KR100901309B1 - 단백질의 활성 부위에 결합하는 화합물을 선별하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 단백질에 대한 결합이 알려진 기지(旣知)의 리간드를 사용하여, 1D NMR에 의해 단백질 활성부위에 결합하는 화합물을 선별하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로, 1) 시험 화합물 또는 시험 화합물 혼합체의 1D NMR 스펙트럼을 측정하는 단계, 2) 1)의 시험 화합물 또는 시험 화합물 혼합체 용액에 표적 단백질을 혼합한 후 1D NMR을 측정하는 단계, 3) 2)의 용액에 표적 단백질의 활성 부위에 결합하는 것이 알려진 기지의 리간드를 혼합한 후 1D NMR을 측정하는 단계, 및 4) 1), 2) 및 3)의 NMR 스펙트럼을 비교하여, 2)에서 표적 단백질과의 결합되었다가 3)에서 기지의 리간드를 혼합함으로써 표적 단백질로부터 분리되거나 결합이 약하게 되는 화합물을 확인하는 단계를 포함하는, 표적 단백질의 활성 부위에 결합하는 화합물을 선별하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 선별방법은 새로운 의약 개발에 소모되는 시간과 비용을 절감함으로써 신약 개발을 위한 후보물질의 판별 및 검색에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
도 1은 본 발명에서 사용된 화합물 CG-PD-0215 (5-(3,4-Dimethoxy-phenyl) -7-trifluoromethyl-pyrazolo[1,5-a]pyrimidine-2-carboxylic acid)의 1D NMR 스펙트럼이고,
도 2는 화합물 CG-PD-0215에 포스포다이에스터레이즈 단백질을 1mg/ml 농도로 섞어준 후에 측정한 1D NMR 스펙트럼이고,
도 3은 단백질-화합물 혼합액에 표적 단백질에 활성부위 결합이 알려진 리간드인 Zardaverine (6-(4-Difluoromethoxy-3-methoxy-phenyl)-2H-pyridazin -3-one) 을 첨가 시켰을 때의 1D NMR 스펙트럼으로서, Zardaverine 첨가에 의해 CG-PD-0215 화합물의 NMR 신호가 다시 나타난 것을 보여주는 스펙트럼 이고,
도 4는 본 발명에서 사용된 표적 단백질에 활성부위 결합이 알려진 리간드인아데닌(Adenine)의 1D NMR 스펙트럼이고,
도 5는 화합물 아데닌에 포스포다이에스터레이즈 단백질을 1mg/ml 농도로 섞어준 후에 측정한 1D NMR 스펙트럼이고,
도 6은 단백질 - 아데닌 혼합액에 CG-PD 0268 (4-(3-Cyclopentyloxy -4- methoxy-phenyl)-pyrrolidin-2-one)을 첨가시켰을 때의 1D NMR 스펙트럼으로서, CG-PD 0268 첨가에 의해 Adenine 화합물의 NMR 신호가 다시 나타난 것을 보여주는 스펙트럼이고,
도 7은 시험 화합물의 혼합체 (CG-PD 0268 : 4-(3-Cyclopentyloxy-4-methoxy -phenyl)-pyrrolidin-2-one, CG-PD 0014: 2-[3-(3,4-Dimethoxy-phenyl)-4,5-dih
ydro-isoxazol-5-ylmethoxy]-benzoic acid, CG-PD 0491: 6-(3,4-Dimethoxy-phenyl) -7-methyl-pyrazolo[1,5-a]pyrimidine)의 실험 예로서, (a)는 시험 화합물 혼합체의 1D NMR 스펙트럼, (b)는 시험 화합물 혼합체에 포스포다이에스터레이즈 단백질을 1mg/ml 농도로 섞어준 후에 측정한 1D NMR 스펙트럼이고, (c)는 단백질-화합물 혼합액에 표적 단백질에 활성부위 결합이 알려진 리간드인 Zardaverine (6-(4-Difluoromethoxy-3-methoxy-phenyl)-2H-pyridazin -3-one) 을 첨가 시켰을 때의 1D NMR 스펙트럼으로서, Zardaverine 첨가에 의해 화합물 혼합체 중 CG-PD 0268의 NMR 신호가 다시 나타난 것을 보여주는 스펙트럼 이고, (d)는 대조 스펙트럼으로서 활성부위 결합이 알려진 리간드인 Zardaverine (6-(4-Difluoromethoxy-3-methoxy-phenyl)-2H-pyridazin-3-one)의 1D NMR 스펙트럼이다.
도 8은 시험 화합물 또는 시험 화합물의 혼합체에 첨가하는 표적 단백질의 농도 차이에 따른 변화를 타내는 결과로서, (a)는 시험 화합물 CG-PD 0229 (3-[4-(3,4 -Dimethoxy-phenyl)-thiazol-2-ylamino]-benzoic acid) 0.1mM 용액의 1D NMR 스펙트럼이고, (b)는 표적 단백질 포스포다이에스터레이즈를 1 mg/ml (시험 화합물 농도 대비 약 1/4 농도) 섞어준 후의 1D NMR 스펙트럼이고, (c)는 표적 단백질 포 스포다이에스터레이즈를 0.5 mg/ml (1/8 농도) 섞어준 후의 1D NMR 스펙트럼이고, (d)는 표적 단백질 포스포다이에스터레이즈를 0.25 mg/ml (1/16 농도) 섞어준 후의 1D NMR 스펙트럼이다.
본 발명은 단백질에 대한 결합이 알려진 기지(旣知)의 리간드를 사용하여, 1D NMR에 의해 단백질 활성부위에 결합하는 화합물을 선별하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로, 1) 시험 화합물 또는 시험 화합물 혼합체의 1D NMR 스펙트럼을 측정하는 단계, 2) 1)의 시험 화합물 또는 시험 화합물 혼합체 용액에 표적 단백질을 혼합한 후 1D NMR을 측정하는 단계, 3) 2)의 용액에 표적 단백질의 활성 부위에 결합하는 것이 알려진 기지(旣知)의 리간드를 혼합한 후 1D NMR을 측정하는 단계, 및 4) 1), 2) 및 3)의 NMR 스펙트럼을 비교하여, 2)에서 표적 단백질과의 결합되었다가 3)에서 기지의 리간드를 혼합함으로써 표적 단백질로부터 분리되거나 결합이 약하게 되는 화합물을 확인하는 단계를 포함하는, 표적 단백질의 활성 부위에 결합하는 화합물을 선별하는 방법에 관한 것이다.
과거의 전통적인 신약 개발 방법은 특정 약효를 보이는 각 화합물을 개별적으로 합성하고, 그 화합물의 효능과 특성을 확인하는 방법으로 진행되었다. 그런데, 최근의 로봇 합성 (robotic synthesis), 순열 조합 화학 (combinatorial chemistry) 및 고효율 스크리닝 (high throughput screening) 등의 새로운 기술들이 선진 제약 기업에서 널리 받아들여짐에 따라 연구자들이 다루어야 하는 화합물의 수가 현격히 증가하게 되었다. 다시 말하면, 구조적으로 다양한 화합물 라이브러리 (compound library)를 사용하여 단시간에 효과적으로 신약 후보 물질을 발굴하는 방법이 선호되고 있다는 것이다. 이러한 경향은 특히 최근의 유전체 연구 활성화로 인하여, 다수의 질환 표적 단백질의 발굴이 가속화됨에 따라서 그 중요성을 더해가고 있다.
이를 위하여, 주로 사용되는 신약 개발 방법은 합성 화합물이나 천연물 라이브러리를 스크리닝하여 표적 분자와 활성 부위에 결합하여 그 기능을 조절하는 리간드 (ligand)를 찾아내는 것이다. 이때, 각 화합물이 표적 분자에 결합하는지 여부는 표적 분자의 크기, 운동성 등을 관측하여 확인하거나, 효소 활성이나 수용체 (receptor) 활성 등을 측정하여 표적 분자의 생물학적 또는 화학적 기능을 평가하게 된다. 전자의 경우는 물리적인 평가 또는 친화도 (affinity) 평가이며, 후자의 경우는 기능 평가에 해당한다. 기존의 친화도 평가나 기능 평가는 이미 신약 발굴 연구에 성공적으로 사용되고 있으나, 이러한 평가 방법이 가지는 본질적인 성질로 인하여 정확성, 신뢰성 및 효율성의 한계가 지적되고 있다.
기존의 분석 방법의 가장 주된 단점 중 하나는 위양성 (false positive) 문제이다. 전형적인 기능 분석에서 위양성이란 특정 화합물이 분석 결과로는 양성 반응을 나타내지만, 실질적으로 기대하는 생리적 활성을 나타내지 못하는 경우를 말한다. 전형적인 물리적 분석에서 위양성이란 화합물이 표적 분자에 결합하지만 비특이적으로 결합하는 경우를 말한다. 비특이적 결합 위양성 (non-specific binding false positive)은 특히 리간드의 농도가 높을 때, 리간드의 비 특이적 효과가 증대함으로써 심해지고 문제를 일으키게 된다. 또한, 기존의 분석 방법에는 위음성 (false negative) 문제도 있을 수 있는데, 이 경우는 화합물이 실제 표적 분자의 리간드임에도 불구하고 음성 반응을 나타내는 경우이다. 위음성은 대개 화합물의 농도가 너무 높아 독성을 나타내거나, 화합물의 농도가 결합 및 해리 상수보다 너무 낮은 경우에 발생한다.
기존의 분석 방법의 또 다른 단점은 분석 결과로부터 제공되는 정보의 한계이다. 분석에 의하여 표적 분자에 결합하여 반응을 나타내는 화합물을 판별할 수 있다 하더라도 이러한 방법으로는 화합물의 특정 결합 부위나, 구조-활성 관계를 밝히는 데에는 한계가 있다. 따라서, 스크리닝 분석을 수행하더라도 연구를 진행하기 위해서는 이러한 정보가 추가로 필요하게 된다. X-선 결정화 (X-ray crystallography)를 이용하여 표적 분자에 대한 유기 용매 (organic solvent)의 결합 부위를 밝히는 것이 가능하게 되었으나, 상기 방법은 표적의 여러 부위에 대한 상대적인 결합 세기를 알려주지는 못한다. 또한, 이 방법은 고농도의 유기 용매에 노출되어도 변성되지 않는 매우 안정된 단백질에 대해서만 적용할 수 있을 뿐만 아니라 구조적으로 다양한 여러 가지 화합물을 스크리닝하는 방법으로는 사용할 수 없고, 몇 가지 유기 용매에 대한 결합 부위를 계획 (mapping)하는 것으로 제한되며 각 결정 구조를 해석하기 위해서는 많은 시간이 소요되는 문제점이 제기되고 있다.
화합물 스크리닝을 통하여 표적 분자의 기능을 조절하는 신약 디자인에 사용 될 선도 물질 (lead compound)을 발굴할 수 있으며, 이러한 선도 물질의 구조적 유사체나 둘 이상의 선도 물질의 결합체 등이 신약 후보 물질로 사용될 수 있다. 그러나, 기존의 스크리닝 방법은 전술한 바와 같은 방법 자체의 본질적인 문제점으로 인하여 현재까지 신약 디자인에 크게 도움을 주지 못하는 측면이 있다. 따라서, 빠르고 효율적이면서 정확하고 신뢰할 만한 새로운 화합물의 검색방법이 요구되고 있다.
한편, 근래 구조 생물학의 발전으로 인하여 X-선 결정화나 NMR을 이용한 구조 연구를 통하여 질병 치료 목적상 표적이 되는 단백질이나 단백질/리간드 복합체의 입체 구조를 원자 수준에서 밝히는 것이 가능하게 되었고, 이러한 시도는 의약 개발을 목적으로 하는 연구 기관의 필수적인 기능이 되었다. 특히, X-선 결정화나 NMR을 통해 실험적으로 규명된 입체 구조를 이용하여, 컴퓨터를 이용한 가상 공간에서 이들 단백질의 활성 부위에 결합하는 화합물을 검색하는 방법이 많이 사용되게 되었다. 이 경우에는 개개의 화합물을 하나씩 합성하여 효능을 확인하는 방법으로는 상상할 수 없을 정도로 훨씬 많은 수의 다양한 화합물을 단시간에 검색하는 것이 가능하므로 시간과 인력을 절약하는 장점이 있다.
반면에 가상 공간에서의 결합 실험은 컴퓨터를 이용한 연결 (docking) 실험으로서, 실제로 사용되는 용액 내에서 결합 실험의 모든 조건을 다 만족시키기 어려운 면이 있다. 즉, 결합에 필요한 주요 잔기 (key moiety)를 발굴하는 데는 유용하나, 실제로 그 화합물을 합성하였을 때 활성 부위에 특이적으로 결합하는지 여부는 실험적으로 확인해 보아야 한다. 이를 실험적으로 확인하는 방법으로는 효소 활성을 측정하는 효소 분석 방법 (enzyme assay)이나 물리적 결합을 확인하는 물리적 분석 방법이 있다.
이러한 경우의 화합물 확인은 화합물들의 구조적인 다양성 및 비교적 분자량이 작은 주요 잔기에 의한 결합을 전제로 하기 때문에, 결합을 보이는 화합물의 친화력이 수십 μM 정도의 약한 결합인 경우가 대부분이다. 이렇게 친화력이 약한 초기의 결합 화합물을 발굴하기 위해서는 수십 내지 수백 μM 정도의 약한 친화력으로 표적 단백질의 활성부위에 결합하는 화합물을 효과적으로 찾아내는 방법이 필요하다. NMR을 이용한 화합물 결합 검색은 통상적인 효소 분석으로는 거의 식별할 수 없는 정도의 약한 친화력 (수십 μM ~ 수 mM)도 효과적으로 식별함으로써, 결합에 필요한 정보를 얻을 수 있다는 특징을 갖는다. 따라서, 검색하는 화합물도 완성된 크기의 화합물이 아닌 작은 화합물을 사용하여 검색할 수가 있고, 이것은 검색해야 할 화합물의 숫자가 상대적으로 적어도 된다는 장점을 갖는다. 또한, 이렇게 해서 선택된 두 세 화합물을 연결시킴으로써 강력한 친화력을 가진 새로운 화합물을 디자인하기에 적합할 뿐만 아니라 단백질의 NMR 신호들이 할당 (assign)된 경우에는 복합체 구조까지 구하여 디자인에 응용할 수 있다는 등의 중요한 장점을 갖는다.
NMR을 이용한 화합물 검색 및 의약 디자인의 개념은 미국의 애보트 (Abbott)사의 슈커 등이 15N으로 균일하게 표지된 단백질을 사용하여 상기 단백질의 활성 부위에 결합하는 화합물을 찾아내는 방법을 제안하고, 이것을 SAR by NMR이라고 명명 하였다 (Shuker, S. B. et al., Science 274: 1531-1534, 1996). 이들은 활성 부위의 결합 포켓 (pocket)이 두 개 이상일 경우, 각 포켓의 화합물을 연결시키는 방법으로 상승 효과를 볼 수 있음을 보여 주었다 (Shuker, S. B. et al., Science 274: 1531-1534, 1996; Olejniczak, E. T. et al., J. Am. Chem. Soc. 119: 5828-5832, 1997). 노바티스 (Novartis)사의 린 등은 용액 내에서의 확산 속도 차이를 이용하여 화합물의 혼합 상태에서 단백질에 결합하는 화합물을 발굴하는 방법을 개발하였고 (Lin, M. et al., J. Org. Chem. 62: 8930-8931, 1997; Chen, A and Shapiro, M. J., J. Am. Chem. Soc. 120: 10258-10259, 1998), 해지덕 등은 분자량이 작은 화합물과 단백질 결합체의 이완 (relaxation) 속도의 차이를 이용하여 화합물을 검색할 수 있음을 보여 주었다 (Hajduk, P. J., Olejniczak, E. T. and Fesik, S. W., J. Am. Chem. Soc. 119: 12257-12261, 1997b). 또한, 메이어 등은 TRNOE (transferred NOE)를 이용한 방법으로 화합물의 혼합상태에서 단백질에 결합한 화합물을 검색하고 이를 Bio-affinity NMR이라고 명명하였다 (Meyer, B. and Peters, T., Eur. J. Biochem. 246: 705-709, 1997).
상기와 같은 방법은 작은 절편 (small fragment)으로 구성된 화합물 라이브러리로부터 표적 단백질 (target protein)에 결합하는 활성 화합물을 찾아내고, 그 구조적인 특성을 정리함으로써 의약 후보물질의 고안 (drug candidate design)에 필요한 정보를 제공한다는 개념이다. NMR을 이용한 이러한 접근 방법은 각각 그 특성 및 장단점이 있으나 모두 친화도를 이용한 스크리닝으로 혼합 화합물로부터 다수의 화합물을 스크리닝할 수 있다는 공통점을 가지므로, 이들을 NMR을 이용한 친화도-기초 화합물 스크리닝 (affinity-based compound screening)이라고 할 수 있다.
본 발명자들은 이들의 기술을 기반으로 보다 간편하고 효율적인 화합물 검색방법을 1D NMR을 이용하여 확립하고자 예의 연구 노력한 결과, 특정 화합물이 표적 단백질에 결합할 때에 소멸되거나 약해진 NMR 신호가 특정 활성 부위 결합이 알려진 기지의 리간드를 사용하여 경쟁적인 결합을 시켰을 경우에 다시 나타나거나 강해지는 현상을 관찰함으로써, 기존의 1D NMR을 이용한 화합물 선별방법에서 해결하지 못했던, 화합물의 결합부위에 대한 정보를 용이하게 얻을 수 있는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
기존의 2D NMR을 이용한 화합물 검색방법에서는 활성부위 신호임이 확인된 실험 결과가 전제 조건이나 이 과정은 단백질을 15N 및 13C 등의 안정 동위원소로 표지하는 것이 필요하여 시간과 비용이 많이 들고, 성공률도 낮았다. 그러나, 본 발명의 방법은 단백질을 안정동위원소 표지할 필요가 없이 화합물의 NMR 신호만을 관찰하여 화합물 혼합체로부터 활성부위에 결합하는 화합물을 선별해 낼 수 있다는 장점이 있다.
본 발명의 목적은 1D NMR을 이용하여 목적 단백질의 활성 부위에 결합하는 화합물을 보다 간편하고 효율적으로 선별하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 특정 부위(예: 활성부위) 결합이 알려진 기지(旣知)의 리간드 및 1D NMR을 이용하여, 단백질 특정 부위 결합 화합물을 선별하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명은 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는 표적 단백질의 활성 부위에 결합하는 화합물을 선별하는 방법을 제공한다:
1) 시험 화합물 또는 시험 화합물 혼합체의 1D NMR 스펙트럼을 측정하는 단계,
2) 1)의 시험 화합물 또는 시험 화합물 혼합체 용액에 표적 단백질을 혼합한 후 1D NMR을 측정하는 단계,
3) 2)의 용액에 표적 단백질의 활성 부위에 결합하는 것이 알려진 기지(旣知)의 리간드를 혼합한 후 1D NMR을 측정하는 단계, 및
4) 1), 2) 및 3)의 NMR 스펙트럼을 비교하여, 2)에서 표적 단백질과의 결합되었다가 3)에서 기지의 리간드를 혼합함으로써 표적 단백질로부터 분리되거나 결합이 약하게 되는 화합물을 확인하는 단계.
즉, 본 발명은 시험 화합물을 표적 단백질에 결합시킨 후, 기지의 리간드를 첨가하여 시험 화합물과 기지의 리간드가 표적 단백질의 특정 부위에 경쟁적으로 결합하는지 여부를 확인하여 표적 단백질의 특정 부위(활성 부위)에 결합하는 화합물을 선별하는 방법을 제공한다.
상기 선별방법을 단계별로 설명하면, 단계 1)에서는 시험 화합물 또는 시험 화합물의 혼합체를 포함하는 용액의 1D NMR 스펙트럼을 얻는다. 이 때의 1D NMR 실험 방법은 해지덕 등이 사용한 것과 같은, 분자량이 작은 화합물과 단백질 결합체의 이완 (relaxation) 속도의 차이를 관측할 수 있는 방법(Hajduk, P. J., Olejniczak, E. T. and Fesik, S. W., J. Am. Chem. Soc. 119: 12257-12261, 1997)을 사용할 수 있다. 그 외에도 통상적인 1D NMR 방법이나, 확산 속도를 관측할 수 있는 방법(Lin, M. et al., J. Org. Chem. 62: 8930-8931, 1997; Chen, A and Shapiro, M. J., J. Am. Chem. Soc. 120: 10258-10259, 1998)을 사용할 수도 있다. 확산 속도를 관측할 수 있는 방법의 경우는 결합하는 화합물의 신호가 관측되고, 결합하지 않는 화합물의 신호가 약해지므로, 이완속도의 차이를 관측하는 방법과 반대로 해석을 하여야 한다. 이하에서는 이완속도의 차이를 이용한 NMR 관측 방법으로 본 발명을 설명한다.
단계 2)에서는 시험 화합물 또는 시험 화합물의 혼합체의 용액에 표적 단백질을 섞어 준 후 1D NMR을 관측한다. 이 때 표적 단백질과 결합한 화합물의 신호는 이완속도의 차이를 관측하는 방법인 경우 결합에 의해 약해지거나 소멸된다. 여러 화합물이 혼합된 경우에도 결합한 화합물의 신호만 선택적으로 소멸되므로, 결합한 화합물을 손쉽게 선별할 수 있다. 그러나 이 단계에서는 결합한 화합물이 단백질의 어느 부위에 결합하였는지에 대한 정보는 얻을 수 없다.
목적하는 표적 단백질로는 효소, 수용체 및 단백질-단백질, 단백질-핵산의 상호작용 복합체 등이 사용될 수 있다. 이 단계에서의 표적 단백질 농도는 결합 시험의 결과를 용이하게 판정할 수 있는 농도라면, 시험 화합물의 농도와 다르게 하는 것도 가능하다. 바람직하게는 표적 단백질의 농도는 시험화합물 또는 시험화합물 혼합체 농도의 5 내지 1/30배이고, 더욱 바람직하게는 1 내지 1/16배이다.
단계 3)에서는 표적 단백질의 특정 부위(활성 부위)에 결합하는 것이 알려진 기지의 리간드를 섞어 준 후 1D NMR을 관측한다. 이 때 기지의 리간드는 X-ray 복합체 실험이나 효소 반응 실험 등을 통하여 특정 부위(활성 부위)에 결합하는 것이 확인된 것으로 한다. 단계 2)에서 표적 단백질과 결합한 화합물이 기지의 리간드와 같은 결합부위(예: 활성부위)에 결합하였을 경우에, 섞어 준 기지의 리간드와의 경쟁에 의하여 화합물의 결합력이 약하여지게 되고, 따라서 단계 2)에서 약해지거나 소멸된 NMR 신호가 다시 강해지거나 나타나게 된다.
기지의 리간드로는 표적 단백질에 대하여 알려진 억제제나 수용체 결합물질 또는 기질 유사체 등으로서 저 분자 유기화합물, 펩타이드, 또는 펩타이드 유사체 등이 포함된다. 기질 유사체 또는 펩타이드 유사체는 기질 펩타이드와 서열이 비슷한 펩타이드, 또는 펩타이드 변형체를 의미한다. 예를 들어, C형 간염 바이러스의 NS3 단백 분해 효소의 기질은 EDVVPCSMSYWT을 포함하는 펩타이드 이다. 이 경우, 펩타이드 유사체로서, EDVVPNva (Nva: Norvaline) 이나, EDVVChaAbu (Cha: beta-cyclohexylalanine, Abu: 2-aminobutyric acid) 등의 화합물을 사용할 수 있게 된다. 이 단계에서의 경쟁 실험의 관측을 보다 명확히 하기 위하여 경쟁적으로 결합시키는 기지의 리간드의 농도를 시험 화합물의 농도보다 1배 - 50배까지 높일 수 있다.
단계 4)에서는 단계 1)- 3)의 실험 결과를 분석하여, 표적 단백질에 결합한 화합물이 기지의 리간드에 의하여 경쟁을 받았는지 여부를 판별한다. 단계 2)에서는 시험 화합물과 표적 단백질의 결합 여부를, 단계 3)의 결과 분석을 통해서는 화합물이 표적 단백질의 특정 부위(활성부위)에 결합하였는지 여부를 판별할 수 있다. 2)에서 표적 단백질과의 결합에 의해 소멸되거나 약해진 NMR 신호가 3)에서 기지의 리간드를 혼합함으로써 다시 나타나거나 강해지는 화합물을 기지의 리간드가 결합하는 특정부위(활성부위)에 결합하는 화합물로 선별한다.
본 발명의 시험 화합물 혼합체는 2 내지 10종의 시험 화합물의 혼합체일 수 있다.
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, 표적 단백질의 특정부위에 결합하는 화합물을 선별하는 방법을 제공한다:
1) 표적 단백질의 활성부위에 결합하는 것이 알려진 기지(旣知)의 리간드의 1D NMR 스펙트럼을 측정하는 단계,
2) 1)의 표적 단백질의 활성부위에 결합하는 것이 알려진 기지의 리간드의 용액에 표적 단백질을 혼합한 후 1D NMR을 측정하는 단계,
3) 2)의 용액에 시험 화합물 또는 시험 화합물 혼합체를 혼합한 후 1D NMR을 측정하는 단계, 및
4) 1), 2) 및 3)의 NMR 스펙트럼을 비교하여, 2)에서 표적 단백질과의 결합하였다가 3)에서 시험 화합물 또는 시험 화합물 혼합체를 혼합함으로써 표적 단백질로부터 분리되거나 결합이 약해지는 기지의 리간드를 확인하는 단계.
즉, 기지의 리간드를 단백질의 결합시킨 후, 시험 화합물을 첨가하여 시험 화합물과 기지의 리간드가 단백질의 특정 부위에 경쟁적으로 결합하는지 여부를 확인하여 표적 단백질의 특정 부위(활성 부위)에 결합하는 화합물을 선별하는 방법을 제공한다.
상기 선별방법을 단계별로 설명하면, 단계 1)에서는 표적 단백질의 활성부위에 결합하는 것이 알려진 기지의 리간드를 포함하는 용액의 1D NMR 스펙트럼을 얻는다. 이 때 기지의 리간드는 X-ray 복합체 실험이나 효소 반응 실험 등을 통하여 특정 부위(활성 부위)에 결합하는 것이 확인된 것으로 하고 1D NMR 스펙트럼은 상기 방법의 단계 1)에서와 동일한 방법으로 얻을 수 있다.
단계 2)에서는 표적 단백질의 활성부위에 결합하는 것이 알려진 기지의 리간드의 용액에 표적 단백질을 섞어 준 후 1D NMR을 관측한다. 이 때 표적 단백질과 결합한 기지의 리간드의 신호는 상기 방법의 단계 2)에서 사용한 방법과 동일하게 얻을 수 있다.
목적하는 표적 단백질로는 효소, 수용체 및 단백질-단백질, 단백질-핵산의 상호작용 복합체 등이 사용될 수 있다. 이 단계에서의 표적 단백질 농도는 결합 시험의 결과를 용이하게 판정할 수 있는 농도라면, 기지의 리간드의 농도와 다르게 하는 것도 가능하다. 바람직하게는 표적 단백질의 농도는 기지의 리간드의 농도의 5 내지 1/30분이고, 더욱 바람직하게는 1 내지 1/16이다.
단계 3)에서는 시험 화합물을 섞어 준 후 1D NMR을 관측한다. 시험 화합물이 단계 2)에서 표적 단백질과 결합한 기지의 리간드와 같은 결합부위(예: 활성부 위)에 결합하는 경우에, 시험 화합물과의 경쟁에 의하여 기지의 리간드의 결합력이 약하여지게 되고, 따라서 단계 2)에서 약해지거나 소멸된 NMR 신호가 다시 강해지거나 나타나게 된다.
기지의 리간드로는 표적 단백질에 대하여 알려진 억제제나 수용체 결합물질 또는 기질 유사체 등으로서 저 분자 유기화합물, 펩타이드, 또는 펩타이드 유사체 등이 포함된다. 기질 유사체 또는 펩타이드 유사체는 기질 펩타이드와 서열이 비슷한 펩타이드, 또는 펩타이드 변형체를 의미한다. 예를 들어, C형 간염 바이러스의 NS3 단백 분해 효소의 기질은 EDVVPCSMSYWT(서열번호: 1)을 포함하는 펩타이드 이다. 이 경우, 펩타이드 유사체로서, EDVVPNva (Nva: Norvaline)(서열번호: 2) 이나, EDVVChaAbu (Cha: beta-cyclohexylalanine, Abu: 2-aminobutyric acid)(서열번호: 3) 등의 화합물을 사용할 수 있게 된다. 이 단계에서의 경쟁 실험의 관측을 보다 명확히 하기 위하여 경쟁적으로 결합시키는 시험 화합물의 농도를 기지의 리간드의 농도보다 1배 - 50배까지 높일 수 있다.
단계 4)에서는 단계 1)- 3)의 실험 결과를 분석하여, 표적 단백질에 결합한 기지의 리간드가 시험화합물에 의하여 경쟁을 받았는지 여부를 판별한다. 단계 2)에서는 기지의 리간드와 표적 단백질의 결합 여부를, 단계 3)의 결과 분석을 통해서는 시험 화합물이 표적 단백질의 특정 부위(활성부위)에 결합하는지 여부를 판별할 수 있다. 2)에서 표적 단백질과의 결합에 의해 소멸되거나 약해진 NMR 신호를 3)에서 시험 화합물을 혼합함으로써 다시 나타나거나 강해지게 하는 화합물을 기지의 리간드가 결합하는 특정부위(활성부위)에 결합하는 화합물로 선별한다.
본 발명의 시험 화합물 혼합체는 2 내지 10종의 시험 화합물의 혼합체일 수 있다.
상기 방법들을 통해 결합이 확인된 화합물들을 이용하여 바로 신약 후보물질의 설계에 사용될 수 있도록 디자인할 수 있으며, 생리활성이 수 uM 대에 이르는 화합물들은 단백질/선도 화합물 결합체의 X-선 구조를 결정한 후 본격적인 최적화 과정에 들어가게 된다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 단백질 - 화합물 결합 시험에 사용할 표적 단백질의 제조
단백질- 화합물의 결합 시험을 위하여, 포스포다이에스터레이즈4D (phosphodiesterase 4D) 의 효소활성을 나타내는 도메인 152-528번 아미노산의 단백질을 표적 단백질로 하고, 발현 벡터 pET vector에 글루타치온 에스 트랜스퍼레이즈(Gluthathion S-transferase) 단백질의 DNA 서열과 함께 연결하여 클로닝 한 벡터를 준비하였다. 이를 대장균 BL21(DE3) (Novagen Inc.사)에 형질전환 시킨 후 LB 배지에서 배양하였다.
재조합 형질전환체로부터 단백질의 생성 여부는 통상적으로 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동이나 웨스턴 블롯팅 분석으로 확인하였다. 배양시 세포 농도가 일정한 수준 (600 ㎚에서의 흡광도가 0.5 내지 1.0 사이)에 이르렀을 때, IPTG (isopropyl-b-D-galactopyranoside)를 첨가하여 표적 단백질의 발현을 유도하였다. 이와 같이 하여 포스포다이에스터레이즈 4D가 발현된 대장균 형질전환 세포를 2 ℓ 배양한 후 원심 분리기를 이용하여 6,000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 대장균 세포 침전물을 수거하였다. 상기 세포 침전물을 40 mM Tris pH 7.5, 150 mM 염화나트륨, 20mM DTT, 5% glycerol을 포함하는 완충용액에 현탁시킨 후 얼음 중탕에서 초음파 분쇄기 (Sonic Dismembrator, Fisher, 미국)를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 상기 용액을 원심분리기로 16,000 rpm에서 30분간 원심 분리한 후 그 상층액을 다음 과정에 이용하였다.
상기에서 얻은 상층액을 상기 완충용액으로 미리 평형된 글루타치온 (Gluthathione) 칼럼 (Pharmacia사)에 결합시킨 후 0 내지 0.5 M 글루타치온 농도 구배를 이용하여 용출하였다. 이로부터 얻은 용출액을 트롬빈(Thrombin)으로 절단한 후 글루타치온 칼럼을 통과시켜 포스포다이에스터레이즈 4D 단백질 부분만 모은 후 다음 과정에 이용하였다. 상기에서 얻은 포스포다이에스터레이즈 4D 단백질 부분을 5 ㎖ 가량 농축한 후 100 mM Tris pH 7.5, 150 mM 염화나트륨, 20mM DTT 를 포함하는 완충용액으로 평형된 겔 여과 칼럼 (gel filtration column, Superdex 75, 26/60, Pharmacis사)에 주입시킨 후 단백질의 분자량에 따라 분리하여 전기영동으로 확인하고 이로부터 포스포다이에스터레이즈 4D 단백질 부분만 회수하였다.
<실시예 2> 1D NMR을 이용한 단백질 - 화합물 결합 시험
1) 단백질 - 화합물 결합 시험에 사용하는 1D NMR 실험은 30℃, pH 7.5에서 90도 pulse - cpmg(Carr-Purcell-Meiboom-Gill sequence) pulse - water gate 의 1D NMR 실험 (Hajduk, P. J., Olejniczak, E. T. and Fesik, S. W., J. Am. Chem. Soc. 119: 12257-12261, 1997b)으로 수행하였다. cpmg 혼합시간은 400ms로 하였다. 이때, 실험은 브루커의 DRX 600 MHz NMR 기기 (Bruker사)를 사용하였고, 삼중-공명 프로브 (triple-resonance probe)를 이용하였다. 스펙트럼 넓이는 1H 축에 대하여 각각 10,000 Hz로 측정하였다. 물피크의 제거는 WATERGATE (Sklenar, V. et al., J. Magn. Reson. A102: 241-245) 기법을 사용하였다.
먼저 화합물 CG-PD-0215 (5-(3,4-Dimethoxy-phenyl)-7-trifluoromethyl- pyrazolo[1,5-a]pyrimidine-2-carboxylic acid)을 0.1 mM 농도로 하여, 100 mM Tris pH 7.5, 150 mM 염화나트륨, 20mM DTT, 10% D2O 완충액에 녹여 1D NMR 실험을 측정하였다. (도 1)
이어서, 상기 실시예 1로부터 분리된 표적 단백질을 1 mg/ml 농도, 화합물 CG-PD-0215을 0.1 mM 농도, Tris pH 7.5, 150 mM 염화나트륨, 20mM DTT, 10% D2O 완충액에 녹여 1D NMR 실험을 측정하였다. (도 2)
위의 두가지 실험 결과를 비교하여 화합물이 단백질에 결합 하는지 여부를 판정한다. 본 실시예에서는 도 1과 도 2에서 보는 바와 같이 화합물의 NMR 신호가 단백질과의 결합에 의하여 지워지는 것을 관측할 수 있었다. 화합물의 NMR 신호는 7.75ppm과 7.98ppm 이었다.
2) 시험 화합물의 혼합체를 사용한 실험도 동일한 결과를 얻을 수 있는지 확인하기 위하여, 시험 화합물의 혼합체 (CG-PD 0268 : 4-(3-Cyclopentyloxy -4-methoxy -phenyl)-pyrrolidin-2-one, CG-PD 0014: 2-[3-(3,4-Dimethoxy-phenyl) -4,5-dihydro-isoxazol-5-ylmethoxy]-benzoic acid, CG-PD 0491: 6-(3,4- Dimethoxy-phenyl) -7-methyl-pyrazolo[1,5-a]pyrimidine)를 이용하는 것 이외에는 상기 1)과 동일한 방법으로 수행하여, 도 7 (b)에 나타낸 것과 같이 화합물의 NMR신호가 단백질과의 결합에 의하여 소멸되는 것을 확인하였다.
<실시예 3> 활성부위 결합이 확인된 기지의 리간드를 이용한 경쟁적 결합 시험
1) 실시예 2-1)에서 사용한 단백질과 화합물의 혼합 용액에 포스포다이에스터레이즈 4D의 활성부위 결합이 확인된 기지의 리간드인 Zardaverine ((6-(4-Difluoromethoxy-3-methoxy-phenyl)-2H-pyridazin-3-one), Biomol 사로부터 구입)을 0.5mM 되도록 첨가하여 1D NMR 실험을 측정하였다.
이 실험 결과 실시예 2의 도 1에서 관측된 것과 같은 위치의 NMR 신호가 다시 나타나게 되는 것을 관측할 수가 있었다 (도 3). 이것은 실시예 2에서 실험한 화합물 CG-PD-0215가 활성부위 결합이 확인된 Zardaverine과 경쟁적으로 결합한 다는 것을 나타내는 결과이다. 즉, 실시예 2에서 실험한 화합물 CG-PD-0215가 포스포다이에스터레이즈 4D의 활성부위에 결합하는 화합물임을 판정하였다. 이 때 Zardaverine의 첨가에 의하여 다시 나타난 NMR 신호는 7.75ppm과 7.98ppm 이었다.
2) 시험 화합물의 혼합체를 사용한 실험도 동일한 결과를 얻을 수 있는지 확인하기 위하여, 실시예 2-2)에서 사용한 단백질과 화합물의 혼합체의 혼합 용액을 사용하는 것 이외에는 상기 1)의 방법과 동일하게 수행하여, 도 7 (c)에 나타낸 것과 같이 화합물 CG-PD-0268이 포스포다이에스터레이즈 4D의 활성부위에 결합하는 화합물임을 판정하였다.
<실시예 4> 단백질 농도 차이에 따른 단백질과 화합물의 결합 시험
표적 단백질 농도를 낮출 수 있는지 확인하기 위하여, 시험 화합물 0.1mM 농도에 대하여, 표적 단백질의 농도를 1mg/ml (약 1/4 농도, 도 8의 (b)), 0.5mg/ml (약 1/8 농도, 도 8의 (c)), 0.25 mg/ml (약 1/16 농도, 도 8의 (d))로 변화시키는 것 이외에는 실시예 2와 동일한 방법을 수행하여, 도 8 (b), (c), (d)에 나타낸 것과 같이 화합물의 NMR신호가 단백질과의 결합에 의하여 소멸되는 것을 확인하였다.
<실시예 5> 활성부위 결합이 알려진 기지의 리간드를 결합 시킨 후 시험 화합물을 첨가하는 실험
포스포다이에스터레이즈 4D 단백질의 활성부위에 결합하는 것으로 알려진 리간드 아데닌 (Sigma 사로부터 구입)을 0.1 mM 농도로 하여, 100 mM Tris pH 7.5, 150 mM 염화나트륨, 20mM DTT, 10% D2O 완충액에 녹여 1D NMR 실험을 측정하였다(도 4). 이 때 아데닌의 NMR 신호는 8.17ppm과 8.20ppm 이었다.
또한, 상기 실시예 1로부터 분리된 표적 단백질을 1 mg/ml 농도, Adenine을 0.1 mM 농도, Tris pH 7.5, 150 mM 염화나트륨, 20mM DTT, 10% D2O 완충액에 녹여 1D NMR 실험을 측정하였다. (도 5)
이어서, 위의 단백질과 아데닌의 혼합 용액에 화합물 CG-PD 0268 (4-(3-Cyclopentyloxy -4-methoxy-phenyl)-pyrrolidin-2-one)을 0.5mM 되도록 첨가하여 1D NMR 실험을 측정하였다(도 6).
이 실험 결과 도 4에서 관측된 adenine의 NMR 신호가 도 5에서 단백질과의 결합에 의하여 지워졌다가, 도 6에서는 도 4에서 관측된 것과 같은 위치의 NMR 신호가 다시 나타나게 되는 것을 관측할 수가 있었다. 이것은 본 실시예에서 실험한 화합물 CG-PD-0268이 활성부위 결합이 확인된 아데닌과 경쟁적으로 결합한 다는 것을 나타내는 결과이다. 즉, 본 실시예에서 실험한 화합물 CG-PD-0268이 포스포다이에스터레이즈 4D의 활성부위에 결합하는 화합물임을 판정하였다. 이 때 CG-PD-0268의 첨가에 의하여 다시 나타난 NMR 신호는 8.17ppm과 8.20ppm 이었다.
본 발명의 검색방법은 단백질을 안정 동위 원소로 표지할 필요가 없고, 단백질의 분자량에 제한을 받을 필요도 없기 때문에, 신약 개발에 대한 응용 범위가 넓다. 또한 단백질의 양이 화합물의 농도에 비하여 5 내지 1/20 정도로도 실험이 가능하므로 상대적으로 적은 비용으로도 수행 가능하며 단백질의 2D NMR 스펙트럼을 관측하는 실험에 비해서 시간도 적게 들기 때문에 효율적이다.
따라서, 본 발명의 검색방법은 기존의 의약 디자인 방법보다 의약 후보물질의 개발에 소모되는 비용과 시간을 절감함으로써 신약 개발을 위한 후보물질의 선별 및 판정에 유용하게 사용될 수 있다.
<110> CrystalGenomics,Inc
<120> Method for screening a compound binding to the active site of
target protein
<160> 3
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> Hepatitis GB virus C
<400> 1
Glu Asp Val Val Pro Cys Ser Met Ser Tyr Trp Thr
1 5 10
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide analogue
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)
<223> Nva
<400> 2
Glu Asp Val Val Pro Xaa
1 5
<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide analogue
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)
<223> beta-cyclohexylalanine
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)
<223> Abu
<400> 3
Glu Asp Val Val Xaa Xaa
1 5
Claims (12)
1) 시험 화합물 또는 시험 화합물 혼합체의 1D NMR 스펙트럼을 측정하는 단계,
2) 1)의 시험 화합물 또는 시험 화합물 혼합체 용액에 표적 단백질을 혼합한 후 1D NMR을 측정하는 단계,
3) 2)의 용액에 표적 단백질의 활성 부위에 결합하는 것이 알려진 기지(旣知)의 리간드를 혼합한 후 1D NMR을 측정하는 단계, 및
4) 1), 2) 및 3)의 NMR 스펙트럼을 비교하여, 2)에서 표적 단백질과의 결합되었다가 3)에서 기지의 리간드를 혼합함으로써 표적 단백질로부터 분리되거나 결합이 약하게 되는 화합물을 확인하는 단계를 포함하는, 표적 단백질의 활성 부위에 결합하는 화합물을 선별하는 방법.
제 1항에 있어서, 표적 단백질의 농도가 시험 화합물 또는 시험 화합물 혼합체의 농도의 5 내지 1/30배인 방법.
제 1항에 있어서, 기지의 리간드의 농도가 시험 화합물 또는 시험 화합물 혼합체 농도의 1 내지 50배인 방법.
제 1항에 있어서, 단계 1)에서 표적 단백질이 효소 및 수용체로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 기지의 리간드가 저분자 유기 화합물, 펩타이드, 또는 펩타이드 유사체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 기지의 리간드가 효소 억제제, 수용체 결합물질, 또는 효소 및 수용체의 기질 유사체인 것을 특징으로 하는 방법.
1) 표적 단백질의 활성부위에 결합하는 것이 알려진 기지(旣知)의 리간드의 1D NMR 스펙트럼을 측정하는 단계,
2) 1)의 표적 단백질의 활성부위에 결합하는 것이 알려진 기지의 리간드의 용액에 표적 단백질을 혼합한 후 1D NMR을 측정하는 단계,
3) 2)의 용액에 시험 화합물 또는 시험 화합물 혼합체를 혼합한 후 1D NMR을 측정하는 단계, 및
4) 1), 2) 및 3)의 NMR 스펙트럼을 비교하여, 2)에서 표적 단백질과의 결합하였다가 3)에서 시험 화합물 또는 시험 화합물 혼합체를 혼합함으로써 표적 단백질로부터 분리되거나 결합이 약해지는 기지의 리간드를 확인하는 단계를 포함하는, 표적 단백질의 활성 부위에 결합하는 화합물을 검색하는 방법.
제 7항에 있어서, 표적 단백질의 농도가 기지의 리간드의 농도의 5 내지 1/30배인 방법.
제 7항에 있어서, 시험 화합물의 농도가 기지의 리간드의 농도의 1 내지 50배인 방법.
제 7항에 있어서, 표적 단백질이 효소 및 수용체로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7항에 있어서, 기지의 리간드가 저분자 유기 화합물, 펩타이드, 또는 펩타이드 유사체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 7항에 있어서, 기지의 리간드가 효소 억제제, 수용체 결합물질, 또는 효소 및 수용체의 기질 유사체인 것을 특징으로 하는 방법.
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