JP2003513290A - ターゲット生体分子と相互作用するリガンドの同定のための二量子１ｈ−ｎｍｒスペクトロスコピーの使用 - Google Patents
ターゲット生体分子と相互作用するリガンドの同定のための二量子１ｈ−ｎｍｒスペクトロスコピーの使用Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明はターゲット生体分子、例えばタンパク質等の治療ターゲット生体分子と相互作用する化合物を同定及び提供するための迅速で効率的なスクリーニング法として、ターゲット生体分子の存在下と不在下で化合物の混合物の二次元プロトン（再集束又は非再集束）二量子又は二量子緩和加重二量子スペクトルを生成し、ターゲット生体分子と結合する１種以上の化合物の存在を示すスペクトル間の差異がある場合にはこれを検出する方法を提供する。
Description
【０００１】
発明の技術分野
本発明はターゲット生体分子に対する潜在的薬剤の基礎構造となる化学分子の
検出における１Ｈ二次元二量子スペクトロスコピーの使用方法に関する。
検出における１Ｈ二次元二量子スペクトロスコピーの使用方法に関する。
【０００２】
発明の背景
潜在的な主導的役割を担う化合物の迅速な同定は薬剤発見プロセスの最重要段
階である。
階である。
【０００３】
多くの場合、主要分子はランダム又は指向性サブライブラリー高スループット
スクリーニング等の生体スクリーニング技術により同定される。市販の化学ライ
ブラリーやロボットシステムをバイオアッセイに利用すると、数十万種の化合物
を数カ月で試験することができる。
スクリーニング等の生体スクリーニング技術により同定される。市販の化学ライ
ブラリーやロボットシステムをバイオアッセイに利用すると、数十万種の化合物
を数カ月で試験することができる。
【０００４】
しかし、これらのアッセイは種々の潜在エラー原因（例えば検出システム、細
胞毒性、正しいターゲットとの結合不在）によりアーチファクトを生じることが
ある。所望ターゲットと相互作用する化合物を同定するために有用なツールとし
て過去にＮＭＲスペクトロスコピーが出現し１−１０、これらの技術の数種のも
のが当分野で公知である。例えば、いずれもＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ名義の国際特許出願ＷＯ９７／１８４６９、ＷＯ９７／１８４７１及びＷ
Ｏ９８／４８２６４とＶｅｒｔｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ
．名義のＷＯ９８／５７１５５参照。
胞毒性、正しいターゲットとの結合不在）によりアーチファクトを生じることが
ある。所望ターゲットと相互作用する化合物を同定するために有用なツールとし
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．名義のＷＯ９８／５７１５５参照。
【０００５】
これらの公知技術は主にタンパク質のシグナルをモニターするもの１，２，１ ０
と、リガンドのシグナルをモニターするもの３−７の２種類に基本的に分類で
きる。しかし、どちらの技術にもいくつかの欠点がある。
きる。しかし、どちらの技術にもいくつかの欠点がある。
【０００６】
例えば、前者は一般に１５Ｎ標識タンパク質ターゲットを使用しているので現
状では低分子量（＜３０ｋＤａ）のタンパク質に限られており、後者は一次元（
１Ｄ）ＮＭＲ実験を使用して分子の混合物に含まれるリガンドを同定している。
このため、特に１０種を越える化合物を含む場合には化合物の混合物の１Ｄスペ
クトルがオーバーラップするという問題があり、ターゲット生体分子と相互作用
する分子を同定するのは困難である。化合物の混合物のスクリーニングにはトラ
ンスファーＮＯＥに基づく二次元（２Ｄ）同核法が提案されている１１，１２。
この技術はドイツ特許ＤＥ１９６４９３５９（Ｐｅｔｅｒ Ｔｈｏｍａｓ）に開
示されている。しかし、実験感度が低く、高リガンド濃度が必要であるが、リガ
ンドがさほど水溶性でない場合及び／又は多数の異なる化合物の混合物を試験し
なければならない場合にはこのようなリガンド濃度に達することは難しいため、
大きな支障が生じる。
状では低分子量（＜３０ｋＤａ）のタンパク質に限られており、後者は一次元（
１Ｄ）ＮＭＲ実験を使用して分子の混合物に含まれるリガンドを同定している。
このため、特に１０種を越える化合物を含む場合には化合物の混合物の１Ｄスペ
クトルがオーバーラップするという問題があり、ターゲット生体分子と相互作用
する分子を同定するのは困難である。化合物の混合物のスクリーニングにはトラ
ンスファーＮＯＥに基づく二次元（２Ｄ）同核法が提案されている１１，１２。
この技術はドイツ特許ＤＥ１９６４９３５９（Ｐｅｔｅｒ Ｔｈｏｍａｓ）に開
示されている。しかし、実験感度が低く、高リガンド濃度が必要であるが、リガ
ンドがさほど水溶性でない場合及び／又は多数の異なる化合物の混合物を試験し
なければならない場合にはこのようなリガンド濃度に達することは難しいため、
大きな支障が生じる。
【０００７】
そこで、本発明者らは特定生体分子ターゲットと結合するリガンドの同定にお
いて化合物の混合物を迅速、確実且つ効率的にスクリーニングする新規手段のた
めの別のＮＭＲ技術を提案する。
いて化合物の混合物を迅速、確実且つ効率的にスクリーニングする新規手段のた
めの別のＮＭＲ技術を提案する。
【０００８】
発明の要約
本発明は特定未標識ターゲットタンパク質との結合性について化合物をスクリ
ーニングするためのＮＭＲ法を提供する。
ーニングするためのＮＭＲ法を提供する。
【０００９】
従って、本発明の目的はターゲット生体分子と相互作用するリガンドを提供す
る方法として、 ｉ）少なくとも２個の二重項を含む１種以上の化学分子を含む溶液の二次元プロ
トン（再集束又は非再集束）二量子又はＤＱＣ（二量子コヒーレンス）緩和加重
二量子スペクトルを生成する段階と、 ｉｉ）ターゲット生体分子を更に含む前記溶液の二次元プロトン（再集束又は非
再集束）二重量子又はＤＱＣ緩和加重二量子スペクトルを生成する段階と、 ｉｉｉ）（ｉ）のスペクトルを（ｉｉ）のスペクトルと比較し、ターゲット生体
分子と結合する１種以上の化学分子の存在を示す差異がある場合にはこれを検出
し、前記１種以上の化学分子をリガンド、すなわち、ターゲット生体分子のリガ
ンドとして選択する段階を含む方法である。
る方法として、 ｉ）少なくとも２個の二重項を含む１種以上の化学分子を含む溶液の二次元プロ
トン（再集束又は非再集束）二量子又はＤＱＣ（二量子コヒーレンス）緩和加重
二量子スペクトルを生成する段階と、 ｉｉ）ターゲット生体分子を更に含む前記溶液の二次元プロトン（再集束又は非
再集束）二重量子又はＤＱＣ緩和加重二量子スペクトルを生成する段階と、 ｉｉｉ）（ｉ）のスペクトルを（ｉｉ）のスペクトルと比較し、ターゲット生体
分子と結合する１種以上の化学分子の存在を示す差異がある場合にはこれを検出
し、前記１種以上の化学分子をリガンド、すなわち、ターゲット生体分子のリガ
ンドとして選択する段階を含む方法である。
【００１０】
ターゲット生体分子と相互作用する分子種の同定は上記（ｉ）及び（ｉｉ）に
記載した２種の二次元スペクトルの分析により得られる。
記載した２種の二次元スペクトルの分析により得られる。
【００１１】
本発明の好適な一態様によると、場合により付加的段階として上記段階ｉｉｉ
）でリガンドとして同定した化合物毎にターゲットタンパク質の存在下と不在下
で二次元プロトン（再集束又は非再集束）二量子スペクトルの生成を含む。
）でリガンドとして同定した化合物毎にターゲットタンパク質の存在下と不在下
で二次元プロトン（再集束又は非再集束）二量子スペクトルの生成を含む。
【００１２】
本発明の別の好適態様によると、二次元プロトン（再集束又は非再集束）二量
子又はＤＱＣ緩和加重二量子スペクトルをｚ又はマジックアングルパルス磁場勾
配により記録する。
子又はＤＱＣ緩和加重二量子スペクトルをｚ又はマジックアングルパルス磁場勾
配により記録する。
【００１３】
本発明の方法は巨大分子と相互作用する化合物の差スピン−スピン及び二量子
コヒーレンス緩和を効率的且つ同時に利用する。本発明の利点の１つはターゲッ
ト生体分子に対するバインダーである分子をスピニングの必要なしに２Ｄスペク
トルから直接決定できるという点にある。また、コヒーレンス選択勾配の使用に
より良好な多重溶媒抑制が得られるという利点もある。マジックアングルで傾斜
したコヒーレンス選択パルス磁場勾配を使用すると優れた多重溶媒抑制が達せら
れる。
コヒーレンス緩和を効率的且つ同時に利用する。本発明の利点の１つはターゲッ
ト生体分子に対するバインダーである分子をスピニングの必要なしに２Ｄスペク
トルから直接決定できるという点にある。また、コヒーレンス選択勾配の使用に
より良好な多重溶媒抑制が得られるという利点もある。マジックアングルで傾斜
したコヒーレンス選択パルス磁場勾配を使用すると優れた多重溶媒抑制が達せら
れる。
【００１４】
従って、非ジュウテリウム化溶媒中で化合物の混合物を調製することができる
。
。
【００１５】
本発明の方法の他の大きな利点は感度が高く、弱いバインダーも同定できると
いう点である。
いう点である。
【００１６】
更に、この方法は上限が無制限の大きなターゲット生体分子に適用できるとい
う利点もあり、１５Ｎ又は１３Ｃ標識生体分子を必要としない。
う利点もあり、１５Ｎ又は１３Ｃ標識生体分子を必要としない。
【００１７】
上述のように、本方法はスクリーニングする分子のプロトンスペクトルが少な
くとも２個の二重線を含むことを絶対要件とする。しかし、大半の分子は相互に
スカラー結合した２個のプロトンを含んでいるので、これは全く厳しい要件では
ない。
くとも２個の二重線を含むことを絶対要件とする。しかし、大半の分子は相互に
スカラー結合した２個のプロトンを含んでいるので、これは全く厳しい要件では
ない。
【００１８】
図面の簡単な説明
図１は２Ｄ１Ｈ二量子（ａ）及びＤＱＣ緩和加重二量子（ｂ）パルスシーケン
ス（ｚ又はマジックアングルパルス磁場勾配を有するパルスシーケンス）を示す
。勾配Ｇ１〜Ｇ３はコヒーレンス選択勾配であり、３軸勾配ハードウェアを入手
可能な場合にはマジックアングルで適用すべきである１３。最初の２つの弱いパ
ルス磁場勾配（ＰＦＧ）は輻射減衰の抑制に使用する。遅延τは３０〜５０ミリ
秒であり、遅延τ１は１０〜２００ミリ秒に設定する。Ｈ２Ｏ抑制が最適でない
場合にはｚ−ＰＦＧ法のＤＱ実験で励起ＤＱ時間前に非常に弱い（＜２０Ｈｚ）
Ｈ２Ｏ予備飽和磁場を加えてもよい。実験の技術的詳細と再集束ＤＱ実験のパル
スシーケンスは最近の研究論文１４に記載されている。
ス（ｚ又はマジックアングルパルス磁場勾配を有するパルスシーケンス）を示す
。勾配Ｇ１〜Ｇ３はコヒーレンス選択勾配であり、３軸勾配ハードウェアを入手
可能な場合にはマジックアングルで適用すべきである１３。最初の２つの弱いパ
ルス磁場勾配（ＰＦＧ）は輻射減衰の抑制に使用する。遅延τは３０〜５０ミリ
秒であり、遅延τ１は１０〜２００ミリ秒に設定する。Ｈ２Ｏ抑制が最適でない
場合にはｚ−ＰＦＧ法のＤＱ実験で励起ＤＱ時間前に非常に弱い（＜２０Ｈｚ）
Ｈ２Ｏ予備飽和磁場を加えてもよい。実験の技術的詳細と再集束ＤＱ実験のパル
スシーケンスは最近の研究論文１４に記載されている。
【００１９】
図２のパネル（ａ）はターゲットタンパク質の不在下の混合物１（Ａｃ−Ｔｙ
ｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−ＯＨ（共鳴Ａ）、Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ３Ｈ２）−
Ｖａｌ−ＮＨ２（共鳴Ｂ）及びＡｃ−（Ｎ−Ｍｅ）Ｐｈｅ（ｐ−ＣＨ２ＰＯ３Ｈ ２ ）−Ｖａｌ−Ａｓｎ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）２（共鳴Ｃ））の２Ｄ
ＤＱスペクトルのフィンガープリント領域を示す。図２のパネル（ｂ）はＧｒｂ
２ ＳＨ２ドメインの存在下の前記混合物の同一２Ｄ ＤＱフィンガープリント
領域を示す。遅延τは４２ミリ秒である。各分子はターゲットタンパク質に対し
て２：１（１００μＭ：５０μＭ）のモル比で存在している。（ｂ）中の長方形
は消失交差ピークの位置を示す。
ｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−ＯＨ（共鳴Ａ）、Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ３Ｈ２）−
Ｖａｌ−ＮＨ２（共鳴Ｂ）及びＡｃ−（Ｎ−Ｍｅ）Ｐｈｅ（ｐ−ＣＨ２ＰＯ３Ｈ ２ ）−Ｖａｌ−Ａｓｎ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）２（共鳴Ｃ））の２Ｄ
ＤＱスペクトルのフィンガープリント領域を示す。図２のパネル（ｂ）はＧｒｂ
２ ＳＨ２ドメインの存在下の前記混合物の同一２Ｄ ＤＱフィンガープリント
領域を示す。遅延τは４２ミリ秒である。各分子はターゲットタンパク質に対し
て２：１（１００μＭ：５０μＭ）のモル比で存在している。（ｂ）中の長方形
は消失交差ピークの位置を示す。
【００２０】
図３のパネル（ａ）はターゲットタンパク質の不在下の混合物１（Ａｃ−Ｔｙ
ｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−ＯＨ（共鳴Ａ）、Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ３Ｈ２）−
Ｖａｌ−ＮＨ２（共鳴Ｂ）及びＡｃ−（Ｎ−Ｍｅ）Ｐｈｅ（ｐ−ＣＨ２ＰＯ３Ｈ ２ ）−Ｖａｌ−Ａｓｎ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）２（共鳴Ｃ））の２Ｄ
ＤＱＣ緩和加重二量子スペクトルの芳香族領域を示す。図３のパネル（ｂ）及び
（ｃ）はＧｒｂ２ ＳＨ２ドメインの存在下の混合物１の２Ｄ二量子及びＤＱＣ
緩和加重二量子スペクトルの同一スペクトル領域を夫々示す。遅延τ及びτ１は
夫々４２ミリ秒と２４ミリ秒である。点線は二量子疑似対角線に対応する。直接
ピークは対角線について対称に配置される。（ｂ）と（ｃ）の消失リガンド共鳴
は化合物Ｃの芳香族部分の共鳴である。
ｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−ＯＨ（共鳴Ａ）、Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ３Ｈ２）−
Ｖａｌ−ＮＨ２（共鳴Ｂ）及びＡｃ−（Ｎ−Ｍｅ）Ｐｈｅ（ｐ−ＣＨ２ＰＯ３Ｈ ２ ）−Ｖａｌ−Ａｓｎ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）２（共鳴Ｃ））の２Ｄ
ＤＱＣ緩和加重二量子スペクトルの芳香族領域を示す。図３のパネル（ｂ）及び
（ｃ）はＧｒｂ２ ＳＨ２ドメインの存在下の混合物１の２Ｄ二量子及びＤＱＣ
緩和加重二量子スペクトルの同一スペクトル領域を夫々示す。遅延τ及びτ１は
夫々４２ミリ秒と２４ミリ秒である。点線は二量子疑似対角線に対応する。直接
ピークは対角線について対称に配置される。（ｂ）と（ｃ）の消失リガンド共鳴
は化合物Ｃの芳香族部分の共鳴である。
【００２１】
図４のパネル（ａ）は混合物２（Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｏ
Ｈ（共鳴Ａ）、Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ３Ｈ２）−Ｖａｌ−ＮＨ２（共鳴Ｂ）、イン
ドール（共鳴Ｃ）及びＡｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ３Ｈ２）−Ｖａｌ−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ
Ｈ２−ＣＯＮＨ２（共鳴Ｄ））の２Ｄ ＤＱスペクトルのフィンガープリント領
域を示す。インドールの共鳴はこのスペクトル領域では認められない。図４のパ
ネル（ｂ）はＧｒｂ２−ＳＨ２ドメインの存在下の前記４種の化合物の混合物の
同一２Ｄ ＤＱフィンガープリント領域を示す。図４のパネル（ｃ）は２つの２
Ｄ ＤＱスペクトル（ａ）及び（ｂ）の相殺により得られる２Ｄ差スペクトルを
示す。（ｃ）に認められるシグナルはスペクトル（ｂ）で消失している化合物Ｃ
のシグナルと、タンパク質の存在下の小さい化学シフト変化を示す化合物Ｂの１
個のシグナルである。これは化合物ＢとＧｒｂ２−ＳＨ２ドメインの弱い相互作
用の可能性を示している。各分子はターゲットタンパク質に対して６：１（３０
０μＭ：５０μＭ）のモル比で存在している。インドールの共鳴はタンパク質の
存在により変化しない（データは示さず）。
Ｈ（共鳴Ａ）、Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ３Ｈ２）−Ｖａｌ−ＮＨ２（共鳴Ｂ）、イン
ドール（共鳴Ｃ）及びＡｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ３Ｈ２）−Ｖａｌ−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ
Ｈ２−ＣＯＮＨ２（共鳴Ｄ））の２Ｄ ＤＱスペクトルのフィンガープリント領
域を示す。インドールの共鳴はこのスペクトル領域では認められない。図４のパ
ネル（ｂ）はＧｒｂ２−ＳＨ２ドメインの存在下の前記４種の化合物の混合物の
同一２Ｄ ＤＱフィンガープリント領域を示す。図４のパネル（ｃ）は２つの２
Ｄ ＤＱスペクトル（ａ）及び（ｂ）の相殺により得られる２Ｄ差スペクトルを
示す。（ｃ）に認められるシグナルはスペクトル（ｂ）で消失している化合物Ｃ
のシグナルと、タンパク質の存在下の小さい化学シフト変化を示す化合物Ｂの１
個のシグナルである。これは化合物ＢとＧｒｂ２−ＳＨ２ドメインの弱い相互作
用の可能性を示している。各分子はターゲットタンパク質に対して６：１（３０
０μＭ：５０μＭ）のモル比で存在している。インドールの共鳴はタンパク質の
存在により変化しない（データは示さず）。
【００２２】
図５はＧｒｂ２−ＳＨ２の不在下（ａ）と存在下（ｂ）の混合物２の２Ｄ Ｄ
Ｑスペクトルの拡大領域を示す。（ｃ）のスペクトルは２つの２Ｄ ＤＱスペク
トル（ａ）及び（ｂ）の相殺により得られる２Ｄ差スペクトルを示す。他の実験
パラメーターは図４に記載した通りである。（ａ）に交差ピークＡ及びＤの強い
オーバーラップがあるが、タンパク質の存在により変化しない交差ピークを２Ｄ
ＤＱ差スペクトル（ｃ）で同定することができる。
Ｑスペクトルの拡大領域を示す。（ｃ）のスペクトルは２つの２Ｄ ＤＱスペク
トル（ａ）及び（ｂ）の相殺により得られる２Ｄ差スペクトルを示す。他の実験
パラメーターは図４に記載した通りである。（ａ）に交差ピークＡ及びＤの強い
オーバーラップがあるが、タンパク質の存在により変化しない交差ピークを２Ｄ
ＤＱ差スペクトル（ｃ）で同定することができる。
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明はターゲット生体分子、例えば治療ターゲット生体分子と相互作用する
化学部分を同定及び提供するための迅速で効率的なスクリーニング法を提供する
。
化学部分を同定及び提供するための迅速で効率的なスクリーニング法を提供する
。
【００２４】
分子はターゲット生体分子の存在下におけるリガンドシグナルの強度又は化学
シフトのそれぞれの変化を２Ｄ１Ｈ ＤＱ又はＤＱＣ（再集束又は非再集束）緩
和加重ＤＱ実験（好ましくはＰＦＧ法）で追跡することにより同定される。
シフトのそれぞれの変化を２Ｄ１Ｈ ＤＱ又はＤＱＣ（再集束又は非再集束）緩
和加重ＤＱ実験（好ましくはＰＦＧ法）で追跡することにより同定される。
【００２５】
ターゲット生体分子は溶液中に遊離しているか、界面活性剤もしくはミセルに
溶解しているか、又は樹脂に結合している。
溶解しているか、又は樹脂に結合している。
【００２６】
樹脂サンプルでは、二次元マジックアングルスピニング（ＭＡＳ）ＤＱ又はＤ
ＱＣ緩和加重ＤＱ実験（好ましくはＰＦＧ法）を記録する。
ＱＣ緩和加重ＤＱ実験（好ましくはＰＦＧ法）を記録する。
【００２７】
本発明の方法によるターゲット生体分子はリガンドよりも十分に寸法が大きく
、選択されたリガンドと結合することが可能な任意生体分子である。
、選択されたリガンドと結合することが可能な任意生体分子である。
【００２８】
適切な生体分子は例えばタンパク質、ペプチド、抗体、ＤＮＡ又はＲＮＡフラ
グメント等である。
グメント等である。
【００２９】
ターゲット生体分子はタンパク質が好ましい。
【００３０】
ＮＭＲタイムスケールで交換速度の大きいリガンド（ＫＤ＞３０〜５０μＭ）
では、ターゲット生体分子（例えばタンパク質）の存在下で化学シフトの変化（
ΔΩ）が観測される。ΔΩは化学部分の遊離状態と結合状態の化学シフトの集団
加重平均である。リガンドはターゲット生体分子に対する親和性が高いほど中間
交換（ＫＤが数μＭ範囲）又は低速交換（ＫＤ＜１μＭ）を示すことができる。
これらの場合には、リガンド共鳴はタンパク質の存在下に記録した２Ｄ ＤＱス
ペクトルで減衰又は広幅化される。
では、ターゲット生体分子（例えばタンパク質）の存在下で化学シフトの変化（
ΔΩ）が観測される。ΔΩは化学部分の遊離状態と結合状態の化学シフトの集団
加重平均である。リガンドはターゲット生体分子に対する親和性が高いほど中間
交換（ＫＤが数μＭ範囲）又は低速交換（ＫＤ＜１μＭ）を示すことができる。
これらの場合には、リガンド共鳴はタンパク質の存在下に記録した２Ｄ ＤＱス
ペクトルで減衰又は広幅化される。
【００３１】
２Ｄ１Ｈ ＤＱ及びＤＱＣ緩和加重ＤＱ実験（ＰＦＧ法）のパルスシーケンス
を図１ａ及び１ｂに夫々示す。
を図１ａ及び１ｂに夫々示す。
【００３２】
ターゲット巨大分子と相互作用するリガンドの２つのスピン１及び２について
説明すると、これらの２つのスピンはＪ１２カップリング定数でスカラー結合し
ている。図１ａ及び図１ｂのパルスシーケンスでスピン１の磁化Ｍ１ ＋（０）に
より生じるスピン１の検出磁化Ｍ１ ＋（ｔ１，ｔ２）は夫々下式で与えられる。
説明すると、これらの２つのスピンはＪ１２カップリング定数でスカラー結合し
ている。図１ａ及び図１ｂのパルスシーケンスでスピン１の磁化Ｍ１ ＋（０）に
より生じるスピン１の検出磁化Ｍ１ ＋（ｔ１，ｔ２）は夫々下式で与えられる。
【００３３】
【数１】
スピン２の磁化Ｍ２ ＋（０）により生じるスピン１の検出磁化Ｍ１ ＋（ｔ１，
ｔ２）についても同様の式が導かれる。式（１）及び（２）を導く際に、多重項
の平行遷移は同一スピン−スピン緩和をもつと仮定した。換言するならば、１Ｈ
ＤＤ−ＣＳＡ交差相関項は無視できるとみなした。
ｔ２）についても同様の式が導かれる。式（１）及び（２）を導く際に、多重項
の平行遷移は同一スピン−スピン緩和をもつと仮定した。換言するならば、１Ｈ
ＤＤ−ＣＳＡ交差相関項は無視できるとみなした。
【００３４】
ｆは単量子（ＳＱ）及び二量子コヒーレンス間の正逆変換効率を表す三角関数
である。２スピン系では、エコー経路選択の三角関数は下式１４，１８−２０：
である。２スピン系では、エコー経路選択の三角関数は下式１４，１８−２０：
【００３５】
【数２】
で与えられ、反エコー経路選択では下式：
【００３６】
【数３】
で与えられ、式中、βは観測パルスの角度であり、τは励起ＤＱ時間である。
【００３７】
ΩＤＱとΩＳＱは夫々ＤＱ及びＳＱコヒーレンスの化学シフトである。Ｔ２ Ｓ Ｑ
とＴＤＱは夫々実験により観測されるスピン１のスピン−スピン緩和と二量子
緩和である。式（１）及び（２）の他の項は図１に記載した通りである。観測さ
れるＴ２ ＳＱとＴＤＱは遊離分子と、２集団のモルフラクションを加重したタン
パク質と複合化している分子のプロトン緩和の平均である。中間交換の場合には
夫々１及び３個の付加交換項が（ＳＱ）及び（ＤＱ）コヒーレンスの観測緩和に
寄与する１６。従って、小さい分子がターゲット巨大分子に結合すると、Ｔ２ Ｓ Ｑ 及びＴＤＱは短くなる（即ち交差ピークのシグナルは両次元で広幅化する）。
広幅化はω１ではＴＤＱが短いためであり（大きい分子ではＤＱ緩和が非常に速
い２１）、ω２ではＴ２ ＳＱが短いためである。この広幅化はタンパク質の存在
下と不在下のリガンドの２Ｄ ＤＱスペクトルを比較することにより判定される
。
緩和である。式（１）及び（２）の他の項は図１に記載した通りである。観測さ
れるＴ２ ＳＱとＴＤＱは遊離分子と、２集団のモルフラクションを加重したタン
パク質と複合化している分子のプロトン緩和の平均である。中間交換の場合には
夫々１及び３個の付加交換項が（ＳＱ）及び（ＤＱ）コヒーレンスの観測緩和に
寄与する１６。従って、小さい分子がターゲット巨大分子に結合すると、Ｔ２ Ｓ Ｑ 及びＴＤＱは短くなる（即ち交差ピークのシグナルは両次元で広幅化する）。
広幅化はω１ではＴＤＱが短いためであり（大きい分子ではＤＱ緩和が非常に速
い２１）、ω２ではＴ２ ＳＱが短いためである。この広幅化はタンパク質の存在
下と不在下のリガンドの２Ｄ ＤＱスペクトルを比較することにより判定される
。
【００３８】
実用的観点では結合の検出に関する段階は、
ａ）相互作用しない１〜ｎ種の化合物を混合する段階と、
ｂ）ターゲット生体分子の不在下で前記化合物の混合物について二次元１Ｈ Ｄ
Ｑ又はＤＱＣ（再集束又は非再集束）緩和加重ＤＱスペクトル（好ましくはＰＦ
Ｇ法）を記録する段階と、 ｃ）混合物を構成する分子の各々が好ましくはターゲット生体分子に対して約１
：１〜約２０：１のモル比で存在するように前記化合物の混合物をターゲット生
体分子と混合する段階と、 ｄ）ターゲット生体分子の存在下で前記化合物の混合物について二次元１Ｈ Ｄ
Ｑ又はＤＱＣ（再集束又は非再集束）緩和加重ＤＱスペクトル（好ましくはＰＦ
Ｇ法）を記録する段階と、 ｅ）段階ｂ）及びｄ）で記録したスペクトルを比較し、混合物の化学種が存在す
る場合には、どの化学種がターゲット生体分子と相互作用したかを検出する段階
と、場合により ｆ）上記段階（ｅ）で検出した化合物の各々についてターゲットタンパク質の存
在下と不在下で二次元１Ｈ ＤＱ又はＤＱＣ（再集束又は非再集束）緩和加重Ｄ
Ｑスペクトル（好ましくはＰＦＧ法）を記録する段階が好ましい。
Ｑ又はＤＱＣ（再集束又は非再集束）緩和加重ＤＱスペクトル（好ましくはＰＦ
Ｇ法）を記録する段階と、 ｃ）混合物を構成する分子の各々が好ましくはターゲット生体分子に対して約１
：１〜約２０：１のモル比で存在するように前記化合物の混合物をターゲット生
体分子と混合する段階と、 ｄ）ターゲット生体分子の存在下で前記化合物の混合物について二次元１Ｈ Ｄ
Ｑ又はＤＱＣ（再集束又は非再集束）緩和加重ＤＱスペクトル（好ましくはＰＦ
Ｇ法）を記録する段階と、 ｅ）段階ｂ）及びｄ）で記録したスペクトルを比較し、混合物の化学種が存在す
る場合には、どの化学種がターゲット生体分子と相互作用したかを検出する段階
と、場合により ｆ）上記段階（ｅ）で検出した化合物の各々についてターゲットタンパク質の存
在下と不在下で二次元１Ｈ ＤＱ又はＤＱＣ（再集束又は非再集束）緩和加重Ｄ
Ｑスペクトル（好ましくはＰＦＧ法）を記録する段階が好ましい。
【００３９】
リガンドとして同定した化合物毎にターゲットタンパク質の存在下と不在下で
二次元プロトン二量子スペクトルを場合により生成する付加段階（ｆ）はリガン
ドとターゲット生体分子の結合を検出する段階（ｅ）を確認するためにかなり複
雑な混合物で有用であると思われる。
二次元プロトン二量子スペクトルを場合により生成する付加段階（ｆ）はリガン
ドとターゲット生体分子の結合を検出する段階（ｅ）を確認するためにかなり複
雑な混合物で有用であると思われる。
【００４０】
従って、本発明の方法はターゲット生体分子と相互作用し得る１種以上即ち１
〜ｎ種の化学部分にも適用できるので、段階（ｆ）はｎ＞１種の化合物を試験す
る場合に特に有用であることが当業者に明白である。
〜ｎ種の化学部分にも適用できるので、段階（ｆ）はｎ＞１種の化合物を試験す
る場合に特に有用であることが当業者に明白である。
【００４１】
本発明の方法は好ましくは１〜１０種の、より好ましくは１〜５種の化合物を
含む被験化合物の任意混合物に適用される。
含む被験化合物の任意混合物に適用される。
【００４２】
スクリーニングに２Ｄ ＤＱスペクトロスコピーを利用する本発明は以下に簡
単に説明するいくつかの固有の利点がある。
単に説明するいくつかの固有の利点がある。
【００４３】
−特にβ＝４５°／１３５°又はβ＝６０°／１２０°で記録するＰＦＧ法の
実験は小サイズ及び中サイズの分子の分析に最も高感度な２Ｄ ＮＭＲ実験であ
る。
実験は小サイズ及び中サイズの分子の分析に最も高感度な２Ｄ ＮＭＲ実験であ
る。
【００４４】
−良好な品質の２Ｄ ＤＱスペクトルを比較的短時間で得るのに約５０〜１０
０μＭの濃度で十分である。クライオプローブ技術２２−２４を２Ｄ ＰＦＧ
ＤＱスペクトロスコピーと併用すると、現行で必要な約１３〜２５μＭのリガン
ド濃度を下げることができる。従って、多数の分子を含む複雑な混合物を調製す
ることができ、例えば有機酸又は塩基の存在に起因する溶液（例えば水性緩衝溶
液）のｐＨ変化が避けられる。疎水性化合物は濃度が高いと水溶液に溶けないが
、これらの実験は低リガンド濃度しか必要としないため、疎水性化合物も使用で
きる。最も重要な点として、実験の高感度とクライオプローブ技術が相俟って、
スクリーニングに必要な貴重なターゲット生体分子（例えばタンパク質）の量が
少なくてすむ。各サンプルのタンパク質濃度は低く、約１〜約５μＭ程度とする
ことができる。
０μＭの濃度で十分である。クライオプローブ技術２２−２４を２Ｄ ＰＦＧ
ＤＱスペクトロスコピーと併用すると、現行で必要な約１３〜２５μＭのリガン
ド濃度を下げることができる。従って、多数の分子を含む複雑な混合物を調製す
ることができ、例えば有機酸又は塩基の存在に起因する溶液（例えば水性緩衝溶
液）のｐＨ変化が避けられる。疎水性化合物は濃度が高いと水溶液に溶けないが
、これらの実験は低リガンド濃度しか必要としないため、疎水性化合物も使用で
きる。最も重要な点として、実験の高感度とクライオプローブ技術が相俟って、
スクリーニングに必要な貴重なターゲット生体分子（例えばタンパク質）の量が
少なくてすむ。各サンプルのタンパク質濃度は低く、約１〜約５μＭ程度とする
ことができる。
【００４５】
−本方法は式（１）及び（２）に示すような２種の物性Ｔ２ ＳＱ及びＴＤＱを
併用するため、弱いリガンドの検出に高感度なツールである。溶液中に遊離して
いる分子と、巨大分子と複合化している分子のＴＤＱの差は非常に大きい。
併用するため、弱いリガンドの検出に高感度なツールである。溶液中に遊離して
いる分子と、巨大分子と複合化している分子のＴＤＱの差は非常に大きい。
【００４６】
−コヒーレンス選択勾配の使用により良好な溶媒抑制が得られる。マジックア
ングルで傾斜したコヒーレンス選択勾配を用いると優れた多重溶媒抑制が達せら
れる。ＮＭＲによるスクリーニングではレシーバーのダイナミックレンジを最適
方法で最大化する必要があるが、このように非常に希薄なサンプルを観測する場
合にこのことは特に重要である。また、多重溶媒抑制が優れていると、非ジュウ
テリウム化溶媒（即ちＤＭＳＯ、ＣＨ３ＯＨ）で化合物の混合物のストック溶液
を調製することも可能になる。Ｈ２Ｏに溶かしたサンプルを使用すると、ＮＨ二
重項の交換可能な共鳴が観測されるという重要な利点もある。これらのシグナル
はＤ２Ｏ溶液中で記録したスペクトルには存在しない。ＮＨプロトンシグナルは
他のシグナルと全く又は殆どオーバーラップせずにスペクトル領域に存在するの
で、複雑な混合物での帰属目的に使用できる。更に、リガンドＮＨは溶液中に遊
離している場合と水素がタンパク質に結合している場合の化学シフトの差が大き
いが、この差は同一リガンドの他のプロトンでは非常に小さい。化学シフトの差
が大きいと、観測されるＴ２ ＳＱ及びＴＤＱ緩和への大きい化学交換への寄与に
よる顕著な広幅化に起因するか又は検出可能な化学シフト変化に起因するＮＨ共
鳴により弱いリガンドを同定し易い。これは、図４で化合物Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ ３ Ｈ２）−Ｖａｌ−ＮＨ２が非常に弱いリガンドとして同定されることを説明す
ると思われる。
ングルで傾斜したコヒーレンス選択勾配を用いると優れた多重溶媒抑制が達せら
れる。ＮＭＲによるスクリーニングではレシーバーのダイナミックレンジを最適
方法で最大化する必要があるが、このように非常に希薄なサンプルを観測する場
合にこのことは特に重要である。また、多重溶媒抑制が優れていると、非ジュウ
テリウム化溶媒（即ちＤＭＳＯ、ＣＨ３ＯＨ）で化合物の混合物のストック溶液
を調製することも可能になる。Ｈ２Ｏに溶かしたサンプルを使用すると、ＮＨ二
重項の交換可能な共鳴が観測されるという重要な利点もある。これらのシグナル
はＤ２Ｏ溶液中で記録したスペクトルには存在しない。ＮＨプロトンシグナルは
他のシグナルと全く又は殆どオーバーラップせずにスペクトル領域に存在するの
で、複雑な混合物での帰属目的に使用できる。更に、リガンドＮＨは溶液中に遊
離している場合と水素がタンパク質に結合している場合の化学シフトの差が大き
いが、この差は同一リガンドの他のプロトンでは非常に小さい。化学シフトの差
が大きいと、観測されるＴ２ ＳＱ及びＴＤＱ緩和への大きい化学交換への寄与に
よる顕著な広幅化に起因するか又は検出可能な化学シフト変化に起因するＮＨ共
鳴により弱いリガンドを同定し易い。これは、図４で化合物Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ ３ Ｈ２）−Ｖａｌ−ＮＨ２が非常に弱いリガンドとして同定されることを説明す
ると思われる。
【００４７】
−２Ｄ ＤＱ実験は余弦変調実験であるため、最初のｔ１増分で最大シグナル
が観測される。この実験は限られた数のｔ１増分だけを獲得することにより迅速
に記録することができる。その後、分解能を改善するためにｔ１次元に線形予測
を適用することができる。ω１で広く畳み込みを実施することができるため、ス
ペクトル幅とｔ１増分数を減らすことができる。
が観測される。この実験は限られた数のｔ１増分だけを獲得することにより迅速
に記録することができる。その後、分解能を改善するためにｔ１次元に線形予測
を適用することができる。ω１で広く畳み込みを実施することができるため、ス
ペクトル幅とｔ１増分数を減らすことができる。
【００４８】
−２Ｄ ＤＱスペクトルでは一次元スペクトルに存在する広いオーバーラップ
がないので、ターゲット生体分子の存在により変化するシグナルを容易に識別す
ることができる。オーバーラップの問題が減ると共に生体分子シグナルが完全に
なくなるため、２Ｄ ＤＱ差スペクトルは１Ｄ差スペクトルに比較してアーチフ
ァクトが生じにくい。
がないので、ターゲット生体分子の存在により変化するシグナルを容易に識別す
ることができる。オーバーラップの問題が減ると共に生体分子シグナルが完全に
なくなるため、２Ｄ ＤＱ差スペクトルは１Ｄ差スペクトルに比較してアーチフ
ァクトが生じにくい。
【００４９】
更に、ＤＱスペクトルでは強い対角線ピークと一重項共鳴がないため、ｔ１ノ
イズがなく、溶媒抑制が優れているため、２Ｄサブトラクション技術をより正確
で確実に使用することができる。
イズがなく、溶媒抑制が優れているため、２Ｄサブトラクション技術をより正確
で確実に使用することができる。
【００５０】
−２Ｄ ＤＱスペクトルではスカラー結合性が観測されるため、混合物をスピ
ニングをかける必要なしにターゲット生体分子と相互作用する分子を直接同定す
ることができる。
ニングをかける必要なしにターゲット生体分子と相互作用する分子を直接同定す
ることができる。
【００５１】
−励起二量子時間とｔ１及びτ１中のＤＱＣの緩和の存在だけでなく、ω２中
の多重項の反位相特徴により生体分子シグナルの抑制が非常に効率的である。タ
ンパク質共鳴の線幅が広いため、ω２中の正負ローブが広く除去される。
の多重項の反位相特徴により生体分子シグナルの抑制が非常に効率的である。タ
ンパク質共鳴の線幅が広いため、ω２中の正負ローブが広く除去される。
【００５２】
以上、ターゲット生体分子と相互作用する化合物の同定に使用する新規に最適
化した１Ｈ二重量子スペクトロスコピーに基づく本発明のＮＭＲ法について説明
した。本発明は巨大分子と相互作用する化合物の差スピン−スピン及び二重量子
コヒーレンス緩和を効率的且つ同時に利用するものである。
化した１Ｈ二重量子スペクトロスコピーに基づく本発明のＮＭＲ法について説明
した。本発明は巨大分子と相互作用する化合物の差スピン−スピン及び二重量子
コヒーレンス緩和を効率的且つ同時に利用するものである。
【００５３】
感度が高く、多重溶媒抑制に優れ、対角線ピークと一重項がなく、共鳴オーバ
ーラップの問題が少ないことが相俟って、この方法はターゲット生体分子に対す
る複雑な化合物の混合物のスクリーニングに確実に適用できる。強いリガンドも
弱いリガンドも混合物から直接同定することができる。
ーラップの問題が少ないことが相俟って、この方法はターゲット生体分子に対す
る複雑な化合物の混合物のスクリーニングに確実に適用できる。強いリガンドも
弱いリガンドも混合物から直接同定することができる。
【００５４】
以下の実施例は本発明をより詳細に説明することを目的とし、発明を制限する
ものではない。
ものではない。
【００５５】
実施例
リガンド同定における本発明の実施可能性をＧｒｂ２−ＳＨ２ドメインに対す
る化合物の混合物で試験した。これは使用するタンパク質のサイズが小さい（Ｍ
Ｗ＝１１８３９）ため、困難な試験例である。中程度のサイズ又は大きいサイズ
のターゲットタンパク質ではＴ２ ＳＱ及びＴＤＱが非常に短いのでこの方法の性
能は上がることに留意すべきである。
る化合物の混合物で試験した。これは使用するタンパク質のサイズが小さい（Ｍ
Ｗ＝１１８３９）ため、困難な試験例である。中程度のサイズ又は大きいサイズ
のターゲットタンパク質ではＴ２ ＳＱ及びＴＤＱが非常に短いのでこの方法の性
能は上がることに留意すべきである。
【００５６】
図２はタンパク質の不在下（ａ）と存在下（ｂ）に図１ａのパルスシーケンス
で記録した化合物の混合物（混合物１）のＤＱフィンガープリント領域を示す。
混合物１は最終濃度１００μＭのＡｃ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−ＯＨ
、Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ３Ｈ２）−Ｖａｌ−ＮＨ２及びＡｃ−（Ｎ−Ｍｅ）Ｐｈｅ
（ｐ−ＣＨ２ＰＯ３Ｈ２）−Ｖａｌ−Ａｓｎ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）２ を含むものとした。２つのスペクトルを厳密に比較すると、化合物Ａｃ−（Ｎ−
Ｍｅ）Ｐｈｅ（ｐ−ＣＨ２ＰＯ３Ｈ２）−Ｖａｌ−Ａｓｎ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ
（ＣＨ３）２（共鳴Ｃ）をＧｒｂ２−ＳＨ２のリガンドとしてすぐに同定するこ
とができる。図２（ｂ）ではＴ２ ＳＱ及びＴＤＱが短く、タンパク質濃度が低い
（５０μＭ）ため、ＮＨタンパク質共鳴は認められない。
で記録した化合物の混合物（混合物１）のＤＱフィンガープリント領域を示す。
混合物１は最終濃度１００μＭのＡｃ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−ＯＨ
、Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ３Ｈ２）−Ｖａｌ−ＮＨ２及びＡｃ−（Ｎ−Ｍｅ）Ｐｈｅ
（ｐ−ＣＨ２ＰＯ３Ｈ２）−Ｖａｌ−Ａｓｎ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）２ を含むものとした。２つのスペクトルを厳密に比較すると、化合物Ａｃ−（Ｎ−
Ｍｅ）Ｐｈｅ（ｐ−ＣＨ２ＰＯ３Ｈ２）−Ｖａｌ−Ａｓｎ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ
（ＣＨ３）２（共鳴Ｃ）をＧｒｂ２−ＳＨ２のリガンドとしてすぐに同定するこ
とができる。図２（ｂ）ではＴ２ ＳＱ及びＴＤＱが短く、タンパク質濃度が低い
（５０μＭ）ため、ＮＨタンパク質共鳴は認められない。
【００５７】
タンパク質芳香族共鳴はアミド共鳴に比較してＴ２ ＳＱ及びＴＤＱが長いので
、ＤＱスペクトルに存在しているとリガンドシグナルの観測を妨げると思われる
。図１ｂに示すようにＤＱＣ緩和フィルターを使用することによりこのような共
鳴を抑制することが可能である。
、ＤＱスペクトルに存在しているとリガンドシグナルの観測を妨げると思われる
。図１ｂに示すようにＤＱＣ緩和フィルターを使用することによりこのような共
鳴を抑制することが可能である。
【００５８】
図３（ａ）は混合物１の２Ｄ緩和加重ＤＱスペクトルの芳香族領域を示す。図
３（ｂ）及び（ｃ）はＧｒｂ２−ＳＨ２ドメインの存在下の混合物１の２Ｄ Ｄ
Ｑ及び緩和加重ＤＱスペクトルの同一スペクトル領域を夫々示す。（ｂ）の残留
芳香族タンパク質シグナルは（ｃ）ではタンパク質共鳴の迅速なＤＱ緩和により
完全に抑制されている。（ｂ）と（ｃ）の消失リガンドシグナルは化合物Ａｃ−
（Ｎ−Ｍｅ）Ｐｈｅ（ｐ−ＣＨ２ＰＯ３Ｈ２）−Ｖａｌ−Ａｓｎ−ＮＨ−ＣＨ２ −ＣＨ（ＣＨ３）２の芳香族部分のシグナルである。
３（ｂ）及び（ｃ）はＧｒｂ２−ＳＨ２ドメインの存在下の混合物１の２Ｄ Ｄ
Ｑ及び緩和加重ＤＱスペクトルの同一スペクトル領域を夫々示す。（ｂ）の残留
芳香族タンパク質シグナルは（ｃ）ではタンパク質共鳴の迅速なＤＱ緩和により
完全に抑制されている。（ｂ）と（ｃ）の消失リガンドシグナルは化合物Ａｃ−
（Ｎ−Ｍｅ）Ｐｈｅ（ｐ−ＣＨ２ＰＯ３Ｈ２）−Ｖａｌ−Ａｓｎ−ＮＨ−ＣＨ２ −ＣＨ（ＣＨ３）２の芳香族部分のシグナルである。
【００５９】
中程度のサイズ及び大きいサイズのタンパク質、膜結合タンパク質又は樹脂に
結合したタンパク質にはＤＱＣ緩和フィルターは不要であることを指摘すべきで
ある。全タンパク質共鳴は線幅が広く、ω２中のＤＱ多重項は逆位相性をもつた
め、正負ローブは完全に除去される。しかし、非常に弱いリガンドの検出にはタ
ーゲット巨大分子と相互作用する分子に大きいＴＤＱ差を利用することによりＤ
ＱＣ緩和フィルターを使用することもできる。
結合したタンパク質にはＤＱＣ緩和フィルターは不要であることを指摘すべきで
ある。全タンパク質共鳴は線幅が広く、ω２中のＤＱ多重項は逆位相性をもつた
め、正負ローブは完全に除去される。しかし、非常に弱いリガンドの検出にはタ
ーゲット巨大分子と相互作用する分子に大きいＴＤＱ差を利用することによりＤ
ＱＣ緩和フィルターを使用することもできる。
【００６０】
図４は非常に弱いリガンドの同定における２Ｄ ＤＱ差スペクトロスコピーの
パワーを示す。図１ａのパルスシーケンスで記録したタンパク質の不在下（ａ）
と存在下（ｂ）における混合物２（３００μＭのＡｃ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ
−Ｖａｌ−ＯＨ、Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ３Ｈ２）−Ｖａｌ−ＮＨ２、Ａｃ−Ｔｙｒ
（ＰＯ３Ｈ２）−Ｖａｌ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＮＨ２及びインドール）
のＤＱフィンガープリント領域を示す。目視比較で化合物Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ３ Ｈ２）−Ｖａｌ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＮＨ２（共鳴Ｄ）を強力なリガン
ドとしてすぐに同定することができるが、２Ｄ差スペクトル（ｃ）から化合物Ａ
ｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ３Ｈ２）−Ｖａｌ−ＮＨ２も潜在的な非常に弱いリガンドとし
て同定することができる。ＶａｌのＮＨに観測される小さい化学シフト変化は約
８Ｈｚであり、３ＪＮＨαＨの値に等しい。従って、差スペクトルにおけるシグ
ナルは強度−１，＋２，−１の三重線として現れる。差スペクトルにはタンパク
質の存在下の強度又は化学シフトの変化を示す化合物共鳴しか認められない。差
スペクトルにはタンパク質と相互作用しない化合物Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓ
ｎ−Ｖａｌ−ＯＨ（共鳴Ａ）とインドール（このスペクトル領域には存在しない
）の共鳴は認められない。
パワーを示す。図１ａのパルスシーケンスで記録したタンパク質の不在下（ａ）
と存在下（ｂ）における混合物２（３００μＭのＡｃ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ
−Ｖａｌ−ＯＨ、Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ３Ｈ２）−Ｖａｌ−ＮＨ２、Ａｃ−Ｔｙｒ
（ＰＯ３Ｈ２）−Ｖａｌ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＮＨ２及びインドール）
のＤＱフィンガープリント領域を示す。目視比較で化合物Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ３ Ｈ２）−Ｖａｌ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＮＨ２（共鳴Ｄ）を強力なリガン
ドとしてすぐに同定することができるが、２Ｄ差スペクトル（ｃ）から化合物Ａ
ｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ３Ｈ２）−Ｖａｌ−ＮＨ２も潜在的な非常に弱いリガンドとし
て同定することができる。ＶａｌのＮＨに観測される小さい化学シフト変化は約
８Ｈｚであり、３ＪＮＨαＨの値に等しい。従って、差スペクトルにおけるシグ
ナルは強度−１，＋２，−１の三重線として現れる。差スペクトルにはタンパク
質の存在下の強度又は化学シフトの変化を示す化合物共鳴しか認められない。差
スペクトルにはタンパク質と相互作用しない化合物Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓ
ｎ−Ｖａｌ−ＯＨ（共鳴Ａ）とインドール（このスペクトル領域には存在しない
）の共鳴は認められない。
【００６１】
対角線ピークとｔ１ノイズと一重線が存在せず、溶媒抑制が優れているため、
２Ｄ ＤＱ差スペクトロスコピーは非常に確実な技術である。これは混合物２に
ついて記録したＤＱスペクトルの拡大領域を示す図５で確認することができる。
（ａ）に交差ピークＡ及びＤの強いオーバーラップがあるが、タンパク質の存在
により変化しない交差ピークとしてＤＱ差スペクトル（ｃ）のピークＤを同定す
ることができる。
２Ｄ ＤＱ差スペクトロスコピーは非常に確実な技術である。これは混合物２に
ついて記録したＤＱスペクトルの拡大領域を示す図５で確認することができる。
（ａ）に交差ピークＡ及びＤの強いオーバーラップがあるが、タンパク質の存在
により変化しない交差ピークとしてＤＱ差スペクトル（ｃ）のピークＤを同定す
ることができる。
【００６２】
全スペクトルは５ｍｍ三重共鳴インバースプローブと能動的に遮蔽したｘ、ｙ
及びｚグラジエントコイルを取付けたＶａｒｉａｎ Ｉｎｏｖａ ６００ＭＨｚ
スペクトロメーターを使用して図１のパルスシーケンスで２５℃で得られたもの
である。ＤＱスペクトルは２５６個のｔ１増分（エコー経路選択と反エコー経路
選択に１２８個のｔ１値）の各々に８〜３２個のトランジェントとｔ２で２０４
８点を使用して収集した。データはフーリエ変換前に両次元で余弦ウインドウ関
数を乗じた。
及びｚグラジエントコイルを取付けたＶａｒｉａｎ Ｉｎｏｖａ ６００ＭＨｚ
スペクトロメーターを使用して図１のパルスシーケンスで２５℃で得られたもの
である。ＤＱスペクトルは２５６個のｔ１増分（エコー経路選択と反エコー経路
選択に１２８個のｔ１値）の各々に８〜３２個のトランジェントとｔ２で２０４
８点を使用して収集した。データはフーリエ変換前に両次元で余弦ウインドウ関
数を乗じた。
【００６３】
励起ＤＱ時間τは４２ミリ秒とし、検出パルスの角度βは反エコー及びエコー
経路選択で夫々４５°と１３５°に設定した。コヒーレンス選択勾配Ｇ１〜Ｇ３ は勾配のｘ及びｚ成分のみを使用してマジックアングルに設定した。励起二量子
時間の始点と終点に適用した最初の２回のＰＦＧは輻射減衰抑制用の弱い勾配で
あった。２Ｄスペクトル識別はＶａｒｉａｎから入手したソフトウェアで実施し
た。本明細書に報告する実施例で使用したスケーリング係数は−１とした。但し
、この係数はタンパク質−リガンド混合物及びリガンド混合物溶液中の多少の濃
度変動を許容するように手動調整することができる。
経路選択で夫々４５°と１３５°に設定した。コヒーレンス選択勾配Ｇ１〜Ｇ３ は勾配のｘ及びｚ成分のみを使用してマジックアングルに設定した。励起二量子
時間の始点と終点に適用した最初の２回のＰＦＧは輻射減衰抑制用の弱い勾配で
あった。２Ｄスペクトル識別はＶａｒｉａｎから入手したソフトウェアで実施し
た。本明細書に報告する実施例で使用したスケーリング係数は−１とした。但し
、この係数はタンパク質−リガンド混合物及びリガンド混合物溶液中の多少の濃
度変動を許容するように手動調整することができる。
【００６４】
３種及び４種の分子から構成される２種の異なる化合物の混合物を調製した。
混合物１は最終濃度１００μＭのＡｃ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−ＯＨ
、Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ３Ｈ２）−Ｖａｌ−ＮＨ２及びＡｃ−（Ｎ−Ｍｅ）Ｐｈｅ
（ｐ−ＣＨ２ＰＯ３Ｈ２）−Ｖａｌ−Ａｓｎ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）２ を含むものとし、混合物２は３００μＭのＡｃ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａ
ｌ−ＯＨ、Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ３Ｈ２）−Ｖａｌ−ＮＨ２、Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ ３ Ｈ２）−Ｖａｌ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＮＨ２及びインドールを含むも
のとした。これらの小ペプチドアナローグは数種のものがＧｒｂ２のＳＨ２ドメ
インに結合することが示されている２５−２７。ペプチド及び関連ペプチドアナ
ローグは固相法により合成した。樹脂上の保護ペプチドはＮ−Ｆｍｏｃ保護アミ
ノ酸の逐次結合により合成し、アミノ酸の一部はＣ末端から出発して側鎖も保護
した。最後の結合後に、ホスホラミダイト化学と順次酸化を使用することにより
チロシン残渣を固相リン酸化した。リン酸化後に酸性処理し、側鎖の脱保護を行
ない、そして、樹脂から分離した。
混合物１は最終濃度１００μＭのＡｃ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−ＯＨ
、Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ３Ｈ２）−Ｖａｌ−ＮＨ２及びＡｃ−（Ｎ−Ｍｅ）Ｐｈｅ
（ｐ−ＣＨ２ＰＯ３Ｈ２）−Ｖａｌ−Ａｓｎ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）２ を含むものとし、混合物２は３００μＭのＡｃ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａ
ｌ−ＯＨ、Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ３Ｈ２）−Ｖａｌ−ＮＨ２、Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ ３ Ｈ２）−Ｖａｌ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＮＨ２及びインドールを含むも
のとした。これらの小ペプチドアナローグは数種のものがＧｒｂ２のＳＨ２ドメ
インに結合することが示されている２５−２７。ペプチド及び関連ペプチドアナ
ローグは固相法により合成した。樹脂上の保護ペプチドはＮ−Ｆｍｏｃ保護アミ
ノ酸の逐次結合により合成し、アミノ酸の一部はＣ末端から出発して側鎖も保護
した。最後の結合後に、ホスホラミダイト化学と順次酸化を使用することにより
チロシン残渣を固相リン酸化した。リン酸化後に酸性処理し、側鎖の脱保護を行
ない、そして、樹脂から分離した。
【００６５】
Ｇｒｂ２のＳＨ２ドメインはライノウイルスＰｒｅｓｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏ
ｔｅａｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）による
開裂の認識部位をもつＧＳＴ融合タンパク質として大腸菌で発現させた。タンパ
ク質は細菌細胞破砕と遠心分離後に細胞溶解液の上清中に存在していた。融合タ
ンパク質を含む上清をＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂にロー
ドし、ＰＢＳ洗浄後に細菌汚染物質を除去した。ＧＳＴ部分を除去するために、
ＧＳＴ−ＳＨ２を担持する樹脂をＰｒｅｓｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅと
共にインキュベートした。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ゲル濾過クロマトグラフィー
を使用してＳＨ２ドメインを均質になるまで更に精製した。ＮＭＲ実験のタンパ
ク質濃度は５０μＭとした。サンプルは水性（９５％Ｈ２Ｏ／５％Ｄ２Ｏ）緩衝
溶液（５０ｍＭリン酸、１００ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ６．２及び０．０２％Ｎａ
Ｎ３）中で使用した。
ｔｅａｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）による
開裂の認識部位をもつＧＳＴ融合タンパク質として大腸菌で発現させた。タンパ
ク質は細菌細胞破砕と遠心分離後に細胞溶解液の上清中に存在していた。融合タ
ンパク質を含む上清をＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂にロー
ドし、ＰＢＳ洗浄後に細菌汚染物質を除去した。ＧＳＴ部分を除去するために、
ＧＳＴ−ＳＨ２を担持する樹脂をＰｒｅｓｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅと
共にインキュベートした。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ゲル濾過クロマトグラフィー
を使用してＳＨ２ドメインを均質になるまで更に精製した。ＮＭＲ実験のタンパ
ク質濃度は５０μＭとした。サンプルは水性（９５％Ｈ２Ｏ／５％Ｄ２Ｏ）緩衝
溶液（５０ｍＭリン酸、１００ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ６．２及び０．０２％Ｎａ
Ｎ３）中で使用した。
【００６６】
【表１】
【図１】
図１は２Ｄ１Ｈ二重量子（ａ）及びＤＱＣ緩和加重二重量子（ｂ）パルスシー
ケンス（ｚ又はマジックアングルパルス磁場勾配法）を示す。勾配Ｇ１〜Ｇ３は
コヒーレンス選択勾配であり、３軸勾配ハードウェアを入手可能な場合にはマジ
ックアングルで適用すべきである１３。最初の２つの弱いパルス磁場勾配（ＰＦ
Ｇ）は輻射減衰の抑制に使用する。遅延τは３０〜５０ミリ秒であり、遅延τ１ は１０〜２００ミリ秒に設定する。Ｈ２Ｏ抑制が最適でない場合にはｚ−ＰＦＧ
法のＤＱ実験で励起ＤＱ時間前に非常に弱い（＜２０Ｈｚ）Ｈ２Ｏ予備飽和磁場
を加えてもよい。実験の技術的詳細と再集束ＤＱ実験のパルスシーケンスは最近
の研究論文１４に記載されている。
ケンス（ｚ又はマジックアングルパルス磁場勾配法）を示す。勾配Ｇ１〜Ｇ３は
コヒーレンス選択勾配であり、３軸勾配ハードウェアを入手可能な場合にはマジ
ックアングルで適用すべきである１３。最初の２つの弱いパルス磁場勾配（ＰＦ
Ｇ）は輻射減衰の抑制に使用する。遅延τは３０〜５０ミリ秒であり、遅延τ１ は１０〜２００ミリ秒に設定する。Ｈ２Ｏ抑制が最適でない場合にはｚ−ＰＦＧ
法のＤＱ実験で励起ＤＱ時間前に非常に弱い（＜２０Ｈｚ）Ｈ２Ｏ予備飽和磁場
を加えてもよい。実験の技術的詳細と再集束ＤＱ実験のパルスシーケンスは最近
の研究論文１４に記載されている。
【図２】
図２のパネル（ａ）はターゲットタンパク質の不在下の混合物１（Ａｃ−Ｔｙ
ｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−ＯＨ（共鳴Ａ）、Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ３Ｈ２）−
Ｖａｌ−ＮＨ２（共鳴Ｂ）及びＡｃ−（Ｎ−Ｍｅ）Ｐｈｅ（ｐ−ＣＨ２ＰＯ３Ｈ ２ ）−Ｖａｌ−Ａｓｎ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）２（共鳴Ｃ））の２Ｄ
ＤＱスペクトルのフィンガープリント領域を示す。図２のパネル（ｂ）はＧｒｂ
２ ＳＨ２ドメインの存在下の前記混合物の同一２Ｄ ＤＱフィンガープリント
領域を示す。遅延τは４２ミリ秒である。各分子はターゲットタンパク質に対し
て２：１（１００μＭ：５０μＭ）のモル比で存在している。（ｂ）中の長方形
は消失交差ピークの位置を示す。
ｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−ＯＨ（共鳴Ａ）、Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ３Ｈ２）−
Ｖａｌ−ＮＨ２（共鳴Ｂ）及びＡｃ−（Ｎ−Ｍｅ）Ｐｈｅ（ｐ−ＣＨ２ＰＯ３Ｈ ２ ）−Ｖａｌ−Ａｓｎ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）２（共鳴Ｃ））の２Ｄ
ＤＱスペクトルのフィンガープリント領域を示す。図２のパネル（ｂ）はＧｒｂ
２ ＳＨ２ドメインの存在下の前記混合物の同一２Ｄ ＤＱフィンガープリント
領域を示す。遅延τは４２ミリ秒である。各分子はターゲットタンパク質に対し
て２：１（１００μＭ：５０μＭ）のモル比で存在している。（ｂ）中の長方形
は消失交差ピークの位置を示す。
【図３】
図３のパネル（ａ）はターゲットタンパク質の不在下の混合物１（Ａｃ−Ｔｙ
ｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−ＯＨ（共鳴Ａ）、Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ３Ｈ２）−
Ｖａｌ−ＮＨ２（共鳴Ｂ）及びＡｃ−（Ｎ−Ｍｅ）Ｐｈｅ（ｐ−ＣＨ２ＰＯ３Ｈ ２ ）−Ｖａｌ−Ａｓｎ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）２（共鳴Ｃ））の２Ｄ
ＤＱＣ緩和加重二量子スペクトルの芳香族領域を示す。図３のパネル（ｂ）及び
（ｃ）はＧｒｂ２ ＳＨ２ドメインの存在下の混合物１の２Ｄ二量子及びＤＱＣ
緩和加重二量子スペクトルの同一スペクトル領域を夫々示す。遅延τ及びτ１は
夫々４２ミリ秒と２４ミリ秒である。点線は二量子疑対角線に対応する。直接ピ
ークは対角線について対称に配置される。（ｂ）と（ｃ）の消失リガンド共鳴は
化合物Ｃの芳香族部分の共鳴である。
ｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−ＯＨ（共鳴Ａ）、Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ３Ｈ２）−
Ｖａｌ−ＮＨ２（共鳴Ｂ）及びＡｃ−（Ｎ−Ｍｅ）Ｐｈｅ（ｐ−ＣＨ２ＰＯ３Ｈ ２ ）−Ｖａｌ−Ａｓｎ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）２（共鳴Ｃ））の２Ｄ
ＤＱＣ緩和加重二量子スペクトルの芳香族領域を示す。図３のパネル（ｂ）及び
（ｃ）はＧｒｂ２ ＳＨ２ドメインの存在下の混合物１の２Ｄ二量子及びＤＱＣ
緩和加重二量子スペクトルの同一スペクトル領域を夫々示す。遅延τ及びτ１は
夫々４２ミリ秒と２４ミリ秒である。点線は二量子疑対角線に対応する。直接ピ
ークは対角線について対称に配置される。（ｂ）と（ｃ）の消失リガンド共鳴は
化合物Ｃの芳香族部分の共鳴である。
【図４】
図４のパネル（ａ）は混合物２（Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｏ
Ｈ（共鳴Ａ）、Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ３Ｈ２）−Ｖａｌ−ＮＨ２（共鳴Ｂ）、イン
ドール（共鳴Ｃ）及びＡｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ３Ｈ２）−Ｖａｌ−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ
Ｈ２−ＣＯＮＨ２（共鳴Ｄ））の２Ｄ ＤＱスペクトルのフィンガープリント領
域を示す。インドールの共鳴はこのスペクトル領域では認められない。図４のパ
ネル（ｂ）はＧｒｂ２−ＳＨ２ドメインの存在下の前記４種の化合物の混合物の
同一２Ｄ ＤＱフィンガープリント領域を示す。図４のパネル（ｃ）は２つの２
Ｄ ＤＱスペクトル（ａ）及び（ｂ）の相殺により得られる２Ｄ差スペクトルを
示す。（ｃ）に認められるシグナルはスペクトル（ｂ）で消失している化合物Ｃ
のシグナルと、タンパク質の存在下の小さい化学シフト変化を示す化合物Ｂの１
個のシグナルである。これは化合物ＢとＧｒｂ２−ＳＨ２ドメインの弱い相互作
用の可能性を示している。各分子はターゲットタンパク質に対して６：１（３０
０μＭ：５０μＭ）のモル比で存在している。インドールの共鳴はタンパク質の
存在により変化しない（データは示さず）。
Ｈ（共鳴Ａ）、Ａｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ３Ｈ２）−Ｖａｌ−ＮＨ２（共鳴Ｂ）、イン
ドール（共鳴Ｃ）及びＡｃ−Ｔｙｒ（ＰＯ３Ｈ２）−Ｖａｌ−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ
Ｈ２−ＣＯＮＨ２（共鳴Ｄ））の２Ｄ ＤＱスペクトルのフィンガープリント領
域を示す。インドールの共鳴はこのスペクトル領域では認められない。図４のパ
ネル（ｂ）はＧｒｂ２−ＳＨ２ドメインの存在下の前記４種の化合物の混合物の
同一２Ｄ ＤＱフィンガープリント領域を示す。図４のパネル（ｃ）は２つの２
Ｄ ＤＱスペクトル（ａ）及び（ｂ）の相殺により得られる２Ｄ差スペクトルを
示す。（ｃ）に認められるシグナルはスペクトル（ｂ）で消失している化合物Ｃ
のシグナルと、タンパク質の存在下の小さい化学シフト変化を示す化合物Ｂの１
個のシグナルである。これは化合物ＢとＧｒｂ２−ＳＨ２ドメインの弱い相互作
用の可能性を示している。各分子はターゲットタンパク質に対して６：１（３０
０μＭ：５０μＭ）のモル比で存在している。インドールの共鳴はタンパク質の
存在により変化しない（データは示さず）。
【図５】
図５はＧｒｂ２−ＳＨ２の不在下（ａ）と存在下（ｂ）の混合物２の２Ｄ Ｄ
Ｑスペクトルの拡大領域を示す。（ｃ）のスペクトルは２つの２Ｄ ＤＱスペク
トル（ａ）及び（ｂ）の相殺により得られる２Ｄ差スペクトルを示す。他の実験
パラメーターは図４に記載したものと同じである。（ａ）に交差ピークＡ及びＤ
の強いオーバーラップがあるが、タンパク質の存在により変化しない交差ピーク
を２Ｄ ＤＱ差スペクトル（ｃ）中に確認できる。
Ｑスペクトルの拡大領域を示す。（ｃ）のスペクトルは２つの２Ｄ ＤＱスペク
トル（ａ）及び（ｂ）の相殺により得られる２Ｄ差スペクトルを示す。他の実験
パラメーターは図４に記載したものと同じである。（ａ）に交差ピークＡ及びＤ
の強いオーバーラップがあるが、タンパク質の存在により変化しない交差ピーク
を２Ｄ ＤＱ差スペクトル（ｃ）中に確認できる。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，
ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ
Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ
，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，
ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，
ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ
Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ
，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，
ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ
Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ
，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，
ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ
Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ
，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，
ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 カツチア，パオロ
イタリー国、イ−21047・サロンノ、ビ
ア・ローマ・60・ビ
(72)発明者 ジヨルダーノ，パトリツツイア
イタリー国、イ−12100・クネオ、ビア・
クインテイノ・セーラ・９
(72)発明者 ペバレツロ，パオロ
イタリー国、イ−27100・パビア、ピアツ
ツア・サン・ピエトロ・イン・チエル・ド
ロ、７／アー
(72)発明者 サンドストロウム，ミハイル
スウエーデン国、エス・イー−11448・ス
トツクホルム、コムメンドルスガタン、12
(72)発明者 タトー，マルコ
イタリー国、イ−20151・ミラノ、ビア・
マルコ・ボーザ・24
Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA12 DA13 DA14 DA36
FB02 FB03 FB07
Claims (14)
- 【請求項１】 ターゲット生体分子と相互作用するリガンドを提供する方法
であって、 ｉ）少なくとも２個の二重線を含む１種以上の化学分子を含む溶液の二次元プロ
トン（再集束又は非再集束）二量子又はＤＱＣ（二量子コヒーレンス）緩和加重
二量子スペクトルを生成する段階と、 ｉｉ）ターゲット生体分子を更に含む前記溶液の二次元プロトン（再集束又は非
再集束）二量子又はＤＱＣ緩和加重二量子スペクトルを生成する段階と、 ｉｉｉ）（ｉ）のスペクトルを（ｉｉ）のスペクトルと比較し、ターゲット生体
分子と結合する１種以上の化学分子の存在を示す差異がある場合にはこれを検出
し、前記１種以上の化学分子をリガンドすなわちターゲット生体分子のリガンド
として選択する段階を含む前記方法。 - 【請求項２】 請求項１の段階ｉｉｉ）でリガンドとして同定した化合物毎
にターゲットタンパク質の存在下と不在下で二次元プロトン（再集束又は非再集
束）二量子スペクトルを生成する付加的段階を場合により含む請求項１に記載の
方法。 - 【請求項３】 ターゲット生体分子と結合する１種以上の化学分子の存在を
示す差異が１個以上のシグナルの化学シフト又は強度の差異である請求項１に記
載の方法。 - 【請求項４】 二次元プロトン（再集束又は非再集束）二量子又はＤＱＣ緩
和加重二量子スペクトルの各々をｚ又はマジックアングルパルス磁場勾配により
記録する請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項５】 二次元プロトン二量子又はＤＱＣ緩和加重二量子スペクトル
を非ジュウテリウム化溶媒中で記録する請求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項６】 各試験化合物がターゲット生体分子に対して約１：１〜約２
０：１のモル比でサンプル中に存在している請求項１に記載の方法。 - 【請求項７】 ターゲット生体分子が溶液中に遊離しているか、界面活性剤
もしくはミセルに溶解しているか、又は樹脂に結合している請求項１に記載の方
法。 - 【請求項８】 ターゲット生体分子がタンパク質、抗体又はＤＮＡもしくは
ＲＮＡフラグメントである請求項１に記載の方法。 - 【請求項９】 ターゲット生体分子がタンパク質である請求項８に記載の方
法。 - 【請求項１０】 タンパク質がＧｒｂ２タンパク質のＳＨ２ドメインである
請求項９に記載の方法。 - 【請求項１１】 ターゲット生体分子との結合性について化合物をスクリー
ニングする方法であって、 ｉ）少なくとも２個の二重線を含む１種以上の化学分子を含む溶液の二次元プロ
トン（再集束又は非再集束）二量子又はＤＱＣ（二量子コヒーレンス）緩和加重
二量子スペクトルを生成する段階と、 ｉｉ）ターゲット生体分子を更に含む前記溶液の二次元プロトン（再集束又は非
再集束）二量子又はＤＱＣ緩和加重二量子スペクトルを生成する段階と、 ｉｉｉ）（ｉ）のスペクトルを（ｉｉ）のスペクトルと比較し、ターゲット生体
分子と結合する１種以上の化学分子の存在を示す差異がある場合にはこれを検出
する段階を含む前記方法。 - 【請求項１２】 請求項１１の段階ｉｉｉ）でリガンドとして同定した化合
物毎にターゲットタンパク質の存在下と不在下で二次元プロトン（再集束又は非
再集束）二量子スペクトルを生成する付加的段階を場合により含む請求項１１に
記載の方法。 - 【請求項１３】 二次元プロトン（再集束又は非再集束）二量子又はＤＱＣ
緩和加重二量子スペクトルの各々をｚ又はマジックアングルパルス磁場勾配によ
り記録する請求項１１又は１２に記載の方法。 - 【請求項１４】 請求項１１から１３のいずれか一項に記載の方法により同
定したターゲット生体分子のリガンド。
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| GBGB9925677.8A GB9925677D0 (en) | 1999-10-29 | 1999-10-29 | Use of double-quantum 1H-NMR spectroscopy for the identification of ligands interacting with target biomolecules |
| GB9925677.8 | 1999-10-29 | ||
| PCT/EP2000/010370 WO2001033243A1 (en) | 1999-10-29 | 2000-10-19 | Use of double-quantum 1h-nmr spectroscopy for the identification of ligands interacting with target biomolecules |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003513290A true JP2003513290A (ja) | 2003-04-08 |
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|---|---|
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| AU (1) | AU780921B2 (ja) |
| CA (1) | CA2388216A1 (ja) |
| CY (1) | CY1105315T1 (ja) |
| DE (1) | DE60025246T2 (ja) |
| DK (1) | DK1224486T3 (ja) |
| ES (1) | ES2254245T3 (ja) |
| GB (1) | GB9925677D0 (ja) |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006522924A (ja) * | 2003-04-14 | 2006-10-05 | アマシャム ヘルス アール アンド ディー アーベー | Ｎｍｒスペクトロスコピーの方法及び構成 |
| JP2016526023A (ja) * | 2013-05-08 | 2016-09-01 | ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム | Ｓｔａｔ６阻害剤 |
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| AU2003240546A1 (en) * | 2002-06-05 | 2003-12-22 | Pharmacia And Upjohn Company | Methods for identifying ligands using competitive binding 1h nmr experiments |
| KR100901309B1 (ko) * | 2002-06-15 | 2009-06-09 | 크리스탈지노믹스(주) | 단백질의 활성 부위에 결합하는 화합물을 선별하는 방법 |
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-
2000
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