CN1225648C - 一维核磁共振用于鉴定靶生物分子配体的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了鉴定与特异性靶分子结合的化合物的方法。该方法包括下列步骤：a)得到一种化学化合物或化合物混合物的第一T2或扩散过滤质子谱；b)将一种化学化合物或化合物混合物与靶分子接触；c)得到在步骤(b)中已与靶分子接触过的一种化学化合物或化合物混合物的第二T2或扩散过滤质子谱；d)比较所述第一和第二T2或扩散过滤质子谱以确定所述第一和所述第二谱之间的差异，所述差异表明存在的一种或多种化合物是已与靶分子结合的配体。

Description

一维核磁共振用于鉴定靶生物分子配体的用途
发明的技术领域
本发明涉及用一维核磁共振(NMR)谱筛选与靶生物分子结合的化合物的方法。
发明背景
发现新的药物先导物的一种最有效的方法是随机筛选合成化合物和天然产物数据库以发现与特定靶分子结合的化合物(即鉴定该靶的配体)。利用该方法，通过配体与靶分子形成物理结合的能力或者通过其改变靶分子功能的能力来鉴定配体。
当寻找物理结合时，通常将靶分子与一种或多种被推测是配体的化合物接触，然后进行检测以确定所述靶分子与一种或多种化合物之间是否形成了复合物。所述检测是本领域熟知的，用于检测标志着复合物形成的靶分子中的总变化(例如，大小、电荷、迁移率的变化)。
若测量功能改变，则要确立检测条件以便测量与靶分子有关的生物学或化学事件(如，酶催化的反应、受体介导的酶激活作用)。为了鉴定一种改变，在与待测化合物接触前后确定靶分子的功能。
现有的物理和功能检测已经被成功地用于鉴定用于设计治疗化合物的新的药物先导物。但是，这些检测方法本身有缺陷，不能很好地解决精确性、可信度和效率问题。
现有检测方法的一个主要缺陷是“假阳性”问题。在典型的功能检测中，“假阳性”是引发检测的化合物，但该化合物在引发所需的生理学反应中不是有效的。在典型的物理检测中，“假阳性”是例如本身与靶以非特异性方式相连(例如非特异性结合)的化合物。在筛选较高浓度的推测配体时，由于许多化合物在所述浓度有非特异性作用，假阳性是特别普遍的，而且引起许多问题。
以类似的方式，现有检测方法还受“假阴性”问题的困扰，在检测中，当化合物产生阴性反应，但所述化合物实际上是靶配体时，会出现这一问题。在待测化合物浓度相对于所述化合物与靶的结合或分解常数过高(引起毒性)或过低的检测中，通常发生假阴性。
最近已表明，可用二维15N/1H光谱分析鉴定与靶蛋白质结合的化合物，这种方法克服了与用于配体鉴定的其它现有检测方法有关的许多问题。但是，这种方法要求蛋白质是15N标记的、可溶的并在高达0.3mM或更高的浓度仍表现正常。此外，只有可产生可分析的15N/1H相关图谱的蛋白质才能使用这种方法，就目的的技术水平而言，所述方法限于小于40kDa的靶蛋白质。另外，这种方法费时，即将化合物以10个为一组进行检测，并且当确定了所述混合物中至少有一种化合物有活性时，就必须分别检测每种化合物与靶蛋白质的结合。
由于现有筛选方法本身所固有的问题，仍然需要提供新的、快速、有效、精确和可靠的筛选化合物的方法以鉴定和设计与特定靶特异性结合的配体。
                     发明综述
在一个方面，本发明提供了筛选化合物的生物活性以鉴定与特异性靶分子结合的配体的方法。该方法包括下列步骤：a)得到一种化学化合物或化合物混合物的第一T2或扩散过滤质子谱；b)将一种化学化合物或化合物的混合物与靶分子接触；c)得到在步骤(b)中已与靶分子接触过的一种化学化合物或化合物混合物的第二T2或扩散过滤质子谱；d)比较所述第一和第二T2或扩散过滤质子谱以确定所述第一和所述第二谱之间的差异，所述差异表明存在的一种或多种化合物是已与靶分子结合的配体。
若本发明方法在步骤(b)中筛选一种以上化合物，即化合物的混合物，并且，若从所述混合物产生的第一谱与存在靶分子条件下从所述混合物产生的谱之间有差异，如果不存在靶分子条件下的所述活性化合物的谱是已知的，则可立即鉴定该活性化合物。这是由于在步骤(d)中观察到的谱之间的差异发生于所述活性化合物的化学位移处。在不存在所述混合物中所述化合物的已知化学位移资料的条件下或为了确定结合，还可进行其它步骤以鉴定所述混合物中的哪种哪些化合物与靶分子结合。这些其它步骤包括步骤(e)得到混合物中各化合物的T2或扩散过滤质子谱；f)将所述混合物中的每种化合物分别与靶分子接触，g)得到与靶分子接触后的所述混合物中各化合物的T2或扩散过滤质子谱；h)将步骤g)中得到的每种谱与单独用靶分子得到的第一谱进行比较以确定所比较谱之间的差异，通过所述差异鉴定存在的化合物是已与靶分子结合的配体。
本发明的一项优点是本发明方法能够确定潜在配体与任何大小或组成的未标记靶分子结合，只要所述靶比潜在配体足够大以致在与所述靶分子结合后可使松弛率或扩散率发生变化。
本发明的另一项优点是本发明方法能够确定甚至很弱结合的配体与靶分子的结合。
本发明的其它优点是本发明方法能够鉴定化合物混合物中的活性化合物，通过将不同谱中的化学位移与不存在靶生物分子条件下，混合物中所含已知化合物的化学位移直接比较来确定的。
在所述优选的实施方案中，可以在存在第二结合配体的条件下，完成确定配体结合的方法。根据所述实施方案，在与待测化合物接触前，将所述靶分子与第二配体结合。
该方法使用上述T2或扩散过滤质子谱以鉴定与靶分子结合的前一个和后一个配体。靶分子与两个或多个配体的复合物形成，并优选用NMR光谱或X射线晶体照相术获得结构数据。用所述结构数据确定配体彼此以及与靶分子的空间方向。
以空间方向为基础，将配体连接在一起以形成高亲和性配体，所述配体可用作特定靶分子的配体并可用作潜在的药理学活性药物。以有机化学领域熟知的键角原理和键长度资料为基础，通过保持配体彼此间以及配体与靶分子间的空间方向来选择适宜的连接基团。结合至少两个配体以形成高亲和性配体的连接方法或合成方案通过熟知的合成方法和/或反合成分析来完成。通过实际上可产生最终配体并不限于通过连接基团简单连接两个配体的任何方法可制备高亲和性配体。可利用任何线性合成或汇集合成法来形成最终产物。在发现至少两个与靶分子(优选蛋白质)有亲和性的配体后，设计高亲和性配体并用本领域技术人员熟知的方法制备。从具有不同原子和分子排列、立体化学等的多种小分子池中选择配体。限制因素是至少两个配体有一定的亲和性可作为多肽或靶分子上至少一个位点的配体。但是，本文公开的筛选方法可鉴定一种或多种配体，所述配体可通过常规药物设计方法操作以形成药理学活性产物或者可用于本文公开的药物设计方法以便将至少两个配体相连形成高亲和性配体。
因此，分子设计方法包括用一维T2或扩散过滤谱鉴定靶分子的第一配体部分；用一维T2或扩散过滤谱鉴定靶分子随后的配体部分；形成所述靶分子的第一和第二配体部分的复合物；获得所述复合物的结构数据，由此确定靶分子上第一和第二配体部分的空间方向；连接第一和第二配体部分以形成是药理学活性药物的高亲和性配体，同时保持配体部分的空间方向。
可以从不存在或者存在第一配体的条件下，鉴定第二配体部分(例如，在与待测化合物接触以鉴定第二配体前，可将靶分子与第一配体结合)。
在优选的实施方案中，在筛选和设计方法中所用的靶分子是多肽。优选以重组形式生产所述多肽靶，所述多肽靶是用含有编码所述多肽的多核苷酸的表达载体转化的宿主细胞而得到的。
                 附图描述
在构成本说明书一部分的附图中：
图1表示(A)化合物1的含水缓冲液的T2过滤谱，(B)存在FKBP条件下，化合物1的T2过滤谱，(C)FKBP T2过滤谱，(D)从(B)中减去(C)的差谱，和(E)从(A)中减去(D)的差谱。对于所有试验，T2过滤自旋锁时间是200ms，自旋回波延迟是1ms，化合物1的浓度是100μM，FKBP的浓度是50μM，缓冲液是50mM PO4，100mM NaCl，pH6.5(95％D20)。
图2表示(A)化合物1-9的混合物的T2过滤谱，(B)存在FKBP条件下，化合物1-9混合物的T2过滤谱，(C)FKBP T2过滤谱，(D)从(B)中减去(C)的差谱，和(E)从(A)中减去(D)的差谱，和(F)单独化合物1的T2过滤谱。对于所有试验，T2过滤自旋锁时间是200ms，自旋回波延迟是1ms，所有化学化合物的浓度是100μM，FKBP的浓度是50μM，缓冲液是50mM PO4，100mM NaCl，pH6.5(95％D20)。
图3表示(A)化合物2-9的混合物的T2过滤谱，(B)存在FKBP条件下，化合物2-9混合物的T2过滤谱，(C)FKBP T2过滤谱，(D)从(B)中减去(C)的差谱，和(E)从(A)中减去(D)的差谱。对于所有试验，T2过滤自旋锁时间是200ms，自旋回波延迟是1ms，所有化学化合物的浓度是100μM，FKBP的浓度是50μM，缓冲液是50mM PO4，100mM NaCl，pH6.5(95％D20)。
图4表示(A)用低梯度强度，在存在FKBP的条件下，化合物1的扩散过滤谱，(B)用高梯度强度，在存在FKBP的条件下，化合物1的扩散过滤谱，(C)从(A)中减去(B)的差谱，(D)用低梯度强度，化合物1的扩散过滤谱，和(E)从(D)中减去(C)得到的差谱。对于所有试验，低和高梯度强度分别对应3和48高斯/cm。高梯度强度足以消除样品中残留的HDO信号。所用的扩散延迟时间是300ms，所有化合物的浓度均是100μM，FKBP的浓度是50μM，缓冲液是50mM PO4，100mM NaCl，pH 6.5(95％D2O)。
图5表示(A)用低梯度强度，在存在FKBP的条件下，化合物1-9的扩散过滤谱，(B)用高梯度强度，在存在FKBP的条件下，化合物1-9的扩散过滤谱，(C)从(A)中减去(B)的差谱，(D)用低梯度强度，化合物1-9的扩散过滤谱，和(E)从(D)中减去(C)得到的差谱，和(F)单独化合物1的参考谱。对于所有试验，低和高梯度强度分别对应3和48高斯/cm。高梯度强度足以消除样品中残留的HDO信号。所用的扩散延迟时间是300ms，所有化学化合物的浓度均是100μM，FKBP的浓度是50μM，缓冲液是50mM PO4，100mM NaCl，pH6.5(95％D2O)。
图6表示(A)用低梯度强度，在存在FKBP的条件下，化合物2-9的混合物的扩散过滤谱，(B)用高梯度强度，在存在FKBP的条件下，化合物2-9的混合物的扩散过滤谱，(C)从(A)中减去(B)的差谱，(D)用低梯度强度，化合物2-9的混合物的扩散过滤谱，和(E)从(D)中减去(C)得到的差谱。对于所有试验，低和高梯度强度分别对应3和48高斯/cm。高梯度强度足以消除样品中残留的HDO信号。所用化学的扩散延迟时间是300ms，所有化学化合物的浓度均是100μM，FKBP的浓度是50μM，缓冲液是50mM PO4，100mM NaCl，pH6.5(95％D2O)。
                   发明详述
本发明提供了用于鉴定配体的快速有效的筛选方法，所述配体与治疗靶分子结合。
通过检测分子与靶分子(例如蛋白质、核酸等)的结合，然后用核磁共振(NMR)谱检测加入靶后，配体共振松弛率或扩散率的变化，可鉴定配体。被筛选的分子池可选自化合物收集中心，例如目前在大部分药物公司或大学实验室的收集中心。
可利用有关用所述方法鉴定的配体之间的构效关系资料设计作为靶分子配体的新药物。例如，若鉴定了给定靶分子的两个或多个配体，则形成所述靶分子与这些配体的复合物。从结构数据中得到配体之间以及配体与靶分子间的空间方向。空间方向定义了两个配体结合位点间的距离和各配体与所述位点的方向。
用所述空间方向数据，可将两个或多个配体连在一起，形成一个新配体。以保持配体与另一配体以及配体与靶分子的空间方向的方式完成连接。
本发明的1D-NMR为基础发现的方法有许多优点。首先，由于本发明通过直接测量与靶分子的结合而鉴定了配体，假阳性的问题显著减少。
第二，由于本发明方法可鉴定与具有宽范围离解常数的靶分子特异性结合的化合物，因此，假阴性问题显著减少。
第三，用本发明方法不需要在高浓度稳定的低分子量(＜40kDa)15N-标记的蛋白质，而这是利用15N/1H相关光谱的方法所需要的。
第四，通过与已知化学位移进行比较，直接鉴定混合物中的活性化合物，筛选和鉴定与靶分子结合的活性化合物的时间显著减少。
由于可监测潜在配体的信号以监测与靶分子的结合，因此，可以鉴定与靶分子同时结合的两个或多个配体。同时鉴定不同配体的结合位点的能力可以是本领域技术人员1)确定配体之间的阴阳合作结合和2)通过将两个或多个配体与一种化合物结合，同时保持配体与另一配体以及配体与其它结合位点的适当方向，可设计新药物。
在其主要方面，本发明提供了筛选化合物以鉴定与特异性靶分子结合的配体的方法。该方法包括下列步骤：a)得到一种化学化合物或化合物混合物的第一T2或扩散过滤质子谱；b)将一种化学化合物或化合物混合物与靶分子接触；c)得到在步骤(b)中已与靶分子接触过的一种化学化合物或化合物混合物的第二T2或扩散过滤质子谱；d)比较所述第一和第二T2或扩散过滤质子谱以确定所述第一和所述第二谱之间的差异，所述差异表明存在的一种或多种化合物是已与靶分子结合的配体。
若本发明方法在步骤(b)中筛选一种以上化合物，并且，若观察到谱之间有差异，不存在靶分子条件下，通过所述化合物的已知化学位移，则可鉴定该活性化合物。在没有所述资料的条件下，还可完成其它步骤以鉴定所述混合物中的哪种化合物与靶分子结合。这些其它步骤包括步骤(e)得到混合物中各化合物的T2或扩散过滤质子谱；f)将所述混合物中的每种化合物分别与靶分子接触，g)得到与靶分子接触后的所述混合物中各化合物的T2或扩散过滤质子谱；h)将步骤g)中得到的每种谱与单独用靶分子得到的第一谱进行比较以确定所比较谱之间的差异，通过所述差异鉴定的化合物是存在已与靶分子结合的配体。
任何靶分子均可使用于本发明方法中，只要所述靶比潜在配体足够大以致在与所述靶分子结合后可使松弛率或扩散率发生变化。由于蛋白质在药物化学中的重要性，优选的靶分子是多肽。在优选的实施方案中，靶分子是分子量大于5kDa的多肽。
本发明的筛选方法从产生或获得混合物中化合物的T2-过滤或扩散过滤的一维质子谱开始。产生T2-过滤或扩散过滤的一维质子谱的方法是本领域熟知的(参见例如S.Meiboomand D.Gill，Rev.Sci.Instrum.29：688(1958)，S.J.Gibbs and C.S.Johnson，Jr.J.Magn.Reson.93：395-402(1991)和A.S.altieri，等J.Am.Chem.Soc.117：7566-7567(1995))。
为了便于获得大量化合物的NMR数据(例如合成或天然小分子有机化合物的数据库)，可以使用换样器(sample changer)。使用换样器，就可以无人照管地测试共60个样品。因此，使用一般的探测参数(每次自由感应衰变(fid)扫描128次)，可以在24小时的时间内获得100-120个波谱。
为了便于加工NMR数据，用计算机程序转移并自动加工多个一维NMR数据。
图1A中列出了化合物的混合物的代表性一维T2过滤谱。图2A中列出了化合物的混合物的代表性一维扩散过滤谱。
获得第一个谱后，将标记的靶分子与一种或多种待测化合物接触。若同时检测一种以上的待测化合物，优选使用化合物例如多种小分子的数据库。通常将所述分子溶解于全氘化二甲亚砜。数据库中的化合物可购自卖主或按照需要制备。
单个化合物可主要根据大小(分子量100-300)和分子多样性来筛选。收集中心的化合物可能有不同的形状(例如平的芳香环，折叠脂环，带有单、双或叁键的直链和支链脂族化合物)以及多种功能团(例如羧酸、酯、醚、胺、醛、酮和各种杂环)以便最大可能地发现与各种结合位点作用的化合物。
本发明的NMR筛选方法使用从约0.05-约1.0mM的配体浓度。在这些浓度，酸或碱性的化合物可明显改变缓冲的蛋白质溶液的pH。化学位移对pH变化以及直接的结合作用敏感，因此，可观察到不是配体结合的结果而是pH改变引起的“假阳性”。因此，需要确保在加入配体后缓冲溶液的pH不发生变化。下文列出控制pH的方法。
将263K化合物作为1.0和0.1M的二甲亚砜(DMSO)储备液贮存。由于配体在水溶液中的溶解度有限，因此，这是很必要的。不可能直接调整DMSO的pH。另外，由于HCl和NaOH在DMSO中形成不溶性盐，因此，必须使用其它酸和碱。已发现下列方法可产生稳定的pH。
将1.0M的DMSO储备液用50mM磷酸，pH7.0以1∶10稀释。测量被稀释等份溶液的pH。如果所述溶液的pH未改变(即仍是7.0)，通过以1∶10稀释DMS0储备液，得到0.1M溶液，可制备工作溶液，然后贮存该溶液。
如果被稀释等份溶液的pH小于7.0，将乙醇胺加至1.0M DMSO储备液中，然后用磷酸盐缓冲液以1∶10稀释所述储备液以制备另一种等份溶液，再测量所述等份溶液的pH。
如果被稀释的等份溶液的pH大于7.0，将乙酸加至1.0M DMSO储备液中，然后用磷酸盐缓冲液以1∶10稀释所述储备液以制备另一种等份溶液，再测量所述等份溶液的pH。
乙醇胺和乙酸在DMSO中是可溶的，加入适当当量，可确保转移至含水缓冲液后，pH不改变。调整pH是一个相互影响的过程，重复该过程，直到得到所需的结果。
应注意，该方法是用1.0M储备液(100mM配体)的1∶10稀释物完成的，以确保在试验所用的较低浓度(0.1-10mM)或不同的/较弱的缓冲系统中，没有pH变化。
待测化合物与靶分子接触后，获得第二个一维T2或扩散过滤谱。对于T2过滤法，用与上述相同的方法得到第二谱。然后，比较第一和第二谱以确定两个谱之间是否有差异。一维T2过滤谱中的差异表明配体与靶分子发生了结合。用本领域熟知的标准方法确定这些差异。对于扩散过滤法，通过观察低高梯度强度间的谱差得到第二谱-由此选择扩散率与不存在靶分子时观察到的扩散率类似的化合物。
例如，图1比较了各种靶分子与待测化合物的混合物接触前后的一维T2过滤谱，随后鉴定活性化合物。在下文实施例1中详细描述了这些研究是如何完成的。
还例如，图2比较了各种靶分子与待测化合物的混合物接触前后的一维扩散过滤谱，随后鉴定活性化合物。在下文实施例2中详细描述了这些研究是如何完成的。
为了发现与蛋白质结合的其它分子，从初筛和/或可与蛋白质结合的初始先导物的结构信息中选择分子进行构效关系试验。例如，初次筛选可鉴定所有含芳香环的配体。第二轮筛选则选用其它芳香分子作为待测化合物。
由于其在药物化学领域的重要性，所以用于所述方法的优选的靶分子是多肽。在一个优选的实施方案中，可在存在第二配体的条件下，检测一个配体与靶分子的结合。根据该实施方案，在将所述靶与待测化合物接触前，将所述靶分子与第二配体结合。
优选的靶分子，用于获得谱的方法和比较谱的方法与上述相同。
在设计过程中的第一步是鉴定与特异性靶分子结合的两个或多个配体。用上述的一维T2或扩散过滤谱鉴定所述配体。
在鉴定出两个或多个配体与靶分子在不同位点结合后，形成了靶分子与配体复合物。若有两个配体，则所述复合物是三元复合物。若有三个或多个配体，则形成四元和其它多元复合物。
在可以使配体与靶分子结合的条件下，将靶分子同时或依次与各种配体混合，可形成复合物。确定这些条件的方法是本领域熟知的。
形成复合物后，就可得到结构数据。可以用任何方法得到结构数据。所述方法是本领域熟知的。举例性的和优选的方法是NMR和X射线晶体照相术。
结构数据的分析可揭示配体之间以及配体与靶分子构型之间的空间方向。首先，各配体与靶分子的空间方向使得可以鉴定直接与结合有关的配体部分(即与靶结合位点相互作用的部分)和各配体中远离结合位点的部分以及哪一部分可用在随后的连接过程中。
第二，用空间方向数据可绘出配体彼此间的位置。换句话说，计算出空间方向上配体间的不同距离。
第三，空间方向数据还可确定配体与靶的三维关系。因此，除计算配体间的绝对距离外，还可确定这些配体的角方向。
然后，用配体与靶的空间方向的知识选择出将两个或多个配体连接在一起的接头形成含所有配体的一个整体。接头的设计是基于将整体中的各配体部分保持在与靶的适当方向所需的距离和角方向。
适宜接头的三维构型是本领域熟知的或者本领域技术人员很容易确定。尽管理论上可在任何距离范围和三维投影上将两个或多个配体连在一起，但是，在实践中，距离和投影的某些限制是优选的。在一个优选的实施方案中，配体之间的距离不小于约15埃，优选不小于约10埃，更优选不小于约5埃。
在鉴定了适宜的接头组后，将配体与所述接头连在一起。连接配体的方法是本领域熟知的，而且取决于配体与连接基团本身的化学结构。配体间通过与靶分子结合无关的部分彼此相连。
下列实施例说明本发明的优选实施方案，但不以任何方式限制说明书和权利要求。
实施例1
用T2-过滤谱筛选化合物
A.FKBP
按Logan等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，236：637-648(1994)所述制备重组人FK结合蛋白(FKBP)。
在存在靶分子条件下，检测潜在配体的横向(T2)松弛率的变化所用的脉冲序列是S.Meiboom和D.Gill，Rev.Sci.Instrum.29：688(1958)所述的Carr-Purcell-Me iboom-Gill(CPMG)。
本发明利用在溶液中翻转缓慢的大分子或分子复合物比在溶液中翻转迅速的小分子有较短的横向(T2)松弛率这一现象。这是本领域熟知的。本发明利用小分子在溶液中自由并通常翻转迅速，但与较大的靶分子结合后，翻转较慢这一现象。因此，与靶分子结合后，小分子的横向(T2)松弛率将变化(减小)。
这在有关FKBP和化合物1的图1中得到说明，化合物1与FKBP的亲和性为200μM。在图1A中，不存在FKBP的条件下，将自旋锁时间为200ms的CPMG序列用于所述化合物。由于在溶液中游离的小分子的横向松弛率通常以秒计，在自旋锁时间内发生的松弛可以忽略，因此，得到游离配体的信号。但存在FKBP时，在自旋锁时间后，配体信号显著降低，并在谱上仅有残留的蛋白质和配体峰，如图1B所示。这些差异可直接观察，或者通过从存在FKBP下的化合物谱(自旋锁后，图1B)中减去FKBP谱(自旋锁后，图1C)的谱分辨法，得到图1D所示的谱。该谱只含有残留的配体峰，如果需要，通过较长的自旋锁时间，进一步减小。然后，从待测化合物的谱(图1A)中减去该谱(图1D)，得到图1E所示的谱。不同谱的正峰对应于不存在靶蛋白质下的化合物的化学位移，如比较图1A和图1E所说明的，而负峰对应于与FKBP结合后的化合物的化学位移。用该资料可鉴定活性化合物。
用化合物的混合物可完成相同的试验。在这些试验中，将已知不与FKBP结合的化合物2-9与化合物1混合。图2分别表示不存在FKBP条件下化合物之混合物的T2-过滤谱(图2A)，存在FKBP条件下化合物之混合物的T2-过滤谱(图2B)和FKBP的谱(图2C)。从图2B减去图2C得到的图2D的谱含有存在蛋白质条件下，所述配体的共振。从图2A中减去图2D得到的图2E的谱包括正峰，该峰对应于不存在FKBP条件下化合物1的共振位置，如图2F中所说明的。用图2E中的化学位移资料不仅可检测与蛋白质结合的配体的存在，还可鉴定化合物混合物中哪种化合物发生了结合，只要游离配体的化学位移资料是事前已知的。
图3列出了仅用化合物2-9的混合物做的一组试验，化合物2-9不与FKBP结合。如图3E中所观察到的，在不同的谱中，没有正的、吸收性的配体共振，这表明没有配体与FKBP结合。
实施例2
用扩散过滤谱筛选化合物
A.FKBP
按S.J.Gibbs和C.S.Johnson，Jr.J.Magn.Reson.93：395-402(1991)和A.S.Altieri等J.Am.Chem.Soc.117：7566-7567(1995)所述，用脉冲序列研究存在靶分子条件下，潜在配体扩散率的变化。
本发明利用在溶液中小分子比大分子扩散更迅速的现象。这是本领域熟知的。本发明利用在溶液中是游离的并通常扩散迅速的小分子在与较大的靶分子结合后扩散变慢的现象。因此，在与靶分子结合后，小分子的扩散率将发生变化(减小)。
用FKBP与化合物1的结合说明用扩散过滤检测配体结合的能力，如图4所示。首先，存在FKBP的条件下，用化合物1的样品得到在弱和强梯度强度的扩散过滤谱(分别为图4A和4B)。然后将这些谱相减以得到图4C所示的谱。该谱包括化合物1的残留配体共振。然后从化合物1的参考谱(弱梯度后，图4D)减去该谱，得到包括与蛋白质结合之配体的共振谱(图4E)。与T2过滤试验一样，图4E的正峰对应于不存在蛋白质时的配体的化学位移，而负峰对应于与FKBP结合时的化合物的化学位移。可用该资料鉴定活性化合物。
用化合物的混合物完成相同的试验。在这些试验中，将已知不与FKBP结合的化合物2-9与化合物1混合。图5A和5B分别表示弱和强梯度强度后，存在FKBP时化合物混合物的谱。这些谱间的差异得到一个谱(图5C)。从不存在FKBP条件下，配体混合物的对照谱减去该谱(弱梯度后，图5D)，得到含有不存在FKBP条件下，在化合物1的化学位移的正共振的谱(图5F)。用图5E中包括的化学位移资料不仅可检测是否存在与蛋白质结合的配体，还可鉴定混合物中哪种化合物发生了结合，只要游离配体的所述化学位移资料是事前已知的。
图6列出了仅用化合物2-9的混合物完成的相同的试验，化合物2-9不与FKBP结合。如图6E所观察到的，在不同的谱中没有观察到正配体共振，这表明没有配体与FKBP结合。
所有NMR谱都是用Bruker AMX500 NMR光谱计在300K记录的。所有谱都是用256扫描和8333.3Hz的质子扫描宽度和7μs的质子90度脉冲记录的。对于T2-过滤试验，自旋锁时间200ms，自旋回波延迟是1ms。对于梯度过滤谱，低和高梯度强度分别对应于3和48高斯/cm，扩散延迟时间为300ms。在所有试验中，各配体的浓度为100μM，FKBP的浓度为50μM，缓冲液的是50mM PO4，100mMNaCl，pH6.5(95％D20)。用Silicon Graphics计算机处理和分析NMR数据。
上述实施例是非限制性的，本发明还涉及设计高亲和性配体的方法，所述配体与上文所述实施例中的至少两种配体相连。
          表1
No.               化合物                          KD
                                                  (mM)a
Figure C9880427100171
a化合物1的KD是从S.Shuker等，科学(Science)274：153-1534(1996)得到的，而化合物2-9的数据是按照相同的参考文献所述，在FKBP的浓度为1.0mM时，用15N-HSQC谱没有观察到化学位移变化而估算出的。

Claims (26)

1.一种鉴定化合物是与特异性靶分子结合的配体的方法，该方法包括下列步骤：
a)得到一种化学化合物或化合物混合物的第一一维T2-或扩散-过滤NMR谱；
b)将所述的化学化合物或化合物混合物与靶分子接触；
c)在步骤(b)中与靶分子接触时得到所述一种化学化合物或所述化合物混合物的第二一维T2-或扩散-过滤NMR谱；和
d)比较所述第一一维T2-或扩散-过滤NMR谱和第二一维T2-或扩散-过滤NMR谱以确定所述第一NMR谱和所述第二NMR谱之间的差异，所述差异表明分别在所述的一种化合物或化合物混合物中存在的一种或多种化合物是已与靶分子结合的配体。
2.权利要求1的方法，其中在(b)中使用的是化学化合物的混合物，在步骤d)后还包括下列步骤：
e)得到混合物中各化合物的第一一维T2-或扩散-过滤NMR谱；
f)将所述混合物中的每种化合物分别与靶分子接触；
g)在步骤f)中与靶分子接触时得到各化合物的第二一维T2-或扩散-过滤NMR谱；
h)将步骤g)中得到的每种NMR谱与所述第一NMR谱进行比较以确定所比较NMR谱之间的差异，通过所述差异鉴定作为已与靶分子结合的配体的化合物的存在。
3.权利要求1的方法，还包括在步骤(a)前将靶分子与第二配体结合的步骤。
4.权利要求1的方法，其中筛选的化合物选自多种小分子的化合物收集中心。
5.权利要求1的方法，其中所述靶分子选自多肽。
6.权利要求5的方法，其中所述多肽选自酶或受体。
7.权利要求1的方法，其中所述靶分子选自多核苷酸。
8.权利要求1的方法，其中所述靶分子是未标记的。
9.设计与靶分子结合的高亲和性配体的方法，包括：
(a)根据权利要求1的方法，用一维T2-或扩散-过滤NMR光谱鉴定靶分子的第一配体；
(b)用一维T2-或扩散-过滤NMR光谱鉴定靶分子的一种或多种其它的配体；
(c)在鉴定的第一配体和鉴定的一种或多种其它的配体与所述靶分子之间形成复合物；
(d)确定复合物中至少第一配体和一种或多种其它配体与靶分子结合的那部分的三维结构，因此，确定第一配体和一种或多种其它配体在靶分子上的空间方向；和
(e)连接第一配体和一种或多种其它配体以保持步骤(d)中确定的空间方向，形成高亲和性配体。
10.权利要求9的方法，其中所述靶分子选自多肽。
11.权利要求9的方法，其中所述靶分子是未标记的。
12.权利要求9的方法，其中所述第一配体和一种或多种其它配体通过汇集或线性有机合成法连接在一起形成高亲和性配体。
13.权利要求9的方法，其中所述高亲和性配体是药物活性部分。
14.权利要求9的方法，所述第一配体和一种或多种其它配体选自多种小分子池。
15.权利要求14的方法，其中所述小分子选自化合物收集中心。
16.权利要求9的方法，其中通过在溶液中将所述第一配体和一种或多种其它配体与靶分子结合来形成复合物。
17.权利要求16的方法，其中在溶液中形成的复合物与在生理条件下所述配体或一种或多种其它配体间形成的复合物相似或相同。
18.权利要求1的方法，还包括
(e)通过所述的比较来协助鉴定一化学化合物是所述靶分子的配体，和
(f)制备所述化合物。
19.权利要求9的方法，还包括一个在步骤(a)前选择靶分子的步骤，和在步骤(e)后制备化学化合物的步骤，所述化学化合物的结构是通过以保持步骤(d)中确定的空间方向的方式连接所鉴定的第一配体和所鉴定的其它配体而得到的。
20.权利要求18或19的方法，其中所述的靶分子是多肽。
21.权利要求20的方法，其中所述多肽的分子量大于5kDa。
22.包含第一配体和一种或多种其它配体的对靶生物分子具有高亲和性的药物活性化合物，其中所述第一配体和所述一种或多种其它配体连接，所述化合物通过权利要求19的方法制备。
23.权利要求22的对靶生物分子具有高亲和性的药物活性化合物，其中所述靶生物分子是核酸。
24.权利要求22的对靶生物分子具有高亲和性的药物活性化合物，其中所述靶生物分子是多肽。
25.权利要求24的对靶生物分子具有高亲和性的药物活性化合物，其中所述靶生物分子是分子量大于5kDa的多肽。
26.权利要求24的对靶生物分子具有高亲和力的药物活性化合物，其中所述的靶生物分子是人FK结合蛋白(FKBP)。
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Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2001503646A (ja) * 1996-03-29 2001-03-21 ローレンス バークレー ナショナル ラボラトリィ 過分極化希ガス存在下でのｎｍｒまたはｍｒｉの増強
US20030143757A1 (en) * 1997-06-13 2003-07-31 Jonathan Moore Methods for identifying drug cores
US6111066A (en) 1997-09-02 2000-08-29 Martek Biosciences Corporation Peptidic molecules which have been isotopically substituted with 13 C, 15 N and 2 H in the backbone but not in the sidechains
US6344330B1 (en) 1998-03-27 2002-02-05 The Regents Of The University Of California Pharmacophore recombination for the identification of small molecule drug lead compounds
JP2002534687A (ja) * 1998-12-30 2002-10-15 アメルシャム・パブリック・リミテッド・カンパニー 過分極を使用したｎｍｒ分光学アッセイ
US6333149B1 (en) 1999-06-04 2001-12-25 Triad Biotechnology, Inc. NMR-solve method for rapid identification of bi-ligand drug candidates
WO2001014886A2 (en) * 1999-08-23 2001-03-01 Polaris Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of binding between proteins and macromolecular ligands
US6677160B1 (en) 1999-09-29 2004-01-13 Pharmacia & Upjohn Company Methods for creating a compound library and identifying lead chemical templates and ligands for target molecules
US6764858B2 (en) 1999-09-29 2004-07-20 Pharmacia & Upjohn Company Methods for creating a compound library
US20010051333A1 (en) * 2000-04-17 2001-12-13 Pharmacia & Upjohn Company Nuclear magnetic resonance methods for identifying sites in papillomavirus E2 protein
US7146277B2 (en) * 2000-06-13 2006-12-05 James H. Prestegard NMR assisted design of high affinity ligands for structurally uncharacterized proteins
US20030165431A1 (en) * 2000-07-13 2003-09-04 The Regents Of The University Of California Method for detecting macromolecular conformational change and binding information
US7061237B2 (en) * 2000-07-13 2006-06-13 The Regents Of The University Of California Remote NMR/MRI detection of laser polarized gases
EP1320387B1 (en) * 2000-09-13 2012-04-11 Praecis Pharmaceuticals Incorporated Pharmaceutical compositions for sustained delivery of peptides
AU1106902A (en) 2000-09-27 2002-04-08 Univ Leiden Method for applying nmr for ligand discovery or as a drug screening tool
CA2432924A1 (en) * 2000-12-21 2002-06-27 Triad Therapeutics, Inc. Sea-trosy and related methods
GB0031566D0 (en) * 2000-12-22 2001-02-07 Mets Ometrix Methods for spectral analysis and their applications
US20030092027A1 (en) * 2001-06-01 2003-05-15 Luciano Mueller Nuclear magnetic resonance method for identifying ligands to target compounds
EP1423427A2 (en) * 2001-08-27 2004-06-02 Novartis AG Nogo receptor homologues and their use
US7653490B2 (en) 2001-09-10 2010-01-26 Triad Liquidating Company LLC Nuclear magnetic resonance assembly of chemical entities
US20050221420A1 (en) * 2001-10-22 2005-10-06 Carmen Barske Nogo receptor homologues and their use
US7037660B2 (en) * 2001-11-06 2006-05-02 Message Pharmaceuticals Methods for detecting and quantifying binding and inhibition of binding of species to nucleic acids
KR100888805B1 (ko) * 2002-06-14 2009-03-16 크리스탈지노믹스(주) 특정 아미노산이 표지된 단백질과 1ｄ ｎｍｒ 기법을이용하여 단백질의 활성 부위에 결합하는 화합물을검색하는 방법
KR100901309B1 (ko) * 2002-06-15 2009-06-09 크리스탈지노믹스(주) 단백질의 활성 부위에 결합하는 화합물을 선별하는 방법
NO20025738D0 (no) * 2002-11-29 2002-11-29 Amersham Health As Metode
CA2466792A1 (en) * 2003-05-16 2004-11-16 Affinium Pharmaceuticals, Inc. Evaluation of spectra
US7595170B2 (en) * 2004-08-05 2009-09-29 Modrovich Ivan E Apparatus and method for measuring concentrations of molecules through a barrier
US8933209B2 (en) 2006-04-26 2015-01-13 Abbvie Inc. Dep2 and its uses in major depressive disorder and other related disorders
US20070256148A1 (en) * 2006-04-26 2007-11-01 Katz David A DEP2 and its uses in major depressive disorder and other related disorders
FR2954830A1 (fr) * 2009-12-31 2011-07-01 Nmrtec Methode d'analyse comparative par resonance magnetique nucleaire
CA2848520C (en) * 2011-09-29 2019-11-26 Seattle Genetics, Inc. Intact mass determination of protein conjugated agent compounds
CN102507627B (zh) * 2011-11-14 2014-10-01 中国科学院武汉物理与数学研究所 一种高通量筛选药物的核磁共振方法
US9678185B2 (en) 2013-03-15 2017-06-13 Pepsico, Inc. Method and apparatus for measuring physico-chemical properties using a nuclear magnetic resonance spectrometer
CN104198517B (zh) * 2014-09-23 2017-02-08 中国科学院昆明植物研究所 联合使用不同核的一维核磁共振混合物定量方法
CN104897826B (zh) * 2015-06-16 2016-06-22 广西师范大学 一种用于细胞原位检测小分子化合物与靶蛋白相互作用的方法
CN107328804B (zh) * 2017-07-21 2019-02-05 中国科学院山西煤炭化学研究所 一种甘油加氢反应混合物的核磁共振检测方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4789832A (en) * 1987-01-14 1988-12-06 Jeol Ltd. Three-dimensional NMR spectroscopy
JPH05503691A (ja) * 1989-12-29 1993-06-17 ユニバーシティ・テクノロジーズ・インターナショナル・インコーポレイテッド アゴニストおよびアンタゴニストを含む生物学的に活性なリガンドの３次構造モデルの設計方法およびアンギオテンシンに基づいた新規合成アンタゴニスト
US5270163A (en) * 1990-06-11 1993-12-14 University Research Corporation Methods for identifying nucleic acid ligands
US5698401A (en) * 1995-11-14 1997-12-16 Abbott Laboratories Use of nuclear magnetic resonance to identify ligands to target biomolecules

Also Published As

Publication number Publication date
BG103856A (en) 2000-07-31
HUP0003956A3 (en) 2002-04-29
SK285411B6 (sk) 2007-01-04
BG64326B1 (bg) 2004-09-30
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SK141699A3 (en) 2000-06-12
CZ297275B6 (cs) 2006-10-11
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ZA982919B (en) 1998-10-12
US6043024A (en) 2000-03-28
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KR100542420B1 (ko) 2006-01-11

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