KR100783670B1

KR100783670B1 - 도메인 단백질을 이용한 생리활성물질의 검색 방법

Info

Publication number: KR100783670B1
Application number: KR1020060045604A
Authority: KR
Inventors: 김형하; 서정근
Original assignee: 한국표준과학연구원
Priority date: 2006-05-22
Filing date: 2006-05-22
Publication date: 2007-12-07
Also published as: KR20070112560A; WO2007136146A1; JP5532478B2; US8906643B2; US20110159478A1; JP2009545296A; WO2007136146A9

Abstract

본 발명은 특정 단백질과 상호작용하는 도메인 단백질을 이용한 생리활성물질의 검색 방법에 관한 것으로서, (1) 하나의 특정 도메인 단백질을 특정 미생물 또는 동식물 세포에 도입하여 생리활성이 있는지를 확인하는 검색방법 및 (2) 임의의 도메인 단백질을 다수의 미생물 또는 동식물 세포에 도입하여 생리활성이 있는지를 확인하는 검색방법에 관한 것이다.

본 발명의 도메인 단백질은 유전자를 대상으로 하는 의약품보다 적은 정보를 가지고도 신규 항생제를 개발하는데 유용하게 사용될 수 있다.

도메인 단백질, 단백질의 작용 네트워크, 생리활성물질의 검색 방법, 항생제

Description

도메인 단백질을 이용한 생리활성물질의 검색 방법{Method for Screening Drug Candidates by Using Domain Protein}

도 1은 박테리아 생체 내에서 단백질의 네트워크를 모델링 한 그림이다.

도 2는 두 가지 단백질이 상호작용할 때 특정 부위의 도메인이 관여하는 과정을 보여주는 모식도이다.

도 3a 내지 3d는 본 발명의 실시예에서 제작된 pECFP-도메인 vector의 vector map이다.

도 4는 도메인 단백질에 의해 정상적인 단백질의 상호작용이 방해되어 단백질의 네트워크가 차단될 수 있음을 보여주는 모식도이다.

도 5 및 도 6은 대장균 내에서 도메인 단백질과 형광표지 단백질의 융합 단백질이 발현되는 양상을 형광 이미지 및 형광 스펙트럼으로 비교하여 나타낸 것이다.

도 7은 대장균에 도메인 단백질을 주입하고 고체 배양을 관찰하여 결과를 분석한 이미지 및 스펙트럼이다.

본 발명은 단백질과 상호작용하는 도메인 단백질을 이용한 의약품용 도메인 단백질의 검색방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 어떤 도메인 단백질이 미생물체에 도입되었을 때 미생물 또는 동식물 세포의 생리활성에 변화가 있는지를 확인하는 과정에 의해 상기 도메인 단백질이 의약품의 용도로 활용될 수 있는지 여부를 검색하는 방법에 관한 것이다.

대부분의 단백질들은 생물체 내에서 다른 단백질과 상호작용을 하거나 순차적으로 작용함으로써 기능을 발휘한다. 단백질간의 상호작용은 생체 내에서 효소 활성의 조절, 신호전달, 유전자 발현의 조절, 세균과 바이러스 감염의 특이성 결정, 면역 반응 등 여러 생명현상에 있어서 중심적인 역할을 하기 때문에 새로운 유전자의 기능을 밝히거나 신약을 개발하는데 있어서 단백질간의 상호작용을 아는 것은 매우 중요하다. 이러한 단백질 간의 상호작용 또는 단백질 기능의 순차적 작용은 생물체 안에서 네트워크를 이루면서 생명체의 생존을 위한 대사에 참여한다(도 1 참조). 도 1은 대장균 E. coli, H. pylori 생체 내에서 단백질의 네트워크를 모델링한 결과이다[1]. 단백질 네트워크 모델링 방법에 관해서는 대한민국 특허공개 10-2003-48974를 참고하였다.

생명체 안에 존재하는 단백질 상호작용의 네트워크는 세균과 같은 비교적 단순한 생물체의 경우에도 매우 복잡한 양상을 보인다. 어떤 네트워크 인자는 크게 중요하지 않으므로 이를 차단하여도 생물체의 생존에 크게 영향을 미치지 않지만, 단백질 네트워크의 중심에 존재하는 인자들은 여러 가지 대사와 관련되어 있으므로 이를 차단하면 생물체의 생존에 치명적인 위협이 될 수 있다[2-4]. 예를 들면, 성장호르몬과 성장호르몬 수용체 사이에서의 단백질 상호작용으로 성장과 관련된 단백질 네트워크 및 다양한 대사과정이 정상적으로 작동되면 키가 자라지만, 네트워크에 문제가 생기면 저성장증을 보이는 등 다양한 문제가 유발된다. 또한 관절염의 경우 TNF 단백질의 과다 발현으로 인해 TNF 수용체와 단백질 상호작용을 통해 염증 반응과 관련된 단백질 네트워크가 활성화되면서 발병되기도 하는 것으로 알려져 있다.

단백질 네트워크는 생물정보학적 연구를 통해 예측할 수 있고, 이 예측 결과를 실험적으로 검증하여 대상 생물체의 필수 단백질 또는 필수 네트워크 인자를 확인할 수 있다[5-7]. 구체적으로, 대상 단백질을 유전자 수준에서 변형하는 돌연변이를 유발하여 단백질의 기능을 마비시킴으로써 단백질 네트워크 인자를 차단한 다음 생물학적 변화를 추적하는 방법이 많이 사용되었다.

한편, 생물체 내로 단백질을 주입하고 그의 생장 과정을 표현형 조사 (phenotyping) 및 세포 분광 분석법으로 관찰하면 어떠한 단백질이 생물체의 필수 단백질이며, 어떠한 기능을 하는 단백질인지를 구분할 수 있다[8-10].

두 개 이상의 단백질이 상호작용을 하기 위해서는 단백질 전체가 아닌 도메인이라고 불리는 특정 부위만이 관여하는 것으로 알려져 있다[11-14]. 도 2에 개념적으로 도시한 바와 같이, 단백질 A 및 단백질 B가 상호작용을 하기 위하여 a1 및 b1이라는 도메인이 서로 결합을 한다면 단백질 A의 도메인 a1과 결합할 수 있는 도메인 b1을 가진 다른 단백질도 단백질 A와 결합할 수 있을 것이다. 도 2에서 (a)는 단백질의 상호작용을 위한 특정 도메인의 결합 모식도이고, (b)는 단백질 및 도메인 단백질의 결합 모식도이다.

종래 효소 또는 항체의 작용 부위인 도메인만을 화학적으로 모사하여 사용하려는 시도가 이루어졌지만, 도메인의 모사 구조가 단백질과 동일한 기능을 하지 않은 경우가 많았다[15-17].

참고로, 이와 유사한 기존의 기술로는 신약 개발에 응용되었던 RNAi (Ribonucleic acid interference) 기술[18-20]이 있으며, 이 기술은 특정 RNA와 상보적으로 결합할 수 있는 RNA 올리고머를 생물체 내에 투입하여 대상 RNA와 결합시키고 이로 인해 대상 RNA의 기능을 마비시키는 방법이다. 따라서 특정 단백질이 생산되지 못한다. 이러한 특성을 이용하여 병원균이 필요로 하거나 질병의 원인이 되는 단백질을 제거하여 질병을 치료하는데 활용된다.

미생물 또는 동식물 세포의 단백질 네트워크를 파악하고 중요한 네트워크 인자를 차단할 수 있는 방법을 찾는다면 단백질을 목표로 하는 신규 항생제 등과 같은 생리활성물질을 개발할 수 있을 것이다.

이에 본 발명자들은 새로운 의약품 후보물질의 검색 방법을 개발하기 위하여 계속 노력한 결과, 특정 단백질과 상호작용하는 도메인 단백질이 상기 특정 단백질의 작용 네트워크를 차단하는 경우 의약품 등과 같은 생리활성물질로 이용될 수 있 음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 미생물 또는 동식물 세포의 단백질 네트워크를 교란·차단하거나 변형시키는 도메인 단백질을 간단하게 검색하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 도메인 단백질을 미생물 또는 동식물 세포에 대한 새로운 생리활성 물질로 활용하도록 하는 것을 목적으로 한다.

전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 (1) 하나의 특정 도메인 단백질을 특정 미생물 또는 동식물 세포에 도입하여 생리활성이 있는지를 확인하는 검색방법 및 (2) 임의의 도메인 단백질을 다수의 미생물 또는 동식물 세포에 도입하여 생리활성이 있는지를 확인하는 검색방법을 제공한다.

이러한 본 발명은 도 4에 도시된 바와 같이, 단백질 A와 결합할 수 있는 도메인 단백질 b가 과량인 경우, 생물체 내에서 단백질 A 및 도메인 단백질 b의 결합이 우세하게 되어 단백질의 상호작용이 방해를 받고 결과적으로 단백질의 네트워크가 차단되면서 생물체의 생리활성이 변화될 수 있을 것이라는 판단에 따라 완성된 것이다.

순서에 따라 본 발명을 상세히 설명한다.

발명(1) 특정 도메인 단백질 및 특정 세포를 이용한 검색방법

하나의 특정 도메인 단백질을 특정 미생물 또는 동식물 세포에 도입하여 생리활성이 있는지를 확인하는 검색방법으로서, 본 발명은 (A) 특정 미생물 또는 동식물 세포에서 필수 단백질을 선택하는 단계; (B) 상기 필수 단백질과 상호작용하는 도메인 단백질을 결정하는 단계; (C) 상기 미생물 또는 동식물 세포 체내로 상기 도메인 단백질을 도입하는 단계: (D) 상기 도메인 단백질이 도입된 미생물 또는 동식물 세포의 생리활성 변화를 확인하는 단계;를 포함하는 것으로 생리활성 도메인 단백질의 검색방법에 관한 것이다.

발명(1)은, 예컨대 특정 병원균에 대한 사멸효과를 보이는 도메인 단백질을 검색하는 방법에 관한 것이다. 먼저 특정 병원균의 생존과 증식에 필수적인 것으로 판단되는 단백질을 선정하고, 그와 결합할 수 있는 것으로 판단되는 도메인 단백질을 상기 병원균의 체내로 도입하는 것이다. 도입된 도메인 단백질이 상기 필수 단백질과 집중 결합하여 필수 단백질이 관여하고 있는 단백질 네트워크를 차단·교란하게 되는 경우 외부적으로 상기 병원균의 증식감소 또는 사멸, 병원균의 형태학적 변화 등이 유발된다.

본 발명에서 상기 도메인 단백질은 도메인 데이터베이스인 InterProScan(/)을 사용하여 결정할 수 있다. 즉, 원하는 단백질의 아미노산 서열을 입력한 후 InterProScan 결과로부터 원하는 단백질의 도메인을 결정한다.

본 발명에서 상기 필수 단백질은 상기 특정 미생물의 생장, 증식 또는 환경적응에 관여하는 효소인 것이 바람직하다. 상기 필수 단백질로는 helicase, deacetylase, protease 및 ligase 등이 포함될 수 있을 것이다.

본 발명의 상기 (C) 단계에서 도메인 단백질은 유전자재조합방법에 의해 사전에 제조된 형태로 도입될 수도 있다. 즉, 상기 도메인 단백질을 암호화하는 염기서열을 잘 확립된 재조합 단백질 발현 시스템에 도입하고 생산된 도메인 단백질을 분리 또는 정제하여 사용할 수 있을 것이다. 이 경우 도메인 단백질을 미생물 또는 동식물 세포의 배양액에 소정 농도로 첨가하는 방식으로 도입시킬 수 있을 것이다.

본 발명에서 확인하는 생리활성 변화는 효소 활성의 조절, 신호전달, 유전자 발현의 조절, 세균과 바이러스 감염의 특이성 결정, 면역 반응 등 여러 방면에서의 변화일 수 있다. 가장 현저한 것은 미생물 등의 증식속도 변화나 사멸 또는 세포의 형태학적 변화일 것이다.

한편, 본 발명의 (D) 단계에서 아무런 생리활성 차원에서의 변화가 발견되지 않을 수도 있다. 이때 상기 도메인 단백질이 생리활성이 없어서 인지 아니면, 도메인 단백질이 세포의 내부로 도입되지 않거나 도입되어도 분해되어서 인지를 확인할 필요가 있다. 따라서 상기 도메인 단백질은 형광표지 단백질과 융합된 형태인 것이 바람직하다. 이를 위하여 상기 도메인 단백질을 암호화하는 염기서열과 형광표지 단백질을 암호화하는 염기서열을 잘 확립된 재조합 단백질 발현 시스템에 도입하고 생산된 도메인-형광표지 융합 단백질을 분리 또는 정제하여 사용할 수 있을 것이다.

본 발명에 이용될 수 있는 상기 형광표지 단백질로는 ECFP(Enhanced Cyan Fluorescent Protein), EYFP(Enhanced Yellow Fluorescent Protein), EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein), DsRed(Discosoma sp. Red Fluorescent Protein) 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 상기 (C) 단계에서 상기 도메인 단백질은 상기 미생물 또는 동식물 세포에서 발현되는 벡터시스템에 삽입된 핵산서열 형태로 도입되는 것도 가능할 것이다. 이 경우 상기 미생물 등의 체내에서 도메인 단백질이 발현되면서 생리활성의 변화 여부를 확인할 수 있게 된다.

한편, 본 발명의 (D) 단계에서 아무런 생리활성 차원에서의 변화가 발견되지 않을 수도 있다. 이때 상기 도메인 단백질이 생리활성이 없어서인지 아니면 도메인 단백질이 발현되지 않아서 인지를 확인할 필요가 있다.

따라서 상기 도메인 단백질을 암호화하는 염기서열과 형광표지 단백질을 암호화하는 염기서열을 함께 벡터시스템에 삽입시키는 것이 바람직하다. 사용될 수 있는 형광표지 단백질의 종류는 위에서 예시한 바 있다.

예를 들면, 특정 단백질과 상호작용을 하는 것으로 예상되는 도메인 단백질 과 형광표지 단백질이 결합된 융합단백질을 대장균에 직접 주입하거나, 상기 융합단백질을 암호화하는 염기서열이 삽입된 벡터시스템을 대장균에 도입·발현을 유도하고 일정 시간이 경과한 다음 세포의 형광 이미지를 측정한다(실시예 및 도 4 참조).

본 발명에서 상기 생리활성은 병원균, 진균 등에 대한 항생제 활성이거나 항바이러스제 활성, 항암제, 또는 다른 질병을 억제하는 활성일 수 있다. 즉, 본 발명에 의해 다양한 항생제, 항바이러스제, 항암제, 항자가면역질환제 또는 기타 질환의 치료제 등으로 활용될 수 있는 새로운 의약품을 검색할 수 있게 된다.

예컨대 대장균에 특정 도메인 단백질을 주입할 경우 대장균의 생장과 분열이 느려지는 반면, 또 다른 도메인 단백질을 주입한 경우는 대장균이 전혀 생존하지 못하는 것을 관찰할 수 있다(실시예 및 도 6 참조). 따라서 도메인 단백질은 대장균에게 있어 치명적인 독소로 작용할 수 있는데, 특히 인체에 대한 독성이 없는 경우라면 매우 효과적인 항생제로 활용될 수 있을 것이다.

발명(2) 임의 도메인 단백질 및 다양한 세포를 이용한 검색방법

또 다른 본 발명은 임의의 도메인 단백질을 다수의 미생물 또는 동식물 세포에 도입하여 생리활성이 있는지를 확인하는 검색방법으로서, (A) 임의의 도메인 단백질을 선택하는 단계; (B) 임의의 미생물 또는 동식물 세포 체내로 상기 도메인 단백질을 도입하는 단계: (C) 상기 도메인 단백질이 도입된 미생물 또는 동식물 세포의 생리활성 변화를 확인하는 단계;를 포함하여 이루어진다.

발명(1)은 미리 특정한 미생물 또는 동식물 세포를 정한 뒤에 그 생물체에 생리활성을 나타내는 도메인 단백질을 검출하는 것이다. 그러나 발명(2)는 임의의 도메인 단백질을 결정한 다음 이를 무작위적으로 미생물 또는 동식물 세포에 도입하여 활성을 나타내는지를 검색하는 방법에 관한 것이다.

발명(2)에서, 도메인 단백질을 사전에 제조된 형태로 도입하는 것, 형광표지 단백질과 융합된 형태인 것, 핵산서열 형태로 도입되는 것, 형광표지 단백질 유전자가 추가되는 것에 관한 기술적 사항이나 필요성 등은 발명(1)에서 설명한 바와 같다. 또한 상기 생리활성은 항생제 활성 등일 수 있다는 점도 전술한 바와 같다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 하기 실시예에서는 대상 생물체로 대장균을 선정하여 실험하였으나, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 다른 미생물이나 동식물 세포도 동일한 개념으로 선정하여 실험할 수 있음은 자명하다. 또한 도메인 단백질의 도입방법으로 재조합법을 적용하였으나, 사전에 제조된 도메인 단백질을 대장균 배양액에 소정 농도로 첨가하는 방식으로 도메인 단백질을 도입하는 것도 가능함은 명백하다.

하기 실시예에서는 도메인 단백질의 행적을 용이하게 추적하기 위하여 형광표지 단백질과 결합된 융합 단백질 형태를 적용하였다.

<실시예 : 도메인 단백질 도입을 통한 생리활성 변화 검출>

특정 도메인 단백질을 미생물에 도입하여 미생물의 생리활성에 영향을 줄 수 있는지를 확인하였다.

(1) 도메인 단백질의 선택 및 클로닝

도메인 단백질의 선택방법은 여러 가지 있으나, 본 실시예에서는 interproscan 프로그램(http://www.ebi.ac.uk/interpro)을 활용하였다. 상기 프로그램에 단백질의 아미노산 서열을 입력하면 도메인 부분의 서열을 알 수 있다.

도메인 단백질을 얻기 위하여 몇몇 대장균 및 H. pylori의 단백질을 선택하여 그 아미노산 서열을 상기 프로그램에 입력하여 각각의 도메인 단백질 서열을 확정하였다(표 1).

대장균 또는 H. pylori 총 DNA를 주형으로 하고, 각각의 프라이머 세트를 사용하여 PCR 기법으로 상기 각 도메인 단백질에 대한 DNA를 증폭하였다.

한편, 형광표지 단백질인 ECFP(Enhanced Cyan Fluorescent Protein) DNA는 Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA, USA) 로부터 pECFP vector를 입수하여 사용하였다. pECFP vector에 TOPO reaction을 적용하기 위해 Gateway Vector Conversion Reagent System을 구입하여 pECFP vector에 Gateway Cassette를 삽입한 후 새로운 vector pECFP-rfa를 제작하여 사용하였다. 도메인 단백질에 해당하는 DNA를 PCR로 증폭한 후 증폭된 DNA를 gel에서 확인하여 TOPO reaction을 거쳐 Entry vector (pENTR-TOPO, Invitrogen Inc., Carlsbad, CA, USA)로 cloning하여 pENTR-도메인 vector를 제작하였다. 각각의 clone에 대해 colony PCR로 insert(도메인 단백질의 DNA) 여부을 조사하였고 plasmid를 DNA miniprep으로 분리한 후 sequencing 하여 다시 한번 도메인 단백질에 대한 DNA의 존재를 검증하였다. 확인된 pENTR-도메인 vector를 master clone으로 하여 재조합 반응을 거쳐 도메인 단백질 부분만을 pECFP-rfa vector로 옮겨 최종적으로 pECFP-도메인 vector를 제작하였다. 제작된 각각의 pECFP-도메인 vector의 vector map을 도 3a~3d에 도시하였다.

재조합 반응은 위치특이적 재조합(site-specific recombination) 특성을 이용하는 Gateway system(Instruction Manual of pENTR Directional TOPO Cloning Kits, Invitrogen)을 사용하였다.

(2) 도메인 단백질의 발현

제작한 bcp 도메인-형광 융합단백질의 DNA를 함유하는 발현벡터(pECFP-domain 28)를 대장균에 주입하여(transformation) 융합단백질의 발현을 유도함으로서 도메인-형광 융합단백질을 대장균에서 발현시켰다. 형질전환방법은 Gateway System 실험 메뉴얼에 따라 실시하였다 .

대장균 내에서 도메인-형광 융합단백질의 발현을 위해 cell line을 2 ml 2× YT 배지에서 16 시간 37 ^oC에서 키운 후 0.1 ml를 취해서 5 ml 2× YT 배지에 접종한 후 37 ^oC에서 3 시간 배양하였다. 이 배양액에 0.05 mM IPTG를 첨가하여 2시간 동안 더 배양함으로 융합단백질의 발현을 유도하였다.

bcp 이외의 다른 도메인 단백질도 동일한 방법으로 배양하여 융합단백질의 발현을 유도하였다.

(3) 형광측정을 통한 도메인 단백질의 발현 확인

ECFP가 도메인 단백질과 결합된 형태로 대장균 내에서 발현되면 형광이 나타나게 된다. 따라서 다음과 같은 방법으로 형광을 측정하였다.

먼저, 상기 발현벡터가 주입된 대장균을 항생제(Amp 100 μg/ml, Cm 34 μg/ml)가 포함된 LB 배지 5 ml에서 overnight culture(37 ^oC, 225 rpm shaking) 후, 동일한 배지 10 ml 에 각각 0.2 ml을 접종하였다. 동일한 조건으로 배양하여 600 nm에서의 흡광도가 0.5~1.0에 도달하면 0.05 mM IPTG을 가하여 발현을 유도한 다음 3 시간 후에 대장균을 수확하였다.

수확된 대장균을 수회 수세한 다음 0.3 ml PBS에 현탁하였다. 대장균 현탁액 10 μl 취하여 cover glass에 놓고 그 위에 40 μl의 low temperature gelling agarose 용액 (1 w/v% 농도)를 덮어 고정되도록 하였다.

공초점 형광측정용 모델인 Axiovert-25CFL(Carl-Zeiss사, 독일)와 자체 제작한 단일분자측정감도를 가지는 레이저여기 공초점 형광현미경을 이용하여 형광이미지를 측정하였다(도 5 참조).

도 5는 bcp 도메인 단백질과 ECFP의 융합 단백질이 발현된 대장균의 세포형광 이미지와 단일세포의 특정부위에서 관찰되는 형광스펙트럼 사진이다. (a)는 bcp의 도메인 단백질과 형광 단백질의 융합 단백질이 발현된 대장균(#28) 세포들의 형광이미지이며 (b)는 발현균(bcp의 도메인 단백질과 형광 단백질의 융합 단백질이 발현된 대장균 2개; #28-1, #28-2), ECFP만 발현시킨 대장균(ECFP) 및 형질전환하지 않은 대장균(VS120)의 세포 내에서 이미지를 분석한 후 특정부위를 선택하여 형광스펙트럼을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 5 (a)에서 보는 바와 같이 세포에서 형광 이미지가 특정 부위만 밝게 나타나므로 형광 단백질이 모여 있다는 사실을 유추할 수 있었다. 도 5 (b)에서 대상 세포 내에서 밝은 부위와 상대적으로 어두운 부위를 선택하여 형광 스펙트럼을 분석한 결과를 보여주고 있는데, 이 스펙트럼을 확인하면 형광이 실험에서 의도적으로 주입시킨 도메인 단백질과 형광 단백질의 결합체에 의한 것인지 또는 다른 생체 물질에 의해 생긴 것인지 여부를 확인할 수 있었다. 즉 대상 부위를 선별하여 레이저 여기 형광 스펙트럼을 측정한 결과, 밝은 부위의 형광 스펙트럼은 #28-2 와 같이 나타나 의도적으로 주입시킨 ECFP의 형광 스펙트럼(그래프에서 ECFP)과 일치하고, 상대적으로 어두운 부위의 형광 스펙트럼은 #28-1과 같이 나타나 아무 것도 주입시키지 않은 대장균(그래프에서 VS120)에서 나타나는 형광 스펙트럼과 거의 일치한다는 점을 확인할 수 있었다.

따라서 도메인 단백질과 형광 단백질의 융합 단백질이 발현되며, 발현된 융합 단백질은 형광 단백질 단독발현과는 달리 대장균 세포 전체에 균일하게 분포하는 것이 아니라 특정 부위에 집중되어 있는 것을 알 수 있다. 이로부터 상기 특정 부위가 도메인 단백질과 상호작용을 일으키는 단백질이 존재하는 부위인 것을 실험적으로 유추할 수 있다.

(4) 도메인 단백질 발현에 따른 생리활성 변화 확인

전술한 도메인 단백질이 발현됨으로써 세균에 어떠한 생리적 변화가 발생하는 지를 확인하기 위하여 세균의 성장 과정을 조사하면서 어떤 현상이 나타나는지를 확인하였다(도 6 참조).

그 결과 도 6 (a)~(d)에서 보는 바와 같이, ECFP 단백질 및 ECFP와 도메인 단백질의 결합체를 대장균 내에서 발현시키고 일정 시간이 경과한 다음 대장균의 성장 형태를 세포 형광 이미지로 분석하였다. 도 6(b)~(d)에서 특정 단백질을 목표로 하는 도메인 단백질이 주입된 대장균들은 ECFP만 주입한 대장균과 성장 형태가 다르게 나타나는 것을 관찰하였다.

구체적으로 아가로스에서 전술한 조건에서 고체 배양한 결과를 도 7에 사진 및 그래프로 나타내었다. 도에서 (b)는 증식이 일어나지 않은 대장균의 형광 이미지이고, (c)는 (b)에서 관찰된 결과를 선택적으로 분석한 형광 스펙트럼 그래프이다.

도에서 pECFP는 ECFP만 발현시킨 대장균, #18은 HP1259의 도메인 단백질과 ECFP단백질의 융합단백질이 발현된 대장균, #49는 HP0062의 도메인 단백질과 ECFP단백질의 융합단백질이 발현된 대장균, #53은 HP0179의 도메인 단백질과 ECFP단백질의 융합단백질이 발현된 대장균을 나타낸다. 그래프에서, 18-1¹ 및 18-1²는 각각 #18번의 다른 콜로니를 의미한다.

도에서 볼 수 있듯이, 양성대조구(+)의 경우 약 100여개 정도의 콜로니가 형성되며 음성대조구(-)의 경우 10개 이하의 콜로니가 형성되었다. 시료의 경우 pECFP구에서는 플레이트당 300~500 여개의 콜로니가 형성되었으나 #18, #49, #53에서는 아주 적은 양의 콜로니가 형성되었다. 즉, 도메인 단백질을 주입한 대장균들은 일반 대장균과 비교하여 증식 속도가 느린 것을 관찰할 수 있고, 세포 분열을 잘 하지 못하여 세포들이 긴 형태를 가지고 있는 것을 세포 형광 이미지를 통하여 쉽게 알 수 있었다. 또한 도메인 단백질과 결합된 ECFP가 세포 전체에 퍼져있기 보다는 특정 부위에 집중되어 높은 농도로 나타내는 것을 볼 수 있으며, 도 6(e)에 나타난 바와 마찬가지로 대장균에서 ECFP의 형광 스펙트럼이 검출되므로 도메인 단백질이 발현된 대장균세포에서 생장과 분열이 느리게 일어난다는 사실을 확인할 수 있었다.

이상과 같은 관찰을 근거로 하여 대장균에 의도적으로 주입시킨 도메인 단백질이 특정 단백질과 결합하여 단백질의 네트워크 인자를 차단하고, 그 결과로 생장과 분열 등과 같은 생리활성에 영향을 미칠 수 있음을 확인하였다.

위에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명에 의하여 생리활성을 나타내는 도메인 단백질을 경제적으로 신속하게 검색방법이 확립되었다.

실시예를 통하여 몇 가지 확인한 바에 의하면, 대장균에 특정 도메인 단백질을 주입할 경우 대장균의 생장과 분열이 느려지는 것을 관찰할 수 있고, 반면 또 다른 도메인 단백질을 주입한 경우는 대장균이 전혀 생존하지 못하는 것을 확인하였다(도 5 및 6 참조). 즉, ECFP와 도메인 단백질의 결합체가 발현된 대장균들은 도메인 단백질이 대장균에게 필수적인 단백질의 네트워크 인자를 차단하여 생존할 수가 없고, 우연히 도메인 단백질이 관찰되지 않을 정도로 미량만 발현된 대장균들만이 생존할 수 있는 것을 확인하였다. 따라서 이러한 도메인 단백질은 대장균을 포함한 세균의 생장을 조절할 수 있는 조절인자로 작용할 수 있으므로 해당 단백질을 작용점으로 활용하여 매우 효과적인 항생제 개발에 적용할 수 있을 것이다.

이러한 결과는 단백질을 목표로 하는 신규 항생제가 개발될 수 있는 점을 시사하는 직접적인 실험 증거이므로, 이 도메인 단백질을 이용하여 기존의 항생제에 내성이 있는 세균을 박멸할 수 있는 새롭고 효과적인 항생제를 효과적으로 제조할 수 있다.

참고문헌

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상기에서 설명하고 입증한 바와 같이, 본 발명은 특정 단백질과 상호작용하는 도메인 단백질을 이용한 생리활성물질의 검색 방법에 관한 것으로서, 기존의 유전자 또는 단백질을 이용한 방법과 차별화되어 단백질을 목표로 하는 신약 등과 같은 생리활성물질의 개발에 효과적으로 이용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

(A) 특정 미생물 또는 동식물 세포에서 필수 단백질을 선택하는 단계;

(B) 상기 필수 단백질과 상호작용하는 도메인 단백질을 결정하는 단계;

(C) 상기 미생물 또는 동식물 세포 체내로 상기 도메인 단백질을 도입하는 단계:

(D) 상기 도메인 단백질이 도입된 미생물 또는 동식물 세포의 생리활성 변화를 확인하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 생리활성 도메인 단백질의 검색방법.
제 1 항에 있어서,

상기 필수 단백질은 상기 특정 미생물 또는 동식물 세포의 생장, 증식 또는 환경적응에 관여하는 효소인 것을 특징으로 하는 생리활성 도메인 단백질의 검색방법.
제 1 항에 있어서,

상기 (C) 단계에서 상기 도메인 단백질은 유전자재조합방법에 의해 사전에 제조된 형태로 도입되는 것을 특징으로 하는 생리활성 도메인 단백질의 검색방법.
제 3 항에 있어서,

상기 도메인 단백질은 형광표지 단백질과 융합된 형태인 것을 특징으로 하는 생리활성 도메인 단백질의 검색방법.
제 1 항에 있어서,

상기 (C) 단계에서 상기 도메인 단백질은 상기 미생물 또는 동식물 세포에서 발현되는 벡터시스템에 삽입된 핵산서열 형태로 도입되는 것을 특징으로 하는 생리활성 도메인 단백질의 검색방법.
제 5 항에 있어서,

상기 도메인 단백질의 유전자는 형광표지 단백질 유전자와 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 생리활성 도메인 단백질의 검색방법.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 생리활성은 항생제, 항바이러스제, 항자가면역질환제 또는 항암제 활성 인 것을 특징으로 하는 생리활성 도메인 단백질의 검색방법.
(A) 임의의 도메인 단백질을 선택하는 단계;

(B) 임의의 미생물 또는 동식물 세포 체내로 상기 도메인 단백질을 도입하는 단계:

(C) 상기 도메인 단백질이 도입된 미생물 또는 동식물 세포의 생리활성 변화를 확인하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 생리활성 도메인 단백질의 검색방법.
제 8 항에 있어서,

상기 (B) 단계에서 상기 도메인 단백질은 유전자재조합방법에 의해 사전에 제조된 형태로 도입되는 것을 특징으로 하는 생리활성 도메인 단백질의 검색방법.
제 9 항에 있어서,

상기 도메인 단백질은 형광표지 단백질과 융합된 형태인 것을 특징으로 하는 생리활성 도메인 단백질의 검색방법.
제 8 항에 있어서,

상기 (B) 단계에서 상기 도메인 단백질은 상기 미생물 또는 동식물 세포에서 발현되는 벡터시스템에 삽입된 핵산서열 형태로 도입되는 것을 특징으로 하는 생리활성 도메인 단백질의 검색방법.
제 11 항에 있어서,

상기 도메인 단백질의 유전자는 형광표지 단백질 유전자와 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 생리활성 도메인 단백질의 검색방법.
제 8 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 생리활성은 항생제, 항바이러스제 또는 항암제 활성인 것을 특징으로 하는 생리활성 도메인 단백질의 검색방법.