagen사)의 BamHI-SalI 부위에 클로닝하여 발현벡터 pQE30srtA를 제작하였고 이를 대장균 BL21(DE3)(Novagen사)에 형질전환시킨 후 M9 최소배지에서 배양하였다. 상기에서 소테이즈 단백질을 발현하는 대장균 형질전환체를 제작하는 방법은 대한민국 특허출원 제 2001-55772 호에 기재된 바에 따라 수행하였다. 이 때, 배지에는 20여종의 아미노산을 50 mM로 첨가하되, 라이신을 ¹⁵N으로 표지하기 위하여 ¹⁵N으로 표지된 라이신을 200 ㎎/ℓ 농도로 첨가하였다.

상기에서 얻은 재조합 플라스미드에 클로닝된 소테이즈 유전자의 염기서열 확인은 생거 등(Sanger, F. 등, PNAS U.S.A., 74: 5463(1977))의 방법에 따라 Big- Dye Cycle Sequencing System(Applied Biosystems사, 미국)을 이용하여 수행하였고 ABI 377 DNA 염기서열 분석기에 의해 분석하였다.

재조합 형질전환체로부터 단백질의 생성 여부는 통상적으로 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동이나 웨스턴 블롯팅 분석으로 확인하였다. 배양시 세포 농도가 일정한 수준(600 ㎚에서의 흡광도가 0.5 내지 1.0 사이)에 이르렀을 때, IPTG (isopropyl-β-D-galactopyranoside)를 첨가하여 표적 단백질의 발현을 유도하였다. 이와 같이 하여 소테이즈가 발현된 대장균 형질전환 세포를 2ℓ배양한 후 원심 분리기를 이용하여 6,000rpm에서 10분간 원심 분리하여 대장균 세포 침전물을 수거하였다. 상기 세포 침전물을 50 mM Tris pH 7.5, 150 mM 염화나트륨을 포함하는 완충용액에 현탁시킨 후 얼음 중탕에서 초음파 분쇄기(Sonic Dismembrator, Fisher사, 미국)를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 상기 용액을 원심분리기로 16,000rpm에서 30분간 원심 분리한 후 그 상층액을 다음 과정에 이용하였다.

상기에서 얻은 상층액을 상기 완충용액으로 미리 평형된 니켈-니트릴로트리아세트산 (Ni-NTA) 칼럼(Pharmacia사)에 결합시킨 후 0 내지 0.5 M 이미다졸 농도 구배를 이용하여 용출하였다. 이로부터 얻은 용출액을 SDS-PAGE에 걸러 분리하여 소테이즈 단백질 부분만 모은 후 다음 과정에 이용하였다. 상기에서 얻은 소테이즈 단백질 부분을 5 ㎖ 가량 농축한 후 50 mM Tris pH 7.5, 150 mM 염화나트륨, 10% 글리세롤, 3 mM DTT를 포함하는 완충용액으로 평형된 겔 여과 칼럼(gel filtration column, Superdex 75, 26/60, Pharmacia사)에 주입시킨 후 단백질의 분자량에 따라 분리하여 전기영동으로 확인하고 이로부터 소테이즈 단백질 부분만 회 수하였다(도 5에서 레인 2).

(3) 발린(valine)이 ¹⁵N으로 표지된 소테이즈의 제조

라이신 대신 발린을 ¹⁵N으로 표지한다는 점을 제외하고는 상기 (2)와 동일한 방법을 수행하여 발린이 ¹⁵N으로 표지된 소테이즈를 제조하였다(도 5에서 레인 3).

<실시예 2> 이소로이신이 ¹⁵ N으로 표지된 단백질의 1D NMR 측정

(1) ¹⁵N-이소로이신으로 표지된 PPAR 알파의 1D NMR 측정

상기 실시예 1의 (1)로부터 분리된 PPAR 알파를 0.1mM 농도로 농축하여, 30℃, pH 6.5에서 1D HSQC(hetero nuclear single quantum correlation; Bax, A. 등, J. Magn. Reson., 36: 304-318(1990)) NMR 실험을 수행하였다. 이때, 실험은 브루커(Bruker)사의 DRX 600 MHz NMR 기기를 사용하였고, 삼중-공명 프로브(triple-resonance probe; 브루커사, 독일)를 이용하였다. 스펙트럼 넓이는 ¹H축에 대하여 각각 10,000Hz로 측정하였다. 물피크의 제거는 WATERGATE(Sklenar, V. 등, J. Magn. Reson., A102: 241-245) 기법을 사용하였고, 물 수소원자의 자기는 +Z 방향으로 되돌려서 자기 교환에 의한 감도소실을 최소화시켰다(Grzesiek, S 및 Bax, A., J. Am. Chem. Soc., 115: 12593-12594(1993)). ¹⁵N 디커플링은 WALTZ-16(Shaka, A. J. 등, J. Magn. Reson., 52: 334(1983))을 사용하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 대조군으로 모든 아미노산이 ¹⁵N으로 표지된 단백질의 스펙트럼에 비하여 아미노산 중 이소로이신만이 ¹⁵N으로 표지된 단백질의 스펙트럼에서 이소로이신의 아미드 수소의 신호만이 검출되어 스펙트럼이 훨씬 간소화됨으로써 활성 부위의 신호를 용이하게 결정할 수 있음을 알 수 있다.

(2) ¹⁵N-라이신으로 표지된 소테이즈의 1D NMR 측정

상기 (1)과 동일한 방법으로 15N 라이신으로 표지된 소테이즈 단백질의 1D HSQC 스펙트럼을 측정하였고, 그 결과 도 6 (a)에 나타낸 것과 같이 아미노산 중 라이신의 아미드 수소의 신호만이 검출되어 스펙트럼이 훨씬 간소화됨으로써 활성 부위의 신호를 용이하게 결정할 수 있음을 알 수 있다.

(3) ¹⁵N-발린으로 표지된 소테이즈의 1D NMR 측정

상기 (1)과 동일한 방법으로 15N 발린으로 표지된 소테이즈 단백질의 1D HSQC 스펙트럼을 측정하였고, 그 결과 도 7 (a)에 나타낸 것과 같이 아미노산 중 발린의 아미드 수소의 신호만이 검출되어 스펙트럼이 훨씬 간소화됨으로써 활성 부위의 신호를 용이하게 결정할 수 있음을 알 수 있다.

<실시예 3> 활성부위 결합이 확인된 화합물 또는 기질 유사체를 이용한 활성 부위 신호 결정

활성 부위 결합에 따른 신호 변화를 확인하기 위하여, PRAR 알파의 활성부위에 결합하는 것으로 알려진 화합물 WY14643(바이오몰(Biomol)사)을 사용하여 화합물이 활성부위에 결합할 때 변화를 보이는 신호를 관측하였다. PRAR 알파를 40mM Tris(pH 7.5), 150mM 염화나트륨, 20mM DTT, 5% 글리세롤 완충액에 0.1mM 농도로 용해시킨 용액에 화합물 WY14643을 0.5mM의 농도로 혼합하고 이 때에 일어나는 NMR 신호 변화를 관측하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 이소로이신이 ¹⁵N으로 표지된 표적 단백질의 스펙트럼에서 #1 과 #2 로 표시된 부분의 신호가 펩티드를 결합시켰을 때의 스펙트럼에서는 그 위치가 이동하였음을 확인하고 이 부분을 상기 표적 단백질의 활성 부위로 결정하였다. 이때, 각각의 NMR 신호는 #1: 8.920 ppm, #2: 7.595 ppm 이었다.

<실시예 4> 표적 단백질의 활성 부위에 결합하는 화합물 검색

(1) PPAR 알파의 활성 부위에서의 신호 변화를 통한 화합물 검색

활성 부위에 결합하는 화합물을 스크리닝하기 위해 하기에 기재된 화합물 1 내지 5(크리스탈지노믹스(주) 소유 화합물 라이브러리)를 각각 실시예 3과 동일한 방법으로 단백질 용액에 혼합한 후 결합에 의한 신호 변화를 관측하였다:

화합물 1:

1-(4-메톡시-벤젠설포닐)-1H-피리미딘-2-티온(1-(4-Methoxy-benzenesulfonyl)- 1H-pyrimidine-2-thione);

화합물 2:

4-[4-(2-(2,6-디메틸모폴리닐)-설포닐-비닐)-벤젠설포닐]-2,6-디메틸-모폴린(4-[4-(2-(2,6-dimethylmorpholinyl)-sulfonyl-vinyl)-benzenesulfonyl]-2,6-dimethyl-morpholine);

화합물 3:

N-푸란-2-일-메틸-4-(피페리딘-1-설포닐)-벤즈아미드(N-Furan-2-yl-methyl-4-(piperidine-1-sulfonyl)-benzamide);

화합물 4:

2-메톡시-N-{4-[4-(모폴린-4-설포닐)-페닐]-티아졸-2-일}-벤즈아미드(2-Methoxy-N-{4-[4-(morpholine-4-sulfonyl)-phenyl]-thiazol-2-yl}-benzamide);

화합물 5:

2-{4-[2-(4-클로로-벤조일아미노)-에틸]-페녹시}-2-메틸-프로피온산(2-{4-[2-(4-Chloro-benzoylamino)-ethyl]-phenoxy}-2-methyl-propionic acid).

PRAR 알파를 40mM Tris(pH 7.5), 150mM 염화나트륨, 20mM DTT, 5% 글리세롤 완충액에 0.1mM 농도로 용해시킨 용액에 각 화합물을 0.1mM 농도로 혼합하고 이때 야기되는 NMR 신호 변화를 관측하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 3의 결과로부터 표적 단백질의 활성 부위로 결정된 부위의 신호가 변화된 스펙트럼을 나타내는 화합물 2-{4-[2-(4-클로로-벤조일아미노)-에틸]-페녹시}-2-메틸-프로피온산을 상기 단백질의 활성 부위 결합 단백질로 선별하였다.

(2) 소테이즈의 활성 부위에서의 신호 변화를 통한 화합물 검색

상기 (1)과 동일한 방법으로 ¹⁵N 라이신 또는 ¹⁵N 발린으로 표지된 소테이즈 단백질에 대하여 활성부위에 결합하는 화합물을 검색하였고, 그 결과, 도 6 내지 도 7에 나타난 바와 같이, 표적 단백질의 활성 부위로 결정된 부위의 신호가 변화된 스펙트럼을 나타내는 화합물 4-디에톡시메틸-3a,4-디하이드로-1H,3H-시클로펜타 [c]푸란-5-온(4-Diethoxymethyl-3a,4-dihydro-1H,3H-cyclopenta[c]furan-5-one)을 상기 단백질의 활성 부위 결합 화합물로 선별하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 검색방법은 특정 아미노산만을 표지하는 방법을 사용하여 분자량이 큰 단백질의 NMR 신호를 훨씬 단순화시키고, 활성부위 결합이 확인된 화합물이나 효소 단백질의 기질과 서열이 동일한 펩티드 또는 펩티드 유사체를 이용하기 때문에 단백질 전체의 NMR 신호를 규명하지 않더라도 활성 부위의 NMR 신호를 용이하게 결정할 수 있게 하여, 의약 후보물질의 개발에 소모되는 비용을 절감하고 경쟁력을 강화시킴으로써 신약 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

또한 , 본 발명의 검색 방법은 1D NMR을 이용함으로써 2D NMR을 사용하는 경우보다 낮은 표적 단백질 농도에서도 화합물의 결합 신호를 빠른 시간 내에 관찰할 수 있게 하여 화합물의 대량 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있다.

<110> Crystalgenomics, Inc. <120> METHOD FOR SCREENING COMPOUND BINDING TO THE ACTIVE SITE OF TARGET PROTEIN BY USING PROTEIN LABELED ON SPECIFIC AMINO ACIDS AND 1D NMR TECHNIQUE <130> FPD/200204-0026 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PPAR alpha gene <400> 1 aattggatcc ctctccccac tcgaggccgg c 31 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for PPAR alpha gene <400> 2 ttaagtcgac tcagtacatg tccctgtaga tctcctgcag 40 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for sortase gene <400> 3 ggccggatcc ccgaaagata aatcgaaagt ggcaggctat 40 <210> 4 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for sortase gene <400> 4 ggccgtcgac ttatttgact tctgtagcta caaagatttt a 41

Claims (12)

1) 특정 아미노산을 ¹⁵N으로 표지된 표적 단백질을 제조하고 1D NMR 스펙트럼을 측정하는 단계;

2) 상기 표적 단백질의 활성부위와 결합하는 화합물 또는 기질 유사체를 상기 표적 단백질과 결합시켜 1D NMR 스펙트럼을 측정한 다음, 단계 1)에서 측정한 스펙트럼과 비교하여 표적 단백질의 활성부위의 신호를 결정하는 단계; 및

3) 화합물 라이브러리로부터 선택된 1종 이상의 화합물을 상기 표적 단백질과 혼합하여 1D NMR 스펙트럼을 측정한 다음, 단계 2)에서 결정된 표적 단백질의 활성부위에 상응하는 부위에서 신호 변화를 나타내는 화합물을 선별하는 단계

를 포함하는, 표적 단백질의 활성 부위에 결합하는 화합물을 확인 또는 검색하는 방법.

제 1 항에 있어서,

단계 1)에서 상기 특정 아미노산이 활성부위에 존재하는 아미노산 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.

제 1 항에 있어서,

단계 1)에서 표적 단백질이 효소 또는 수용체로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.

제 1 항에 있어서,

단계 1)에서 ¹⁵N으로 표지된 표적 단백질이 유전자 재조합 미생물을 이용한 발현방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.

삭제

제 1 항에 있어서,

표적 단백질의 라이신(Lysine), 발린(Valine), 로이신(Leucine) 또는 이소로이신(Isoleucine) 잔기가 ¹⁵N으로 표지되는 것을 특징으로 하는 방법.

1) 특정 아미노산이 ¹⁵N으로 표지된 표적 단백질을 제조하고 1D NMR 스펙트럼을 측정하는 단계; 및

2) 화합물 라이브러리로부터 선택된 1종 이상의 화합물을 상기 표적 단백질과 혼합하여 1D NMR 스펙트럼을 측정한 다음, 단계 1)에서 측정한 스펙트럼과 비교하여 신호 변화를 나타내는 화합물을 선별하는 단계

를 포함하는, 표적 단백질에 결합하는 화합물을 확인 또는 검색하는 방법.

제 7 항에 있어서,

단계 1)에서 상기 특정 아미노산이 활성부위에 존재하는 아미노산 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.

제 7 항에 있어서,

단계 1)에서 표적 단백질이 효소 또는 수용체로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.

제 7 항에 있어서,

단계 1)에서 ¹⁵N으로 표지된 표적 단백질이 유전자 재조합 미생물을 이용한 발현방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.

제 7 항에 있어서,

표적 단백질이 효소이고 이에 결합하는 화합물이 기질 펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.

제 7 항에 있어서,

표적 단백질의 라이신, 발린, 로이신 또는 이소로이신 잔기가 ¹⁵N으로 표지되는 것을 특징으로 하는 방법.

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