ES2215296T3 - Utilizacion de la resonancia magnetica nuclear de una dimension para identificar ligandos que se unen a biomoleculas blanco. - Google Patents
Utilizacion de la resonancia magnetica nuclear de una dimension para identificar ligandos que se unen a biomoleculas blanco.Info
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Abstract
La invención se refiere a un procedimiento para identificar compuestos que se unen a moléculas blanco específicas. El procedimiento comprende los pasos de: a) producir un primer T2-o espectro de fotones filtrados o de difusión de un compuesto o una mezcla de compuestos químicos, B) exponer un producto o mezcla de productos químicos a la molécula blanco; c) generar un segundo T2- o espectro de fotón filtrado-difusión de un producto o una mezcla de productos químicos que han sido expuestos a moléculas blanco en el paso (b), y d) comparar los citados primeros y segundos T2- o espectros de protón filtrado-difusión para determinar las diferencias entre los citados primero y segundo espectros. Las diferencias identifican la presencia de uno o más compuestos que son ligandos que se han unido a la molécula blanco.
Description
Utilización de la resonancia magnética nuclear de
una dimensión para identificar ligandos que se unen a biomoléculas
blanco.
La presente invención está relacionada con un
método de rastreo de compuestos que se unen a biomoléculas diana
utilizando espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN)
unidimensional.
Una de las herramientas más poderosas para el
descubrimiento de nuevas guías de fármacos es el rastreo al azar de
bases de datos de productos químicos sintéticas y naturales para
descubrir compuestos que se unen a una molécula diana concreta (es
decir, la identificación de ligandos de esa diana). Utilizando este
método, se pueden identificar ligandos por su capacidad para formar
una asociación física con una molécula diana o por su capacidad para
alterar una función de una molécula diana.
Cuando se pretende la unión física, típicamente
se expone una molécula diana a uno o más compuestos de los que se
sospecha que son ligandos y se realizan análisis para determinar si
se forman complejos entre la molécula diana y uno o más de esos
compuestos. Tales análisis, como es bien sabido en la técnica,
someten a ensayo los cambios groseros en la molécula diana (v.g.,
cambios de tamaño, carga, movilidad) que indican la formación de
complejos.
Cuando se miden los cambios funcionales, se
establecen condiciones de análisis que permiten una medida de un
evento biológico o químico relacionado con la molécula diana (v.g.,
reacción catalizada por enzima, activación de enzima mediada por un
receptor). Para identificar una alteración, se determina la función
de la molécula diana antes y después de la exposición a los
compuestos de ensayo.
Los análisis físicos y funcionales existentes han
sido utilizados con éxito para identificar nuevas guías de fármacos
para su uso en el diseño de compuestos terapéuticos. Existen, sin
embargo, limitaciones inherentes a esos análisis que comprometen su
precisión, fiabilidad y eficacia.
Un defecto principal de los análisis existentes
hace referencia al problema de los "falsos positivos". En un
análisis funcional típico, un "falso positivo" es un compuesto
que desencadena el análisis pero cuyo compuesto no es eficaz para
lograr la respuesta deseada. En un análisis físico típico, un
"falso positivo" es un compuesto que, por ejemplo, se ancla por
si mismo a la diana pero no de manera específica (v.g., unión no
específica). Los falsos positivos son particularmente prevalentes y
problemáticos cuando se rastrean concentraciones superiores de
supuestos ligandos debido a que muchos compuestos tienen efectos no
específicos a esas concentraciones.
De una manera similar, los análisis existentes
resultan importunados por el problema de los "falsos
negativos", que se producen cuando un compuesto da una respuesta
negativa en el análisis pero cuyo compuesto es realmente un ligando
para la diana. Los falsos negativos se producen típicamente en
análisis en los que se utilizan concentraciones de compuestos de
ensayo que o bien son demasiado elevadas (produciendo toxicidad) o
bien son demasiado bajas en relación con la constante de unión o
disociación del compuesto a la diana.
Recientemente se ha demostrado que se pueden
utilizar análisis espectrales N^{15}/H^{1} bidimensionales para
identificar compuestos que se unen a una proteína diana, y este
enfoque supera muchos de los problemas asociados con otros análisis
existentes para la identificación de ligandos. No obstante, este
enfoque requiere que la proteína esté marcada con N^{15}, soluble
y tenga un buen comportamiento hasta concentraciones de 0,3 M o
superiores. Además, sólo las proteínas que dan origen a mapas de
correlación N^{15}/H^{1} analizables pueden ser utilizadas en
este método, que, con la tecnología actual, limita el peso molecular
de la proteína diana a menos de 40 kDa. Además, el método lleva
tiempo, ya que los compuestos son sometidos a ensayo en
combinaciones de 10, y, cuando se ha determinado que al menos uno de
los compuestos de la mezcla es activo, cada compuesto debe ser
sometido a ensayo individualmente en cuanto a la unión a la proteína
diana.
Debido a los problemas inherentes a los métodos
existentes, continúa existiendo la necesidad de proporcionar medios
nuevos, rápidos, eficaces, exactos y fiables de rastreo de
compuestos para identificar y diseñar ligandos que se unan
específicamente a una diana concreta.
En un aspecto, la presente invención proporciona
un procedimiento, como se define en las reivindicaciones
1-8.
Una ventaja de la presente invención es la
capacidad del procedimiento de la presente invención para determinar
la unión de ligandos potenciales a una molécula diana no marcada de
cualquier tamaño o composición, siempre que el tamaño de la diana
sea suficientemente mayor que el ligando potencial con el fin de
ocasionar cambios en sus velocidades de relajación o difusión tras
la unión a la molécula diana.
Otra ventaja de la presente invención es la
capacidad del procedimiento de la presente invención para determinar
la unión incluso de ligandos que se unen débilmente a la molécula
diana.
Una ventaja adicional del procedimiento de la
presente invención es la capacidad del procedimiento para
identificar un compuesto o compuestos activos en una mezcla de
compuestos mediante comparación directa de los desplazamientos
químicos en los diferentes espectros con los desplazamientos
químicos conocidos de los compuestos de los que consta la mezcla en
ausencia de la biomolécula diana.
En esta realización preferida, el procedimiento
de determinación de la unión de un ligando se puede llevar a cabo en
presencia de un segundo ligando unido. Según esta realización, la
molécula diana está unida a ese segundo ligando antes de exponer esa
diana a los compuestos de ensayo.
En este método se utiliza un procedimiento de
rastreo espectroscópico de protón de filtrado T_{2} o filtrado por
difusión como se ha mostrado antes para identificar un primer
ligando y uno posterior que se unen a la molécula diana. Se forma un
complejo de la molécula diana y dos o más ligandos y los datos
estructurales se obtienen preferiblemente utilizando la
espectroscopia de RMN o la cristalografía de rayos X. Esos datos
estructurales se utilizan para determinar la orientación espacial de
los ligandos entre sí y con respecto a la molécula diana.
Basándose en la orientación espacial, los
ligandos son conectados para formar un ligando de elevada afinidad
que es útil como ligando para la molécula diana concreta y es útil
como fármaco farmacéuticamente activo potencial. La selección de un
grupo conector apropiado se realiza manteniendo la orientación
espacial de los ligandos entre sí y con respecto a la molécula diana
basada en los principios del ángulo de enlace y la información de la
longitud del enlace bien conocidos en la técnica de la química
orgánica. El procedimiento de conexión o el esquema sintético para
combinar al menos los dos ligandos para formar el ligando de elevada
afinidad se realiza mediante procedimientos sintéticos bien
conocidos y/o análisis retrosintético. El ligando de elevada
afinidad puede ser preparado mediante cualquier método que produzca
realmente el ligando final y no esté limitado a conectar simplemente
los dos ligandos juntos a través de un grupo conector. Se puede
utilizar cualquier síntesis lineal o método sintético convergente
para formar el producto final. Una vez que se han encontrado al
menos los dos ligandos que tienen afinidad por la molécula diana
(preferiblemente una proteína), se diseña el ligando de elevada
afinidad y se elaboran mediante métodos bien conocidos por los
expertos en la técnica. Los ligandos se seleccionan de la reserva
diversa de pequeñas moléculas que tienen diversos átomos y
disposiciones moleculares, estereoquímica, etc. El factor limitante
es que al menos los dos ligandos tienen cierta afinidad como ligando
con al menos un sitio del polipéptido o la molécula diana. El
procedimiento de rastreo descrito aquí, no obstante, puede
identificar un único ligando o una pluralidad de ligandos que
también pueden ser manipulados mediante los métodos de diseño de
fármacos tradicionales para formar productos farmacéuticamente
activos o pueden ser utilizados en el procedimiento de diseño de
fármacos descrito aquí para conectar al menos dos ligandos para
formar un ligando de elevada afinidad.
Así, el método de diseño molecular comprende un
procedimiento como se define en la reivindicación 9.
La identificación de los radicales ligando
subsiguientes se puede realizar en ausencia o presencia del primer
ligando (v.g., la molécula diana puede ser unida al primer ligando
antes de ser expuesta a los compuestos de ensayo para la
identificación del segundo ligando).
En una realización preferida, la molécula diana
utilizada en un procedimiento de rastreo o diseño es un polipéptido.
La diana polipeptídica se produce preferiblemente de forma
recombinante a partir de una célula huésped transformada con un
vector de expresión que contenga un polinucleótido que codifique el
polipéptido.
En los dibujos que forman parte de la
memoria:
La Fig. 1 muestra (A) un espectro de filtrado
T_{2} del compuesto 1 en tampón acuoso, (B) un espectro de
filtrado T_{2} del compuesto 1 en presencia de FKBP, (C) un
espectro de filtrado T_{2} de FKBP, (D) un espectro diferencia
obtenido restando (C) de (B), y (E) un espectro diferencia obtenido
restando (D) de (A). Para todos los experimentos, el tiempo de
bloqueo del giro del filtro T_{2} era de 200 ms, con un retraso
del eco del giro de 1 ms, la concentración del compuesto 1 era de
100 \muM, la concentración de FKBP era de 50 \muM, y el tampón
era PO_{4} 50 mM, NaCl 100 mM, pH 6,5 (95% de D2O).
La Fig. 2 muestra (A) un espectro de filtrado
T_{2} de una mezcla de compuestos 1-9, (B) un
espectro de filtrado T_{2} de una mezcla de compuestos
1-9 en presencia de FKBP, (C) un espectro de
filtrado T_{2} de FKBP, (D) un espectro diferencia obtenido
restando (C) de (B), (E) un espectro diferencia obtenido restando
(D) de (A), y (F) un espectro de filtrado T_{2} de referencia del
compuesto 1 solo. Para todos los experimentos, el tiempo de bloqueo
del giro del filtro T_{2} era de 200 ms, con un retraso del eco
del giro de 1 ms, la concentración de todos los compuestos químicos
era de 100 \muM, la concentración de FKBP era de 50 \muM, y el
tampón era PO_{4} 50 mM, NaCl 100 mM, pH 6,5 (95% de D2O).
La Fig. 3 muestra (A) un espectro de filtrado
T_{2} de una mezcla de compuestos 2-9, (B) un
espectro de filtrado T_{2} de una mezcla de compuestos
2-9 en presencia de FKBP, (C) un espectro de
filtrado T_{2} de FKBP, (D) un espectro diferencia obtenido
restando (C) de (B), y (E) un espectro diferencia obtenido restando
(D) de (A). Para todos los experimentos, el tiempo de bloqueo del
giro del filtro T_{2} era de 200 ms, con un retraso del eco del
giro de 1 ms, la concentración de todos los compuestos químicos era
de 100 \muM, la concentración de FKBP era de 50 \muM, y el
tampón era PO_{4} 50 mM, NaCl 100 mM, pH 6,5 (95% de D2O).
La Fig. 4 muestra un espectro de filtrado por
difusión del compuesto 1 en presencia de FKBP utilizando una fuerza
de gradiente baja, (B) un espectro de filtrado por difusión del
compuesto 1 en presencia de FKBP utilizando una fuerza de gradiente
elevada, (C) un espectro diferencia obtenido restando (B) de (A),
(D) un espectro de filtrado por difusión del compuesto 1 utilizando
una fuerza de gradiente baja, y (E) un espectro diferencia obtenido
restando (C) de (D). Para todos los experimentos, las fuerzas de
gradiente bajas y elevadas se corresponden con 3 y 48 Gauss/cm,
respectivamente. La fuerza de gradiente elevada era suficiente para
eliminar la señal de HDO residual de la muestra. Se utilizó un
tiempo de retraso de la difusión de 300 ms, la concentración de
todos los compuestos químicos era de 100 \muM, la concentración de
FKBP era de 50 \muM, y el tampón era PO_{4} 50 mM, NaCl 100 mM,
pH 6,5 (95% de D2O).
La Fig. 5 muestra (A) un espectro de filtrado por
difusión de una mezcla de compuestos 1-9 en
presencia de FKBP utilizando una fuerza gradiente baja, (B) un
espectro de filtrado por difusión de una mezcla de compuestos
1-9 en presencia de FKBP utilizando una fuerza de
gradiente elevada, (C) un espectro diferencia obtenido restando (B)
de (A), (D) un espectro de filtrado por difusión de una mezcla de
compuestos 1-9 utilizando una fuerza de gradiente
baja, (E) un espectro diferencia obtenido restando (C) de (D), y (F)
un espectro de referencia del compuesto 1 solo. Para todos los
experimentos, las fuerzas de gradiente bajas y elevadas se
corresponden con 3 y 48 Gauss/cm, respectivamente. La fuerza de
gradiente elevada era suficiente para eliminar la señal de HDO
residual de la muestra. Se utilizó un tiempo de retraso de la
difusión de 300 ms, la concentración de todos los compuestos
químicos era de 100 \muM, la concentración de FKBP era de 50
\muM, y el tampón era PO_{4} 50 mM, NaCl 100 mM, pH 6,5 (95% de
D2O).
La Fig. 6 muestra (A) un espectro de filtrado por
difusión de una mezcla de compuestos 2-9 en
presencia de FKBP utilizando una fuerza gradiente baja, (B) un
espectro de filtrado por difusión de una mezcla de compuestos
2-9 en presencia de FKBP utilizando una fuerza de
gradiente elevada, (C) un espectro diferencia obtenido restando (B)
de (A), (D) un espectro de filtrado por difusión de una mezcla de
compuestos 2-9 utilizando una fuerza de gradiente
baja, y (E) un espectro diferencia obtenido restando (C) de (D).
Para todos los experimentos, las fuerzas de gradiente bajas y
elevadas se corresponden con 3 y 48 Gauss/cm, respectivamente. La
fuerza de gradiente elevada era suficiente para eliminar la señal de
HDO residual de la muestra. Se utilizó un tiempo de retraso de la
difusión de 300 ms, la concentración de todos los compuestos
químicos era de 100 \muM, la concentración de FKBP era de 50
\muM, y el tampón era PO_{4} 50 mM, NaCl 100 mM, pH 6,5 (95% de
D2O).
La presente invención proporciona un método de
rastreo rápido y eficaz para identificar ligandos que se unen a
moléculas diana terapéuticas.
Los ligandos son identificados sometiendo a
ensayo la unión de las moléculas a una molécula diana (v.g., una
proteína, ácido nucleico, etc.) siguiendo, con una espectroscopia de
resonancia magnética nuclear (RMN) los cambios de las velocidades o
bien de relajación o bien de difusión de las resonancias del ligando
tras la adición de la diana. La reserva de moléculas rastreadas
puede ser seleccionada a partir de una colección de compuestos tales
como los asequibles actualmente en la mayoría de las compañías
farmacéuticas o laboratorios universitarios.
La información sobre las relaciones
estructura/actividad entre los ligandos identificados mediante
semejante procedimiento puede ser utilizada para diseñar nuevos
fármacos que sirvan como ligandos para la molécula diana. A modo de
ejemplo, cuando se identifican dos o más ligandos para una molécula
diana dada, se forma un complejo de esos ligandos y la molécula
diana. La orientación espacial de los ligandos entre sí así como con
respecto a la molécula diana se deriva de los datos estructurales.
La orientación espacial define la distancia entre los sitios de
unión de los dos ligandos y la orientación de cada ligando a esos
sitios.
Utilizando esos datos de la orientación espacial,
se conectan después los dos o más ligandos para formar un nuevo
ligando. La conexión se completa de manera que se mantiene la
orientación espacial de los ligandos entre sí y a la molécula
diana.
Existen numerosas ventajas en el procedimiento de
descubrimiento basado en la RMN 1D para la presente invención.
Primero, debido a que el procedimiento de la presente invención
identifica ligandos midiendo directamente la unión a la molécula
diana, el problema del falso positivo se reduce
significativamente.
Segundo, el problema de los falsos negativos se
reduce significativamente ya que el presente procedimiento puede
identificar compuestos que se unen específicamente a la molécula
diana con un amplio intervalo de constantes de disociación.
Tercero, utilizando la presente invención se
elimina el requerimiento de proteínas marcadas con N^{15} de bajo
peso molecular (<40 kDa) que sean estables a elevadas
concentraciones, como requieren los métodos en los que se utiliza la
espectroscopia de correlación N^{15}/H^{1}.
Cuarto, la capacidad de identificar directamente
los compuestos activos en una mezcla de compuestos mediante la
comparación de los desplazamientos químicos conocidos reduce
significativamente la cantidad de tiempo requerida para rastrear e
identificar compuestos activos que se unan a la molécula diana.
Debido a que las señales de los ligandos
potenciales son controladas para detectar la unión a la molécula
diana, se pueden identificar dos o más ligandos que se unen
simultáneamente a la molécula diana. La capacidad para identificar
simultáneamente los sitios de unión de diferentes ligandos permite a
un artesano experto 1) definir la unión cooperativa negativa y
positiva entre ligandos y 2) diseñar nuevos fármacos conectando dos
o más ligandos en un único compuesto a la vez que se mantiene una
orientación apropiada de los ligandos entre sí y con respecto a sus
sitios de unión.
En su aspecto principal, la presente invención
proporciona un procedimiento de rastreo de compuestos para
identificar la presencia de compuestos que son ligandos que se unen
a una molécula diana específica. Ese procedimiento se define en la
reivindicación 1.
Cuando en un procedimiento de la invención se
rastrea más de un compuesto en la etapa (b) y cuando se observa una
diferencia entre espectros, se puede identificar el compuesto activo
por el conocimiento previo de los desplazamientos químicos de los
compuestos de la mezcla en ausencia de la molécula diana. En
ausencia de semejante información, se realizan etapas adicionales
para identificar qué compuesto específico se está uniendo a la
molécula diana. Aquellas etapas adicionales se definen en la
reivindicación 2.
Se puede utilizar cualquier molécula diana en el
procedimiento de la presente invención, siempre que la molécula
diana sea suficientemente más grande que los compuestos de ensayo
con el fin de causar grandes diferencias en las velocidades de
relajación o difusión del compuesto de ensayo después de unirse a la
molécula diana. Debido a la importancia de las proteínas en la
química médica, una molécula diana preferida es un polipéptido. En
una realización preferida, la molécula diana es un polipéptido de
peso molecular superior a 5 kDa.
El procedimiento de rastreo de la presente
invención comienza con la generación o adquisición de un espectro de
protón unidimensional o bien de filtrado T_{2} o bien de filtrado
por difusión del compuesto o la mezcla de compuestos. Los métodos
para generar los espectros de protón unidimensionales de filtrado
T_{2} o filtrado por difusión son bien conocidos en la técnica
(ver, v.g., S. Meiboom y D.Gill, Rev. Sci. Instrum.
29:688 (1.958), S.J. Gibbs y C.S.Johnson, Jr J. Magn.
Reson. 93:395-402 (1.991) y A.S. Altieri,
y col. J. Am. Chem. Soc. 117:7566-7567
(1.995)).
Para facilitar la adquisición de los datos de RMN
de un gran número de compuestos (v.g., una base de datos de
compuestos orgánicos pequeños de origen sintético o natural), se
emplea un intercambiador de muestras. Utilizando el intercambiador
de muestras, se pueden manejar sin vigilancia un total de 60
muestras. Así, utilizando los parámetros de adquisición típicos (128
barridos por desintegración por inducción libre (fid), se pueden
adquirir 100-120 espectros en un período de 24
horas.
Para facilitar el tratamiento de datos de RMN, se
utilizan programas para transferir y tratar automáticamente los
múltiples datos de RMN unidimensionales.
En la Fig. 1A se muestra un espectro de filtrado
T_{2} unidimensional de una mezcla de compuestos. En la Fig. 2A se
muestra un espectro de filtrado por difusión unidimensional
representativo de una mezcla de compuestos.
Tras la adquisición del primer espectro, la
molécula diana marcada es expuesta a uno o más compuestos de ensayo.
Cuando se va a someter a ensayo más de un compuesto de ensayo
simultáneamente, se prefiere utilizar una base de datos de
compuestos tales como una pluralidad de pequeñas moléculas. Tales
moléculas se disuelven típicamente en dimetilsulfóxido perdeuterado.
El compuesto de la base de datos puede ser adquirido de vendedores o
creado según las necesidades deseadas.
Los compuestos individuales pueden ser
seleccionados entre otros basándose en el tamaño (peso molecular =
100-300) y en la diversidad molecular. Los
compuestos de la colección pueden tener diferentes formas (v.g.,
anillos aromáticos planos, anillos alifáticos plegados, compuestos
alifáticos de cadena lineal y ramificada con enlaces sencillos,
dobles, o triples) y diversos grupos funcionales (v.g., ácidos
carboxílicos, ésteres, éteres, aminas, aldehídos, cetonas, y
diversos anillos heterocíclicos) para maximizar la posibilidad de
descubrir compuestos que interaccionen con sitios de unión
ampliamente diversos.
En el procedimiento de rastreo por RMN de la
presente invención se utilizan concentraciones de ligando que
oscilan de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 1,0 mM. A estas
concentraciones, los compuestos que son ácidos o alcalinos pueden
cambiar significativamente el pH de las soluciones de proteínas
tamponadas. Los desplazamientos químicos son sensibles a los cambios
de pH así como las interacciones de unión directa, y por lo tanto se
pueden observar cambios de desplazamiento químico "falsos
positivos", que no son resultado de la unión del ligando sino de
los cambios de pH. Por tanto es necesario asegurarse de que el pH de
la solución tamponada no cambia tras la adición del ligando. Más
abajo se expone un método para controlar el pH.
Los compuestos se almacenan a 263K en forma de
soluciones de partida 1,0 y 0,1 M en dimetilsulfóxido (DMSO). Esto
es necesario debido a la solubilidad limitada de los ligandos en
solución acuosa. No es posible ajustar directamente el pH de la
solución de DMSO. Además, el HCl y el NaOH forman sales insolubles
en DMSO, de modo que se deben utilizar ácidos y bases alternativos.
Se ha encontrado que el siguiente enfoque produce un pH estable.
Las soluciones de partida en DMSO 1,0 M se
diluyen 1:10 en fosfato 50 mM, pH 7,0. Se mide el pH de esa solución
de alícuota diluida. Si el pH de la alícuota no cambia (es decir,
permanece a 7,0), se elabora una solución de trabajo diluyendo la
solución de partida en DMSO 1:10 para elaborar una solución 0,1 M y
esa solución se almacena.
Si el pH de la alícuota diluida es menor de 7,0,
se añade etanolamina a la solución de partida en DMSO 1,0 M, después
esa solución se diluye 1:10 con tampón fosfato para elaborar otra
alícuota, y el pH de la alícuota se vuelve a verificar.
Si el pH de la alícuota diluida es mayor de 7,0,
se añade ácido acético a la solución de partida en DMSO 1,0 M, esa
solución de partida se diluye después 1:10 con tampón fosfato para
elaborar otra alícuota, y se vuelve a verificar el pH de la
alícuota.
La etanolamina y el ácido acético son solubles en
DMSO, y se añaden los equivalentes apropiados para asegurarse de que
tras la transferencia al tampón acuoso, el pH no cambia. El ajuste
del pH es un procedimiento interactivo, repetido hasta que se
obtiene el resultado deseado.
Obsérvese que este procedimiento se realiza en
diluciones 1:10 de las soluciones de partida 1,0 M (ligando 100 mM)
para asegurarse de que no se observan cambios de pH a las
concentraciones inferiores utilizadas en los experimentos (0,1 a 10
mM) o en sistemas tampón diferentes/más débiles.
Tras la exposición de los compuestos de ensayo a
la molécula diana, se genera un segundo espectro de filtrado T_{2}
o por difusión unidimensional. Para el enfoque de filtrado T_{2},
el segundo espectro se genera de la misma manera mostrada antes. El
primer y el segundo espectros se comparan después para determinar si
hay cualquier diferencia entre los dos espectros. Las diferencias en
los espectros de filtrado T_{2} unidimensionales indican que el
ligando se está uniendo a la molécula diana. Esas diferencias se
determinan utilizando procedimientos normalizados bien conocidos en
la técnica. Para el método de filtrado por difusión, el segundo
espectro se genera considerando las diferencias espectrales entre
fuerzas de gradiente bajas y elevadas - seleccionando así aquellos
compuestos cuyas velocidades de difusión son comparables con las
observadas en ausencia de la molécula diana.
A modo de ejemplo, en la Fig. 1 se muestran
comparaciones de los espectros de filtrado T_{2} unidimensionales
antes y después de la exposición de diversas moléculas diana a una
mezcla de compuestos de ensayo, y la posterior identificación de un
compuesto activo. Una descripción detallada de cómo se realizaron
estos estudios se puede encontrar más adelante en el Ejemplo 1.
También a modo de ejemplo, en la Fig. 2 se
muestran comparaciones de los espectros de filtrado por difusión
unidimensionales antes y después de la exposición de diversas
moléculas diana a una mezcla de compuestos de ensayo, y la posterior
identificación de un compuesto activo. Una descripción detallada de
cómo se realizaron estos estudios se puede encontrar más adelante en
el Ejemplo 2.
Para descubrir moléculas adicionales que se unen
a la proteína, se seleccionan las moléculas para el ensayo basándose
en las relaciones estructura/actividad del rastreo inicial y/o en la
información estructural de las guías iniciales cuando se unía a la
proteína. A modo de ejemplo, el rastreo inicial puede dar como
resultado la identificación de ligandos, todos lo cuales contienen
un anillo aromático. En la segunda tanda del rastreo se utilizarían
otras moléculas aromáticas como compuestos de ensayo.
Debido a su importancia en la química médica, una
molécula diana preferida para su uso en semejante procedimiento es
un polipéptido. En una realización preferida, se puede realizar un
procedimiento de detección de la unión de un ligando a la molécula
diana en presencia de un segundo ligando. Según esta realización, la
molécula diana se une a ese segundo ligando antes de ser expuesta a
los compuestos de ensayo.
Las moléculas diana preferidas, los métodos para
generar los espectros, y los métodos para comparar los espectros son
los mismos mostrados antes.
La etapa inicial en el procedimiento de diseño es
la identificación de dos o más ligandos que se unan a la molécula
diana específica. La identificación de tales ligandos se realiza
utilizando la espectroscopia de filtrado T_{2} o por difusión
unidimensional como se ha mostrado antes.
Una vez que dos o más ligandos son identificados
por unirse a la molécula diana en sitios diferentes, se forma un
complejo entre la molécula diana y los ligandos. Cuando existen dos
ligandos, el complejo es un complejo ternario. Se forman complejos
cuaternarios y otros complejos cuando hay tres o más ligandos.
Los complejos se forman mezclando la molécula
diana simultáneamente o sucesivamente con los diversos ligandos en
circunstancias que permitan a esos ligandos unirse a la diana. Los
métodos para determinar esas condiciones son bien conocidos en la
técnica.
Una vez que se ha formado el complejo, se
obtienen los datos estructurales. Se puede utilizar cualquier método
para obtener datos estructurales. Tales métodos son bien conocidos
en la técnica. Los métodos ejemplares y preferidos son la RMN y la
cristalografía de rayos X.
Un análisis de los datos estructurales puede
revelar la orientación espacial relativa de los ligandos entre sí
así como la conformación de la molécula diana. Primero, la
orientación espacial de cada ligando con respecto a la molécula
diana permite la identificación de aquellas porciones del ligando
directamente implicadas en la unión (es decir, aquellas porciones
que interaccionan con el sitio de unión a la diana) y aquellas
porciones de cada ligando que se proyectan a partir del sitio de
unión y qué porciones pueden ser utilizadas en procedimientos de
conexión posteriores.
Segundo, los datos de orientación espacial se
utilizan para mapear las posiciones relativas de cada ligando entre
sí. En otras palabras, se pueden calcular las distancias discretas
entre los ligandos orientados espacialmente.
Tercero, los datos de orientación espacial
también definen las relaciones tridimensionales entre los ligandos y
la diana. Así, además de calcular las distancias absolutas entre
ligandos, también se pueden determinar las orientaciones angulares
de esos ligandos.
El conocimiento de las orientaciones espaciales
de los ligandos y la diana se utiliza después para seleccionar
conectores para conectar dos o más ligandos en una sola entidad que
contiene todos los ligandos. El diseño de los conectores se basa en
las distancias y la orientación angular necesarias para mantener
cada porción de ligando de la entidad única en una orientación
apropiada para la diana.
La conformación tridimensional de los conectores
adecuados es bien conocida o es fácilmente averiguable por un
experto normal en la técnica. Si bien es teóricamente posible
conectar dos o más ligandos a lo largo de cualquier intervalo de
distancia y proyección tridimensional, en la práctica se prefieren
ciertas limitaciones de distancia y proyección. En una realización
preferida, los ligandos están separados por una distancia de menos
de aproximadamente 15 Angstroms (\ring{A}), más preferiblemente
menos de aproximadamente 10 \ring{A} e, incluso más
preferiblemente menos de aproximadamente 5 \ring{A}.
Una vez que se ha identificado un grupo conector
adecuado, los ligandos se conectan con ese conector. Los métodos
para conectar ligandos son bien conocidos en la técnica y dependen
de la estructura química del ligando y del propio grupo conector.
Los ligandos son conectados entre sí utilizando aquellas porciones
del ligando que no están directamente implicadas en la unión a la
molécula diana.
Los siguientes Ejemplos ilustran las
realizaciones preferidas de la presente invención y no son
limitantes de la memoria ni de las reivindicaciones en modo
alguno.
Se preparó proteína de unión FK humana
recombinante (FKBP) como describen Logan y col., J. Mol.
Biol. 236:637-648 (1.994).
La secuencia de pulsos empleada para explotar los
cambios de las velocidades de relajación transversales (T_{2}) de
los ligandos potenciales en presencia de la molécula diana es la
secuencia de
Carr-Purcell-Meiboom-Gill
(CPMG) como describen S. Meiboom y D. Gill, en Rev. Sci.
Instrum, 29:688 (1.958).
La presente invención saca ventaja del hecho de
que las grandes moléculas o complejos de moléculas que voltean
lentamente en solución tendrán tiempos de relajación transversal
(T_{2}) más cortos que una molécula pequeña que voltea rápidamente
en solución. Esto es bien conocido en la técnica. La presente
invención saca ventaja del hecho de que una pequeña molécula, que
normalmente voltea rápidamente cuando está libre en solución,
volteará más lentamente cuando se una a una molécula diana más
grande. Así, las velocidades de relajación transversales (T_{2})
de la molécula pequeña cambiarán (disminuirán) cuando se unan a una
molécula diana.
Esto se demuestra en la Fig. 1 para FKBP y el
compuesto 1, que se une a FKBP con una afinidad de 200 \muM. En la
Fig. 1A, se aplica una secuencia CPMG con un tiempo de bloqueo del
giro de 200 ms al compuesto en ausencia de FKBP. Puesto que las
velocidades de relajación transversal de las moléculas pequeñas
libres en solución son generalmente del orden de segundos, se
produce una relajación insignificante durante el tiempo de bloqueo
del giro, y se observan las señales del ligando libre. En presencia
de FKBP, sin embargo, las señales del ligando se reducen
significativamente tras el tiempo de bloqueo del giro, y sólo los
picos de la proteína residual y del ligando permanecen en el
espectro, como se muestra en la Fig. 1B. Estas diferencias pueden
ser detectadas o bien mediante inspección directa, o bien mediante
un método de diferenciación espectral en el que el espectro de FKBP
solo (tras el bloqueo del giro, Fig. 1C) se resta del espectro del
compuesto en presencia de FKBP (también después del bloqueo del
giro, Fig. 1B), dando como resultado el espectro mostrado en la Fig.
1D. Este espectro contiene en ese caso sólo los picos del ligando
residual, que, si se desea, puede ser incluso reducido
adicionalmente en intensidad mediante la aplicación de tiempos de
bloqueo del giro más largos. Este espectro (Fig. 1D) es restado
después del espectro del compuesto de ensayo solo (Fig. 1A), dando
como resultado el espectro mostrado en la Fig. 1E. Los picos
positivos del espectro diferencia corresponden a los desplazamientos
químicos del compuesto en ausencia de la proteína diana, como se
demuestra mediante la comparación de la Fig. 1A con la Fig. 1E,
mientras los picos negativos corresponden a los desplazamientos
químicos del compuesto cuando se une a FKBP. Esta información puede
ser utilizada para identificar el compuesto activo.
Los mismos experimentos se pueden realizar sobre
una mezcla de compuestos. En estos experimentos, los compuestos
2-9, que son conocidos por no unirse a FKBP, fueron
combinados con el compuesto 1. La Fig. 2 muestra los espectros de
filtrado T_{2} para la mezcla de compuestos en ausencia de FKBP
(Fig. 2A), la presencia de FKBP (Fig. 2B), y para FKBP solo (Fig.
2C). El espectro de la Fig. 2D, obtenido restando la Fig. 2C de la
Fig. 2B, contiene las resonancias de los ligandos en presencia de la
proteína. El espectro de la Fig. 2E, obtenido restando la Fig. 2D de
la Fig. 2A, contiene picos positivos que corresponden a las
posiciones de las resonancias del compuesto 1 en ausencia de FKBP,
como se demuestra en el espectro de referencia mostrado en la Fig.
2F. La información del desplazamiento químico contenida la Fig. 2E
se utiliza no sólo para detectar la presencia de un ligando que se
une a la proteína, sino que también puede ser utilizada para
identificar qué compuesto de la mezcla de compuestos se está
uniendo, siempre que semejante información del desplazamiento
químico acerca de los ligandos libres sea conocida a
priori.
La Fig. 3 muestra el mismo grupo de experimentos
con una mezcla de compuestos 2-9 solamente, que no
se unen a FKBP. Como se observa en la Fig. 3E, no se observan
resonancias del ligando absortivo, positivas en el espectro
diferencia, indicando que no se están uniendo ligandos a FKBP.
La secuencia de pulsos empleada para explotar los
cambios en las velocidades de difusión de los ligandos potenciales
en presencia de la molécula diana es la descrita por S.J. Gibbs y
C.S. Johnson, Jr. J. Magn. Reson.
93:395-402 (1.991) y A.S. Altieri, y col.
J. Am. Chem. Soc. 117:7566-7567
(1.995).
La presente invención saca ventaja del hecho de
que las moléculas pequeñas difunden más rápidamente que las
moléculas grandes en solución. Esto es bien sabido en la técnica. La
presente invención saca ventaja del hecho de que una pequeña
molécula, que normalmente difunde rápidamente cuando está libre en
solución, difundirá más lentamente cuando se una a una molécula
diana más grande. Así, las velocidades de difusión de la molécula
más pequeña cambiarán (disminuirán) cuando se unan a una molécula
diana.
La capacidad para detectar la unión del ligando
utilizando filtros de difusión se demuestra para la unión de FKBP al
compuesto 1, como se muestra en la Fig. 4. Primero, se obtienen los
espectros de filtrado por difusión a fuerzas de gradientes débiles y
fuertes sobre una muestra del compuesto 1 en presencia de FKBP (Fig.
4A y 4B, respectivamente). Estos espectros son restados después para
producir el espectro mostrado en la Fig. 4C. Este espectro contiene
resonancias del ligando residual del compuesto 1. Este espectro es
restado después de un espectro de referencia del compuesto 1 solo
(después de un gradiente débil, Fig. 4D), para rendir un espectro
que contiene las resonancias del ligando que se une a la proteína
(Fig. 4E). Como con el experimento de filtrado T_{2}, los picos
positivos de la Fig. 4E corresponden a los desplazamientos químicos
del ligando en ausencia de proteína, mientras los picos negativos
corresponden a los desplazamientos químicos cuando se unen a FKBP.
Esta información puede ser utilizada para identificar el compuesto
activo.
Los mismos experimentos se pueden realizar en una
mezcla de compuestos. En estos experimentos, los compuestos
2-9, que se sabe que no se unen a FKBP, fueron
combinados con el compuesto 1. Las Fig. 5 y 5B muestran espectros de
la mezcla de compuestos en presencia de FKBP después de fuerzas de
gradiente débiles y fuertes, respectivamente. La diferencia entre
estos espectros produce un espectro (Fig. 5C). La sustracción de
este espectro de un espectro de control de la mezcla de ligandos en
ausencia de FKBP (después de un gradiente débil, Fig. 5D), rinde un
espectro (Fig. 5E) que contiene las resonancias positivas en los
desplazamientos químicos para el compuesto 1 en ausencia de FKBP
(Fig. 5F). La información del desplazamiento químico contenida en
la Fig. 5E se utiliza no sólo para detectar la presencia de un
ligando que se une a la proteína, sino que también puede ser
utilizada para identificar qué compuesto de la mezcla de compuestos
se está uniendo, siempre que semejante información del
desplazamiento químico acerca de los ligandos libres sea conocida
a priori.
La Fig. 6 muestra el mismo grupo de experimentos
con una mezcla de compuestos 2-9 solamente, que no
se unen a FKBP. Como se observa en la Fig. 6E, no se observan
resonancias del ligando positivas en el espectro diferencia,
indicando que ningún ligando se está uniendo a FKBP.
Todos los espectros de RMN fueron registrados a
300 K en un espectrómetro AMX500 NMR. Todos los espectros fueron
registrados con 256 barridos y una anchura de barrido de protón de
8333,3 Hz y una duración del pulso a 90 grados de protón de 7
\mus. Para los experimentos de filtrado T_{2}, el tiempo de
bloqueo del giro era de 200 ms con un retraso del eco de giro de 1
ms. Para los espectros de filtrado en gradiente, las fuerzas de
gradiente bajas y elevadas corresponden a 3 y 48 Gauss/cm,
respectivamente, y se utilizó un tiempo de retraso de la difusión de
300 ms. En todos los experimentos, la concentración de cada ligando
era de 100 \muM, la concentración de FKBP era de 50 \muM, y el
tampón era PO_{4} 50 mM, NaCl 100 mM, pH 6,5 (95% de D2O). Los
datos de RMN fueron tratados y analizados en ordenadores Silicon
Graphics.
Los ejemplos anteriores no son limitantes y la
presente invención también está dirigida a un procedimiento de
diseño de un ligando de elevada afinidad que es la combinación
conectada de al menos dos ligandos encontrados en el ejemplos
presentado antes.
^{a} La K_{D} para el compuesto 1 se obtuvo
de S. Shuker, y col., Science
274:1531-1534 (1.996), mientras las de los
compuestos 2-9 fueron estimadas a partir de la
ausencia de cambios en el desplazamiento químico observado en los
espectros N^{15}-HSQC de FKBP a concentraciones
de compuesto de 1,0 mM, como se describe en la misma
referencia.
Claims (26)
1. Un procedimiento de rastreo de compuestos para
identificar la presencia de compuestos que son ligandos que se unen
a una molécula diana específica que comprende las etapas de:
- a)
- generar un primer espectro de RMN de filtrado T_{2} o por difusión unidimensional de un compuesto o una mezcla de compuestos químicos;
- b)
- exponer el compuesto o la mezcla de compuestos químicos a una molécula diana;
- c)
- generar un segundo espectro de RMN de filtrado T_{2} o por difusión unidimensional de dicho compuesto o dicha mezcla de compuestos químicos cuando se expone a la molécula diana en la etapa (b); y
- d)
- comparar dichos primer y segundo espectros de RMN de filtrado T_{2} o por difusión unidimensionales para determinar las diferencias entre dichos primer y segundo espectros de RMN, identificando las diferencias la presencia de uno o más compuestos entre dicho compuesto o dicha mezcla de compuestos químicos, respectivamente, que son ligandos que se han unido a la molécula diana.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, donde
se utiliza una mezcla de compuestos químicos de (b), que comprende
adicionalmente las etapas posteriores a la etapa (d) de
- (e)
- generar un primer espectro de RMN de filtrado T_{2} o por difusión unidimensional de cada compuesto de la mezcla;
- (f)
- exponer dicho compuesto de dicha mezcla individualmente a la molécula diana,
- (g)
- generar un segundo espectro de RMN de filtrado T_{2} o por difusión unidimensional de cada compuesto cuando se expone a la molécula diana en la etapa (f); y
- (h)
- comparar cada espectro de RMN generado en la etapa
- (g)
- con dicho primer espectro de RMN para determinar las diferencias en cualquiera de esos espectros de RMN comparados, identificando las diferencias la presencia de un compuesto que es un ligando que se ha unido a la molécula diana.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, que
comprende adicionalmente la etapa de unir la molécula diana a un
segundo ligando antes de la etapa (a).
4. El procedimiento de la reivindicación 1, donde
los compuestos rastreados se seleccionan de una colección de
compuestos de diversas moléculas pequeñas.
5. El procedimiento de la reivindicación 1, donde
la molécula diana se selecciona entre los polipéptidos.
6. El procedimiento de la reivindicación 5, donde
el polipéptido se selecciona entre una enzima o un receptor.
7. El procedimiento de la reivindicación 1, donde
la molécula diana se selecciona entre los ácidos polinucleicos.
8. El procedimiento de la reivindicación 1, donde
la molécula diana no está marcada.
9. Un procedimiento de diseño de un ligando de
elevada afinidad a una molécula diana, que comprende
- (a)
- identificar un primer ligando para la molécula diana utilizando la espectroscopia de RMN de filtrado T_{2} o por difusión unidimensional utilizando un procedimiento según la reivindicación 1;
- (b)
- identificar uno o más ligandos adicionales para la molécula diana utilizando la espectroscopia de RMN de filtrado T_{2} o por difusión unidimensional;
- (c)
- formar un complejo entre el primer ligando identificado y uno o más de los ligandos adicionales identificados con la molécula diana;
- (d)
- determinar la estructura tridimensional de al menos esa porción del complejo donde el primero y uno o más ligandos adicionales se están uniendo a la molécula diana y, de ese modo, la orientación espacial del primer y uno o más ligandos adicionales sobre la molécula diana; y
- (e)
- conectar el primer y uno o más ligandos adicionales para mantener la orientación espacial determinada en la etapa (d) para formar el ligando de alta afinidad.
10. Un procedimiento según la reivindicación 9,
donde la molécula diana se selecciona entre los polipéptidos.
11. Un procedimiento según la reivindicación 9,
donde la molécula diana no está marcada.
12. Un procedimiento según la reivindicación 9,
donde el ligando y uno o más ligandos adicionales están conectados
juntos por medio de una síntesis orgánica lineal o convergente para
formar el ligando de alta afinidad.
13. Un procedimiento según la reivindicación 9,
donde el ligando de alta afinidad es un radical farmacéuticamente
activo.
14. Un procedimiento según la reivindicación 9,
donde el primer y uno o más ligandos adicionales se seleccionan de
una reserva de diversas moléculas pequeñas.
15. Un procedimiento según la reivindicación 14,
donde las moléculas pequeñas se seleccionan entre una colección de
compuestos.
16. Un procedimiento según la reivindicación 9,
donde el complejo se forma combinando el primer y uno o más ligandos
adicionales con la molécula diana en solución.
17. Un procedimiento según la reivindicación 16,
donde el complejo formado en solución es similar o idéntico al
complejo formado entre el ligando o uno o más ligandos adicionales
en condiciones fisiológicas.
18. Un procedimiento según la reivindicación 1,
que comprende adicionalmente las etapas de:
- (e)
- utilizar dicha comparación para ayudar a la identificación de un compuesto químico que es un ligando para dicha molécula diana, y
- (f)
- preparar dicho compuesto.
19. Un procedimiento según la reivindicación 9,
que comprende antes de la etapa (a) una etapa de selección de una
molécula diana y después de la etapa (e) una etapa de preparación de
un compuesto químico cuya estructura es aquella obtenida conectando
dicho primer ligando y dichos ligandos identificados adicionales de
tal manera que se mantenga la orientación espacial determinada en la
etapa (d).
20. El procedimiento de la reivindicación 18 o la
reivindicación 19, donde la molécula diana es un polipéptido.
21. El procedimiento de la reivindicación 20,
donde dicho polipéptido tiene un peso molecular mayor de 5 kDa.
22. Un compuesto farmacéuticamente activo que
tiene una elevada afinidad hacia una biomolécula diana que comprende
un primer ligando y uno o más ligandos adicionales, donde dicho
primer y uno o más de dichos ligandos adicionales están conectados,
siendo preparado dicho compuesto mediante el procedimiento según la
reivindicación 19.
23. Un compuesto farmacéuticamente activo que
tiene elevada afinidad hacia una biomolécula diana según la
reivindicación 22, donde dicha biomolécula diana es un ácido
nucleico.
24. Un compuesto farmacéuticamente activo que
tiene elevada afinidad hacia una biomolécula diana según la
reivindicación 22, donde dicha biomolécula diana es un
polipéptido.
25. Un compuesto farmacéuticamente activo que
tiene elevada afinidad hacia una biomolécula diana según la
reivindicación 24, donde dicha biomolécula diana es un polipéptido
que tiene un peso molecular mayor de 5 kDa.
26. Un compuesto farmacéuticamente activo que
tiene elevada afinidad hacia una biomolécula diana según la
reivindicación 24, donde dicha biomolécula diana es la proteína de
unión FK humana (FKBP).
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