KR20010006454A - 표적 생체분자에 대한 리간드를 확인하기 위한 일차원 핵자기 공명의 용도 - Google Patents

표적 생체분자에 대한 리간드를 확인하기 위한 일차원 핵자기 공명의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 특정 표적 분자에 결합하는 화합물을 확인하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법 (a) 화합물 하나 또는 화합물들의 혼합물의 제1 T2- 또는 확산-필터 양자 스펙트럼을 생성하는 단계; (b) 화합물 하나 또는 화합물들의 혼합물을 표적 분자에 노출시키는 단계; (c) 단계(b)에서 표적 분자에 노출시킨 화합물 하나 또는 화합물들의 혼합물의 제2 T2- 또는 확산-필터 양자 스펙트럼을 생성하는 단계 및 (d) 상기 제1 및 제2 T2- 또는 확산-필터 양자 스펙트럼을 비교하여 상기 제1 및 제2 스펙트럼 사이의 차이를 측정하고, 이러한 차이에 의해 표적 분자에 결합되는 리간드인 하나 이상의 화합물의 존재여부를 확인하는 단계를 포함한다.

Description

표적 생체분자에 대한 리간드를 확인하기 위한 일차원 핵자기 공명의 용도{Use of one-dimensional nuclear magnetic resonance to identify ligands to target biomolecules}
신규한 약물의 실마리를 발견하기 위한 가장 강력한 수단 중의 하나는 특정 표적 생체분자에 결합하는 화합물을 발견하기 위해 합성 화학 생성물 및 천연 생성물 데이타 베이스를 랜덤하게 선별하는 것이다(즉, 표적물의 리간드 확인). 상기한 방법을 사용하면, 리간드는 표적 분자와 물리적으로 결합을 형성하는 이의 능력 또는 표적 분자의 기능을 변화시키는 이의 능력으로 확인될 수 있다.
물리적 결합을 시도하는 경우, 전형적으로는 표적 분자를 리간드로 추정되는 하나 이상의 화합물에 노출시키고, 표적 분자와 하나 이상의 상기한 화합물 사이에 복합체가 형성되는 경우, 검정을 수행하여 이를 측정한다. 상기한 검정은 당해 분야에서 익히 공지된 바와 같이, 복합체 형성을 나타내는 표적 분자의 전체적인 변화(예: 크기, 전하 및 운동성의 변화)에 대해 시험된다.
기능적인 변화가 측정되는 경우, 검정 조건은 표적 분자와 관련된 생물학적 또는 화학적 사건(예: 효소 촉매된 반응, 수용체 매개된 효소 활성화)을 측정할 수 있도록 설정한다. 변화를 확인하기 위해, 시험 화합물에 노출시키기 전후에 표적 분자의 기능을 측정한다.
치료학적 화합물을 설계하는데 사용하기위한 신규한 약물의 실마리를 확인하는데 현존하는 물리적 및 기능적 검정이 성공적으로 사용되고 있다. 그러나, 이들은 정확성, 신뢰성 및 효율과 절충된, 검정에 대한 고유의 한계를 지닌다.
현존하는 검정의 주요 단점은 "가양성(false positive)"의 문제에 관한 것이다. 통상적인 기능적 검정에서, "가양성"은 목적하는 생리학적 반응을 이끌어내는데는 효과적이지 못하지만 검정을 유발시키는 화합물이다. 통상적인 물리적 검정에서, "가양성"은, 예를 들어 비특이적 방식(예: 비특이적 결합)으로 표적에 자체 결합하는 화합물이다. 가양성은, 보다 고농도의 추정 리간드를 선별하는 경우, 다수의 화합물이 이러한 농도에서 비특이적 영향을 갖기 때문에 특히 우세하고 문제가 된다.
유사한 양식으로, 현존하는 검정에서는, 화합물이 표적에 대한 실질적인 리간드이지만 검정에서는 음성 반응을 나타내는 화합물인 경우에 발생하는 "가음성(false negative)"이 문제가 된다. 가음성은 통상적으로는, 표적에 대한 화합물의 결합 상수 또는 해리 상수에 비해 너무 높거나(독성 생성) 낮은 시험 화합물 농도를 사용하는 검정에서 발생한다.
최근, 이차원15N/1H 스펙트럼 분석을 표적 단백질과 결합하는 화합물을 확인하는데 사용할 수 있음이 입증되었는데, 상기한 방식은 리간드 확인을 위한 현존하는 다른 검정과 관련된 다수의 문제를 극복한다. 그러나, 이러한 방식은15N-표지되고 가용성이며 0.3mM 이상의 농도까지 거동이 우수한 단백질을 필요로한다. 또한, 분석가능한15N/1H 상호관계 맵(map)을 생성하는 단백질만이 상기 방법에 사용될 수 있으며, 현재의 기술을 사용하면 표적 단백질의 분자량은 40kDa 미만으로 한정된다. 또한, 상기 방법은, 화합물을 10개의 혼합물에서 시험하고, 혼합물중에서 하나 이상의 화합물이 활성인 것이 측정되는 경우, 표적 단백질에 대한 결합에 대해 각각의 화합물을 개별적으로 시험해야만 하기 때문에 시간 소모적이다.
현존하는 선별방법에 대한 고유한 문제점 때문에, 특정 표적에 특이적으로 결합하는 리간드를 확인하고 설계하기 위해서는, 신규하고 신속하고 효율적이고 정확하며 신뢰할 수 있는 화합물 선별수단을 제공해야할 필요가 여전히 존재하고 있다.
발명의 요약
한가지 양태에서, 본 발명은 특정 표적 분자에 결합하는 리간드를 확인하기 위해, 생물학적 활성에 대해 화합물을 선별하는 방법을 제공한다. 본 발명은, (a) 화합물 하나 또는 화합물들의 혼합물의 제1 T2- 또는 확산-필터 양자 스펙트럼(diffusion-filtered proton spectrum)을 생성하는 단계; (b) 화합물 하나 또는 화합물들의 혼합물을 표적 분자에 노출시키는 단계; (c) 단계(b)에서 표적 분자에 노출시킨 화합물 하나 또는 화합물들의 혼합물의 제2 T2- 또는 확산-필터 양자 스펙트럼을 생성하는 단계 및 (d) 상기 제1 및 제2 T2- 또는 확산-필터 양자 스펙트럼을 비교하여 상기 제1 및 제2 스펙트럼 사이의 차이를 측정하고, 이러한 차이에 의해 표적 분자에 결합되는 리간드인 하나 이상의 화합물의 존재여부를 확인하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법이 단계(b)에서 하나 이상의 화합물, 즉 화합물들의 혼합물을 선별하고, 혼합물로부터 생성되는 제1 스펙트럼과 표적 분자의 존재하에 혼합물로 부터 생성되는 스펙트럼 사이에 차이가 나는 경우, 표적 분자의 부재하의 활성 화합물의 스펙트럼이 공지되어 있다면 활성 화합물을 즉시 확인할 수 있다. 이는 단계(d)의 스펙트럼 사이에서 관찰되는 차이가 활성 화합물의 화학적 이동에 의해 발생하기 때문이다. 상기 혼합물중의 화합물에 대한 공지된 화학적 이동 정보가 없거나 결합을 확신하는 상태에서는, 혼합물에 포함되어 있는 특정 화합물 또는 화합물들이 표적 분자에 결합하는 것을 확인하기 위해 추가의 단계를 수행할 수 있다. 이러한 추가 단계는 (e) 혼합물중의 각각의 화합물의 T2- 또는 확산-필터 양자 스펙트럼을 생성하는 단계; (f) 혼합물중의 각각의 화합물을 개별적으로 표적 분자에 노출시키는 단계; (g) 표적 분자에 노출시킨 후 혼합물중의 각각의 화합물의 T2- 또는 확산-필터 양자 스펙트럼을 생성하는 단계 및 (h) 단계(g)에서 생성된 각각의 스펙트럼을 표적 분자만으로부터 생성되는 제1 스펙트럼과 비교하여 임의의 비교 스펙트럼에서 차이를 측정하고, 이러한 차이에 의해 표적 분자에 결합되는 리간드인 화합물의 존재여부를 확인하는 단계를 포함한다.
본 발명의 잇점은, 표적의 크기가 표적 분자에 결합시에 이완율 및 확산율을 변화시키기 위해 잠재성 리간드보다 충분히 큰 조건하에, 임의의 크기 또는 조성의 비표지된 표적 분자에 대한 잠재성 리간드의 결합을 측정하는 본 발명의 방법의 능력이다.
본 발명의 또 다른 잇점은 표적 분자에 심지어 약하게 결합하는 리간드의 결합까지도 측정하는 본 발명의 방법의 능력이다.
본 발명의 추가의 잇점은 상이한 스펙트럼에서의 화학적 이동을, 표적 생체분자의 부재하에 혼합물을 포함한 화합물의 공지된 화학적 이동과 직접 비교함으로써, 활성 화합물 또는 화합물들의 혼합물중의 활성 화합물을 확인하는 본 발명의 방법의 능력이다.
상기한 바람직한 양태에 있어서, 리간드의 결합을 측정하는 방법은 제2 결합 리간드의 존재하에 수행할 수 있다. 상기 양태에 따르면, 표적물을 시험 화합물에 노출시키기 전에, 표적 분자가 상기 제2 리간드에 결합한다.
본 방법은 표적 분자에 결합하는 제1 리간드 및 후속적인 리간드를 확인하기 위해, 상기한 바와 같은 T2- 또는 확산-필터 양자 분광법적 선별방법을 사용한다. 표적 분자와 두개 이상의 리간드의 복합체를 형성시키고, 바람직하게는 NMR 분광법 또는 X선 결정학을 사용하여 구조적 데이타를 수득한다. 이러한 구조적 데이타는 리간드 상호간 및 표적 분자에 대한 리간드의 입체 배향(spatial orientation)을 결정하는데 사용된다.
입체 배향을 기준으로, 리간드를 함께 결합시켜 특정 표적 분자에 대한 리간드로서 유용하고 잠재성의 약제학적 활성 약물로서 유용한 고친화성 리간드를 형성한다. 적절한 결합 그룹은 유기 화학 분야에서 익히 공지된 결합각 및 결합 길이 정보의 원칙을 기준으로, 리간드 상호간 및 표적 분자에 대한 리간드의 입체 배향을 유지시키도록 선택한다. 고친화성 리간드를 형성하기 위해 두개 이상의 리간드를 결합시키는 결합 공정 및 합성법은 익히 공지된 합성 공정 및/또는 역합성 분석에 의해 수행한다. 고친화성 리간드는, 실질적으로 최종 리간드를 생성하고 결합 그룹을 통해 2개의 리간드를 함께 간단히 결합시키는데 제한이 없는 어떤 수단에 의해서든지 제조할 수 있다. 임의의 선형 합성 또는 수렴성 합성 방법을 최종 생성물을 형성하는데 사용할 수 있다. 표적 분자(바람직하게는 단백질)에 대해 친화성이 있는 두개 이상의 리간드를 발견한 경우, 당해 분야의 숙련가에게 익히 공지된 바와 같은 방법에 의해 고친화성 리간드를 설계하고 제조한다. 리간드는 다양한 원자 및 분자 배열, 입체화학 등을 갖는 소분자의 다양한 풀(pool)로부터 선택한다. 제한 인자는, 두개 이상의 리간드가 폴리펩타이드 또는 표적 분자상의 하나 이상의 부위에서 리간드로서 다소의 친화성을 갖는다는 점이다. 그러나, 본원에서 기술하는 선별방법으로, 약제학적 활성 화합물을 형성하기 위한 전통적인 약물 설계 방법으로 조작될 수 있거나, 두개 이상의 리간드를 결합시켜 고친화성 리간드를 형성시키기 위한, 본원에 기술된 약물 설계방법에서 사용될 수 있는 단일 리간드 또는 다수의 리간드를 확인할 수 있다.
따라서, 분자적 설계방법은 일차원 T2- 또는 확산-필터 분광법을 사용하여 표적 분자에 대한 제1 리간드 잔기를 확인하고; 일차원 T2- 또는 확산-필터 분광법을 사용하여 표적 분자에 대한 후속적 리간드 잔기를 확인하고; 표적 분자에 대한 제1 리간드 및 후속적 리간드 잔기의 복합체를 형성시키고; 복합체의 구조적 데이타를 수득하여 표적 분자에 대한 제1 리간드 및 후속적 리간드 잔기의 입체 배향을 수득하며; 제1 리간드 및 후속적 리간드 잔기를 결합시켜 리간드 잔기의 입체 배향을 유지시키면서 또한 약제학적 활성 약물일 수 있는 고친화성 리간드를 형성시킴을 포함한다.
후속적 리간드 잔기의 확인은 제1 리간드의 부재 또는 존재하에 수행할 수 있다(즉, 표적 분자는 제2 리간드를 확인하기 위해 시험 화합물에 이를 노출시키기 전에 제1 리간드에 결합할 수 있다).
바람직한 양태에서, 선별 또는 설계방법에 사용되는 표적 분자는 폴리펩타이드이다. 폴리펩타이드 표적은 바람직하게는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포로부터의 재조합 형성물중에서 생성된다.
본 발명은 일차원 핵자기 공명(NMR) 분광법을 사용하여 표적 생체분자에 결합하는 화합물을 선별하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일부를 형성하는 도면에서는 다음을 나타낸다.
도 1은 수성 완충액중의 화합물 1의 T2-필터 스펙트럼(A), FKBP의 존재하의 화합물 1의 T2-필터 스펙트럼(B), FKBP의 T2-필터 스펙트럼(C), (B)로부터 (C)를 감산함으로써 수득되는 스펙트럼 차이(D) 및 (A)로부터 (D)를 감산함으로써 수득되는 스펙트럼 차이(E)를 나타낸 것이다. 모든 실험에서, 1ms의 스핀-에코 지연(spin-echo delay)을 갖는 T2-필터 스핀-록 시간(sipn-lock time)은 200ms이고, 모든 화합물의 농도는 100μM이고 FKBP의 농도는 50μM이며, 완충액은 pH가 6.5인 50mM의 PO4, 100mM의 NaCl(95% D2O)이다.
도 2는 화합물 1 내지 9의 혼합물의 T2-필터 스펙트럼(A), FKBP의 존재하의 화합물 1 내지 9의 혼합물의 T2-필터 스펙트럼(B), FKBP의 T2-필터 스펙트럼(C), (B)로부터 (C)를 감산함으로써 수득되는 스펙트럼 차이(D), (A)로부터 (D)를 감산함으로써 수득되는 스펙트럼 차이(E) 및 화합물 1만의 참조 T2-필터 스펙트럼(F)를 나타낸 것이다. 모든 실험에서, 1ms의 스핀-에코 지연을 갖는 T2-필터 스핀-록 시간은 200ms이고, 모든 화합물의 농도는 100μM이고 FKBP의 농도는 50μM이며, 완충액은 pH가 6.5인 50mM의 PO4, 100mM의 NaCl(95% D2O)이다.
도 3은 화합물 2 내지 9의 혼합물의 T2-필터 스펙트럼(A), FKBP의 존재하의 화합물 2 내지 9의 혼합물의 T2-필터 스펙트럼(B), FKBP의 혼합물의 T2-필터 스펙트럼(C), (B)로부터 (C)를 감산함으로써 수득되는 스펙트럼 차이(D) 및 (A)로부터 (D)를 감산함으로써 수득되는 스펙트럼 차이(E)를 나타낸 것이다. 모든 실험에서, 1ms의 스핀-에코 지연을 갖는 T2-필터 스핀-록 시간은 200ms이고, 모든 화합물의 농도는 100μM이고 KRBP의 농도는 50μM이며, 완충액은 pH가 6.5인 50mM의 PO4, 100mM의 NaCl(95% D2O)이다.
도 4는 낮은 구배 강도(gradient strength)를 사용하는, FRKP의 존재하의 화합물 1의 확산-필터 스펙트럼(A), 높은 구배 강도를 사용하는, FKBP의 존재하의 화합물 1의 확산-필터 스펙트럼(B), (A)로부터 (B)를 감산함으로써 수득되는 스펙트럼 차이(C), 낮은 구배 강도를 사용하는 화합물 1의 확산-필터 스펙트럼(D) 및 (C)로부터 (D)를 감산함으로써 수득되는 스펙트럼 차이(E)를 나타낸 것이다. 모든 실험에서, 낮은 구배 및 높은 구배 강도는 각각 3 및 48가우스(Gauss)/㎝에 상응한다. 높은 구배 강도는 샘플에 잔류하는 HDO 시그날을 제거하기에 충분하다. 300ms의 확산 지연 시간이 사용되고, 모든 화합물의 농도는 100μM이고 FKBP의 농도는 50μM이며, 완충액은 pH가 6.5인 50mM의 PO4, 100mM의 NaCl(95% D2O)이다.
도 5는 낮은 구배 강도를 사용하는, FRKP의 존재하의 화합물 1 내지 9의 혼합물의 확산-필터 스펙트럼(A), 높은 구배 강도를 사용하는, FKBP의 존재하의 화합물 1 내지 9의 혼합물의 확산-필터 스펙트럼(B), (A)로부터 (B)를 감산함으로써 수득되는 스펙트럼 차이(C), 낮은 구배 강도를 사용하는 화합물 1 내지 9의 혼합물의 확산-필터 스펙트럼(D), (D)로부터 (C)를 감산함으로써 수득되는 스펙트럼 차이(E) 및 화합물 1만의 참조 스펙트럼(F)을 나타낸 것이다. 모든 실험에서, 낮은 구배 및 높은 구배 강도는 각각 3 및 48가우스/㎝에 상응한다. 높은 구배 강도는 샘플에 잔류하는 HDO 시그날을 제거하기에 충분한다. 300ms의 확산 지연 시간이 사용되고, 모든 화합물의 농도는 100μM이고 KRBP의 농도는 50μM이며, 완충액은 pH가 6.5인 50mM의 PO4, 100mM의 NaCl(95% D2O)이다.
도 6은 낮은 구배 강도를 사용하는, FRKP의 존재하의 화합물 2 내지 9의 혼합물의 확산-필터 스펙트럼(A), 높은 구배 강도를 사용하는, FKBP의 존재하의 화합물 2 내지 9의 혼합물의 확산-필터 스펙트럼(B), (A)로부터 (B)를 감산함으로써 수득되는 스펙트럼 차이(C), 낮은 구배 강도를 사용하는 화합물 2 내지 9의 혼합물의 확산-필터 스펙트럼(D) 및 (D)로부터 (C)를 감산함으로써 수득되는 스펙트럼 차이(E)를 나타낸 것이다. 모든 실험에서, 낮은 구배 및 높은 구배 강도는 각각 3 및 48가우스/㎝에 상응한다. 높은 구배 강도는 샘플에 잔류하는 HDO 시그날을 제거하기에 충분한다. 300ms의 확산 지연 시간이 사용되고, 모든 화합물의 농도는 100μM이고 KRBP의 농도는 50μM이며, 완충액은 pH가 6.5인 50mM의 PO4, 100mM의 NaCl(95% D2O)이다.
본 발명은 치료학적 표적 분자에 결합하는 리간드를 확인하는, 신속하고 효율적인 선별방법을 제공한다.
리간드는, 표적 분자(예: 단백질, 핵산 등)에 분자를 결합시키고, 이어서 핵자기 공명(NMR) 분광법을 사용하여 표적의 첨가에 따른 리간드 공명의 이완율 및 확산율의 변화를 시험함으로써 확인된다. 선별된 분자의 풀은 대부분 제약 회사 및 대학 실험에서 현재 입수할 수 있는 바와 같은 화합물 수집물로부터 선택할 수 있다.
이어서, 상기한 방법에 의해 확인되는 리간드 사이의 구조/활성 관계에 대한 정보를 표적 분자에 대한 리간드로서 작용하는 신규한 약물을 설계하는데 사용할 수 있다. 실시예를 통해, 소정의 표적 분자에 대한 두개 이상의 리간드가 확인되는 경우, 이들 리간드와 표적 분자의 복합체가 형성된다. 표적 분자뿐만 아니라 리간드 각각에 대한 입체 배향은 구조적 데이타로부터 유도된다. 입체 배향은 2개의 리간드의 결합 부위 사이와 상기 부위에 대한 각각의 리간드의 배향 사이의 거리로 정의된다.
입체 배향 데이타를 사용하여, 두개 이상의 리간드를 함께 결합시켜 신규한 리간드를 형성한다. 결합은 리간드 상호간 및 표적 분자에 대한 리간드의 입체 배향을 유지시키는 방법으로 성취된다.
본 발명의 1D-NMR계 발견방법은 다수의 잇점을 지닌다. 먼저, 본 발명의 방법은 표적 분자에 대한 결합을 직접적으로 측정함으로써 리간드를 확인하기 때문에, 가양성의 문제를 상당히 감소시킨다.
두번째로, 본 발명의 방법은 광범위한 해리 상수를 갖는 표적 분자에 특이적으로 결합하는 화합물을 확인할 수 있기 때문에 가음성의 문제도 상당히 감소시킨다.
세번째로, 본 발명의 방법을 사용하면,15N/1H 상호관계 분광법을 사용하는 방법에 의해 요구되는 바와 같이 고농도에서 안정한 저분자량(40kDa 미만)의15N 표지된 단백질이 필요하지 않다.
네번째로, 공지된 화학적 이동을 비교함으로써 화합물들의 혼합물중에서 활성 화합물을 직접적으로 확인하는 이의 능력은, 표적 분자에 결합하는 활성 화합물을 선별하고 확인하는데 요구되는 시간을 상당히 단축시킨다.
잠재성 리간드의 시그날을 모니터하여 표적 분자에 대한 결합을 검출하기 때문에, 표적 분자에 동시에 결합하는 두개 이상의 리간드가 확인될 수 있다. 상이한 리간드의 결합 부위를 동시에 확인하는 능력은, 당해 분야의 숙련가가 1) 리간드 사이의 음성 및 양성적인 협력 결합을 정의하고, 2) 리간드 상호간 및 이의 결합 부위에 대한 리간드의 적절한 정위를 유지시키면서 두개 이상의 리간드를 단일 화합물내로 결합시킴으로써 신규한 약물을 설계할 수 있게 한다.
이의 중요 양태에서, 본 발명은 특정 표적 분자에 결합하는 리간드를 확인하는 화합물의 선별방법을 제공한다. 상기 방법은, (a) 화합물 또는 화합물들의 혼합물의 제1 T2- 또는 확산-필터 양자 스펙트럼을 생성하는 단계; (b) 화합물 또는 화합물들의 혼합물을 표적 분자에 노출시키는 단계; (c) 단계(b)에서 표적 분자에 노출시킨 화합물 또는 화합물들의 혼합물의 제2 T2- 또는 확산-필터 양자 스펙트럼을 생성하는 단계 및 (d) 상기 제1 및 제2 T2- 또는 확산-필터 양자 스펙트럼을 비교하여 상기 제1 및 제2 스펙트럼 사이의 차이점을 확인하고, 이러한 차이에 의해 표적 분자에 결합되는 리간드인 하나 이상의 화합물의 존재여부를 확인하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법이 단계(b)에서 하나 이상의 화합물을 선별하고 스펙트럼 사이의 차이가 관찰되는 경우에는, 표적 분자의 부재하에 혼합물중의 화합물의 화학적 이동에 대한 사전 정보로 활성 화합물을 확인할 수 있다. 이러한 정보의 부재하에, 표적 분자에 결합하는 특정 화합물을 확인하기 위해 추가의 단계를 수행한다. 이러한 추가 단계는, (e) 혼합물중의 각각의 화합물의 T2- 또는 확산-필터 양자 스펙트럼을 생성하는 단계; (f) 혼합물중의 각각의 화합물을 개별적으로 표적 분자에 노출시키는 단계; (g) 표적 분자에 노출시킨 후 혼합물중의 각각의 화합물의 T2- 또는 확산-필터 양자 스펙트럼을 생성하는 단계; (h) 단계(g)에서 생성된 각각의 스펙트럼을 표적 분자만으로부터 생성된 제1 스펙트럼과 비교하여 임의의 비교 스펙트럼에서의 차이를 측정하고, 이러한 차이에 의해 표적 분자에 결합되는 리간드인 하나 이상의 화합물의 존재여부를 확인하는 단계를 포함한다.
표적 분자에 결합시, 시험 화합물의 이완율 또는 해리율의 차이를 크게 하기 위해 시험 분자보다 충분히 큰 임의의 표적 분자가 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 의화학에서의 단백질의 중요성 때문에, 바람직한 표적 분자는 폴리펩타이드이다. 바람직한 양태에서, 표적 분자는 분자량이 5kDa를 초과하는 폴리펩타이드이다.
본 발명의 선별방법은 화합물 또는 화합물들의 혼합물의 T2- 또는 확산-필터 일차원 양자 스펙트럼의 생성 또는 획득으로 시작된다. T2- 또는 확산-필터 일차원 양자 스펙트럼을 생성하는 방법은 당해 분야에 익히 공지되어 있다[참조 문헌: S. Meiboom and D. Gill, Rev. Sci. Instrum. 29: 688 (1958), S. J. Gibbs and C. S. Johnson, Jr. J. Magn. Reson. 93: 395-402 (1991) and A. S. Altieri, et al. J. Am. Chem. Soc. 117: 7566-7567 (1995)].
다수의 화합물들(예: 합성 또는 천연 발생의 작은 유기 화합물의 데이타베이스)의 NMR 데이타를 획득하는 것을 용이하게 하기위해, 샘플 변환기를 사용한다. 샘플 변환기를 사용하면, 총 60개의 샘플을 손대지않고 처리할 수 있다. 따라서, 통상적인 획득 파라미터[자유 유도 붕괴((free induction decay)(fid)) 당 128스캔]를 사용하여 100 내지 120개의 스펙트럼을 24시간내에 획득할 수 있다.
NMR 데이타 처리를 용이하게 하기위해, 컴퓨터 프로그램을 사용하여 다수의 일차원 NMR 데이타를 전사시키고 자동적으로 처리한다.
화합물들의 혼합물의 대표적인 일차원 T2-필터 스펙트럼은 도 1A에 나타나있다. 화합물들의 혼합물의 대표적인 일차원 확산-필터 스펙트럼은 도 2A에 나타나있다.
제1 스펙트럼을 획득한 후, 표지된 표적 분자를 하나 이상의 시험 화합물에 노출시킨다. 하나 이상의 시험 화합물을 동시에 시험하는 경우, 다수의 소분자와 같은 화합물의 데이타베이스를 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 분자는 통상적으로는 과중수소화된(perdeuterated) 디메틸설폭사이드에 용해된다. 데이타베이스에 있는 화합물은 판매자로부터 구입하거나 필요한 목적에 따라 제조할 수 있다.
각각의 화합물은 특히 크기(분자량=100 내지 300) 및 분자적 다양성를 기준으로 선택할 수 있다. 매우 다양한 결합 부위와 상호작용하는 화합물을 발견할 가능성을 극대화하기 위해, 수집물에서의 화합물은 상이한 형태(예: 평면 방향족 환, 뒤틀린 방향족 환, 및 단일결합, 이중결합 또는 삼중결합을 갖는 직쇄 및 측쇄 지방족 화합물) 및 다양한 관능성 그룹(예: 카복실산, 에스테르, 에테르, 아민, 알데히드, 케톤 및 다양한 헤테로사이클릭 환)을 가질 수 있다.
본 발명의 NMR 선별방법은 약 0.05 내지 약 1.0mM의 범위의 리간드 농도를 사용한다. 상기한 농도에서, 산성 또는 염기성인 화합물은 완충된 단백질 용액의 pH를 상당히 변화시킬 수 있다. 화학적 이동은 직접적인 결합 상호작용뿐만 아니라 pH 변화에 민감하여, 리간드 결합의 결과가 아닌 pH의 변화로 "가양성" 화학적 이동 변화가 관찰될 수 있다. 따라서, 완충액의 pH가 리간드의 첨가에 의해 변화되지 않도록 보장하는 것이 필요하다. pH를 조절하는 한가지 수단은 하기에 기술한다.
화합물은 263K에서 디메틸설폭사이드(DMSO)중의 1.0 및 0.1M 원액으로 저장한다. 이는 수용액중의 리간드의 한정된 가용성 때문에 필요하다. DMSO 용액의 pH를 직접적으로 조절할 수는 없다. 또한, HCl 및 NaOH는 DMSO중에서 불용성 염을 형성하기 때문에, 다른 선택적인 산 또는 염기를 사용해야만 한다. 하기의 방법은 안정된 pH를 생성하는 것으로 밝혀졌다.
DMSO중의 1.0M 원액을 pH가 7.0인 50mM의 인산염중에 1:10으로 희석시킨다. 희석된 분취 용액의 pH를 측정한다. 분취량의 pH가 변하지 않는 경우(즉, 7.0으로 유지되는 경우), DMSO 원액을 1:10으로 희석시켜서 실시 용액을 0.1M의 용액으로 제조한 다음 용액을 보관한다.
희석시킨 분취량의 pH가 7.0 미만인 경우, 에탄올아민을 1.0M의 원액 DMSO 용액에 가하고, 원액을 인산염 완충액을 사용하여 1:10으로 희석시켜 다른 분취량을 만들고, 분취량의 pH를 재검사한다.
희석시킨 분취량의 pH가 7.0을 초과하는 경우, 아세트산을 1.0M의 원액 DMSO 용액에 가하고, 원액을 인산염 완충액을 사용하여 1:10으로 희석시켜 다른 분취량을 만들고, 분취량의 pH를 재검사한다.
에탄올아민 및 아세트산은 DMSO중에서 가용성이고, 적절한 당량을 가하여 완충액으로 이전시 pH가 변하지 않도록 한다. pH의 조절은 목적하는 결과가 수득될 때까지 반복되는 상호작용 공정이다.
상기 공정이, 실험에 사용되는 저농도(0.1 내지 10mM) 또는 상이한/약한 완충 시스템에서 pH 변화가 관찰되지 않도록 1.0M 원액(100mM 리간드)의 1:10 희석으로 수행됨을 인지한다.
표적 분자에 대해 시험 화합물을 노출시킨 후, 제2 일차원 T2- 또는 확산-필터 스펙트럼이 생성된다. T2-필터 방법의 경우, 제2 스펙트럼이 상기한 바와 동일한 방식으로 생성된다. 이어서, 제1 및 제2 스펙트럼을 비교하여 2개의 스펙트럼 사이의 임의의 차이점을 측정한다. 일차원 T2-필터 스펙트럼에서의 차이는 리간드가 표적 분자에 결합함을 나타낸다. 이러한 차이는 당해 분야에서 익히 공지된 표준 방법을 사용하여 측정한다. 확산-필터 방법의 경우, 제2 스펙트럼은 낮은 구배 및 높은 구배 강도 사이의 스펙트럼 차이를 관찰하고 표적 분자의 부재하에 관찰되는 확산율이 비교가능한 화합물을 선택함으로써 생성된다.
실시예를 통해, 도 1은 다양한 표적 분자를 시험 화합물들의 혼합물에 노출시키기 전후에 일차원 T2-필터 스펙트럼을 비교하고 후속적으로 활성 화합물을 확인한 것을 나타낸다. 수행된 이러한 연구 방법에 대한 상세한 설명은 이후의 실시예 1에서 찾아볼 수 있다.
또한 실시예를 통해, 도 2는 다양한 표적 분자를 시험 화합물들의 혼합물에 노출시키기 전후에 일차원 확산-필터 스펙트럼을 비교하고 후속적으로 활성 화합물을 확인한 것을 나타낸다. 수행된 이러한 연구 방법에 대한 상세한 설명은 이후의 실시예 2에서 찾아볼 수 있다.
단백질에 결합하는 추가의 분자를 발견하기 위해, 분자는 초기 선별로부터의 구조/활성 관계를 기준으로 하고/하거나 단백질에 결합되어 있는 경우의 초기 실마리에 대한 구조적 정보를 기준으로 하여 시험용으로 선택된다. 실시예를 통해, 초기 선별로 모두 방향족 환을 포함하는 리간드를 확인할 수 있다. 이어서, 2차 선별은 시험 화합물로서 다른 방향족 분자를 사용한다.
의화학 분야에서의 중요성 때문에, 상기한 방법에 사용하기에 바람직한 표적 분자는 폴리펩타이드이다. 한가지 바람직한 양태에서, 표적 분자에 대한 한가지 리간드의 결합을 검출하는 방법은 제2 리간드의 존재하에 수행할 수 있다. 상기 양태에 따르면, 표적 분자는, 표적물을 시험 화합물에 노출시키기 전에 제2 리간드와 결합한다.
바람직한 표적 분자, 스펙트럼 생성 수단 및 스펙트럼 비교 수단은 상기한 바와 동일하다.
설계방법에서의 초기 단계는 특정 표적 분자에 결합하는 두개 이상의 리간드를 확인하는 것이다. 이러한 리간드의 확인은 상기한 바와 같이 일차원 T2- 또는 확산-필터 분광법을 사용하여 수행한다.
두개 이상의 리간드가 상이한 위치에서 표적 분자에 결합하는 것으로 확인되면, 표적 분자와 리간드 사이에 복합체가 형성된다. 리간드가 2개일 경우, 복합체는 3급 복합체이다. 4급 및 다른 복합체는 세개 이상의 리간드가 존재할 경우에 형성된다.
리간드가 표적에 결합하는 것을 허용하는 환경하에, 표적 분자를 다양한 리간드와 동시에 또는 후속적으로 혼합시켜 복합체를 형성한다. 이러한 조건을 측정하는 수단은 당해 분야에 익히 공지되어 있다.
복합체가 형성되면, 구조적 데이타를 수득한다. 구조적 데이타를 수득하는 임의의 수단을 이에 사용할 수 있다. 이러한 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예시적이고 바람직한 방법은 NMR 및 X-선 결정학이다.
구조적 데이타 분석은 표적 분자의 형태뿐만 아니라 리간드 상호간에 대한 리간드의 입체 배향을 드러낼 수 있다. 먼저, 표적 분자에 대한 각각의 리간드의 입체 배향은 결합에 직접적으로 수반되는 리간드 부분(즉, 표적 결합 부위와 상호작용하는 부분) 및 결합 부위로부터 돌출된 각각의 리간드 부분을 확인할 수 있게 하고, 이러한 부분은 후속적인 결합 공정에 사용될 수 있다.
두번째로, 입체 배향 데이타는 리간드 상호간에 대한 리간드의 위치를 맵핑하는데 사용된다. 바꾸어 말하면, 입체 배향된 리간드 사이의 분리된 거리를 계산할 수 있다.
세번째로, 입체 배향 데이타는 또한 리간드와 표적 사이의 삼차원적인 관계를 정의한다. 따라서, 리간드들 사이의 절대적인 거리를 계산하는것 이외에, 이들 리간드의 각 배향을 또한 측정할 수 있다.
리간드 및 표적의 입체 배향의 지식은, 모든 리간드를 포함하는 단일체내로 두개 이상의 리간드를 함께 결합시키는 링커를 선택하는데 사용된다. 링커의 설계는 표적에 대해 적절한 배향에 있는 단일체의 리간드 부분을 각각 유지시키는데 요구되는 거리 및 각 배향을 기준으로 한다.
적합한 링커의 삼차원적 형태는 당해 분야의 통상의 숙련가에게 익히 공지되어 있거나 숙련가가 용이하게 입수할 수 있다. 임의의 범위의 거리 및 삼차원 계획안을 초과하는 두개 이상의 리간드를 함께 결합시키는 것이 이론적으로는 가능하지만, 실제로 특정 한계의 거리 및 계획안이 바람직하다. 바람직한 양태에서, 리간드는 약 15옹스트롱(Å) 미만, 보다 바람직하게는 약 10Å 미만, 심지어 보다 더 바람직하게는 약 5Å 미만의 거리로 분리되어 있는 것이 바람직하다.
적합한 링커 그룹이 확인되면, 리간드를 링커에 결합시킨다. 리간드를 결합시키는 수단은 당해 분야에 익히 공지되어 있으며 리간드 및 링커 그룹 자체의 화학적 구조에 좌우된다. 리간드는 표적 분자와의 결합에 직접적으로 수반되지 않는 리간드 부분을 사용하여 서로 결합시킨다.
하기의 실시예는 본 발명의 바람직한 양태를 설명하는데, 이는 명세서 및 청구항을 어떤 방식으로든지 한정하지는 않는다.
실시예 1
T2-필터 분광법을 사용하는 화합물 선별
A. FKBP
사람의 재조합 FK 결합 단백질(FKBP)를 문헌에 따라 제조한다[참조 문헌: Logan et al., J. Mol. Biol., 236: 637-648 (1994)].
표적 분자의 존재하에서의 잠재성 리간드의 횡(T2) 이완율의 변화를 촉진시키기 위해 사용되는 펄스 순서는 문헌에 기술되어 있는 바와 같은 카르-퍼셀-마이붐-길(Carr-Purcell-Meiboom-Gill; CPMG) 순서이다[참조 문헌: S. Meiboom and D. Gill, Rev. Sci. Instrum. 29: 688 (1958)].
본 발명은 용액중에서 서서히 텀블링하는 거대 분자 또는 분자의 복합체가 용액중에서 신속하는 텀블링하는 소분자보다 짧은 횡(T2) 이완 시간을 갖는다는 사실을 이용한다. 이는 당해 분야에서 익히 공지되어 있다. 본 발명은 용액중에 유리될 경우 일반적으로 신속하는 텀블링하는 소분자가 보다 거대한 표적 분자에 결합되는 경우 서서히 텀블링한다는 사실을 이용한다. 따라서, 소분자의 횡(T2) 이완율은 표적 분자에 결합하는 경우에 변화(감소)된다.
이는 FKBP, 및 200μM의 친화성으로 FKBP와 결합하는 화합물 1에 대한 도 1에 입증되어 있다. 도 1A에서, 200ms의 스핀-록 시간을 갖는 CPMG 순서를 FKBP의 부재하에 화합물에 적용시킨다. 용액중에 유리된 소분자의 횡 이완율은 일반적으로 초와 유사하기 때문에 무시할만한 이완이 스핀-록 시간 동안에 발생하고, 유리 리간드의 시그날이 관찰된다. 그러나, FKBP의 존재하에서는 스핀-록 시간 이후에 리간드 시그날이 상당히 감소되고, 도 1B에 나타낸 바와 같이 잔류 단백질 및 리간드 피크만이 스펙트럼에 남게된다. 이러한 차이는 직접적인 조사나 FKBP만의 스펙트럼(스핀-록 후, 도 1C)을 FKBP의 존재하의 화합물의 스펙트럼(또한 스핀-록 후, 도 1B)으로부터 감산하여 도 1D에 나타낸 바와 같은 스펙트럼을 생성하는 스펙트럼 차별화방법에 의해 검출할 수 있다. 이러한 스펙트럼은, 경우에 따라 보다 장시간의 스핀-록 시간 적용에 의해 강도를 추가로 감소시킬 수 있는 잔류 리간드 피크만을 포함한다. 이러한 스펙트럼(도 1D)은 시험 화합물만의 스펙트럼(도 1A)로부터 감산시켜 도 1E에 나타낸 스펙트럼을 생성한다. 스펙트럼 차이에서의 양성 피크는 도 1A를 도 1E와 비교함으로써 입증되는 바와 같이, 표적 단백질의 부재하의 화합물의 화학적 이동에 상응하지만, 음성 피크는 FKBP에 결합되는 경우의 화합물의 화학적 이동에 상응한다. 이러한 정보는 활성 화합물을 확인하는데 사용할 수 있다.
동일한 실험을 화합물들의 혼합물에서 수행할 수 있다. 상기 실험에서, FKBP에 결합하지 않는 것으로 공지된 화합물 2 내지 9는 화합물 1과 결합한다. 도 2는 FKBP의 부재(도 2A) 및 FKBP의 존재(도 2B)하에서의 화합물들의 혼합물, 및 FKBP만(도 2C)에 대한 T2-필터 스펙트럼을 나타낸 것이다. 도 2B로부터 도 2C를 감산하여 수득한 도 2D의 스펙트럼은 단백질의 존재하의 리간드의 공명을 포함한다. 도 2A로부터 도 2D를 감산하여 수득한 도 2E의 스펙트럼은 도 2F에 나타낸 참조 스펙트럼에서 입증된 바와 같이, FKBP의 부재하의 화합물 1의 공명 위치에 상응하는 양성 피크를 포함한다. 도 2E에 포함된 화학적 이동 정보는 단백질과 결합하는 리간드의 존재를 검출하는데 사용될 뿐만 아니라 또한 화합물들의 혼합물중의 화합물 결합을 확인하는데 사용할 수 있으며, 여기서 유리 리간드에 관한 이러한 화학적 이동 정보는 이전부터 공지되어 있다.
도 3은 FKBP에 결합하지 않는, 화합물 2 내지 9의 혼합물만을 사용한 동일 실험 세트를 나타낸 것이다. 도 3E에서 관찰되는 바와 같이, 양성이 아닌 흡수성 리간드 공명이 상이한 스펙트럼에서 관찰되며, 이는 리간드가 FKBP에 결합하지 않음을 나타낸다.
실시예 2
확산-필터 분광법을 사용한 화합물 선별
A. FKBP
표적 분자의 존재하에서 잠재성 리간드의 확산율의 변화를 촉진시키기 위해 사용되는 펄스 순서는 문헌에 기술되어 있는 바와 같다[참조 문헌: S.J. Gibbs and C.S. Johnson, Jr. J. Magn. Reson. 93: 395-402(1991) and A.S. Altieri, et al., J. A. Chem. Soc. 117: 7566-7567 (1995)].
본 발명은 용액중에서 소분자가 보다 큰 분자보다 신속하게 확산된다는 사실을 이용한다. 이는 당해 분야에서 익히 공지되어 있다. 본 발명은 용액중에 유리될 경우 일반적으로 신속하게 확산되는 소분자가 보다 거대한 표적 분자에 결합되는 경우에 서서히 확산된다는 사실을 이용한다. 따라서, 소분자의 확산율은 표적 분자에 결합하는 경우에 변화(감소)된다.
확산 필터를 사용하여 리간드 결합을 검출하는 능력은 도 4에 나타낸 바와 같이, 화합물 1에 대한 FKBP 결합으로 입증한다. 먼저, FKBP의 존재하에 화합물 1의 샘플상에서 약한 구배 강도 및 강한 구배 강도에서 확산-필터 스펙트럼을 수득한다(각각 도 4A 및 4B). 이어서, 이러한 스펙트럼을 감산하여 도 4C에 나타낸 스펙트럼을 생성한다. 상기한 스펙트럼은 화합물 1의 잔류 리간드 공명을 포함한다. 이러서, 상기한 스펙트럼을 화합물 1만의 참조 스펙트럼(약한 구배 후, 도 4D)으로부터 감산하여 단백질에 결합하는 리간드의 공명을 포함한 스펙트럼을 생성한다(도 4E). T2-필터 실험에서와 같이, 도 4E에서의 양성 피크는 단백질의 존재하의 리간드의 화학적 이동에 상응하고, 음성 피크는 FKBP에 결합하는 경우의 화합물의 화학적 이동에 상응한다. 이러한 정보는 활성 화합물을 확인하는데 사용할 수 있다.
동일한 실험을 화합물들의 혼합물상에서 수행할 수 있다. 이러한 실험에서, FKBP에 결합하지 않는 것으로 공지된 화합물 2 내지 9를 화합물 1과 혼합한다. 도 5A 및 5B는 약한 구배 및 강한 구배 강도를 각각 적용한 후에 FKBP의 존재하의 화합물들의 혼합물의 스펙트럼을 나타낸 것이다. 이러한 스펙트럼 사이의 차이는 스펙트럼(도 5C)을 생성한다. FKBP의 부재하에서의 리간드 혼합물의 대조 스펙트럼(약한 구배를 적용한 후, 도 5D)으로부터 상기한 스펙트럼을 감산하여, FKBP의 부재하의 화합물 1에 대한 화학적 이동(도 5F)에서 양성 공명을 포함하는 스펙트럼(도 5E)을 생성한다. 도 5E에 포함된 화학적 이동 정보는 단백질에 결합하는 리간드의 존재를 검출하는데 사용될 뿐만 아니라 화합물들의 혼합물중의 화합물 결합을 확인하는데 사용할 수도 있으며, 여기서 유리 리간드에 대한 이러한 화학적 이동 정보는 이전부터 공지되어 있다.
도 6은 FKBP에 결합하지 않는, 화합물 2 내지 9의 혼합물만을 사용한 동일 실험 세트를 나타낸 것이다. 도 6E에서 관찰되는 바와 같이, 양성이 아닌 흡수성 리간드 공명이 상이한 스펙트럼에서 관찰되며, 이는 리간드가 FKBP에 결합하지 않음을 나타낸다.
모든 NMR 스펙트럼은 브루커(Bruker) AMX500 NMR 분광기상에서 300K에서 기록한다. 모든 스펙트럼은 256스캔으로 폭이 8333.3㎐인 양자 스위프(proton sweep) 및 7㎲의 양자 90도 펄스 길이에서 기록한다. T2-필터 실험의 경우, 1ms의 스핀-에코 지연을 갖는 스핀-록 시간은 200ms이다. 구배-필터 스펙트럼의 경우, 낮은 구배 및 높은 구배 강도는 각각 3 및 48가우스/㎝에 상응하고, 300ms의 확산 지연 시간이 사용된다. 모든 실험에서, 각각의 리간드의 농도는 100μM이고 FKBP의 농도는 50μM이며, 완충액은 pH가 6.5인 50mM의 PO4, 100mM의 NaCl(95% D2O)이다. NMR 데이타는 실리콘 그래픽스(Silicon Graphics) 컴퓨터상에서 처리되고 분석된다.
상기한 실시예는 비제한적이며, 본 발명은 또한 상기에서 나타낸 바와 같은 실시예에서 발견되는 두개 이상의 리간드의 결합된 조합인, 고친화성 리간드를 설계하는 방법에 관한 것이다.
a화합물 1의 KD는 에스. 셔커(S. Shuker) 등의 문헌[참조 문헌: Science 274: 1531-1534]으로부터 수득하고, 화합물 2 내지 9의 KD는 동일한 참조로서 기술되어 있는 바와 같이, 1.0mM의 화합물 농도에서 FKBP의15N-HSQC 스펙트럼에서 관찰되는 화학적 이동의 변화가 없음으로부터 추정된다.

Claims (18)

  1. (a) 화합물 하나 또는 화합물들의 혼합물의 제1 일차원 T2- 또는 확산-필터 스펙트럼을 생성하는 단계;
    (b) 화합물 하나 또는 화합물들의 혼합물을 표적 분자에 노출시키는 단계;
    (c) 단계(b)에서 표적 분자에 노출시킨 화합물 하나 또는 화합물들의 혼합물의 제2 일차원 T2- 또는 확산-필터 스펙트럼을 생성하는 단계 및
    (d) 상기 제1 및 제2 일차원 T2- 또는 확산-필터 스펙트럼을 비교하여 상기 제1 스펙트럼과 제2 스펙트럼 사이의 차이를 측정하고, 이러한 차이에 의해 표적 분자에 결합되는 리간드인 하나 이상의 화합물의 존재여부를 확인하는 단계를 포함하는, 특정 표적 분자에 결합하는 리간드인 화합물을 확인하는 화합물 선별방법.
  2. 제1항에 있어서, 화합물들의 혼합물이 단계(b)에서 사용되고, 단계(d)의 후속 단계로서
    (e) 혼합물중의 각각의 화합물의 제1 일차원 T2- 또는 확산-필터 스펙트럼을 생성하는 단계;
    (f) 상기 혼합물중의 각각의 화합물을 개별적으로 표적 분자에 노출시키는 단계;
    (g) 단계(f)에서 표적 분자에 노출시킨 각각의 화합물의 제2 일차원 T2- 또는 확산-필터 스펙트럼을 생성하는 단계 및
    (h) 단계(g)에서 생성된 각각의 스펙트럼을 제1 스펙트럼과 비교하여 상기 임의의 비교 스펙트럼에서 차이를 측정하고, 이러한 차이에 의해 표적 분자에 결합되는 리간드인 화합물의 존재여부를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 표적 분자를 단계(a) 전에 제2 리간드에 결합시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 선별된 화합물이 다양한 소분자의 화합물 수집물로부터 선택되는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 표적 분자가 폴리펩타이드로부터 선택되는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 폴리펩타이드가 효소 또는 수용체로부터 선택되는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 표적 분자가 폴리핵산으로부터 선택되는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 표적 분자가 비표지된 방법.
  9. (a) 일차원 T2- 또는 확산-필터 NMR 분광법을 사용하여 표적 분자에 대한 제1 리간드를 확인하고;
    (b) 일차원 T2- 또는 확산-필터 NMR 분광법을 사용하여 표적 분자에 대한 하나 이상의 추가 리간드를 확인하고;
    (c) 확인된 제1 리간드 및 추가로 확인된 하나 이상의 리간드와 표적 분자와의 복합체를 형성시키고;
    (d) 제1 리간드 및 하나 이상의 추가 리간드가 표적 분자에 결합하는 복합체의 하나 이상의 부분의 삼차원 구조와, 이에 따른 표적 분자에 대한 제1 리간드 및 하나 이상의 추가 리간드의 입체 배향을 측정하며;
    (e) 제1 리간드 및 하나 이상의 추가 리간드를 결합시켜 단계(d)에서 측정된 입체 배향을 유지시켜 고친화성 리간드를 형성함을 포함하는, 표적 분자에 대한 고친화성 리간드의 설계방법.
  10. 제9항에 있어서, 표적 분자가 폴리펩타이드로부터 선택되는 방법.
  11. 제9항에 있어서, 표적 분자가 비표지된 방법.
  12. 제9항에 있어서, 제1 리간드 및 하나 이상의 추가 리간드가 다양한 소분자의 풀(pool)로부터 선택되는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 소분자가 화합물 수집물로부터 선택되는 방법.
  14. 제9항에 있어서, 복합체가 용액중에서 제1 리간드 및 하나 이상의 추가 리간드와 표적 분자를 결합시킴으로써 형성되는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 용액중에서 형성된 복합체가 생리학적 조건하에 리간드 또는 하나 이상의 추가 리간드 사이에 형성된 복합체와 유사하거나 동일한 방법.
  16. 제9항에 있어서, 리간드 및 하나 이상의 추가 리간드를 수렴성 또는 선형 유기 합성법에 의해 함께 결합시켜 고친화성 리간드를 형성시키는 방법.
  17. 제9항에 있어서, 고친화성 리간드가 약제학적 활성 잔기인 방법.
  18. 제9항에 따른 방법에 의해 설계된 약제학적 활성 잔기.
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