PL194184B1 - Sposób przeprowadzania skriningu związków do identyfikacji ligandów cząsteczek docelowych i sposób modelowania ligandów - Google Patents
Sposób przeprowadzania skriningu związków do identyfikacji ligandów cząsteczek docelowych i sposób modelowania ligandówInfo
- Publication number
- PL194184B1 PL194184B1 PL98336299A PL33629998A PL194184B1 PL 194184 B1 PL194184 B1 PL 194184B1 PL 98336299 A PL98336299 A PL 98336299A PL 33629998 A PL33629998 A PL 33629998A PL 194184 B1 PL194184 B1 PL 194184B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- target molecule
- ligands
- ligand
- compound
- compounds
- Prior art date
Links
- 239000003446 ligand Substances 0.000 title claims abstract description 179
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 139
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims abstract description 99
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 95
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 58
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 18
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 38
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 37
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 19
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 17
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 17
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 17
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 claims description 16
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 claims description 15
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 claims description 13
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 4
- GNFTZDOKVXKIBK-UHFFFAOYSA-N 3-(2-methoxyethoxy)benzohydrazide Chemical compound COCCOC1=CC=CC(C(=O)NN)=C1 GNFTZDOKVXKIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 3
- FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 Chemical compound C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N 0.000 claims description 2
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 claims description 2
- -1 respectively Substances 0.000 claims description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 18
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 17
- 229940125904 compound 1 Drugs 0.000 description 16
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 16
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 10
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 8
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 5
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 4
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 3
- AICOOMRHRUFYCM-ZRRPKQBOSA-N oxazine, 1 Chemical compound C([C@@H]1[C@H](C(C[C@]2(C)[C@@H]([C@H](C)N(C)C)[C@H](O)C[C@]21C)=O)CC1=CC2)C[C@H]1[C@@]1(C)[C@H]2N=C(C(C)C)OC1 AICOOMRHRUFYCM-ZRRPKQBOSA-N 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000001208 nuclear magnetic resonance pulse sequence Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 2
- KJLPSBMDOIVXSN-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[2-[4-(3,4-dicarboxyphenoxy)phenyl]propan-2-yl]phenoxy]phthalic acid Chemical compound C=1C=C(OC=2C=C(C(C(O)=O)=CC=2)C(O)=O)C=CC=1C(C)(C)C(C=C1)=CC=C1OC1=CC=C(C(O)=O)C(C(O)=O)=C1 KJLPSBMDOIVXSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000685 Carr-Purcell-Meiboom-Gill pulse sequence Methods 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical group [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 150000001491 aromatic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009146 cooperative binding Effects 0.000 description 1
- 238000005100 correlation spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000990 heteronuclear single quantum coherence spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 1
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000000238 one-dimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000006461 physiological response Effects 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000000452 restraining effect Effects 0.000 description 1
- 238000010916 retrosynthetic analysis Methods 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N24/00—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects
- G01N24/08—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects by using nuclear magnetic resonance
- G01N24/087—Structure determination of a chemical compound, e.g. of a biomolecule such as a protein
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01R—MEASURING ELECTRIC VARIABLES; MEASURING MAGNETIC VARIABLES
- G01R33/00—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables
- G01R33/20—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables involving magnetic resonance
- G01R33/44—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables involving magnetic resonance using nuclear magnetic resonance [NMR]
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N24/00—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects
- G01N24/08—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects by using nuclear magnetic resonance
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01V—GEOPHYSICS; GRAVITATIONAL MEASUREMENTS; DETECTING MASSES OR OBJECTS; TAGS
- G01V3/00—Electric or magnetic prospecting or detecting; Measuring magnetic field characteristics of the earth, e.g. declination, deviation
- G01V3/14—Electric or magnetic prospecting or detecting; Measuring magnetic field characteristics of the earth, e.g. declination, deviation operating with electron or nuclear magnetic resonance
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/20—Screening for compounds of potential therapeutic value cell-free systems
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/81—Packaged device or kit
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- High Energy & Nuclear Physics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Environmental & Geological Engineering (AREA)
- Geology (AREA)
- Remote Sensing (AREA)
- General Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Geophysics (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Magnetic Resonance Imaging Apparatus (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
1. Sposób przeprowadzania skriningu zwiazków w celu identyfikowania ligandów wiazacych sie ze specyficzna czasteczka docelowa, znamienny tym, ze prowadzi sie etapy, w których: a) generuje sie pierwsze jednowymiarowe T 2 - lub dyfuzyjnie filtrowane widmo NMR jednego zwiazku lub mieszaniny zwiazków chemicznych; b) wystawia sie zwiazek lub mieszanine zwiazków chemicznych na dzialanie czasteczki do- celowej; c) generuje sie drugie jednowymiarowe T 2 - lub dyfuzyjnie filtrowane widmo NMR jednego zwiazku lub mieszaniny zwiazków chemicznych, które zostaly wystawione na dzialanie docelowej czasteczki b); i d) porównuje sie wymienione pierwsze i drugie jednowymiarowe T 2 - lub dyfuzyjnie filtrowane widma NMR i okresla sie róznice pomiedzy wymienionym pierwszym i drugim widmem, które to rózni- ce identyfikuja obecnosc jednego lub wiecej zwiazków sposród wymienionych powyzej jednego zwiazku lub mieszaniny zwiazków chemicznych, odpowiednio, bedacych ligandami, które wiaza sie z czasteczka docelowa. PL PL PL
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób przeprowadzania skriningu związków w celu identyfikowania ligandów specyficznych docelowych cząsteczek biologicznych z użyciem jednowymiarowej spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) oraz sposób modelowania ligandu o wysokim powinowactwie do docelowej cząsteczki.
Jednym z najbardziej dynamicznych narzędzi do odkrywania nowych leków jest statystyczny skrining baz danych syntetycznych i naturalnych produktów chemicznych w celu wykrycia związków, które wiążą się ze szczególną docelową cząsteczką (tj. identyfikacja ligandów docelowej cząstki). Przy użyciu tego sposobu ligandy mogą być zidentyfikowane poprzez ich zdolność do tworzenia fizycznych asocjatów z docelową cząsteczką lub poprzez ich zdolność do zmieniania funkcji docelowej cząsteczki.
Przy poszukiwaniu fizycznego wiązania docelowa cząsteczka jest zwykle eksponowana na jeden lub więcej związków, stanowiących domniemane ligandy, i przeprowadza się oznaczenia w celu określenia czy są tworzone kompleksy pomiędzy cząsteczką docelową i jednym lub więcej z tych związków. Oznaczenia takie, jak dobrze wiadomo w dziedzinie, wyszukują większe zmiany w docelowej cząsteczce (np. zmiany wielkości, ładunku, mobilności), które wskazywałyby na tworzenie się kompleksu.
Jeśli są mierzone zmiany funkcjonalne, ustalane są warunki oznaczenia, które umożliwiają pomiar zdarzeń biologicznych lub chemicznych związanych z docelową cząsteczką (np. reakcja katalizowana enzymem, czy aktywacja enzymatyczna z pośrednictwem receptora). Aby zidentyfikować zmiany określane jest funkcjonowanie docelowej cząsteczki przed i po eksponowaniu na związki testowane.
Istniejące oznaczenia fizyczne i funkcyjne są stosowane z powodzeniem do identyfikacji nowych leków, prowadząc do zaprojektowania związków leczniczych. Występują jednak ograniczenia charakterystyczne dla tych oznaczeń, które limitują ich dokładność, rzetelność i wydajność.
Główne niedociągnięcie istniejących oznaczeń polega na problemie „fałszywego pozytywu”. W typowym oznaczeniu funkcyjnym „fałszywym pozytywem” jest związek, który jest aktywny w oznaczeniu, ale który to związek nie jest skuteczny w ujawnianiu pożądanej reakcji fizjologicznej. W typowym oznaczeniu fizycznym „fałszywym pozytywem” jest związek, który na przykład łączy się z docelową cząstką, ale w sposób niespecyficzny (np. wiązanie niespecyficzne). Fałszywe pozytywy są szczególnie dominujące i problematyczne, gdy poddaje się skriningowi większe stężenia domniemanych ligandów, ponieważ wiele związków przy takich stężeniach wykazuje oddziaływania niespecyficzne.
W podobny sposób istniejące oznaczenia są zaciemniane przez problem „fałszywych negatywów”, które powstają gdy związek daje negatywną reakcję w oznaczeniu, ale który to związek właściwie jest ligandem docelowej cząstki. Fałszywe negatywy zwykle pojawiają się w oznaczeniach, w których stosuje się zarówno stężenia związków testowanych zbyt wysokie (prowadzące do zatrucia) lub zbyt niskie w stosunku do stałej wiązania lub dysocjacji związku z docelową cząstką.
Ostatnio wykazano, że dwuwymiarowa analiza widmowa 15N/1H może być stosowana do identyfikacji związków, które wiążą się z docelową proteiną, i to podejście przezwycięża wiele problemów związanych z innymi istniejącymi oznaczeniami przy identyfikacji ligandów. Jednakże, podejście to wymaga aby proteina była znaczona 15N, była rozpuszczalna i dobrze zachowywała się w stężeniach do 0,3 mM lub wyższych. Ponadto, tylko proteiny, które dają analizowalne mapy korelacyjne 15N/1H mogą być stosowane w tym sposobie, co przy obecnej technologii ogranicza ciężar cząsteczkowy docelowej proteiny do poniżej 40 kDa. Ponadto, sposób jest czasochłonny, gdyż związki są testowane w kombinacjach po 10, i jeśli zostanie określone, że co najmniej jeden ze związków w mieszaninie jest aktywny, to każdy ze związków musi być indywidualnie testowany pod względem wiązania się z docelową proteiną.
Ze względu na problemy związane z istniejącymi metodami skriningu, występuje wciąż zapotrzebowanie na dostarczenie nowych, szybkich, wydajnych, dokładnych i rzetelnych sposobów prowadzenia skriningu związków w celu zidentyfikowania i modelowania ligandów, które specyficznie wiążą się z docelową cząsteczką.
Sposób przeprowadzania skriningu związków w celu identyfikowania ligandów wiążących się ze specyficzną cząsteczką docelową zgodny z wynalazkiem charakteryzuje się tym, że prowadzi się etapy, w których:
PL 194 184 B1
a) generuje się pierwsze jednowymiarowe T2- lub dyfuzyjnie filtrowane widmo NMR jednego związku lub mieszaniny związków chemicznych;
b) wystawia się związek lub mieszaninę związków chemicznych na działanie cząsteczki docelowej;
c) generuje się drugie jednowymiarowe T2- lub dyfuzyjnie filtrowane widmo NMR jednego związku lub mieszaniny związków chemicznych, które zostały wystawione na działanie docelowej cząsteczki b); i
d) porównuje się wymienione pierwsze i drugie jednowymiarowe T2- lub dyfuzyjnie filtrowane widma NMR i określa się różnice pomiędzy wymienionym pierwszym i drugim widmem, które to różnice identyfikują obecność jednego lub więcej związków spośród wymienionych powyżej jednego związku lub mieszaniny związków chemicznych, odpowiednio, będących ligandami, które wiążą się z cząsteczką docelową.
Gdy w etapie b) stosuje się mieszaninę związków chemicznych, to po etapie d) prowadzi się etapy, w których:
e) generuje się pierwsze jednowymiarowe T2- lub dyfuzyjnie filtrowane widmo NMR każdego związku w mieszaninie;
f) wystawia się każdy związek z wymienionej mieszaniny indywidualnie na działanie cząsteczki docelowej;
g) generuje się drugie jednowymiarowe T2- lub dyfuzyjnie filtrowane widmo NMR każdego związku, który został wystawiony na działanie cząstki docelowej, w etapie f); i
h) porównuje się każde widmo NMR wygenerowane w etapie g) z wymienionym pierwszym widmem NMR i określa się różnice w każdym z tych porównywanych widm, które to różnice identyfikują obecność związku stanowiącego ligand wiążący się z docelową cząsteczką.
Przed etapem (a) można przeprowadzić etap, w którym wiąże się docelową cząsteczkę z drugim ligandem.
Korzystne jest, gdy związki poddawane skriningowi wybiera się ze zbioru związków o zróżnicowanych małych cząsteczkach.
Docelową cząsteczkę dobiera się korzystnie spośród polipeptydów, korzystnie spośród enzymów lub receptorów.
Docelową cząsteczkę można korzystnie dobrać też spośród kwasów polinukleinowych.
W sposobie według wynalazku można stosować cząsteczkę docelową nie znaczoną.
Sposób przeprowadzania skriningu związków może alternatywnie zawierać dodatkowe etapy, w których:
e) stosuje się wymienione porównanie widm T2- i widm NMR aby wspomóc identyfikację związku chemicznego, który jest ligandem dla cząsteczki docelowej, i
f) sporządza się wymieniony związek.
W takim przypadku korzystnie jako cząsteczkę docelową stosuje się polipeptyd, korzystnie o masie cząsteczkowej większej niż 5 kDa.
Wynalazek obejmuje ponadto sposób modelowania ligandu o wysokim powinowactwie do docelowej cząsteczki, zawierający etapy, w których:
a) identyfikuje się pierwszy ligand docelowej cząsteczki za pomocą jednowymiarowej T2- lub dyfuzyjnie filtrowanej spektroskopii NMR sposobem opisanym w zastrz. 1;
b) identyfikuje się jeden lub więcej dodatkowych ligandów na docelowej cząsteczce za pomocą jednowymiarowej T2- lub dyfuzyjnie filtrowanej spektroskopii NMR;
c) tworzy się kompleks pomiędzy pierwszym zidentyfikowanym ligandem i jednym lub więcej niż jednym dodatkowym zidentyfikowanym ligandem z docelową cząsteczką;
d) określa się trójwymiarową strukturę co najmniej tej części kompleksu, w której pierwszy ligand i jeden lub więcej dodatkowych ligandów związane są z docelową cząsteczką, i tym sposobem określa się orientację przestrzenną pierwszego i jednego lub więcej dodatkowych ligandów na cząsteczce docelowej; i
e) łączy się pierwszy i jeden lub więcej dodatkowych ligandów zachowując przestrzenną orientację określoną w etapie (d) z utworzeniem ligandu o wysokim powinowactwie.
Korzystnie docelowa cząsteczka wybrana jest spośród polipeptydów.
Stosowana docelowa cząsteczka może być nie znaczona.
PL 194 184 B1
Ligand i jeden lub więcej dodatkowych ligandów można łączyć razem za pomocą zbieżnej lub liniowej syntezy organicznej tworząc ligand o wysokim powinowactwie, korzystnie stanowiący ugrupowanie farmaceutycznie czynne.
Pierwszy i jeden lub więcej dodatkowych ligandów dobiera się z puli zróżnicowanych małych cząsteczek, przy czym korzystnie małe cząsteczki dobiera się ze zbioru związków.
Zgodnie ze sposobem według wynalazku korzystnie tworzy się kompleks przez połączenie pierwszego ligandu i jednego lub więcej dodatkowych ligandów z cząsteczką docelową w roztworze, który korzystnie jest podobny lub identyczny z kompleksem tworzonym pomiędzy ligandem i jednym lub więcej dodatkowymi ligandami w warunkach fizjologicznych.
Sposób modelowania ligandu korzystnie przed etapem a) może zawierać etap, w którym selekcjonuje się cząsteczkę docelową, a po etapie e) etap, w którym sporządza się związek chemiczny o strukturze otrzymanej przez przyłączenie pierwszego i wymienionych dodatkowych zidentyfikowanych ligandów przy zachowaniu orientacji przestrzennej określonej w etapie d). Cząsteczką docelową jest tu korzystnie polipeptyd, korzystnie o masie cząsteczkowej większej niż 5 kDa.
Zatem w jednym aspekcie obecny wynalazek dostarcza sposób prowadzenia skriningu związków pod względem aktywności biologicznej w celu identyfikowania ligandów, które wiążą się ze specyficzną docelową cząsteczką. Sposób ten obejmuje etapy: a) generowania pierwszego T2- lub dyfuzyjnie filtrowanego widma protonowego jednego lub mieszaniny związków chemicznych; b) eksponowania jednego lub mieszaniny związków chemicznych wobec docelowej cząsteczki; c) generowania drugiego T2- lub dyfuzyjnie filtrowanego widma protonowego jednego lub mieszaniny związków chemicznych, które zostały wyeksponowane wobec docelowej cząsteczki w etapie b); i d) porównanie wymienionego pierwszego i drugiego T2- lub dyfuzyjnie filtrowanego widma protonowego w celu określenia różnic pomiędzy wymienionym pierwszym i wymienionym drugim widmem, które to różnice identyfikują obecność jednego lub więcej związków, które są ligandami, które wiążą się z docelową cząsteczką.
Jeśli sposób według obecnego wynalazku poddaje skriningowi więcej niż jeden związek w etapie (b), to jest mieszaninę związków, i jeśli występuje różnica pomiędzy pierwszym widmem generowanym dla mieszaniny i tym generowanym dla mieszaniny w obecności docelowej cząsteczki, to związek aktywny może być zidentyfikowany natychmiast o ile jest znane widmo związku aktywnego w nieobecności docelowej cząsteczki. Jest tak, ponieważ obserwowane różnice pomiędzy widmami w etapie (d) pojawiają się przy przesunięciach chemicznych związku aktywnego. Mogą być przeprowadzone dodatkowe etapy w celu zidentyfikowania, który specyficzny związek, lub związki zawarte w mieszaninie, wiąże się z docelową cząsteczką, również przy braku informacji o przesunięciach chemicznych dla związków w wymienionej mieszaninie lub w celu potwierdzenia wiązania. Te dodatkowe etapy obejmują etapy: e) generowania T2- lub dyfuzyjnie filtrowanego widma protonowego każdego związku w mieszaninie, f) eksponowania każdego związku z mieszaniny indywidualnie wobec docelowej cząsteczki, g) generowania T2- lub dyfuzyjnie filtrowanego widma protonowego każdego związku z mieszaniny po eksponowaniu wobec docelowej cząstki, h) porównania każdego z widm wygenerowanych w etapie g) z pierwszym widmem generowanym dla samej docelowej cząsteczki w celu określenia różnic w którymkolwiek z tych porównywanych widm, różnic identyfikujących obecność związku, który jest ligandem, który wiąże się z docelową cząsteczką.
Zaletą obecnego wynalazku jest możliwość określania wiązania potencjalnych ligandów przez nieznaczoną docelową cząsteczkę o dowolnej wielkości i składzie, pod warunkiem, że wielkość docelowej cząsteczki jest odpowiednio większa od potencjalnego ligandu, tak aby wywołać zmiany jej szybkości relaksacji lub dyfuzji w wyniku wiązania z docelową cząsteczką.
Inną zaletą obecnego wynalazku jest możliwość określania wiązania nawet słabo wiążących ligandów z docelową cząsteczką.
Dalszą zaletą obecnego wynalazku jest możliwość identyfikacji związku aktywnego lub związków w mieszaninie związków poprzez bezpośrednie porównanie przesunięć chemicznych w widmach różnicowych ze znanymi przesunięciami chemicznych związków zawartych w mieszaninie w nieobecności docelowej cząsteczki biologicznej.
W tej korzystnej praktycznej realizacji sposób określania wiązania ligandu może być przeprowadzony w obecności drugiego związanego ligandu. Zgodnie z tą praktyczną realizacją docelowa cząsteczka jest związana z tym drugim ligandem przed eksponowaniem jej wobec związków testowanych.
PL 194 184 B1
Sposób ten wykorzystuje spektroskopową metodę poddania skriningowi z użyciem T2- lub dyfuzyjnie filtrowanego widma protonowego przytoczoną powyżej w celu zidentyfikowania pierwszego i kolejnych ligandów, które wiążą się z docelową cząsteczką. Tworzony jest kompleks cząsteczki docelowej i dwóch lub więcej ligandów, a dane strukturalne są otrzymywane korzystnie z użyciem spektroskopii NMR lub krystalografii rentgenowskiej. Te dane strukturalne są używane do określenia przestrzennej orientacji ligandów względem siebie i cząsteczki docelowej.
Według orientacji przestrzennej, ligandy są związane ze sobą z utworzeniem ligandu o wysokim powinowactwie, który jest użyteczny jako ligand szczególnej docelowej cząsteczki i jest użyteczny jako potencjalny farmaceutycznie aktywny lek. Wybór odpowiedniej grupy łączącej jest dokonywany przy zachowaniu przestrzennej orientacji ligandów względem siebie i docelowej cząsteczki, w oparciu o podstawowe informacje o kątach wiązań i długościach wiązań dobrze znane w dziedzinie chemii organicznej. Procedura łączenia lub schemat syntetyczny wiązania co najmniej dwóch ligandów z utworzeniem ligandu o wysokim powinowactwie jest przeprowadzana według dobrze znanych procedur syntetycznych i/lub analizy retrosyntetycznej. Ligand o wysokim powinowactwie może być otrzymany jakąkolwiek drogą, która właściwie prowadzi do finalnego ligandu i nie jest ograniczona do prostego połączenia dwóch ligandów grupą łączącą. Jakikolwiek sposób syntezy liniowej lub syntezy zbieżnej może być wykorzystany do utworzenia finalnego produktu. Po znalezieniu co najmniej dwóch ligandów, które mają powinowactwo do docelowej cząsteczki (korzystnie proteiny), modelowany jest ligand o wysokim powinowactwie i otrzymywany sposobami dobrze znanymi specjalistom w dziedzinie. Ligandy są wybierane ze zróżnicowanego zbioru małych cząsteczek, mających różne atomy i organizację cząsteczek, stereochemię itd. Czynnikiem limitującym jest to, że co najmniej dwa ligandy mają pewne powinowactwo, jako ligand, do co najmniej jednego centrum w polipeptydzie lub docelowej cząsteczce. Sposób prowadzenia skriningu tu ujawniony może jednak identyfikować pojedynczy ligand lub wiele ligandów, które mogą być również poddawane tradycyjnym sposobom modelowania leku z wytworzeniem farmaceutycznie aktywnych produktów, lub mogą być wykorzystane w sposobie modelowania leku, tu ujawnionym, aby związać co najmniej dwa ligandy z utworzeniem ligandu o wysokim powinowactwie.
Zatem, sposób modelowania molekularnego obejmuje identyfikowanie fragmentu pierwszego ligandu docelowej cząsteczki z użyciem jednowymiarowej T2- lub dyfuzyjnie filtrowanej spektroskopii; identyfikowanie kolejnych fragmentów ligandów docelowej cząsteczki z użyciem jednowymiarowej T2- lub dyfuzyjnie filtrowanej spektroskopii; tworzenie kompleksu pierwszego i dalszych fragmentów ligandów z docelową cząsteczką; otrzymywanie danych strukturalnych dla kompleksu i zatem przestrzennej orientacji pierwszego i dalszych fragmentów ligandów z utworzeniem ligandu o wysokim powinowactwie, który może być również farmaceutycznie aktywnym lekiem, przy zachowaniu przestrzennej orientacji fragmentów ligandów.
Identyfikacja dalszych fragmentów ligandów może być przeprowadzana w nieobecności lub w obecności pierwszego ligandu (np. docelowa cząsteczka może być związana z pierwszym ligandem przed eksponowaniem wobec związków testowanych w celu identyfikacji drugiego ligandu).
W korzystnej praktycznej realizacji docelową cząsteczką stosowaną w skriningu lub procesie modelowania jest polipeptyd ze względu na znaczenie protein w chemii medycznej. Docelowy polipeptyd jest korzystnie wytwarzany w postaci rekombinacyjnej z komórki gospodarza transformowanej wektorem ekspresji, który zawiera polinukleotyd kodujący polipeptyd. Docelowa cząsteczka musi być przy tym odpowiednio większa od związków testowanych, tak aby wywołać znaczne różnice w szybkościach relaksacji lub dyfuzji związku testowanego w wyniku wiązania z docelową cząsteczką. W korzystnej praktycznej realizacji docelowa cząsteczka jest polipeptydem o ciężarze cząsteczkowym większym od 5 kDa.
Wynalazek dostarcza zatem szybki i wydajny sposób prowadzenia skriningu do identyfikacji ligandów, które wiążą się z terapeutycznie docelowymi cząsteczkami.
Ligandy są identyfikowane poprzez testowanie wiązania cząsteczek z docelową cząsteczką (np. proteiną, kwasem nukleinowym, itd.) śledząc za pomocą magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) zmiany zarówno w szybkościach relaksacji lub dyfuzji rezonansu ligandu w wyniku dodania docelowej cząsteczki. Zbiór cząsteczek poddawanych skriningowi może być wybrany spośród zestawu związków, takich jak te aktualnie dostępne w większości firm farmaceutycznych lub laboratoriach uniwersyteckich.
Informacje o zależności budowa/aktywność między ligandami identyfikowanymi takim sposobem mogą być następnie użyte do modelowania nowych leków, które działają jako ligandy docelo6
PL 194 184 B1 wych cząsteczek. Na przykład, jeśli zidentyfikowano dwa lub więcej ligandy dla danej docelowej cząsteczki, tworzony jest kompleks tych ligandów i docelowej cząsteczki. Przestrzenna wzajemna orientacja ligandów jak i względem docelowej cząsteczki jest pozyskiwana z danych strukturalnych. Orientacja przestrzenna definiuje odległości między centrami wiążącymi dwóch ligandów i orientacje każdego ligandu względem tych centrów.
Przy użyciu danych orientacji przestrzennej dwa lub więcej ligandów wiąże się następnie z utworzeniem nowego ligandu. Wiązanie jest dokonywane w sposób, który zachowuje orientację przestrzenną ligandów względem siebie i względem docelowej cząsteczki.
Oparty na 1D-NMR sposób według wynalazku ma liczne zalety. Po pierwsze, ponieważ sposób według obecnego wynalazku identyfikuje ligandy poprzez bezpośredni pomiar wiązania z docelową cząsteczką, problem fałszywych pozytywów jest znacznie ograniczony.
Po drugie, problem fałszywych negatywów jest znacząco ograniczony, ponieważ obecny sposób może identyfikować związki, które specyficznie wiążą się z docelową cząsteczką, w dużym zakresie stałych dysocjacji.
Po trzecie, wymaganie co do niskiego ciężaru cząsteczkowego (<40 kDa) znaczonych 15N protein, które są trwałe przy wysokich stężeniach, potrzebne w metodach wykorzystujących spektroskopię korelacyjną 15N/1H, jest wyeliminowane przy zastosowaniu obecnego wynalazku.
Po czwarte, możliwość bezpośredniego identyfikowania związków aktywnych w mieszaninie związków przez porównanie znanych przesunięć chemicznych znacznie zmniejsza ilość czasu wymaganą do skriningu i identyfikowania związków aktywnych, które wiążą się z docelową cząsteczką.
Ponieważ sygnały potencjalnych ligandów są monitorowane aby wykryć wiązanie z docelową cząsteczką, mogą być zidentyfikowane dwa lub więcej ligandy, które wiążą się jednocześnie z docelową cząsteczką. Możliwość jednoczesnego identyfikowania centrów wiążących różnych ligandów pozwala biegłemu pracownikowi 1) zdefiniować negatywne i pozytywne współdziałające wiązanie pomiędzy ligandami i 2) modelować nowe leki przez łączenie dwóch i więcej ligandów w jeden związek przy zachowaniu właściwej orientacji ligandów względem siebie i ich centrów wiążących.
Przedmiot wynalazku został w korzystnym przykładzie wykonania zilustrowany na rysunku, na którym:
Figura 1 przedstawia (A) T2-filtrowane widmo związku 1 w buforze wodnym, (B) T2-filtrowane widmo związku 1 w obecności FKBP, (C) T2-filtrowane widmo FKBP, (D) widmo różnicowe otrzymane przez odjęcie (C) od (B), i (E) widmo różnicowe otrzymane przez odjęcie (D) od (A). We wszystkich eksperymentach T2-filtrowany czas ujarzmiania spinów wynosił 200 ms z opóźnieniem echa spinowego 1ms, stężenie związku 1 wynosiło 100 mM, stężenie FKBP wynosiło 50 mM i bufor stanowiły 50 nM PO4, 100 mM NaCl, pH 6,5 (95% D2O).
Figura 2 przedstawia (A) T2-filtrowane widmo mieszaniny związków 1-9, (B) T2-filtrowane widmo mieszaniny związków 1-9 w obecności FKBP, (C) T2-filtrowane widmo FKBP, (D) widmo różnicowe otrzymane przez odjęcie (C) od (B), (E) widmo różnicowe otrzymane przez odjęcie (D) od (A), i (F) wzorcowe T2-filtrowane widmo samego związku 1. We wszystkich eksperymentach T2-filtrowany czas ujarzmiania spinów wynosił 200 ms z opóźnieniem echa spinowego 1 ms, stężenie wszystkich związków chemicznych wynosiło 100 mM, stężenie FKBP wynosiło 50 mM i bufor stanowiły 50 nM PO4, 100 mM NaCl, pH 6,5 (95% D2O).
Figura 3 przedstawia (A) T2-filtrowane widmo mieszaniny związków 2-9, (B) T2-filtrowane widmo mieszaniny związków 2-9 w obecności FKBP, (C) T2-filtrowane widmo mieszaniny FKBP, (D) widmo różnicowe otrzymane przez odjęcie (C) od (B), i (E) widmo różnicowe otrzymane przez odjęcie (D) od (A). We wszystkich eksperymentach T2-filtrowany czas ujarzmiania spinów wynosił 200 ms z opóźnieniem echa spinowego 1 ms, stężenie wszystkich związków chemicznych wynosiło 100 mM, stężenie FKBP wynosiło 50 mM i bufor stanowiły 50 nM PO4, 100 mM NaCl, pH 6,5 (95% D2O).
Figura 4 przedstawia (A) dyfuzyjnie filtrowane widmo związku 1 w obecności FKBP z użyciem gradientu o niskiej mocy, (B) dyfuzyjnie filtrowane widmo związku 1 w obecności FKBP z użyciem gradientu o wysokiej mocy, (C) widmo różnicowe otrzymane przez odjęcie (B) od (A), (D) dyfuzyjnie filtrowane widmo związku 1 z użyciem gradientu o niskiej mocy i (E) widmo różnicowe otrzymane przez odjęcie (C) od (D). We wszystkich eksperymentach gradienty o niskiej i wysokiej mocy stanowią, odpowiednio, 3 i 48 Gausów/cm. Gradient o wysokiej mocy był dostateczny do wyeliminowania resztkowego sygnału HDO próbki. Stosowany czas opóźnienia dyfuzyjnego wynosił 300 ms, stężenie wszystkich związków chemicznych wynosiło 100 mM, stężenie FKBP wynosiło 50 mM i bufor stanowiły 50 nM PO4, 100mM NaCl, pH 6,5 (95% D2O).
PL 194 184 B1
Figura 5 przedstawia (A) dyfuzyjnie filtrowane widmo mieszaniny związków 1-9 w obecności FKBP z użyciem gradientu o niskiej mocy, (B) dyfuzyjnie filtrowane widmo mieszaniny związków 1-9 w obecności FKBP z użyciem gradientu o wysokiej mocy, (C) widmo różnicowe otrzymane przez odjęcie (B) od (A), (D) dyfuzyjnie filtrowane widmo mieszaniny związków 1-9 z użyciem gradientu o niskiej mocy, (E) widmo różnicowe otrzymane przez odjęcie (C) od (D) i (F) widno wzorcowe samego związku 1. We wszystkich eksperymentach gradienty o niskiej i wysokiej mocy stanowią, odpowiednio, 3 i 48 Gausów/cm. Gradient o wysokiej mocy był dostateczny do wyeliminowania resztkowego sygnału HDO próbki. Stosowany czas opóźnienia dyfuzyjnego wynosił 300 ms, stężenie wszystkich związków chemicznych wynosiło 100 mM, stężenie FKBP wynosiło 50 mM i bufor stanowiły 50 nM PO4, 100 mM NaCl, pH 6,5 (95% D2O).
Figura 6 przedstawia (A) dyfuzyjnie filtrowane widmo mieszaniny związków 2-9 w obecności FKBP z użyciem gradientu o niskiej mocy, (B) dyfuzyjnie filtrowane widmo mieszaniny związków 2-9 w obecności FKBP z użyciem gradientu o wysokiej mocy, (C) widmo różnicowe otrzymane przez odjęcie (B) od (A), (D) dyfuzyjnie filtrowane widmo mieszaniny związków 2-9 z użyciem gradientu o niskiej mocy i (E) widmo różnicowe otrzymane przez odjęcie (C) od (D). We wszystkich eksperymentach gradienty o niskiej i wysokiej mocy stanowią, odpowiednio, 3 i 48 Gausów/cm. Gradient o wysokiej mocy był dostateczny do wyeliminowania resztkowego sygnału HDO próbki. Stosowany czas opóźnienia dyfuzyjnego wynosił 300 ms, stężenie wszystkich związków chemicznych wynosiło 100 mM, stężenie FKBP wynosiło 50 mM i bufor stanowiły 50 nM PO4, 100 mM NaCl, pH 6,5 (95% D2O).
Sposób poddawania skriningowi według obecnego wynalazku rozpoczyna się od generowania lub akwizycji zarówno T2-filtrowanego lub dyfuzyjnie filtrowanego jednowymiarowego widma protonowego związku lub mieszaniny związków. Środki do generowania T2-filtrowanego lub dyfuzyjnie filtrowanego jednowymiarowego widma protonowego są dobrze znane w dziedzinie (patrz np. S. Meiboom i D. Gill, Rev. Sci. Instrum., 29: 688 (1958), S.J. Gibbs i C.S. Johnson, Jr., J. Magn. Reson., 93: 395-402 (1991) i A.S. Altieri, et al., J. Am. Chem. Soc., 117: 7566-7567 (1995)).
W celu ułatwienia akwizycji danych NMR dużej liczby związków (np. bazy danych syntetycznych lub występujących naturalnie małych związków organicznych) wykorzystywany jest zmieniacz próbek. Przy użyciu zmieniacza próbek do 60 próbek może być zbadanych bez obsługi. Zatem stosując typowe parametry akwizycji (128 skanów na swobodny spadek indukcji (fid)) 100-200 widm może być zebranych w okresie 24 godzin.
W celu ułatwienia przetwarzania danych NMR stosowane są oprogramowania komputerowe do przenoszenia i automatycznego przetwarzania mnogich jednowymiarowych danych NMR.
Reprezentatywne jednowymiarowe T2-filtrowane widmo mieszaniny związków jest przedstawione na fig. 1A. Reprezentatywne jednowymiarowe dyfuzyjnie filtrowane widmo mieszaniny związków jest przedstawione na fig. 2A.
Po akwizycji pierwszego widma znaczona docelowa cząsteczka jest eksponowana na jeden lub więcej związków testowanych. Jeśli więcej niż jeden związek testowany ma być jednocześnie testowany, korzystne jest użycie bazy danych związków, takiej jak mnogość małych cząsteczek, takie cząsteczki są zwykle rozpuszczone w perdeuterowanym sulfotlenku dimetylowym. Związki w bazie danych mogą być nabyte od dostawców lub wytworzone według aktualnych potrzeb.
Indywidualne związki mogą być wybrane inter alia w oparciu o wielkość (ciężar cząsteczkowy = 100-300) i zróżnicowanie cząsteczkowe. Związki w zbiorze mogą mieć różne kształty (np. płaski pierścień aromatyczny, pofałdowany pierścień alifatyczny, alifatyczny łańcuch prosty i rozgałęziony z wiązaniami pojedynczymi, podwójnymi i potrójnymi) i zróżnicowane grupy funkcyjne (np. kwasy karboksylowe, estry, etery, aminy, aldehydy, ketony i rozmaite pierścienie heterocykliczne) w celu maksymalizowania prawdopodobieństwa wykrycia związków, które oddziaływają z dalece zróżnicowanymi centrami wiążącymi.
Sposób NMR prowadzenia skriningu według obecnego wynalazku stosuje stężenia ligandów w zakresie od około 0,05 do około 1,0 mM. W tych stężeniach związki, które są kwasowe lub zasadowe mogą znacząco zmieniać pH buforowanych roztworów protein. Przesunięcia chemiczne są czułe na zmiany pH jak również bezpośrednie oddziaływania wiążące i zatem mogą być obserwowane „fałszywe pozytywne” zmiany przesunięcia chemicznego, które nie są wynikiem wiązania ligandu ale zmian pH. Zatem jest niezbędne zapewnienie, że pH buforowanego roztworu nie ulegnie zmianie po dodaniu ligandu. Jeden ze sposobów kontrolowania pH jest przytoczony poniżej.
Związki są przechowywane w 263K jako 1,0 i 0,1 roztwory bazowe w dimetylosulfotlenku (DMSO). Jest to konieczne ze względu na ograniczoną rozpuszczalność ligandów w wodnym roztworze.
PL 194 184 B1
Nie możliwe bezpośrednie korygowanie pH roztworu w DMSO. W dodatku HCl i NaOH tworzą nierozpuszczalne dole w DMSO, tak że alternatywne kwasy i zasady muszą być stosowane. Następujące podejście, jak stwierdzono, prowadzi do stabilnego pH.
Roztwory 1,0 M w DMSO są rozcieńczane 1:10 w 50 mM buforze fosforanowym, pH 7,0. Mierzone jest pH tak rozcieńczonej porcji roztworu. Jeśli pH porcji jest niezmienione (tj. pozostaje przy 7,0) przygotowywany jest roztwór roboczy przez rozcieńczenie bazowego roztworu w DMSO 1:10, wytwarzając roztwór 0,1 M i ten roztwór jest przechowywany.
Jeśli pH rozcieńczonej porcji jest mniejsze od 7,0 dodawana jest etanoloamina do 1,0 M roztworu bazowego w DMSO, roztwór bazowy jest następnie rozcieńczany 1:10 buforem fosforanowym z utworzeniem nowej porcji i pH porcji jest ponownie sprawdzane.
Jeśli pH rozcieńczonej porcji jest większe od 7,0 dodawany jest kwas octowy do 1,0 M roztworu bazowego w DMSO, roztwór bazowy jest następnie rozcieńczany 1:10 buforem fosforanowym z utworzeniem nowej porcji i pH porcji jest ponownie sprawdzane.
Etanoloamina i kwas octowy są rozpuszczalne w DMSO i dodaje się właściwe równoważniki aby zapewnić, że w wyniku przeniesienia do wodnego buforu pH będzie niezmienione. Korygowanie pH jest procesem interaktywnym, powtarzanym aż do uzyskania pożądanego rezultatu.
Należy zwrócić uwagę, że procedura ta jest przeprowadzana na rozcieńczonych 1:10 1,0 M roztworach bazowych (100 mM ligandu) aby zapewnić, że nie zaobserwuje się zmian pH przy niższych stężeniach stosowanych w eksperymencie (0,1 do 10 mM) lub w innych/słabszych układach buforowych.
Następnie, po eksponowaniu związków testowanych wobec docelowej cząsteczki, generowane jest drugie jednowymiarowe T2- lub dyfuzyjnie filtrowane widmo. Dla podejścia T2-filtrowanego drugie widmo jest generowane w ten sam sposób jak przytoczono powyżej. Pierwsze i drugie widmo są następnie porównywane w celu określenia czy występują jakiekolwiek różnice między dwoma widmami. Różnice w jednowymiarowym T2-filtrowanym widmie wskazują, że ligand wiąże się z docelową cząsteczką. Różnice te są określane z użyciem standardowych procedur dobrze znanych w dziedzinie. Dla metody z dyfuzyjnym filtrowaniem drugie widmo jest generowane przez porównanie różnic widmowych pomiędzy gradientem o niskiej i wysokiej mocy - wybierając zatem te związki, których szybkości dyfuzji są porównywalne do tych obserwowanych w nieobecności docelowej cząsteczki.
Na przykład fig. 1 przedstawia porównanie jednowymiarowych T2-filtrowanych widm przed i po ekspozycji różnych docelowych cząsteczek wobec mieszaniny związków testowanych, i kolejno identyfikację związku aktywnego. Szczegółowy opis jak te badania są przeprowadzane można znaleźć dalej w przykładzie 1.
Również przykładowo fig. 2 przedstawia porównania jednowymiarowych dyfuzyjnie filtrowanych widm przed i po ekspozycji różnych docelowych cząsteczek wobec mieszaniny związków testowanych i kolejno identyfikację związku aktywnego. Szczegółowy opis jak te badania są przeprowadzane można znaleźć dalej w przykładzie 2.
W celu wykrycia dodatkowych cząsteczek, które wiążą się z proteiną, cząsteczki są wybrane do testowania w oparciu o zależność budowa/aktywność po pierwotnej analizie i/lub o informacje strukturalne o wstępnych wynikach po wiązaniu z proteiną. Na przykład wstępny skrining może prowadzić do identyfikacji ligandów, z których wszystkie zawierają pierścień aromatyczny. Druga runda skriningu użyje zatem inne związki aromatyczne jako związki testowane.
Ze względu na znaczenie w chemii medycznej korzystną docelową cząsteczką do zastosowania w takim sposobie jest polipeptyd. W jednej praktycznej realizacji sposób wykrywania wiązania jednego ligandu z docelową cząsteczką może być przeprowadzony w obecności drugiego ligandu. Zgodnie z tą praktyczną realizacją docelowa cząsteczka wiąże się z tym drugim ligandem przed ekspozycją tej docelowej cząsteczki wobec związku testowanego.
Korzystne cząsteczki docelowe, środki do generowania widm i środki do porównywania widm są takie same jak przytoczone powyżej.
Wstępny etap w sposobie modelowania to identyfikacja dwóch lub więcej ligandów, które wiążą się ze specyficzną cząsteczką docelową. Identyfikacja takich ligandów jest dokonywana z użyciem jednowymiarowej spektroskopii T2- lub dyfuzyjnie filtrowanej, przytoczonej powyżej.
Po identyfikacji dwóch lub więcej ligandów jako wiążących się z docelową cząsteczką w różnych centrach, tworzony jest kompleks pomiędzy docelową cząsteczką i ligandami. Jeśli są dwa ligandy kompleks jest kompleksem potrójnym. Poczwórne i inne kompleksy są tworzone jeśli są trzy lub więcej ligandów.
PL 194 184 B1
Kompleksy są tworzone przez mieszanie docelowej cząsteczki jednocześnie lub kolejno z różnymi ligandami w warunkach, które umożliwiają tym ligandom wiązanie się z cząsteczką docelową. Środki do określania takich warunków są dobrze znane w dziedzinie.
Po utworzeniu kompleksu otrzymywane są dane strukturalne. Jakiekolwiek środki do otrzymywania danych strukturalnych mogą być używane. Sposoby takie są dobrze znane w dziedzinie. Przykładowymi i korzystnymi sposobami są NMR i krystalografia rentgenowska.
Analiza danych strukturalnych może wykazać przestrzenną orientację ligandów względem siebie jak również konformację docelowej cząsteczki. Po pierwsze, przestrzenna orientacja każdego ligandu względem docelowej cząsteczki umożliwia identyfikacje tych części ligandu bezpośrednio zaangażowanych w wiązanie (tj. tych części oddziałujących centrami wiążącymi cząsteczki docelowej) i te części ligandu, które są skierowane na zewnątrz centrów wiążących, które to części mogą być wykorzystane w kolejnych procedurach łączenia.
Po drugie, dane przestrzennej orientacji są używane do mapowania pozycji każdego ligandu względem innych. Czyli, że mogą zostać obliczone dyskretne odległości pomiędzy zorientowanymi przestrzennie ligandami.
Po trzecie, dane przestrzennej orientacji definiują również trójwymiarowe zależności pomiędzy ligandami i cząsteczkę docelową. Zatem, w dodatku do obliczenia absolutnych odległości pomiędzy ligandami, mogą być również określone kątowe orientacje tych ligandów.
Wiedza o przestrzennych orientacjach ligandów i cząsteczki docelowej jest następnie wykorzystana do wybrania łączników do związania dwóch lub więcej ligandów w jedną całość, która zawiera wszystkie ligandy. Modelowanie łączników jest oparte na odległościach i orientacji kątowej niezbędnej do zachowania każdej części całościowego ligandu we właściwej orientacji względem cząsteczki docelowej.
Trójwymiarowa konformacja odpowiednich łączników jest dobrze znana lub łatwa do określenia przez osobę biegłą w dziedzinie. Aczkolwiek jest teoretycznie możliwe połączenie razem dwóch lub więcej ligandów poprzez dowolną odległość w projekcji trójwymiarowej, w praktyce korzystne są pewne ograniczenia odległości i projekcji. W korzystnej praktycznej realizacji ligandy są rozdzielone w odległości mniejszej od około 15 angsztremów (A), bardziej korzystnie mniejszej niż około 10 A i jeszcze bardziej korzystnie mniejszej niż około 5 A.
Po identyfikacji odpowiedniego łącznika, ligandy są łączone z tym łącznikiem. Środki do połączenia ligandów są dobrze znane w dziedzinie i zależą do struktury chemicznej ligandu i samej grupy łączącej. Ligandy są łączone ze sobą z wykorzystaniem tych części ligandu, które nie są bezpośrednio zaangażowane w wiązanie z docelową cząsteczką.
Przykł ad 1
Skrining związków z użyciem spektroskopii T2-filtrowanej
A. FKBP
Rekombinacyjna ludzka proteina wiążąca FK (FKBP) została otrzymana według ujawnienia Logan'a, et al., J. Mol. Biol., 236: 637-648 (1994).
Sekwencja impulsów wykorzystywana do badania zmian szybkości relaksacji poprzecznej (T2) potencjalnych ligandów w obecności cząsteczki docelowej jest sekwencją Carr-Purcell-Meinboom-GilTa (CPMG) ujawnioną w: S. Meinboom i D. Gill, Rev. Sci. Instrum., 29: 688 (1958).
Obecny wynalazek wykorzystuje fakt, że duże cząsteczki lub kompleksy cząsteczkowe, które obracają się powoli w roztworze będą miały krótsze czasy relaksacji poprzecznej (T2), niż małe cząsteczki, które obracają się szybko w roztworze. Jest to ogólnie znane w dziedzinie. Obecny wynalazek wykorzystuje fakt, że małe cząsteczki, które zwykle szybko obracają się w stanie wolnym w roztworze, będą obracały się wolniej po związaniu z większą cząsteczką docelową. Zatem czasy relaksacji poprzecznej (T2) małychcząsteczek ulegną zmianie (zmniejszeniu) po związaniu z cząsteczką docelową.
Jest to przedstawione na fig. 1dla FKBP i związku 1, który wiąże się z FKBP z powinowactwem 200 mM. Na fig. 1A sekwencja CPMG z czasem ujarzmiania spinów 200 ms jest aplikowana dla związku w nieobecności FKBP. Ponieważ szybkości relaksacji poprzecznej małych cząstek w stanie wolnym w roztworze są na ogół rzędu sekund, pojawiają się pomijalne relaksacje w trakcie czasu ujarzmiania spinów i obserwowane są sygnały wolnego ligandu. Jednakże, w obecności FKBP sygnały ligandu są znacząco zmniejszone po czasie ujarzmiania spinów i tylko resztkowe piki proteiny i ligandu pozostają w widmie, jak pokazano na fig. 1B. Różnice te mogą być wykryte zarówno przez bezpośredni podgląd lub metodą różnicowania widmowego, w której widmo samego FKBP (po ujarzmianiu spinów, fig. 1C) jest odejmowane od widma związku w obecności FKBP (również po ujarzmianiu
PL 194 184 B1 spinów, fig. 1B), prowadząc do widma przedstawionego na fig. 1D. Widmo to zatem zawiera tylko resztkowe piki ligandu, które jeśli żądane mogą mieć dalej zmniejszoną intensywność poprzez zastosowanie dłuższych czasów ujarzmiania spinów. Widmo to (fig. 1D) jest następnie odejmowane od widma samego związku testowanego (fig. 1A), prowadząc do widma przedstawionego na fig. 1E. Piki dodatnie w widmie różnicowym odpowiadają przesunięciom chemicznym związku w nieobecności docelowej proteiny, co wykazano przez porównanie fig. 1A z fig. 1E, podczas gdy piki ujemne odpowiadają przesunięciom chemicznym związku po związaniu z FKBP. Informacja ta może być użyta do identyfikacji związku aktywnego.
Ten sam eksperyment może być przeprowadzony dla mieszaniny związków. W tych eksperymentach związki 2-9, które jak wiadomo nie wiążą się z FKBP są kombinowane ze związkiem 1. Figura 2 przedstawia T2-filtrowane widmo mieszaniny związków w nieobecności FKBP (fig. 2A), w obecności FKBP (fig. 2B) i dla samego FKBP (fig. 2C). Widmo na fig. 2D, otrzymane przez odjęcie fig. 2C od fig. 2B, zawiera częstości rezonansowe ligandów w obecności proteiny. Widmo na fig. 2E, otrzymane poprzez odjęcie fig. 2D od fig. 2A, zawiera dodatnie piki, które odpowiadają pozycjom rezonansowym związku 1 w nieobecności FKBP, wykazanym na widmie wzorcowym przedstawionym na fig. 2F. Informacja o przesunięciach chemicznych zawarta w fig. 2E jest wykorzystana nie tylko do wykrycia obecności ligandu, który wiąże się z proteiną, ale również może być użyta do identyfikacji, który związek w mieszaninie związków wiąże się, pod warunkiem, że taka informacja o przesunięciach chemicznych dla wolnych ligandów jest z góry znana.
Figura 3 przedstawia ten sam zbiór eksperymentów dla samej mieszaniny związków 2-9, które nie wiążą się z FKBP. Jak obserwowano na fig. 3E, nie zaobserwowano dodatnich, absorpcyjnych częstości rezonansowych dla ligandu w widmie różnicowym, wskazując, że ligandy nie wiążą się z FKBP.
P r zyk ł a d 2
Skrining związków z użyciem spektroskopii dyfuzyjnie filtrowanej
A.m FKBP
Sekwencja impulsów wykorzystywana do badania zmian szybkości dyfuzji potencjalnych ligandów w obecności cząsteczki docelowej jest ujawniona przez: S.J. Gibbs i C.S. Johnson, Jr., J. Magn. Reson., 93: 395-402 (1991) i A.S. Altieri, et al., J. Am. Chem. Soc., 117: 7566-7567 (1995).
Obecny wynalazek wykorzystuje fakt, że małe cząsteczki dyfundują szybciej niż większe w roztworze. Jest to ogólnie znane w dziedzinie. Obecny wynalazek wykorzystuje fakt, że małe cząsteczki, które normalnie dyfundują szybko w stanie wolnym w roztworze, będą dyfundować wolniej po związaniu z większą docelową cząsteczką. A zatem szybkości dyfuzji ulegną zmianie (zmniejszeniu) po związaniu z docelową cząsteczką.
Możliwość wykrywania ligandów wiążących się z użyciem filtrów dyfuzyjnych jest wykazana dla wiązania FKBP ze związkiem 1, jak przedstawiono na fig. 4. Najpierw otrzymano widma filtrowane dyfuzyjnie przy niskim i wysokim gradiencie mocy dla próbki związku 1 w obecności FKBP (odpowiednio, fig. 4A i 4B). Widma te następnie odjęto z utworzeniem widma przedstawionego na fig. 4C. Widmo to zawiera resztkowe częstości rezonansowe ligandu, związku 1. Widmo to następnie odjęto od widma wzorcowego samego związku 1 (po niskim gradiencie, fig. 4D), dostarczając widmo zawierające częstości rezonansowe ligandu, który wiąże się z proteiną (fig. 4E). Jak dla eksperymentu T2-filtrowanego, piki dodatnie na fig. 4E odpowiadają przesunięciom chemicznym ligandu w nieobecności proteiny, podczas gdy piki ujemne odpowiadają przesunięciom chemicznym związku po związaniu z FKBP. Informacja ta może być użyta do identyfikacji związku aktywnego.
Te same eksperymenty mogą być przeprowadzone dla mieszaniny związków. W tych eksperymentach związki 2-9, o których wiadomo, że nie wiążą się z FKBP, są kombinowane ze związkiem 1. Figury 5A i 5B przedstawiają widma mieszaniny związków w obecności FKBP, odpowiednio, po niskim i wysokim gradiencie mocy. Różnica pomiędzy widmami generuje widmo (fig. 5C). Odjęcie tego widma od widma kontrolnego mieszaniny ligandów w nieobecności FKBP (po niskim gradiencie, fig. 5D) dostarcza widmo (fig. 5E), które zawiera dodatnie częstości rezonansowe przy przesunięciach chemicznych dla związku 1 w nieobecności FKBP (fig. 5F). Informacja o przesunięciach chemicznych zawarta na fig. 5E jest użyta nie tylko do wykrycia obecności ligandu, który wiąże się z proteiną, ale również może być użyta do identyfikacji, który związek w mieszaninie związków jest wiązany, pod warunkiem, że taka informacja o przesunięciach chemicznych dla wolnych ligandów jest z góry znana.
Figura 6 przedstawia ten sam zbiór eksperymentów tylko dla mieszaniny związków 2-9, które nie wiążą się z FKBP. Jak można zaobserwować na fig. 6E, nie pojawiają się dodatnie częstości rezonansowe w widmie różnicowym, wskazując, że ligandy nie wiążą się z FKBP.
PL 194 184 B1
Wszystkie widma NMR zarejestrowano w 300K spektrometrem NMR Bruker AMX500. Wszystkie widma rejestrowano przy 256 skanach i szerokością przemiatania protonowego 8333,3 Hz i impulsem protonowym 90 stopni długości 7 ms. Dla eksperymentów T2-filtrowanych czas ujarzmiania spinów wynosił 200 ms z opóźnieniem echa spinowego 1 ms. Dla widm filtrowanych gradientem, odpowiednio, gradienty o niskiej i wysokiej mocy odpowiadają 3 i 48 Gaussów/cm, i stosowano czas opóźnienia dyfuzyjnego 300 ms. We wszystkich eksperymentach stężenie każdego ligandu wynosiło 100 mM, stężenie FKBP wynosiło 50 mM i bufor stanowiły 50 nM PO4, 100 mM NaCl, pH6,5 (95% D2O). Dane NMR były przetwarzane i analizowane na komputerach Silicon Graphics.
Powyższe przykłady nie ograniczają zakresu i obecny wynalazek obejmuje również sposób modelowania ligandu o wysokim powinowactwie, który jest połączoną kombinacją co najmniej dwóch ligandów znalezionych w przykładzie, tak jak przedstawiono powyżej.
KD dla związku 1 otrzymano z S. Shuker, et al., Science 274: 1531-1534 (1996), podczas gdy dla związków 2-9 oszacowano na podstawie obserwowanego braku zmian przesunięć chemicznych w widmach 15N-HSQC FKBP dla stężenia związku 1,0 mM, jak opisano w tym samym odnośniku.
Claims (23)
1. Sposób przeprowadzania skriningu związków w celu identyfikowania ligandów wiążących się ze specyficzną cząsteczką docelową, znamienny tym, że prowadzi się etapy, w których:
a) generuje się pierwsze jednowymiarowe T2- lub dyfuzyjnie filtrowane widmo NMR jednego związku lub mieszaniny związków chemicznych;
b) wystawia się związek lub mieszaninę związków chemicznych na działanie cząsteczki docelowej;
c) generuje się drugie jednowymiarowe T2- lub dyfuzyjnie filtrowane widmo NMR jednego związku lub mieszaniny związków chemicznych, które zostały wystawione na działanie docelowej cząsteczki b); i
d) porównuje się wymienione pierwsze i drugie jednowymiarowe T2- lub dyfuzyjnie filtrowane widma NMR i określa się różnice pomiędzy wymienionym pierwszym i drugim widmem, które to różnice identyfikują obecność jednego lub więcej związków spośród wymienionych powyżej jednego związku lub mieszaniny związków chemicznych, odpowiednio, będących ligandami, które wiążą się z cząsteczką docelową.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie b) stosuje się mieszaninę związków chemicznych i po etapie d) prowadzi się etapy, w których:
e) generuje się pierwsze jednowymiarowe T2- lub dyfuzyjnie filtrowane widmo NMR każdego związku w mieszaninie;
f) wystawia się każdy związek z wymienionej mieszaniny indywidualnie na działanie cząsteczki docelowej;
g) generuje się drugie jednowymiarowe T2- lub dyfuzyjnie filtrowane widmo NMR każdego związku, który został wystawiony na działanie cząstki docelowej, w etapie f); i
h) porównuje się każde widmo NMR wygenerowane w etapie g) z wymienionym pierwszym widmem NMR i określa się różnice w każdym z tych porównywanych widm, które to różnice identyfikują obecność związku stanowiącego ligand wiążący się z docelową cząsteczką.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przed etapem (a) przeprowadza się etap, w którym wiąże się docelową cząsteczkę z drugim ligandem.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że związki poddawane skriningowi wybiera się ze zbioru związków o zróżnicowanych małych cząsteczkach.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że docelową cząsteczkę dobiera się spośród polipeptydów.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że polipeptyd dobiera się spośród enzymów lub receptorów.
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że docelową cząsteczkę dobiera się spośród kwasów polinukleinowych.
8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się cząsteczkę docelową nie znaczoną.
9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że prowadzi się dodatkowe etapy, w których:
e) stosuje się wymienione porównanie aby wspomóc identyfikację związku chemicznego, który jest ligandem dla cząsteczki docelowej, i
f) sporządza się wymieniony związek.
10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że jako cząsteczkę docelową stosuje się polipeptyd.
11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że stosuje się polipeptyd o masie cząsteczkowej większej niż 5 kDa.
12. Sposób modelowania ligandu o wysokim powinowactwie do docelowej cząsteczki, znamienny tym, że prowadzi się etapy, w których:
a) identyfikuje się pierwszy ligand docelowej cząsteczki za pomocą jednowymiarowej T2- lub dyfuzyjnie filtrowanej spektroskopii NMR sposobem opisanym w zastrz. 1;
b) identyfikuje się jeden lub więcej dodatkowych ligandów na docelowej cząsteczce za pomocą jednowymiarowej T2- lub dyfuzyjnie filtrowanej spektroskopii NMR;
c) tworzy się kompleks pomiędzy pierwszym zidentyfikowanym ligandem i jednym lub więcej niż jednym dodatkowym zidentyfikowanym ligandem z docelową cząsteczką;
d) określa się trójwymiarową strukturę co najmniej tej części kompleksu, w której pierwszy i jeden lub więcej dodatkowych ligandów związane są z docelową cząsteczką, i tym sposobem określa
PL 194 184 B1 się orientację przestrzenną pierwszego i jednego lub więcej dodatkowych ligandów na cząsteczce docelowej; i
e) łączy się pierwszy i jeden lub więcej dodatkowych ligandów zachowując przestrzenną orientację określoną w etapie (d) z utworzeniem ligandu o wysokim powinowactwie.
13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że stosuje się docelową cząsteczkę wybraną spośród polipeptydów.
14. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że stosuje się docelową cząsteczkę nie znaczoną.
15. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że ligand i jeden lub więcej dodatkowych ligandów łączy się razem za pomocą zbieżnej lub liniowej syntezy organicznej tworząc ligand o wysokim powinowactwie.
16. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że tworzy się ligand o wysokim powinowactwie stanowiący ugrupowanie farmaceutycznie czynne.
17. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że pierwszy i jeden lub więcej dodatkowych ligandów dobiera się z puli zróżnicowanych małych cząsteczek.
18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że małe cząsteczki dobiera się ze zbioru związków.
19. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że tworzy się kompleks, przez połączenie pierwszego i jednego lub więcej dodatkowych ligandów z cząsteczką docelową, w roztworze.
20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że kompleks, który tworzy się w roztworze, jest podobny lub identyczny z kompleksem tworzonym pomiędzy ligandem i jednym lub więcej dodatkowymi ligandami w warunkach fizjologicznych.
21. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że przed etapem a) przeprowadza się etap w którym selekcjonuje się cząsteczkę docelową i po etapie e) sporządza się związek chemiczny o strukturze otrzymanej przez przyłączenie pierwszego i wymienionych dodatkowych zidentyfikowanych ligandów przy zachowaniu orientacji przestrzennej określonej w etapie d).
22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że jako cząsteczkę docelową stosuje się polipeptyd.
23. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że stosuje się polipeptyd o masie cząsteczkowej większej niż 5 kDa.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/844,124 US6043024A (en) | 1997-04-18 | 1997-04-18 | Use of one-dimensional nuclear magnetic resonance to identify ligands to target biomolecules |
| PCT/US1998/007907 WO1998048264A1 (en) | 1997-04-18 | 1998-04-17 | Use of one-dimensional nuclear magnetic resonance to identify ligands to target biomolecules |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL336299A1 PL336299A1 (en) | 2000-06-19 |
| PL194184B1 true PL194184B1 (pl) | 2007-05-31 |
Family
ID=25291882
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL98336299A PL194184B1 (pl) | 1997-04-18 | 1998-04-17 | Sposób przeprowadzania skriningu związków do identyfikacji ligandów cząsteczek docelowych i sposób modelowania ligandów |
Country Status (29)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6043024A (pl) |
| EP (1) | EP0975954B2 (pl) |
| JP (1) | JP2002507277A (pl) |
| KR (1) | KR100542420B1 (pl) |
| CN (1) | CN1225648C (pl) |
| AR (1) | AR004651A1 (pl) |
| AT (1) | ATE259061T1 (pl) |
| AU (1) | AU7138098A (pl) |
| BG (1) | BG64326B1 (pl) |
| BR (1) | BR9808079A (pl) |
| CA (1) | CA2286795C (pl) |
| CO (1) | CO5060446A1 (pl) |
| CZ (1) | CZ297275B6 (pl) |
| DE (1) | DE69821475T3 (pl) |
| DK (1) | DK0975954T4 (pl) |
| ES (1) | ES2215296T5 (pl) |
| HK (1) | HK1027158A1 (pl) |
| HU (1) | HU228433B1 (pl) |
| IL (1) | IL131726A0 (pl) |
| NO (1) | NO995078L (pl) |
| NZ (1) | NZ337126A (pl) |
| PL (1) | PL194184B1 (pl) |
| PT (1) | PT975954E (pl) |
| SI (1) | SI0975954T1 (pl) |
| SK (1) | SK285411B6 (pl) |
| TR (1) | TR199902167T2 (pl) |
| TW (1) | TW574502B (pl) |
| WO (1) | WO1998048264A1 (pl) |
| ZA (1) | ZA982919B (pl) |
Families Citing this family (36)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001503646A (ja) * | 1996-03-29 | 2001-03-21 | ローレンス バークレー ナショナル ラボラトリィ | 過分極化希ガス存在下でのｎｍｒまたはｍｒｉの増強 |
| US20030143757A1 (en) * | 1997-06-13 | 2003-07-31 | Jonathan Moore | Methods for identifying drug cores |
| US6111066A (en) | 1997-09-02 | 2000-08-29 | Martek Biosciences Corporation | Peptidic molecules which have been isotopically substituted with 13 C, 15 N and 2 H in the backbone but not in the sidechains |
| US6344330B1 (en) | 1998-03-27 | 2002-02-05 | The Regents Of The University Of California | Pharmacophore recombination for the identification of small molecule drug lead compounds |
| JP2002534687A (ja) * | 1998-12-30 | 2002-10-15 | アメルシャム・パブリック・リミテッド・カンパニー | 過分極を使用したｎｍｒ分光学アッセイ |
| US6333149B1 (en) | 1999-06-04 | 2001-12-25 | Triad Biotechnology, Inc. | NMR-solve method for rapid identification of bi-ligand drug candidates |
| WO2001014886A2 (en) * | 1999-08-23 | 2001-03-01 | Polaris Pharmaceuticals, Inc. | Inhibitors of binding between proteins and macromolecular ligands |
| US6677160B1 (en) | 1999-09-29 | 2004-01-13 | Pharmacia & Upjohn Company | Methods for creating a compound library and identifying lead chemical templates and ligands for target molecules |
| US6764858B2 (en) | 1999-09-29 | 2004-07-20 | Pharmacia & Upjohn Company | Methods for creating a compound library |
| US20010051333A1 (en) * | 2000-04-17 | 2001-12-13 | Pharmacia & Upjohn Company | Nuclear magnetic resonance methods for identifying sites in papillomavirus E2 protein |
| US7146277B2 (en) * | 2000-06-13 | 2006-12-05 | James H. Prestegard | NMR assisted design of high affinity ligands for structurally uncharacterized proteins |
| US20030165431A1 (en) * | 2000-07-13 | 2003-09-04 | The Regents Of The University Of California | Method for detecting macromolecular conformational change and binding information |
| US7061237B2 (en) * | 2000-07-13 | 2006-06-13 | The Regents Of The University Of California | Remote NMR/MRI detection of laser polarized gases |
| EP1320387B1 (en) * | 2000-09-13 | 2012-04-11 | Praecis Pharmaceuticals Incorporated | Pharmaceutical compositions for sustained delivery of peptides |
| AU1106902A (en) | 2000-09-27 | 2002-04-08 | Univ Leiden | Method for applying nmr for ligand discovery or as a drug screening tool |
| CA2432924A1 (en) * | 2000-12-21 | 2002-06-27 | Triad Therapeutics, Inc. | Sea-trosy and related methods |
| GB0031566D0 (en) * | 2000-12-22 | 2001-02-07 | Mets Ometrix | Methods for spectral analysis and their applications |
| US20030092027A1 (en) * | 2001-06-01 | 2003-05-15 | Luciano Mueller | Nuclear magnetic resonance method for identifying ligands to target compounds |
| EP1423427A2 (en) * | 2001-08-27 | 2004-06-02 | Novartis AG | Nogo receptor homologues and their use |
| US7653490B2 (en) | 2001-09-10 | 2010-01-26 | Triad Liquidating Company LLC | Nuclear magnetic resonance assembly of chemical entities |
| US20050221420A1 (en) * | 2001-10-22 | 2005-10-06 | Carmen Barske | Nogo receptor homologues and their use |
| US7037660B2 (en) * | 2001-11-06 | 2006-05-02 | Message Pharmaceuticals | Methods for detecting and quantifying binding and inhibition of binding of species to nucleic acids |
| KR100888805B1 (ko) * | 2002-06-14 | 2009-03-16 | 크리스탈지노믹스(주) | 특정 아미노산이 표지된 단백질과 1ｄ ｎｍｒ 기법을이용하여 단백질의 활성 부위에 결합하는 화합물을검색하는 방법 |
| KR100901309B1 (ko) * | 2002-06-15 | 2009-06-09 | 크리스탈지노믹스(주) | 단백질의 활성 부위에 결합하는 화합물을 선별하는 방법 |
| NO20025738D0 (no) * | 2002-11-29 | 2002-11-29 | Amersham Health As | Metode |
| CA2466792A1 (en) * | 2003-05-16 | 2004-11-16 | Affinium Pharmaceuticals, Inc. | Evaluation of spectra |
| US7595170B2 (en) * | 2004-08-05 | 2009-09-29 | Modrovich Ivan E | Apparatus and method for measuring concentrations of molecules through a barrier |
| US8933209B2 (en) | 2006-04-26 | 2015-01-13 | Abbvie Inc. | Dep2 and its uses in major depressive disorder and other related disorders |
| US20070256148A1 (en) * | 2006-04-26 | 2007-11-01 | Katz David A | DEP2 and its uses in major depressive disorder and other related disorders |
| FR2954830A1 (fr) * | 2009-12-31 | 2011-07-01 | Nmrtec | Methode d'analyse comparative par resonance magnetique nucleaire |
| CA2848520C (en) * | 2011-09-29 | 2019-11-26 | Seattle Genetics, Inc. | Intact mass determination of protein conjugated agent compounds |
| CN102507627B (zh) * | 2011-11-14 | 2014-10-01 | 中国科学院武汉物理与数学研究所 | 一种高通量筛选药物的核磁共振方法 |
| US9678185B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-06-13 | Pepsico, Inc. | Method and apparatus for measuring physico-chemical properties using a nuclear magnetic resonance spectrometer |
| CN104198517B (zh) * | 2014-09-23 | 2017-02-08 | 中国科学院昆明植物研究所 | 联合使用不同核的一维核磁共振混合物定量方法 |
| CN104897826B (zh) * | 2015-06-16 | 2016-06-22 | 广西师范大学 | 一种用于细胞原位检测小分子化合物与靶蛋白相互作用的方法 |
| CN107328804B (zh) * | 2017-07-21 | 2019-02-05 | 中国科学院山西煤炭化学研究所 | 一种甘油加氢反应混合物的核磁共振检测方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4789832A (en) * | 1987-01-14 | 1988-12-06 | Jeol Ltd. | Three-dimensional NMR spectroscopy |
| JPH05503691A (ja) * | 1989-12-29 | 1993-06-17 | ユニバーシティ・テクノロジーズ・インターナショナル・インコーポレイテッド | アゴニストおよびアンタゴニストを含む生物学的に活性なリガンドの３次構造モデルの設計方法およびアンギオテンシンに基づいた新規合成アンタゴニスト |
| US5270163A (en) * | 1990-06-11 | 1993-12-14 | University Research Corporation | Methods for identifying nucleic acid ligands |
| US5698401A (en) * | 1995-11-14 | 1997-12-16 | Abbott Laboratories | Use of nuclear magnetic resonance to identify ligands to target biomolecules |
-
1997
- 1997-04-18 US US08/844,124 patent/US6043024A/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-03-11 TW TW87103594A patent/TW574502B/zh not_active IP Right Cessation
- 1998-04-06 ZA ZA982919A patent/ZA982919B/xx unknown
- 1998-04-15 CO CO98020602A patent/CO5060446A1/es unknown
- 1998-04-17 SI SI9830634T patent/SI0975954T1/xx unknown
- 1998-04-17 CA CA2286795A patent/CA2286795C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-04-17 JP JP54622898A patent/JP2002507277A/ja active Pending
- 1998-04-17 HU HU0003956A patent/HU228433B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1998-04-17 CN CNB988042711A patent/CN1225648C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-04-17 DE DE69821475T patent/DE69821475T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-17 PL PL98336299A patent/PL194184B1/pl unknown
- 1998-04-17 PT PT98918461T patent/PT975954E/pt unknown
- 1998-04-17 BR BR9808079-2A patent/BR9808079A/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-04-17 DK DK98918461T patent/DK0975954T4/da active
- 1998-04-17 AT AT98918461T patent/ATE259061T1/de active
- 1998-04-17 NZ NZ337126A patent/NZ337126A/en not_active IP Right Cessation
- 1998-04-17 ES ES98918461T patent/ES2215296T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-17 TR TR1999/02167T patent/TR199902167T2/xx unknown
- 1998-04-17 IL IL13172698A patent/IL131726A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-04-17 KR KR1019997009544A patent/KR100542420B1/ko active IP Right Grant
- 1998-04-17 EP EP98918461A patent/EP0975954B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-17 WO PCT/US1998/007907 patent/WO1998048264A1/en active IP Right Grant
- 1998-04-17 AU AU71380/98A patent/AU7138098A/en not_active Abandoned
- 1998-04-17 AR ARP980101800A patent/AR004651A1/es unknown
- 1998-04-17 CZ CZ0368399A patent/CZ297275B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-04-17 SK SK1416-99A patent/SK285411B6/sk not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-10-18 NO NO995078A patent/NO995078L/no not_active Application Discontinuation
- 1999-11-04 BG BG103856A patent/BG64326B1/bg unknown
-
2000
- 2000-07-28 HK HK00104759A patent/HK1027158A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL194184B1 (pl) | Sposób przeprowadzania skriningu związków do identyfikacji ligandów cząsteczek docelowych i sposób modelowania ligandów | |
| Vanwetswinkel et al. | TINS, target immobilized NMR screening: an efficient and sensitive method for ligand discovery | |
| van Dongen et al. | Structure-based screening and design in drug discovery | |
| Coles et al. | NMR-based screening technologies | |
| Dalvit et al. | NMR-based quality control approach for the identification of false positives and false negatives in high throughput screening | |
| Yanamala et al. | NMR‐Based Screening of Membrane Protein Ligands | |
| Davis | Screening protein–small molecule interactions by NMR | |
| Craik et al. | Studies of protein-ligand interactions by NMR | |
| Maurer | Advancing fragment binders to lead-like compounds using ligand and protein-based NMR spectroscopy | |
| JP2005536763A (ja) | 高処理量スクリーニングのためのフッ素ｎｍｒの使用 | |
| JP2003513290A (ja) | ターゲット生体分子と相互作用するリガンドの同定のための二量子１ｈ−ｎｍｒスペクトロスコピーの使用 | |
| AU772620B2 (en) | Use of one-dimensional nuclear magnetic resonance to identify ligands to target biomolecules | |
| Davis | Fragment Screening by NMR | |
| US20030077628A1 (en) | Method of screening compounds for biological activity | |
| JP5129424B2 (ja) | リガンドの発見または薬物スクリーニング手段としてのｎｍｒ利用法 | |
| EP0210410B1 (en) | Fluorescence polarization immunoassay and reagents for measurement of c-reactive protein | |
| MXPA99009558A (en) | Use of one-dimensional nuclear magnetic resonance to identify ligands to target biomolecules | |
| US20120122237A1 (en) | Homogeneous noncompetitive detection of post translational modifications for use in high throughput assays | |
| Nowak et al. | Microscale thermophoresis (MST) and Spectral Shift (SpS) in drug discovery | |
| JPH10221341A (ja) | 体液中の遊離リガンドの測定方法 | |
| Blommers et al. | Strategies for drug discovery using NMR | |
| Huber | Application of SPR technology to pharmaceutical relevant drug-receptor interactions | |
| Jahnke | Fragment-based Ligand Design |