HU228433B1 - Use of one-dimensional nuclear magnetic resonance to identify ligands to target biomolecules - Google Patents
Use of one-dimensional nuclear magnetic resonance to identify ligands to target biomolecules Download PDFInfo
- Publication number
- HU228433B1 HU228433B1 HU0003956A HUP0003956A HU228433B1 HU 228433 B1 HU228433 B1 HU 228433B1 HU 0003956 A HU0003956 A HU 0003956A HU P0003956 A HUP0003956 A HU P0003956A HU 228433 B1 HU228433 B1 HU 228433B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- compounds
- target molecule
- compound
- diffusion
- dimensional
- Prior art date
Links
- 239000003446 ligand Substances 0.000 title claims description 103
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 title description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 153
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims description 92
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 61
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 50
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 claims description 48
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 30
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 15
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 15
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 claims description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 9
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 claims description 8
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 7
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 claims description 7
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 5
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 3
- GNFTZDOKVXKIBK-UHFFFAOYSA-N 3-(2-methoxyethoxy)benzohydrazide Chemical compound COCCOC1=CC=CC(C(=O)NN)=C1 GNFTZDOKVXKIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 Chemical compound C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N 0.000 claims description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- YTAHJIFKAKIKAV-XNMGPUDCSA-N [(1R)-3-morpholin-4-yl-1-phenylpropyl] N-[(3S)-2-oxo-5-phenyl-1,3-dihydro-1,4-benzodiazepin-3-yl]carbamate Chemical compound O=C1[C@H](N=C(C2=C(N1)C=CC=C2)C1=CC=CC=C1)NC(O[C@H](CCN1CCOCC1)C1=CC=CC=C1)=O YTAHJIFKAKIKAV-XNMGPUDCSA-N 0.000 claims 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 claims 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 18
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 18
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 13
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 8
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 8
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 8
- 102000018679 Tacrolimus Binding Proteins Human genes 0.000 description 7
- 108010027179 Tacrolimus Binding Proteins Proteins 0.000 description 7
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 7
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical group [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 3
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 3
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000012938 design process Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 235000016068 Berberis vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 241000335053 Beta vulgaris Species 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700016256 Dihydropteroate synthases Proteins 0.000 description 1
- IAZDPXIOMUYVGZ-WFGJKAKNSA-N Dimethyl sulfoxide Chemical compound [2H]C([2H])([2H])S(=O)C([2H])([2H])[2H] IAZDPXIOMUYVGZ-WFGJKAKNSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 206010029897 Obsessive thoughts Diseases 0.000 description 1
- 241000238413 Octopus Species 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 150000007824 aliphatic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 150000007514 bases Chemical class 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940125904 compound 1 Drugs 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 230000009146 cooperative binding Effects 0.000 description 1
- 238000005100 correlation spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 235000019788 craving Nutrition 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 125000000118 dimethyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical class [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011990 functional testing Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000118 hair dye Substances 0.000 description 1
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000990 heteronuclear single quantum coherence spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 125000000468 ketone group Chemical group 0.000 description 1
- 238000009940 knitting Methods 0.000 description 1
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 230000006461 physiological response Effects 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229940124606 potential therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- -1 small molecule organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000005556 structure-activity relationship Methods 0.000 description 1
- 150000003462 sulfoxides Chemical class 0.000 description 1
- ZZIZZTHXZRDOFM-XFULWGLBSA-N tamsulosin hydrochloride Chemical compound [H+].[Cl-].CCOC1=CC=CC=C1OCCN[C@H](C)CC1=CC=C(OC)C(S(N)(=O)=O)=C1 ZZIZZTHXZRDOFM-XFULWGLBSA-N 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N24/00—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects
- G01N24/08—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects by using nuclear magnetic resonance
- G01N24/087—Structure determination of a chemical compound, e.g. of a biomolecule such as a protein
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01R—MEASURING ELECTRIC VARIABLES; MEASURING MAGNETIC VARIABLES
- G01R33/00—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables
- G01R33/20—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables involving magnetic resonance
- G01R33/44—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables involving magnetic resonance using nuclear magnetic resonance [NMR]
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N24/00—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects
- G01N24/08—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects by using nuclear magnetic resonance
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01V—GEOPHYSICS; GRAVITATIONAL MEASUREMENTS; DETECTING MASSES OR OBJECTS; TAGS
- G01V3/00—Electric or magnetic prospecting or detecting; Measuring magnetic field characteristics of the earth, e.g. declination, deviation
- G01V3/14—Electric or magnetic prospecting or detecting; Measuring magnetic field characteristics of the earth, e.g. declination, deviation operating with electron or nuclear magnetic resonance
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/20—Screening for compounds of potential therapeutic value cell-free systems
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/81—Packaged device or kit
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- High Energy & Nuclear Physics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Environmental & Geological Engineering (AREA)
- Geology (AREA)
- Remote Sensing (AREA)
- General Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Geophysics (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Magnetic Resonance Imaging Apparatus (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Egydimenziós mágneses magrezonancia alkalmazása cél biomobkulák ligaodumainak azonosítására
A találmány tárgya eljárás cél biomolekuláhhoz kötődő vegynletek szkFíneíésére egydimenziós mágneses magrezonancia (NMR) spektroszkópia alkalmazásával·
Az új hatóanyagok kutatásának egyik legeredményesebb módszere a szintetikus vegyületek és természetes termékek adatbazisának véletlenszerű szkrineiese, amellyel kiválaszthatok az adott célmolekulához kötődő vegyületek (azaz azonosíthatók a célmolekuIához kötődő llgandumok). Ezen eljárás alkalmazásával a ligandumok azon képességűk alapján azonosíthatok, hogy a oéimolekulával fizikai kapcsolatot hoznak létre, vagy a célmolekula működését megváltoztatják.
A fizikai kötődésen alapuló vizsgálatok esetén a célmolekulát jellemzően egy vagy több olyan vegyülettel hozzák érintkezésbe, amelyről faltételezik, hogy ligandumok, és megvizsgálják a cél molekula és az egy vagy több Ilyen vegyület közötti komptexképzodést Ezekben a vizsgálatokban' a célmoiekuiáoan bekövetkező nagymértékű változásokat a szakirodalomban jói ismert módon tesztelik (például komplex képződését jelző méret-, töltés- ás mozgekonyságváttözás).
A működésben változások mérése esetén olyan vizsgálati körülményeket alakítanak ki, ami lehetővé teszi a oéimolekulával kapcsolatos biológiai vagy kémiai esemény mérését (például enzim katalizálta reakció, receptor által közvetített enzimaktlválásj, A váltó
90551~1045 FO/té « 0 * * * V * ...« ♦ * ** 00>9 ♦* · A·* φ «»** zás azonosításéra maghatározzák a cálmotekuía működését a tesztvegyöíettel való éhintkeztetés előtt és után.
A létező fizikai és működésben vizsgálatokat sikeresen alkalmaztak gyógyászati hatásé vegyületek tervezésében az új hatóanyagok azonosítására. Azonban ezen vizsgálatoknak olyan korlátái vannak, amelyek veszélyeztetik a meghatározás pontosságát, megbízhatóságát és hatékonyságát
A meglévő vizsgálatok fő hibája a .hamis pozitívok* problémája. A működési vizsgálatok során jellemzően „hamis pozitív* egy vegyülel,. ha a vizsgálatban hatásosnak mutatkozik, de nem hatásos a kívánt fiziológiás válasz kiváltásában. A fizikai vizsgálatok során jellemzően „hamis pozitív agy vegyölet, ha például nem specifikus módon tapad a célhoz (például nem specifikus kötődés}. A hamis pozitivok különösen gyakran jelentkeznek a vélt ligandumok nagy koncentrációinak vizsgálatánál, mivel ilyen koncentrációknál számos vegyölet mutat nem specifikus hatást.
A jelenleg ismert vizsgálatokat hasonlóan sújtja a „hamis negatívok problémája, amely azt eredményezi, hogy egy olyan vágyóiét, amely valójában a cél liganduma, negatív választ ad a vizsgálatban. A hamis negatívok jellemzően olyan vizsgálatokban fordulnak elő, amelyekben a tesztvegynieteket vagy túl nagy (ez toxicltást okoz} vagy túl kicsi koncentrációban használják, a vegyölet célmclekula kötődési vagy dlsszocláclös állandójához viszonyítva.
Nemrégiben kimutatták, hogy a kétdimenziós -SN/’H spektrum analízis jól alkalmazható célproteinhez kötődő vegyületek azonosítására, és ezzel a megoldással a iigandumok azonosítására vonatkozó más Ismert vizsgálatoknál felmerülő problémák kiküszöbölhetők. Azonban ehhez a megoldáshoz olyan ^N-jetzett fehérjére van szűk♦ ♦ **
-X X * * φ « » » φ
ség, amely 0,3 mmól/l vagy ennél nagyobb koncentrációban oldható és megfelelő tulajdonságokat mutat. Továbbá ebben az eljárásban csak olyan fehérjék használhatók, amelyek a 1SN/5H korrelációs térképen analizálhatók, és ami a jelen technológiával a célprotein molekulatömegét 40 kDa-nál kisebb értékre korlátozza. Ráadásul az eljárás időigényes, mivel a vegyületeket tizes kombinációkban vizsgálják, és amikor azt találják, hogy a keverék legalább egyik vegyülete hatásos, akkor mindegyik vegyületet egyenként meg kell vizsgálni s célproteinhez való kötődése szempontjából.
Mivel az ismert szkrinelesl eljárásoknál problémák mutatkoznak, felmerült az igény egy új, gyors, hatékony, pontos és megbízható vegyület szkrinelési eljárás kidolgozására, amellyel jól azonosíthatók egy adott eélmolekulához specifikusan kötődő tervezett lioandumok
Találmányunk egyik megvalósítási módja eljárást biztosít biológiai hatású vegyületek szkrlnelésére, amellyel egy specifikus célmolekulához kötődő ügandumok azonosíthatók. Az eljárás a következő lépéseket tartalmazza:
aj felvesszük egy vegyület vagy vegyületkeverék első egydimenziós ϊ?- vagy diffúziós szűrt NIMR spektrumát;
bj a vegyületet vagy a vegyütetek keverékét érintkezésbe hozzuk egy célmolekulával;
c) felvesszük a bj lépés szerinti célmolekulával történő érintkeztetéskor az említett vegyület vagy az említett vegyületkeverék egy második egydimenziós Ts- vagy diffúziós szűrt NMR spektrumát és
d) Összehasonlítjuk a fenti első és második egydimenziós Tzvagy diffúziós szűrt NMR spektrumokat az említeti első és második HMR spektrum közötti különbségek meghatározására, és a különöségek alapján azonosítjuk az említett vegyület vagy vegyületkeverék közöl rendre annak az egy vagy több vegyuletnek a jelenlétét, amely Ugandámként kötődik a célmolekulahoz.
Amikor a találmányunk szerinti eljárás b) lépésben egynél több vegyületek azaz vegyútetkeveréket vizsgálunk, ahol a keverékből generált első spektrum és a célmotekula jelenlétében a keverékből generált második spektrum között különbség mutatkozik, akkor a hatóanyag azonnal azonosítható, amennyiben a célmolekulát nem tartalmazó hatóanyag spektruma ismert. Ez abbéi adódik, hogy a d) lépés szerinti spektrumok között megfigyelhető különbségek a hatóanyag kémiai eltolódás értékeinél jelentkeznek. Ezután további lépések végezhetők a cétmolekuiát megkötő keverékben lévő adott vágyóiét vagy vegyületek azonosítására abból a célból., hogy információt szerezzünk a keverékben lévő vegyületek kémiai eltolódására vonatkozóan vagy meggyőződjünk a kötődésről. Ezek a további lépések az alábbiakat foglalhatják magukban:
e) felvesszük a keverékben lévő egyes vegyületek első egydimenziós T.2- vagy diffúziós szőrt NMR protonspekfrumát;
f) a keverék mindegyik vegyüietéf egyenként érintkezésbe hozzuk a cél molekulával;
g) az f) lépés szerinti célmölekuíával történő érintkeztetéskor felvesszük mindegyik vegyület második egydimenziós T?- vagy diffúziós szűrt NME spektrumát; és
h) a g) lépésben felveti egyes NME spektrumokat összehasonlítjuk az első NME spektrumokkal, meghatározzuk az összehasonlított NME spektrumok bármelyike közötti különbségeket, és a különbségek segítségévei azonosítjuk azokat a vegyületeket, amelyek figandumként kötődnek a eétmolekufáboz.
χ«« *·«« * * **♦ ♦ ♦ * *·*'>«* » χ· * -iW
Találmányunk egyik előnye, hogy a találmányunk szerinti eljárással bármilyen méretű vagy összetételű jelöletlen oélmolekulához kötődő potenciális llgandumok kötődése meghatározható., azzal a megkötéssel, hogy a célmolekula mérete elegendően nagy a potenciális liganduméhoz viszonyítva, így utóbbinak a csímolekuiáhöz való kötődése kiterjedésben vagy diffúzió sebességbeli változást okoz,
Találmányunk egy további előnye, hogy a találmányunk szerinti eljárással a célmolekuIához, gyengén kötődé lig&ndumok kötődése is meghatározható.
Találmányunk tövéből előnye, hogy a találmányunk szerinti eljárással egy vagy több hatóanyag a hatóanyagok keverékében is azonosítható a differencia spektrumokban lévő kémiai eltolódások és a célmolekulát nem tartalmazó keverékben lévő vegyületek Ismert kémiai eltolódásainak közvetlen összehasonlításával.
Egy előnyös megvalősitási mód szerint a hgandum kötődésémsghafározására vonatkozó eljárás egy második kötött lígandum jelenlétében is elvégezhető. Ezen megvalósítási mód szerint a célmolekulát ezen második Ugandámhoz kötjük, mielőtt a vizsgált vegyülettel érintkezésbe hozzuk.
Ezen eljárásban a fenti Ts- vagy diffúziós szűri profon spektroszkőpíás szkrlnelésl eljárást alkalmazunk a célmplekolához kötődő első és további iígandumok azonosítására, A célmolekula két vagy több íígandummaí komplexet képez, amelynek a szerkezeti adatait előnyösen NMR spektroszkópiával vagy röntgensugár kristallögráfrávaí határozzuk meg, A szerkezeti adatokat a llg and űrnek egymáshoz és a oélmolekulához viszonyitotf térbeli orientációjának meghatározására használjuk fel·.
*** * « »« φ« ♦
X ♦ φ « φ φ φ « φ Χφφφ φ
*♦ X ίφ*
A térbeli orientáció alapján a liga adum ok egymáshoz kapcsalódnak és egy nagy affinitásé llgandumot alkatnak, amely az adott séimoiekula ligandumaként használható, és potenciális gyógyászati hatóanyagként alkalmazható. A megfelelő összekötőosoportot úgy választjuk mag, hogy a llgaadomek egymáshoz és a céimoiekuláhaz viszonyított térbeli orientációja fennmaradjon a szerves kémia szakterületén jól Ismert kötési szögek és távolságok elve alapján. A legalább két hgandum nagy affinitásé Ugandámmá történő összekapcsolása vagy szintézlsütja jól ismert eljárásokkal és/vagy retroszlníézls analízissel végezhető. A nagy affinitásé ligendum bármilyen módon előállítható, amelynek során az előállítani kívánt ligandum képződik, és az előállítás nem korlátozódik a két ligandum egy összekotőcsoperten át történő egyszerű összekapcsolására. A végtermék előállítható bármilyen lineáris vagy konvergens szintézissel. A célmolekulával {előnyösen proteinnsí) szemben affinitást mutató legalább kát ligandum kiválasztása után a nagy affinitásé ligandum a szakterületen járatos személy számára jól Ismert módon megtervezhető és előállítható, A ligandumokat különböző atomokét tartalmazó, különböző molekula- ás térszerkezetű kismelekuiák közül választhatjuk. A korlátozó faktor az, hogy legalább két figandumnak bizonyos ligandum affinitást kell mutatnia a poiipeptid vagy céfmolekula legalább egy helyén. Azonban a találmányunk szerinti szkrinelési eljárásban egy vagy több ligandum is azonosítható, amelyek szokásos hatóanyag tervezési eljárásokkal gyógyászatllag hatásos termékekké alakíthatók vagy az itt Ismertetett hatóanyag tervezési eljárásban használhatók, amelyek során legalább két ligandum kapcsolódik össze nagy affinitásé llgandummá.
♦ * *.·¥ * φ « φ « * ♦ «ΦΦ « Φ XX <
φ φ ♦ **«* φ ♦ '♦ φ·„ ♦
A moiekuiatervezési eljárás magában foglalja a célmolekuia egy első íig and urnának egydimenziós Tz- vagy diffúziós szűrt spektroszkópiával történő azonosítását; a célmolekuia további ligandumainak agy dimenziós Tj- vagy diffúziós szűrt spektroszkópiával történő azonosítását; sz alsó és a további ligandumok és a célmolekula komplezképzését; a komplex szerkezeti adatainak meghatározását, ezáltal az első és további ligandumok térbeli orientációját a célmolekulán; valamint az első és további ligandumok összekapcsolását, amelyek során nagy affinitásé ligandum képződik, ami gyógyászati hatóanyagként használható a ilgandomok tárbeli orientációjának megőrzése mellett.
A további ligandumrészek azonosítását az első ligandum jelenlétében vagy tavolíétében végezhetjük (például a célmolekulát hozzákapcsolhatjuk az első Ugandámhoz mielőtt a tssztvegyűlettei érintkeztetjök a második llgsndum: azonosítása séljábóO.
Egv előnyős megvalósítási mód szerint a szkrínelési vagy a tervezési eljárás során használt célmolekuia egy poíipeptid. A oéípoiipepfidei előnyösen rekomblnáns formában állítjuk elő egy expresszáló vektorral transzformált gazdasejtből· amely a pollpepiidet kódoló polinukleotidei tartalmazza.
A leírás részét képezik a következő ábrák;
az 1A ábrán az 1. táblázatban bemutatott (1) képletö vegyűlet T2- szövi spektruma látható vizes puffét oldatban, az 18 ábrán az (!) képletű vegyület T? szűrt spektruma látható FK8-P jelenlétében, a IC ábrán az FK8F T2 szőrt spektruma látható, az IC ábrán az IC ábrából az 18 ábra kivonásával előállított differencia spektrum iát;ő és az 1E ábrán az 10 ábrából az 1A ábra kivonásával előállított differencia spektrum látható; mindegyik kísérletben a szűrés φφφ
X* Φφ « φ Κ ί V Φ
ΦΦΦ *Χ* * Φ φ φ * «·«♦♦. φ φφ φφ κ φ* spinn-iock idő '200 ms, a spin-visszhang késleltetés 1 ms, minden vegyület koncentrációja löö urnöi/l, az FK8F koncentrációja 50 gmól/l és pufféiként 50 mmól/l foszfát, 100 mmol/í nátrium-klond összetételű oldatot használunk., amelynek kémhatása pH 6,5 (95 % DzO);
a 2A ábrán az I. táblázatban bemutatott (1)-(9) képletű vegyületek keverékének Ts-szőrt spektruma látható, a 28 ábrán az (1)(9) képletű vegyületek keverékének FK8P jelenlétében felvett íjszűrt spektruma látható, a 2C ábrán az FK8P T2 szűrt spektruma látható, a 2D ábrán a 2C ábrából 3 28 ábra kivonásával előállított differencia spektrum látható, a 25 ábrán a 2D ábrából a 2A ábra kivonásával -előállított differencia spektrum és a 2F ábrán az (1) képletű vegyület önmagában felvett referencia Tj szűrt spektruma látható: mindegyik kísérletben a T2 szűrési spin-lock idő 200 ms, a spinvisszhang késleltetés 1 ms, minden vegyület koncentrációja 100 .umól/l, a FK8P koncentrációja 5ö pmői/i és pufféiként 50 mmól/l foszfát, 109 mmól/l nátrium-kierid összetételű oldatot használunk, amelynek kémhatása pH 8,5 (95- % OzO);
. a 3.A ábrán a -(2:)-(9) képlete vegyületek keverékének T? szűrt spektruma látható, a 38 ábrán a (2)-(9) képletű vegyületek keverékének FKBP jelenlétében felvett T2 szűrt spektruma látható, a 3C ábrán az FK8P keverékének T.2 szűrt spektruma látható, a 3D ábrán a 3C ábrából a 38 ábra kivonásával előállított differencia spektrum látható, és a 3E ábrán a 3D ábrából a 3Α ábra kivonásával előállított differencia spektrum látható; mindegyik kísérletben a T2 szűrés spin-lock idő 200 ms, spin-visszhang késleltetés 1 ms, minden vegyület koncentrációja löö nmol/l, a FK8P koncentrációja 50 gmól/í és pof0 00 **:» « «
0 0 ♦ ♦♦*
0* farként 50 mmbi/l foszfát, 100 rnmől/l nátrium-kloríd összetételű oldatot használunk, amelynek kémhatása pH 5,5 (95 % DjO);
a 4A ábrán az (1) képietű vegyület FK8P jelenlétében kis gradiens erősség alkalmazásával felvett diffúziós szúrt spektruma látható, a 48 ábrán az -(1} képietű vegyület FK8P jelenlétében nagy gradiens erősség alkalmazásával felvett diffúziós szűrt spektruma látható, a 4C ábrán a 48 ábrából a 4A ábra .kivonásával eíösBított diffúziós spektrum, látható, a 4D ábrán az (1) képietű vegyület kis gradiens erősség alkalmazásával felvett diffúziós szűrt spektruma látható és a 4E ábrán a 4C ábrából a 40 ábra kivonásával előállított diffúziós spektrum látható; a kísérleteknél a kis és nagy gradiens erősség rendre 3 Gauss/cm, illetve 48 Gauss/cm értéknek felel meg; a nagy gradiens erősség elegendő a mintában visszamaradó HDO lel eltávolítására; 300 ms diffúziós késleltetési időt alkalmazunk, minden vegyület koncentrációja 100 pmóí/l, az FK8P koncentrációja 50 μηνόΙ/Ι és pufféiként 50 mm ót/! foszfát és 100 mmél/l nátriumklorid összetételű oldatot' használunk, amelynek kémhatása pH 6,5 (95 % D>O};
az 5A ábrán az (1)-(9} képietű vegyületek keverékének FK8P jelenlétében kis gradiens erősség alkalmazásával felvett diffúziós szűrt spektruma látható, az 58 ábrán az (1)-(9} képietű vegyületek keverékének FK8F jelenlétében nagy gradiens erősség alkalmazásával felvett diffúziós szűrt spektruma látható-, a 5C ábrán az. 58 ábrából az 5A ábra kivonásával előállított diffúziós spektrum látható, az 50 ábrán az (1)-(9) képietű vegyületek keverékének kis gradiens erősség alkalmazásával felvett diffúziós szűrt spektruma látható, az 5E ábrán az SC ábrából az 50 ábra kivonásával előállított diffúziós spektrum látható és az 5F ábrán az (1) képietű vegyület Önmagában
ΙΟ ** felvett referencíaspekíruma látható; a kísérletekben a nagy és kis gradiens erősség rendre 3 Gauss/cm és 48 Gauss/cm érieknek felel meg; a nagy gradíenserősség a mintaben visszamaradó HDO jel eltávolítására alkalmas; 300 ms diffúzió késleltetési Időt használunk, minden vegyület koncentrációja 100 gmól/l, az FKSP koncentrációja 5Ö jimól/l és pufféiként §0 mmől/l foszfát és WO mmöi/l nátriumklorid összetételű oldatot használunk, amelynek kémhatása pH 6,5 (95 % QsO):
a 6A ábrán a (2)-(9} képletű vegyületek keverékének FKSP jelenlétében kis gradiens erősség alkalmazásával felvett diffúziós szűrt spektruma látható, a 68 ábrán a (2)-(9} képletű vegyületek keverékének FK8P jelenlétében nagy gradiens erősség alkalmazásával felvett diffúziós szúrt spektruma látható, a 6C ábrán a 6B ábrából a 8A ábra kivonásával előállított diffúziós spektrum látható, a 8D ábrán a (2)-(9} képletű vegyületek keverékének kis gradlanserősség alkalmazásával felvett diffúziós szűrt spektruma látható és a 6E ábrán a 6C ábrából a 6D ábra kivonáséval előállított diffúziós spektrum látható; a kísérletekben a kis és nagy gradlensarősség rendre 3 Gauss/cm, Illetve 48 Gauss/cm értéknek felel meg; a gradiens erősség a mintában visszamaradó HDÖ jel eltávolítására alkalmas; 300 ms diffúziós késleltetési időt használunk, minden vegyülel koncentrációja WO μηιόΙ/Ί, az FKSP koncentrációja 50 pmói/l és puffer kent 50 mmól/l foszfát, WÖ mmől/l nátríum-kloríd összetételű oldatot használunk, amelynek kémhatása pH 6,5 (95 % OsÖ).
Találmányunk gyors és hatékony szkrinelésí eljárást biztosít gyógyhatású céímölekulákhoz kötődé llgandumok azonosítására.
A llgand untokat a célmolekulához (például fehérjéhez, nukieínsavhoz) való kötődésének vizsgálatával azonosítjuk mágneses magrezonancia (MMR) spektroszkópiával követve a lígandum rezonanciák kiterjedésében vagy diffúziós sebességében bekövetkező változásokat a célvsgyölet adagolása közben. A ezkrínelt molekulákat olyan vegyületek közül választjuk ki, amelyek a legtöbb gyógyszerváíialaffől és egyetemi laboratóriumtól folyamatosan beszerezhetők.
A ligandumok közötti szerkazet/aktívitás összefüggéssel kapcsolatos információk azonosítására olyan eljárást használunk, amellyel e célmolekula Ugandáméiként szolgáló új hatóanyagok tervezhetők. Például, ha egy adott célmolekulához két vagy több lígandumot azonosítunk, akkor Hgandemck a cékmolekulával komplexet képeznek, A ligandumok: egymással és a eélmolekuíával szemben mutatott térbeli orientációja a szerkezeti adatokból következik. A térbeli orientáció meghatározza a két ligandum kötődési helyeinek távolságát és az egyes Ogandumok ezen helyekkel szembeni önentáclA térbeli orientációs adatok alkalmazásával a két vagy több Hgandumot ezután egymáshoz kapcsoljuk és egy új .lígandumot hozunk létre. A kapcsolást úgy végezzük, hogy a ligandumok egymással és a célmolekulával szembeni térbeli orientációja megmaradjon.
A találmányunk szerinti W-MMR alapú kutatási eljárásnak számos előnye van. Először is, mivel a találmányunk szerinti eljárásban a ligandumok közvetlenül a célmoiekuláhaz való kötődés mérésével azonosíthatók, a hamis pozitívok problémája jelentősen csökKen.
Másodszor, a hamis negatívok problémája is jelentősen csökken, mivel a találmányunk szerinti eljárással olyan vegyületeket azoX « Φ* « « X « * « ν « e η * « * « * « » ♦ * ♦ «·♦ nősítünk, amelyek a célmciekulához széles dlsszocláoiés állandó tartományban .specifikusan kötődnek.
Harmadszor, a találmányunk szerinti megoldásban nincs szükség kis molfőmegű (<4G kDa) ÍSN-jelzefí fehérjékre, amelyek nagy koncentrációban stabilak, szemben a ÍSNPH korrelációs spektroszkópia alkalmazásán alapuló eljárásokkal.
Negyedszer, az a lehetőség, hogy a hatóanyagok az ismert kémiai eitolódásök összehasonlításával közvetlenül a vegyületek keverékében azonosíthatók, jelentősen csökkenti a célmoíekulához kötődő hatóanyagok szkrlnelésének és azonosításának Időtartamát,
Mivel a potenciális llgandumok jeleit a célmolekulához, való kötődésüket detektálása céljából rögzítjük, a célmolekutáhöz egyidejűleg kötődő két vagy több ligandum azonosítható. A különböző llgandumok kötődési helyeinek egyidejű azonosítása a szakember számára a következő lehetőségeket nyújtja:
1} a llgandumok közötti negatív és pozitív kooperációs kötődés meghatározása és
2} új hatóanyagok tervezése egyetlen vegyületben két vagy több ligandum egyetlen vegyülefté való összekapcsolásával, ahol a lígandumok egymással és kötődési helyeikkel szembeni orientációja fennmarad.
Ezen lég fontosabb megvalósítási mód szerint találmányunkkal vegyület szknnelést eljárást biztosítunk meghatározott specifikus céfmoleküiákhoz kötődő ilgandumok azonosítására. Az eljárás a kővetkező lépéseket tartalmazza;
a) felvesszük egy vegyület vagy vegyületkeverék első egydimenziós T2- vagy diffúziós szűrt protonspektrumát;
» < » * » * ♦ » » 9 9 « V « 9 9 9.
Μ 9 » * X 9 ♦ 9 < 9 « -» X * *
b) a vegyületet vagy a vegyületek keverékét sgy célmolakúiéval hozzuk érintkezésbe;
c) felvesszük a cétmalekuiával a b) pont szerint érintkeztetett vegyület vagy vegyületkeverék sgy második egydimenziós T2- vagy diffúziós szőrt prolonspektramáí ás dj összehasonlítjuk s fenti első és második egydimenziós T2vagy diffúziós szűrt spektrumot az első és második spektrum közötti különbségek meghatározására, ahol a különbségek azonosítják azt az egy vagy több vegyületet, amelyek Ugandámként kötődtek a; cél· molekulához.
Amikor a találmányunk szerinti eljárás b) lépésében egynél több vegyületet szknnelőnk és a spektrumokban különbség mutatkozik, a hatóanyag a céhnoletetát nem tartalmazó keverékben lévő vegyületek kémiai eltolódásának előzetes Ismeretében azonosítható. Ezen in formáció hiányában további lépéseket végzünk annak meghatározására, hogy melyik vegyület kötődik a eélmolekulához. Ezek a további lépések a következők:
e) felvesszük a keverékben lévő: mindegyik vegyület első egydimenziós T2- vagy diffúziós szűrt protonspektrumáí;
f) a keverék mindegyik vegyületét egyenként érintkezésbe hozzuk a célmolekulával;
g) felvesszük a eéfmölskuiával érintkezésbe hozott egyes vegyületek második egydimenziós Ta- vagy diffúziós szőrt protonspektrurnát; és
h) mindegyik felvett spektrumot összehasonlítjuk az első spektrumokkal és meghatározzuk az összehasonlított spektrumok közötti különbségeket - amennyiben vannak Ilyenek és a különöséChem gsk segítségével azonosítjuk azokat a vegyületeket, amelyek ligándómként kötődnek a célmolskulához.
A találmányunk szerinti eljárásban bármilyen célmoíakula használható., azzal a megkötéssel, begy a oélmolekula a vizsgált vegyületeknél lényegesen nagyobb, ezáltal a oélmolekuláboz való kötődés hatására a vizsgáit vegyölet kiterjedése és diffúziós sebessége nagy mértékben megváltozik, A fehérjék győgyszerkémiai jelentőségénél fogva előnyős célmolekuiák a polipeptfdek. Egy előnyös megvalósítási mód szerint a célmolekula egy 5 kOa-nél nagyobb molekulatömegö poiipeptid.
A találmányunk szerinti szkrineiési eljárás során előszór felvesszük vagy beszerezzük a vegyölet vagy a vegyületek keverékének Ϊ2 szűrt vagy diffúziós szűrt egydimenziós protonspektrumát. A Tz szűrt vagy diffúziós szűrt egydimenziós protonspektrumok előállítása a szakirodalomban jól Ismert jMeiboom S. és GUI, 0,: Rév, Sói. instrum, 29, 688 (1958), Gibbs, SJ. és Johnson C.S., Jr.: j. Magn. Reson, 93, 395-4Ö2 (1991) és Altierl, A.S. és munkatársai: J. Am. oc. 117, 7586-7567 (1995)1.
A nagyszámú vegyölet NMR adatainak meghatározásához (például szintetikus vagy természetben előforduló kismolekulájő szerves vegyületek adatbázisa) egy mintacserélőt alkalmazunk. A mintaoseréiö alkalmazásával összesen 60 minta futtatható segítség nélkül. így a szokásos felvételi paraméterek alkalmazásával 1128 be120 spektrum vehető oívasás/szabad Indukciós csillapodás (i fel 24 óra alatt.
Az NMR adatok feldolgozása során számítógépes programot használunk a többszörös egydimenziós H-MR adatok átadására és automatikus feldolgozására.
φ φ φ ** φ»
A vegyületek jellemző egydimenziós Tg szűrt spektruma az 1A ábrán látható. A vegyületek keverékének jellemző egydimenziós diffúziós szűrt spektruma a 2A ábrán látható.
Az első spektrum felvétele után a jelzett celmoiakulát egy vagy több vizsgálati vegyülettel hozzuk érintkezésbe. Amikor egyidejűleg egynél főbb vegyületet vizsgálunk, előnyösen a vegyületek főbb kis molekulái magábafoglaló adatbázisát használjuk. Ezek a molekulák jellemzően előzőleg deuterált dlmetllszulfoxidban oldódnak. Az adatbázisban lévő vegyületek a kereskedelemben beszerezhetők vagy kívánt módon sfőátiífbatók.
Az egyes vegyületek többek között alapméretűk (molekulatömeg; 100 és 300 között) és molekuláris eltéréseik alapján választhatók ki. A gyűjtemény vegyületel különböző alakúak lehetnek (például sík aromás gyűrő(k), hajlított alifás gyűrőjk}, egyes, kettős vagy hármas kötéseket tartalmazó egyenes és elágazó láncú alifás vegyüfetekj és különböző funkciós csoportokat (például karbonsav-, észter-, éter-, amin-, aldehid-, keton csoportokat és különböző heterociklusos gyűrűket) tartalmazhatnak, ezáltal maximálisan kibővítve a legkülönbözőbb kötődési helyekkel kölcsönhatásba lepő vegyületek lehetséges körét.
A találmányunk szerinti HME spektroszkóplás szkrinelési eljárásban a llgandumot körülbelül öfÖ5 mmói/1 ás körülbelül 1,0 mmói/l közötti koncentrációban használjuk. A savas vagy bázisos vegyületek ilyen koncentrációja a puff ereit íehérjeoldaiok pH-ját jelentősen megváltoztathatja. A kémiai eltolódások érzékenyek a pH változásokra, valamint a közvetlen kötési kölcsönhatásokra, ezért ,hamis pozitív kémiai eltolódás változások figyelhetők meg, amelyeket a pH változása és nem a figandom okoz. Ezért biztosítani kell, hogy a pufferolt oldatok ρΗ-ja a lígandum hozzáadásakor na változzon- A pH szabályzásának egyik módját az alábbiakban ismertetjük.
A vegyüieteket 263 K hőmérsékleten tároljuk 1,0 mbl/l-es ás 0,1 mől/l-es dímetilszultoxldos (DM.SÖ) torzsoídatokban. Erre azért van szükség, mivel a ligandumok vizes oldatban korlátozottan oldódnak. A dlmetilszulfoxldos oldatban a pH közvetlenül nem állítható be. Ráadásul a sósav és a nátrlum-hldroxld dimetllszulfoxidban oldhatatlan sókat alkot, ezért alternatív savakat és bázisokat kell használni. A stabil pH beállítására a következő megoldásokat találtuk alkalmasnak.
Az 1,0 mobl-as dímetilszulfoxídos törzsoldatot 30 mmól/l-es foszfát oldattal 1: 10 arányban hígítjuk pH 7 értéken. Meghatározzuk a hígított alikvot oldatok piH-jéí. Ha az alikvot oldat pK-ja változatlan (azaz 7,0 maradj, a dimeblszulfoxldos iörzsoidatot 1:10 aranyban hígítva munkaoldatot állítunk elő a 0,1 mél/i koncentrációjú oldat előállítására, és ezt az oldatot tároljuk.
Ha a hígított alikvot oldat ρΗ-ja kisebb, mint 7,0, az 1,0 mót/i-es örrneliíszoííoxídos törzsoldathoz etanol-amint adunk, ezt a törzsoldatot ezután 1:10 arányban foszfétpuíferrsl hígítjuk egy újabb alikvot oldat előállítására, és az alikvot oldat pH-ját Ismét ellenőrizzük.
Ha a hígított alikvot oldat ρΗ-ja 7,0-nél nagyobb, az 1,0 möl/l-es dlmetilszulfoxídos törzsoldafhoz ecetsavat adunk, ezt a iörzsoidatot ezután 1;W arányban foszfátpufferrel hígítjuk egy újabb alikvot oldat előállítására, és az alikvot oldat pH-ját Ismét ellenőrizzük.
Az etanoi-amm és az ecetsav dímeillszeiíoxidban oldódik, megfelelő ekvivalens mennyiségeket adagolunk annak biztosítására,
X * * ♦♦ 0 * hogy a vizes pufferoldat adagolása közben a pH változatlan maradjon. A pH beállítása egy olyan kölcsönhatáson alapuló eljárás, amelyet a kívánt eredmény eléréséig ismételünk.
Felhívjuk a figyelmet, hogy ezt az eljárást ez 4,ö mól/l-as tőrzsoldatok <100 mmól/l íígandumj 1::10 arányú hígításaival végezzük annak biztosítására, hogy a kísérletekben (0,1 mmöl/'l és íö mmol/i közötti koncentráció) vagy küienbözö/gyenge puffer rendszerekben használt kisebb koncentrációknál pH változás ne legyen észlelhető.
A vizsgáit vegyületek ás a céímolekula árlntkezteíése után előállítjuk a második egydimenziós TH vagy diffúziós szűrt spektrumot. A Ts-szűrésen alapuló megvalósítási módnál a második spektrumot a fentivel azonos módon állítjuk elő. Ezután az első és második .spektrumokat összehasonlítjuk annak meghatározására, hogy a két .spajktrum között mutatkozik-e· különbség. Az egydimenziós T?. szűrt spektrumok közötti különbségek: azt mutatják, hogy a Ugandám a céímelekuíához kötődik. A különbségeket a szakirodalomban jól Ismert szokásos eljárások alkalmazásával határozzuk meg, A diffúziós szúrt eljárás esetén a második spektrumot úgy állítjuk elő, hogy a kis ás nagy gradienserősségek közötti spektrum különbségeket vizsgáljuk - így választjuk ki azokat a vegyületeket, amelyek diffúziós sebessége összehasonlítható: a céímolekula nélkül megfígyelttel.
Például: az I. ábrán látható a vizsgált vegyületek keverékének különböző oélmolekulákkal való áríntkezfeíése előtt és után felvett egydimenziós Te szűrt spektruma és ezt követően a hatásos vegyület azonosítása. Ezeket a vizsgálatokat részletesen Ismertetjük az 1. oé Idában.
XV* ««« « * ν * X w««
X* X» X
Szintén példaként mutatjuk be a 2. ábrát, amelyen a vizsgált vegyületek keverékének különböző oéímolekulákkaí való éríntkeztelése előtt és után felvett egydimenziós diffúziós szűrt spektruménak összehasonlítása és- ezt követően a hatásos vegyület azonosítása látható. Ezen vizsgálatokat részletesen ismertetjük a 2. példában.
A fehérjéhez kötődő további molekulák .kutatása során a molekulákat a szerkezet/aktivitás összefüggésen alapuló vizsgálatokhoz
| a kezdeti szkrlnelésból | választjuk, | és- a kezdeti szerkezeti i | nformácí- |
| őt a fehérjéhez való k | ötödésnél h | átárazzuk. meg,. Például | a kezdeti |
| szk rí n s lés ereömények | éppen olya? | / iigandumokat azonosító | nk, ame- |
| lyek mindegyike aroma | s gyűrűt tartalmaz, Ezután a szkrinel | és máso- | |
| dik körében vizsgálati rt ά h 5 π k | vegyül síké? | R más aromás molekulái | lat hasz- |
| í < va U ' 5 ÍV.· Gyógyszeíkémíz | ?! jelentőség | ók következtében ezen a | ijárásöan |
| céímolekuiaként előnyt | lsen polipé | ptldet használunk. Egyik | előnyös |
| megvalósítási mód szei | int a ligand | um sélmo-lekuiához való 1 | őtödésát |
| egy második íigantíum | jelenlétébe | n detektáljuk. Ezen meg\ | '‘alósitasi |
| mód szerint a célmölek | ulát ezen m | ásodik Ugandámhoz kötjü | <, mielőtt |
| a céimolskuláf a vizsga | It vegyűlettoi érlntkeztetjük. | ||
| A. spektrumok fr | elvétele és | össze hasonlítása során a | lönyösen |
| a fent említettel azonos | céiíTiO lekül | ákai használunk, | |
| A tervezési el ja | 'ás első lépése az adott céímolekulái | wz kötő- | |
| dó két vagy több ligandum azonos! | fása. A íigandumok azonosítását a | ||
| fent Ismertetett módos | i végezzük | egydimenziós T? vagy | diffÜZlÓS |
| szűrt spektroszkópia all | caimazásáv; | 3l. | |
| .Miután két vagy | több olyan | ligandumot azonosítunk, | amelyek |
| a célmolekula különbőz | ö helyein k | ötödnek, előállítjuk a cél | molekula |
és a íigandumok közötti komplexet. Ahol kél Hgandum van, a komplex > χ· x <
egy hármas komplex. Ahol három vagy több ligandum van négyes és további komplexek képződnek,
A komplexeket a célmolekula és a különböző llgandumok egyidejű vagy egymást követő összekeverésével állítjuk elő olyan körülmények között, amelyek között a llgandumok a célhoz kötődhetnek, Ezen körülmények meghatározása a szakirodalomban jól ismert.
A komplex előállítása után meghatározzuk a szerkezeti adatokat, Bármilyen, a szerkezeti adatok meghatározására alkalmas módszer használható, Ezek az eljárások a szakirodalomban jól ismertek. ilyen eljárások például az NMR és röntgensugár krlstailográfia,
A szerkezeti adatok analízisével meghatározható a llgandumok egymással szembeni térbeli orientációja, továbbá a cáimoíekuia. konformációja. Először Is, az egyes ligandumoknak a célmoiekulávai szembeni térbeli orientációja lehetővé feszi a lígandomok a kötésben közvetlenül részt vevő részének (azaz a célmolekula kötődési helyével kölcsönhatásba lépő részek), az egyes llgandumok kötődési helytől távolabb kerülő részének, továbbá egy kővetkező kötési eljárásban használható részeinek azonosítását
Másodszor, a térbeli orientációs adatok felhasználhatók a llgandumok egymáshoz viszonyított helyzetének feltérképezésére. Más szóval kiszámíthatok a térben orientált llgandumok közötti távolHarmadszor, a térbeli orientációs adatok meghatározzák a llgandumok és a cél közötti háromdimenziós kapcsolatokat. Ennek megfelelően a llgandumok közötti abszolút távolságok kiszámítása mellett meghatározható a llgandumok főbb orientációja is, * *♦
A ügandumok és a cél tárbeli orientációjának ismerete fel· ználhatö az összekötók kiválasztására, amelyekkel két vagy több ligandum egyetlen, az összes ligandomot tartalmazó egységgé sesothaiő. Az összekötök tervezése az egyetlen egység egyes Hgandumalnák a célmolekuiával szembeni megfelelő orientációjának fenntartásához szükséges távolságokon és szőgorlentáción alapul.
A megfelelő összekötők háromdimenziós, konformációja a szakterületen járatos személy számára jól Ismert vagy könnyen meghatározható, Habár két vagy több ligandum elméletileg bármilyen távolság- és háromdimenziós leképzés tartományban összekapcsolható, a gyakorlatban bizonyos tévolseghell és leképzésben határok előnyösek. Egy előnyös megvalósítási mód szerint a lígandumokat körülbelül 15 Á, előnyösebben kevesebb mint körülbelül 10 A és még előnyösebben kevesebb mint körülbelül § Á távolság alapján vátjux meg.
A megfelelő összekötöosoport azonosítása után a ligsndemokat összekötjük az összekötővel. A lígandumok összekötésének módszerei a szakirodalomban jól Ismertek és függnek a ligandum és az összekötő csoport kémiai szerkezetétől. A llgandumok egymáshoz való kötésekor a ligandum azon részeit használjuk, amelyek a célmolekulával való kötődésben közvetlenül nem vesznek részt.
Találmányunk előnyös megvalósítási módjait az alábbi példákban Ismertetjük, azonban: találmányunk oltalmi körét nem korlátozzuk ezekre.
1. Példa letek szkrínelése Tz-szűrt
Rekombínáns humán FK kötőproteint (PK8P) állítunk elő a szakirodalomban ismert módon [Logan és munkatársai: d. Moh. Siói., 235, 637-648 (1994)].
A potenciális ligandumok célmolekuia jelenlétében mutatott iranszverz (Ta) relaxációs sebességváltozásának meghatározására pulzálö szekvenciaként yeiboom, S. és OBI, D. által. Ismertetett CarrPurcell-Meiboom-Giil (CPMG) szekvenciát használjuk fMeíboem, S. és GIH, ö,: Rév,Sói. ínstrum, 29, 688 (1958)].
Találmányunkban azt használjuk ki, hogy az oldatban lassan forgó nagymolekulák vagy mmlekulakomplexek transzverz (Ta) relaxációs Ideje fövidebb, mint az oldatban gyorsan forgó klsmolekutáé, Ez a szakirodalomban jól ismert. így a kismolekulák transzverz ÍT?) relaxációs ideje a célmolekulához kötött állapotban megváltozik
Ezt az 1A-1E ábrákon mutatjuk be az (1) vegyüleínek az FKSP~bez való kötése eseten, ahol az FKBP-hez való kötődés affinitása 200 umól/l. Az 1A ábrán egy GPMG szekvenciát 200 ms spinioek idővel alkalmazunk a vegyübten FK8P távoílétében. Mivel az oldatban a szabad kismolekulák transzverz relaxációsa általában szekundum na
I, a spin-loek idő alatt a rslaxáció elhanyagolható és a szabad tlgandumok jele figyelhető meg. Azonban PKBP jelenlétében a spin-bek Idő után a ílgandum jelek jelentősen lecsökkennek és a spektrumban csak a visszamaradó protein ás ligaadum csúcsok maradnak megy ahogy ez az 13 ábrán látható. Ezek a különbségek közvetlen vizsgálattal vagy spektrum kivonási eljárással Is detektálhatok, amelynek során az FKSP önmagában felvett spektrumát [spin Iock után, lásd 1C ábra) kivonjuk a vegyület FKSP Jelenlétében felvett spektrumából [szintén soin-lock után, lásd IS ábra]., az ennek eredményeképpen előállított spektrum az 1D ábrán látható. Ez a spektrum csak a visszamaradó ligandum csúcsokat tartalmazza, amelyek intenzitása kívánt esetben tovább csökkenthete hosszabb spin-iock idők alkalmazásával, Ezt a spektrumét (1D ábra) kivonjak a vizsgált vegyület Önmagában felvett spektrumából (1A ábra), az ennek eredményeként kapott spektrum az 1E ábrán látható, A különbségi spektrumban lévő pozitív csúcsok a vegyület célfehérje távolIáiéban mutatott kémiai eltolódásainak felelnek meg, ahogy ez az 1A ábra és az 1E ábra összehasonlításából látható, a negatív csúcsok az FKSP-hez kötött vegyület kémiai eltolódásainak felelnek meg. Ez az információ a hatóanyag azonosítására használható.
Ugyanez a vizsgálat elvégezhető a vegyüietek keverékével is. Ebben a kísérletben az FK8P~hez nem kötődő (2)-(9) vegyületeket, az (t) vegyüiettei keverjük össze, A 2A-2C ábrákon a vegyüietek FKSP távollétében (2Α ábra), FKSP jelenlétében (28 ábra) felvett és az EKBP önmagában felvett (2C ábra) Tz-szürt spektruma látható. A 20 ábrán látható spektrumot a. 2C ábrának a 28 ábrából való kivonásával állítjuk elő, ez a ligandumok fehérje jelenlétében mutatott rezonanciáit tartalmazza. A 2E ábrán lévő spektrumot a 2D ábrának a 2A ábrából való kivonásával állítjuk elő, az ezen látható pozitív csúcsok az (1) vegyület FKBP távoliétében jelentkező rezonanciáinak feleinek meg, ahogy ez a 2F ábrán bemutatott referencia spektrumban látható, A 2E ábrán bemutatott kémiai eltolódás értékeket nem csak a fehérjéhez kötődő ligandum jelenlétének detektálására használjuk, hanem felhasználhatjuk annak azonosítására is, hogy a vegyölstkeverékben melyik vegyület kötődik, feltéve hogy a szabad ligandumok kémiai eltolódás értékel eredendően ismertek, φ
* X φ *>·* X ♦ ΛΦ X * Φ ΦΦΦ
ΊΛ*
A 3Α-3Ε ábrákon egy hasonló kisérletsorszat látható, az FK8P-hez nem kötődő (2)-(9) képletű vegyűletek keverékével. A 3E ábrán bemutatott különbségi spektrumban nem figyelhető meg pozitív abszorpciós ligandum rezonancia, ami azt mutatja, hogy FKBP-hez kötődő ligandum nincs jelen.
2. Példa nos
A célmolekuia jelenlétében a potenciális ligandumok diffúziós sebesség változásának kimutatására a Gibbs, S. d,, és Johnson, C.S. dr. jd, Magn. Reson, 93, 395-402 (1991}) és Altiért, A.S. és munkatársai íd.Am. Chem. Soc,, 117, 7566-756? (1995)1 által Ismertetett
UIZUS szekvenciát alkalmazzuk.
A találmányunk szerinti megoldás azon alapul, hogy a klsmolekulák oldatban gyorsabban dlfíundálnsk, mint a nagymolekulák. Ez a szakirodalomban jól ismert, A találmányunk szerinti megoldás lényege, hogy egy kis molekula, amely normális esetben szabadon gyorsan díffundái oldatban, sokkal lassabban diffundál egy nagy célmoiekulához kötve. Ezért a kismolekula diffúziós sebessége változni fog (csökken), ha egy célmoiekulához kötődik.
A 4. ábrán a diffúziós szűrők ligandum kötődés detektálására való alkalmazását mutatjuk be FKSP-hez kőtődő (1) vegyület esetében. Először is, a 4A és 48 ábrán az (1) vegyűletet tartalmazó minta FKSP jelenlétében rendre gyenge és erős gradienserősségnél felvett diffúziós szűrt spektruma látható, Ezeket a spektrumokat egymásból kivonva állítjuk elő a 4C ábrán látható spektrumot. Ez a spektrum az (1) vegyület maradék ligandum rezonanciáit tartalmazza. Ezt a spektrumot ezután kivonjuk az (1) vegyület önmagában felvett referencia * * Φ X * * «ΦΦ Φ > Χν» * * * « ** ΦΦ Φ Φ* spektrumából (gyenge gradiens után, lásd 4D ábra), így nyerjük a fehérjéhez kötődő ilgandum: rezonanciáit tartalmazó spektrumot <4£ ábra). A T2 szőrt kísértetekhez hasonlóan a 4E ábrán a pozitív csúcsok a ligandumnak a fehérje távolléteben mutatott kémiai eltolódásainak felelnek meg és a negatív csúcsok ez FKSP-hsz kötött vegyölet kémiai eltolódásainak felelnek meg, Ez az Információ felhasználható a hatóanyag azonosítására.
Hasonló kísértetek végezhetők a vegyületek keverékeivel. Ezekben a kisérletekben a (2)-(3) vegyületeket, amelyekről ismeretes, hogy nem kötődnek az PKBP-hez, összekeverjük az (1) képletö vegyülettel. Az. 5A. és 58 ábrán ezen vegyületek keverékének spektruma fátható FK8F jelenlétében rendre gyenge és erős gradienserősség után. Ezen spektrumok különbségéből állítjuk elő az §C ábrán látható spektrumot. Ezen spektrumból kivonjuk a Irgandumok FKBP jelenlétében felvett kontroll spektrumát (gyenge gradiens után, lásd 50 ábra), így nyerjük az $E ábrán látható spektrumot, amelyen az (1) képletö vegyölet FK8P távoliétében felvett (5F ábra) spektrumán található kémiai eltolódás értékeknél pozitív rezonanciát mutat. Az 5E ábrán lévő kémiai eltolódás értékek nemcsak a fehérjéhez kötődő Iígandum jelenlétének detektálására használhatók, hanem annak azonosítására is, hogy a vegyüSetkeverékben melyik vegyulet kötődik, feltéve, hogy a szabad Iígandum kémiai eltolódás értekei eredendően Ismertek,
A 6. ábrán egy hasonló kísérletsorozat látható, amely az FKBP-hez nem^ kötődő (2)-(3) vegyulet keverékén alapul, A 6E ábrán látható, hogy a különbségi spektrumban pozitív iígandum rezonancia nem figyelhető meg, ami azt mutatja, hogy egyik Iígandum sem kötődik az FK8P-bez, φ* φφ· φ * φφφ « φ ♦ »κ φφφ « φ φφφ
Φ φ « Φ ν φ Φ φ
Minden NMR spektrumot 300 Κ értéken veszünk fel Bróker AMXSÖÖ NMR spektrométeren, A spektrum felvétel adatai: 256 sean profon eltérítés szélessége („sweep widliO 8333.3 Hz és proton 80* pulzushossz 7 ps. A Ta-szört vizsgalatoknál a spin-lock Idő 200 ms, spin-visszhangé késleltetés 1 ms, {„spin-eohe delay”), A gradiens szűrt spektrumok esetében a kis és nagy gradienserősség rendre 3 Gauss/em és 48 Gauss/cm és a diffúzió késleltetési idő 300 ms, A ligandumok koncentrációja minden kísérletben 100 pmol/l, az FK8P koncentrációja 50 pmól/i és pufféiként 50 mmól/l foszfát, 100 mmól/l náfrium-klorid összetételű oldatot használunk, amelynek kémhatása pH 6,5 (95 % O2O). Az NMR adatokat Silicon Graphics komputerrel dolgozzuk fel és analizáljuk.
Találmányunk nem korlátozódik a fenti példákra, és kiterjed az olyan nagy affinitásó ligandumok tervezési eljárására is, amelyben a fenti példái össze.
bemutatott legalább két
OH
Hgandum kapcsolódik
Kp (m^)a
0.2 >10 >10 >18 >10
» Az (1) képietü vegyület Ke értékét Shuker, 5, és munkatársai határoztak meg (Science, 274, 1531-1534 (1998)]« a (2)-(3} vegyületek megfelelő értékeit az FKBP i5N~HSQC spektrumén nem mutatkozó kémiai eltolódás változás alapján határozzuk meg 1,0 mmól/l vegyület koncentráció értéknél a fenti referenciában Ismertetett módon,
Claims (15)
1. Eljárás vegyületek szkrínelésére, amelynek során olyan vegyületeket azonosítunk, amelyek egy speciális eéímolekulához Itgandomként kötődnek, azzal jellemezve, hogy az alábbi lépéseket hajtjuk végre;
aj felvesszük egy vegyület vagy vegyületkeverék első egydimenziós TV vagy diffúziós szűrt HMR spektrumát;
b) a végyületet vagy a vegyületek keverékét érintkezésbe hozzuk egy cél molekulával:
ej felvesszük a b) lépés szerinti célmölekuíával történő érintkeztetéskor az említett vegyület vagy az említett vegyületkeverék egy második egydimenziós T?- vagy diffúziós szűrt NMR spektrumát és
d) összehasonlítjuk a fenti első és második egydimenziós T2vagy diffúziós szűrt NMR spektrumokat az említett első és második NMR spektrum közötti különbségek meghatározására, és a különbségek alapján azonosítjuk az említett vegyület vagy vegyületkeverék közül rendre annak az egy vagy több vsgyületnek a jelenlétét, amely Ugandámként kötődik a céteotekolához,
2. Az í. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a bj lépésben vegyületkeveréket használunk, továbbá a dj lépés után az alábbi lépéseket hajtjuk végre:
e) felvesszük a keverékben lévő egyes vegyületek első egydimenziós T2- vagy diffúziós szűrt NMR spektrumát;
t) a keverék mindegyik vegyületét egyenként érintkezésbe hozzuk 2 célmölekuíával:
2S
g) az f) lépés szerinti célmolekulával történő érlntkeztetéskor felvesszük mindegyik vegyidet második egydimenziós Ts- vagy diffúziós szőri NMR spektrumát; és bj a g) lépésben felvett egyes fOR spektrumokét összehasonlítjuk az első NMR .spektrumokkal, meghatározzuk az összehasonlított HMR spektrumok bármelyike közötti különbségeket és a különbségek segítségévei azonosítjuk azokat a vegyületeket, amelyek Ugandámként kötődnek a célmoiekulához.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az aj lépés előtt a célmolekulát egy második Ugandámhoz kötjük,
4. Az 1, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az szkrínelt vegyületeket különböző kísmolekutájú vegyületek csoportjából választjuk.
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a célmotekulát peptidek közöl választjuk.
S. Az 5, igénypont szerinti eljárás, ezzel jellemezve, hogy a poíipeptidet enzim vagy receptor közül választjuk,
?. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy célmοIekuIakéηI pοIinuk 1 e 1 nsavaI váIasztunk.
8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy jelöletlen célmolekulát használunk.
9, Eljárás egy célmoiekulához nagy affinitással kötődő iigandom előállítására, azzal jellemezve, hogy aj a célmoiekulához egy első lígandumot azonosítunk egydimenziós T?- vagy diffúziós szűrt HMR spektroszkópiával, az 1. igénypont szerinti eljárás alkalmazásával;
b) a célmoiekulához egy vagy több további lígandumot azonosítunk egydimenziós T.?- vagy diffúziós szőrt HMR spektroszkópiával;
ej az első azonosított Ügandumot és az egy vagy több további azonosított Ugandumot a cétmotekufavaí komplex-szó alakítjuk:
d) meghatározzuk a komplex legalább azon részének háromdimenziós szerkezetet, ahol az első és az egy vagy több további Ugandám a céimolekuíához kötődik, ezáltal meghatározzuk az első és egy vagy főbb további ligandum térbeli orientációját a céimolekulán és
e) elöádUjuk a nagy afflnítású Ugandumot, amelyben az egy vagy több további líganbumot égy kapcsoljuk össze, hogy a d) lépésben meghatározott térbeli orientáció megmarad.
iö. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy célmolekulaként poltpeptidat választunk.
11. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy jelöletlen célmolekula? használunk.
12. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Ugandámét és az egy vagy több további Ugandumot konvergens vagy lineáris szerves szintézissel kapcsoljuk össze a nagy affinitásé t lg and u m el öál 11 fás ára.
13. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy nagy affinitásé Ugandám gyógyászafilag hatásos szerkezeti részt képez.
14. A S. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az első és egy vagy több további ligandemot különböző kis molekulák c s ο p o r t j á hót v á I a sz f j u k.
15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kis molekulákat egy vegyületcsopsrtból választjuk.
18. A 9, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a komplex előállítása során az első és az agy vagy több további ligandumot és a oélvegyűíetet oldatban összekeverjük.
17.. Az 18, .igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oldatban képződő komplex hasonló v.a-gy azonos azzal a komplexszel, ami a Ugandámból vagy az egy vagy több további llgandumból fiziológiás körülmények között képződik.
1S. A 9. igénypont szerinti eljárás, ezzel jellemezve, hogy a következő további lépéseket hajtjuk végre:
tj az említett összehasonlítást egy olyan vegyület azonosítására használjuk, amely az említett eélvegyűtet liganduma, és gj előállítjuk az említett vegyületet.
ÍS. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az aj lépés előtt egy lépésben kiválasztunk egy célmoíekuláí, amely a gyógyszerkémial területén jelentős biológiai hatást mutat; és az ej lépés után egy lépésben előállítunk egy vegyületet, amelynek szerkezetét úgy alakítjuk ki, hogy az első és a további azonosított ligandumok összekapcsolása során a d) tépésben meghatározott térbeli orientáció fennmarad.
20. A 18. vagy 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy célmolekulaként egy poiipeplIdet használunk.
21. A 20. Igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy 5 kOa-nál nagyobb molekulatömegü poíípepfídet használunk.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/844,124 US6043024A (en) | 1997-04-18 | 1997-04-18 | Use of one-dimensional nuclear magnetic resonance to identify ligands to target biomolecules |
| PCT/US1998/007907 WO1998048264A1 (en) | 1997-04-18 | 1998-04-17 | Use of one-dimensional nuclear magnetic resonance to identify ligands to target biomolecules |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP0003956A2 HUP0003956A2 (en) | 2001-03-28 |
| HUP0003956A3 HUP0003956A3 (en) | 2002-04-29 |
| HU228433B1 true HU228433B1 (en) | 2013-03-28 |
Family
ID=25291882
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0003956A HU228433B1 (en) | 1997-04-18 | 1998-04-17 | Use of one-dimensional nuclear magnetic resonance to identify ligands to target biomolecules |
Country Status (29)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6043024A (hu) |
| EP (1) | EP0975954B2 (hu) |
| JP (1) | JP2002507277A (hu) |
| KR (1) | KR100542420B1 (hu) |
| CN (1) | CN1225648C (hu) |
| AR (1) | AR004651A1 (hu) |
| AT (1) | ATE259061T1 (hu) |
| AU (1) | AU7138098A (hu) |
| BG (1) | BG64326B1 (hu) |
| BR (1) | BR9808079A (hu) |
| CA (1) | CA2286795C (hu) |
| CO (1) | CO5060446A1 (hu) |
| CZ (1) | CZ297275B6 (hu) |
| DE (1) | DE69821475T3 (hu) |
| DK (1) | DK0975954T4 (hu) |
| ES (1) | ES2215296T5 (hu) |
| HK (1) | HK1027158A1 (hu) |
| HU (1) | HU228433B1 (hu) |
| IL (1) | IL131726A0 (hu) |
| NO (1) | NO995078L (hu) |
| NZ (1) | NZ337126A (hu) |
| PL (1) | PL194184B1 (hu) |
| PT (1) | PT975954E (hu) |
| SI (1) | SI0975954T1 (hu) |
| SK (1) | SK285411B6 (hu) |
| TR (1) | TR199902167T2 (hu) |
| TW (1) | TW574502B (hu) |
| WO (1) | WO1998048264A1 (hu) |
| ZA (1) | ZA982919B (hu) |
Families Citing this family (36)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001503646A (ja) * | 1996-03-29 | 2001-03-21 | ローレンス バークレー ナショナル ラボラトリィ | 過分極化希ガス存在下でのｎｍｒまたはｍｒｉの増強 |
| US20030143757A1 (en) * | 1997-06-13 | 2003-07-31 | Jonathan Moore | Methods for identifying drug cores |
| US6111066A (en) | 1997-09-02 | 2000-08-29 | Martek Biosciences Corporation | Peptidic molecules which have been isotopically substituted with 13 C, 15 N and 2 H in the backbone but not in the sidechains |
| US6344330B1 (en) | 1998-03-27 | 2002-02-05 | The Regents Of The University Of California | Pharmacophore recombination for the identification of small molecule drug lead compounds |
| JP2002534687A (ja) * | 1998-12-30 | 2002-10-15 | アメルシャム・パブリック・リミテッド・カンパニー | 過分極を使用したｎｍｒ分光学アッセイ |
| US6333149B1 (en) | 1999-06-04 | 2001-12-25 | Triad Biotechnology, Inc. | NMR-solve method for rapid identification of bi-ligand drug candidates |
| WO2001014886A2 (en) * | 1999-08-23 | 2001-03-01 | Polaris Pharmaceuticals, Inc. | Inhibitors of binding between proteins and macromolecular ligands |
| US6677160B1 (en) | 1999-09-29 | 2004-01-13 | Pharmacia & Upjohn Company | Methods for creating a compound library and identifying lead chemical templates and ligands for target molecules |
| US6764858B2 (en) | 1999-09-29 | 2004-07-20 | Pharmacia & Upjohn Company | Methods for creating a compound library |
| US20010051333A1 (en) * | 2000-04-17 | 2001-12-13 | Pharmacia & Upjohn Company | Nuclear magnetic resonance methods for identifying sites in papillomavirus E2 protein |
| US7146277B2 (en) * | 2000-06-13 | 2006-12-05 | James H. Prestegard | NMR assisted design of high affinity ligands for structurally uncharacterized proteins |
| US20030165431A1 (en) * | 2000-07-13 | 2003-09-04 | The Regents Of The University Of California | Method for detecting macromolecular conformational change and binding information |
| US7061237B2 (en) * | 2000-07-13 | 2006-06-13 | The Regents Of The University Of California | Remote NMR/MRI detection of laser polarized gases |
| EP1320387B1 (en) * | 2000-09-13 | 2012-04-11 | Praecis Pharmaceuticals Incorporated | Pharmaceutical compositions for sustained delivery of peptides |
| AU1106902A (en) | 2000-09-27 | 2002-04-08 | Univ Leiden | Method for applying nmr for ligand discovery or as a drug screening tool |
| CA2432924A1 (en) * | 2000-12-21 | 2002-06-27 | Triad Therapeutics, Inc. | Sea-trosy and related methods |
| GB0031566D0 (en) * | 2000-12-22 | 2001-02-07 | Mets Ometrix | Methods for spectral analysis and their applications |
| US20030092027A1 (en) * | 2001-06-01 | 2003-05-15 | Luciano Mueller | Nuclear magnetic resonance method for identifying ligands to target compounds |
| EP1423427A2 (en) * | 2001-08-27 | 2004-06-02 | Novartis AG | Nogo receptor homologues and their use |
| US7653490B2 (en) | 2001-09-10 | 2010-01-26 | Triad Liquidating Company LLC | Nuclear magnetic resonance assembly of chemical entities |
| US20050221420A1 (en) * | 2001-10-22 | 2005-10-06 | Carmen Barske | Nogo receptor homologues and their use |
| US7037660B2 (en) * | 2001-11-06 | 2006-05-02 | Message Pharmaceuticals | Methods for detecting and quantifying binding and inhibition of binding of species to nucleic acids |
| KR100888805B1 (ko) * | 2002-06-14 | 2009-03-16 | 크리스탈지노믹스(주) | 특정 아미노산이 표지된 단백질과 1ｄ ｎｍｒ 기법을이용하여 단백질의 활성 부위에 결합하는 화합물을검색하는 방법 |
| KR100901309B1 (ko) * | 2002-06-15 | 2009-06-09 | 크리스탈지노믹스(주) | 단백질의 활성 부위에 결합하는 화합물을 선별하는 방법 |
| NO20025738D0 (no) * | 2002-11-29 | 2002-11-29 | Amersham Health As | Metode |
| CA2466792A1 (en) * | 2003-05-16 | 2004-11-16 | Affinium Pharmaceuticals, Inc. | Evaluation of spectra |
| US7595170B2 (en) * | 2004-08-05 | 2009-09-29 | Modrovich Ivan E | Apparatus and method for measuring concentrations of molecules through a barrier |
| US8933209B2 (en) | 2006-04-26 | 2015-01-13 | Abbvie Inc. | Dep2 and its uses in major depressive disorder and other related disorders |
| US20070256148A1 (en) * | 2006-04-26 | 2007-11-01 | Katz David A | DEP2 and its uses in major depressive disorder and other related disorders |
| FR2954830A1 (fr) * | 2009-12-31 | 2011-07-01 | Nmrtec | Methode d'analyse comparative par resonance magnetique nucleaire |
| CA2848520C (en) * | 2011-09-29 | 2019-11-26 | Seattle Genetics, Inc. | Intact mass determination of protein conjugated agent compounds |
| CN102507627B (zh) * | 2011-11-14 | 2014-10-01 | 中国科学院武汉物理与数学研究所 | 一种高通量筛选药物的核磁共振方法 |
| US9678185B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-06-13 | Pepsico, Inc. | Method and apparatus for measuring physico-chemical properties using a nuclear magnetic resonance spectrometer |
| CN104198517B (zh) * | 2014-09-23 | 2017-02-08 | 中国科学院昆明植物研究所 | 联合使用不同核的一维核磁共振混合物定量方法 |
| CN104897826B (zh) * | 2015-06-16 | 2016-06-22 | 广西师范大学 | 一种用于细胞原位检测小分子化合物与靶蛋白相互作用的方法 |
| CN107328804B (zh) * | 2017-07-21 | 2019-02-05 | 中国科学院山西煤炭化学研究所 | 一种甘油加氢反应混合物的核磁共振检测方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4789832A (en) * | 1987-01-14 | 1988-12-06 | Jeol Ltd. | Three-dimensional NMR spectroscopy |
| JPH05503691A (ja) * | 1989-12-29 | 1993-06-17 | ユニバーシティ・テクノロジーズ・インターナショナル・インコーポレイテッド | アゴニストおよびアンタゴニストを含む生物学的に活性なリガンドの３次構造モデルの設計方法およびアンギオテンシンに基づいた新規合成アンタゴニスト |
| US5270163A (en) * | 1990-06-11 | 1993-12-14 | University Research Corporation | Methods for identifying nucleic acid ligands |
| US5698401A (en) * | 1995-11-14 | 1997-12-16 | Abbott Laboratories | Use of nuclear magnetic resonance to identify ligands to target biomolecules |
-
1997
- 1997-04-18 US US08/844,124 patent/US6043024A/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-03-11 TW TW87103594A patent/TW574502B/zh not_active IP Right Cessation
- 1998-04-06 ZA ZA982919A patent/ZA982919B/xx unknown
- 1998-04-15 CO CO98020602A patent/CO5060446A1/es unknown
- 1998-04-17 SI SI9830634T patent/SI0975954T1/xx unknown
- 1998-04-17 CA CA2286795A patent/CA2286795C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-04-17 JP JP54622898A patent/JP2002507277A/ja active Pending
- 1998-04-17 HU HU0003956A patent/HU228433B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1998-04-17 CN CNB988042711A patent/CN1225648C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-04-17 DE DE69821475T patent/DE69821475T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-17 PL PL98336299A patent/PL194184B1/pl unknown
- 1998-04-17 PT PT98918461T patent/PT975954E/pt unknown
- 1998-04-17 BR BR9808079-2A patent/BR9808079A/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-04-17 DK DK98918461T patent/DK0975954T4/da active
- 1998-04-17 AT AT98918461T patent/ATE259061T1/de active
- 1998-04-17 NZ NZ337126A patent/NZ337126A/en not_active IP Right Cessation
- 1998-04-17 ES ES98918461T patent/ES2215296T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-17 TR TR1999/02167T patent/TR199902167T2/xx unknown
- 1998-04-17 IL IL13172698A patent/IL131726A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-04-17 KR KR1019997009544A patent/KR100542420B1/ko active IP Right Grant
- 1998-04-17 EP EP98918461A patent/EP0975954B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-17 WO PCT/US1998/007907 patent/WO1998048264A1/en active IP Right Grant
- 1998-04-17 AU AU71380/98A patent/AU7138098A/en not_active Abandoned
- 1998-04-17 AR ARP980101800A patent/AR004651A1/es unknown
- 1998-04-17 CZ CZ0368399A patent/CZ297275B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-04-17 SK SK1416-99A patent/SK285411B6/sk not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-10-18 NO NO995078A patent/NO995078L/no not_active Application Discontinuation
- 1999-11-04 BG BG103856A patent/BG64326B1/bg unknown
-
2000
- 2000-07-28 HK HK00104759A patent/HK1027158A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU228433B1 (en) | Use of one-dimensional nuclear magnetic resonance to identify ligands to target biomolecules | |
| Li et al. | Alkyne-and nitrile-anchored gold nanoparticles for multiplex SERS imaging of biomarkers in cancer cells and tissues | |
| Lucas et al. | Measuring ligand‐protein binding using NMR diffusion experiments | |
| Stryer et al. | A spin-labeled hapten. | |
| Nicholson et al. | High resolution nuclear magnetic resonance spectroscopy of biological samples as an aid to drug development | |
| DE19621133A1 (de) | Bestimmungsverfahren mit oligomerisierten Rezeptoren | |
| JPH02504640A (ja) | 表面カップリング官能性を有するイットリウム、ランタニドおよびアクチニドの大環状錯体 | |
| Tengel et al. | Use of 19F NMR spectroscopy to screen chemical libraries for ligands that bind to proteins | |
| Hoesl et al. | Internal standardization of LA-ICP-MS immuno imaging via printing of universal metal spiked inks onto tissue sections | |
| DE69613146T3 (de) | Verwendung von kernspinresonanz zur bestimmung von liganden für zielbiomoleküle | |
| DE60310012T2 (de) | Verfahren, Assay und Kit zur Quantifizierung von HIV-Proteasehemmer | |
| JPH04504063A (ja) | 悪性疾病を検出する方法 | |
| US6652833B2 (en) | Functionalized active-nucleus complex sensor | |
| CN109690313A (zh) | 使用至少两种抗原检测样品中分枝杆菌物质存在的方法 | |
| Nieto | The Use of NMR to Study Transient Carbohydrate—Protein Interactions | |
| Kachooei et al. | Constructing a structural model of troponin using site-directed spin labeling: EPR and PRE-NMR | |
| CN107607711A (zh) | 铁蛋白检测试剂盒及其制备方法 | |
| AU772620B2 (en) | Use of one-dimensional nuclear magnetic resonance to identify ligands to target biomolecules | |
| Mason et al. | Glutathione in whole blood: a novel determination using double quantum coherence transfer proton NMR spectroscopy | |
| DE69931467T3 (de) | Neue komplexe, die vernetztes avidin enthalten, verfahren zur herstellung und analyseverfahren, das diese verwendet | |
| De Silva et al. | Optimization of time-resolved fluorescence assay for detection of Eu-DOTA-labeled ligand-receptor interactions | |
| Kuhn et al. | Illuminating the Human Metabolome: Selective Detection of Multiple Metabolites in Unaltered Biofluids via Hyperpolarisation-Enhanced NMR Spectroscopy | |
| MXPA99009558A (en) | Use of one-dimensional nuclear magnetic resonance to identify ligands to target biomolecules | |
| DE102015121187A1 (de) | Baukasten für ein Multiplex-Drug Discovery System mit High-Throughput Eigenschaften | |
| JPS59206763A (ja) | 生体高分子の定量法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| GB9A | Succession in title |
Owner name: ABBVIE INC., US Free format text: FORMER OWNER(S): ABBOTT LABORATORIES, US |
|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |