ES2348608T3 - Procedimientos basados en rmn para detectar ligandos, en los que el ligando o diana estan hiperpolarizados y el espectro de rmn de compara con un espectro de referencia de ligando o diana. - Google Patents
Procedimientos basados en rmn para detectar ligandos, en los que el ligando o diana estan hiperpolarizados y el espectro de rmn de compara con un espectro de referencia de ligando o diana. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento basado en RMN para identificar ligandos que se unen a una diana que es una biomolécula, comprendiendo dicho procedimiento a) hiperpolarizar al menos un ligando o una diana, en el que dicho ligando o dicha diana se enriquecen isotópicamente de forma selectiva con núcleos activos en RMN 13 C y/o 15 N; b) formar una mezcla por contacto del al menos un ligando hiperpolarizado con una diana, o con una diana y al menos un ligando adicional, o poner en contacto la diana hiperpolarizada con al menos un ligando, c) generar un espectro de RMN de la mezcla y d) comparar dicho espectro de RMN con un espectro de referencia del al menos un ligando hiperpolarizado o de la diana hiperpolarizada, respectivamente.
Description
La invención se refiere a procedimientos basados en RMN que comprenden ligandos o dianas hiperpolarizados para su uso en ensayos basados en RMN.
Los diversos proyectos de secuenciación de genoma actualmente en marcha están generando datos a una velocidad muy grande. Las biomoléculas codificadas por las secuencias génicas pertinentes sirven como moléculas diana (= dianas) para identificación o el diseño de compuestos que se unan a las mismas (= ligandos), por ejemplo, como ligandos naturales, como agonistas o antagonistas de un ligando natural, como un inhibidor, un sustrato
o un vector diana. Como tal, la identificación de ligandos es una de las primeras etapas en el descubrimiento de fármacos. El descubrimiento de fármacos comprende tanto la identificación de compuestos candidato, es decir, compuestos que presentan altas afinidades de unión a la diana seleccionada, como un procedimiento de optimización en el que se estudia en detalle la relación estructura-actividad entre la diana y el compuesto candidato identificado. Para acelerar el descubrimiento de fármacos, se emplean bibliotecas de supuestos ligandos naturales o sintéticos en un procedimiento de exploración de alto rendimiento y el parámetro de exploración inicial es habitualmente una alta actividad de unión del ligando hacia la diana. El procedimiento de optimización se centra también en otros parámetros importantes del ligando para que sea adecuado como compuesto farmacológico futuro, tal como estabilidad química y metabólica, no toxicidad y propiedades ADME óptimas (administración, distribución, metabolismo y excreción).
La RMN es una de las herramientas más versátiles en el descubrimiento de fármacos a día de hoy. La RMN no sólo puede contribuir a la identificación de compuestos candidato, sino que también facilita el procedimiento de optimización de compuestos candidato proporcionando información acerca de la estructura molecular e información específica acerca de la unión del ligando a la diana. Existen dos formas diferentes de recoger la información necesaria: el control de las señales de RMN derivadas de la diana o las que surjan del ligando.
Chen y col., J. Am. Chem. Soc. 120 (1998), 10258-10259 describen la denominada “técnica de bombeo de EON” que depende de EON para transferir la señal desde la diana hasta un ligando unido. Se crea una magnetización no en equilibrio por saturación de las moléculas de ligando. Las señales de los ligandos que no se unen a la diana se suprimen por uso de un filtro de difusión (fuerza de gradiente y tiempo de retardo de difusión). Puesto que el filtro de difusión destruye las señales de los ligandos antes de que se aplique una secuencia de EON, sólo la transferencia de polarización desde la diana hasta un ligando unido puede proporcionar polarización a dicho ligando. Cuando el ligando se disocia de la diana, la polarización transferida permanece en el ligando libre. La desventaja del procedimiento descrito es que debido a una relajación rápida (especialmente relajación T2) de la diana la intensidad de señal es reducida, lo que reduce la sensibilidad del procedimiento. Además, el filtro de difusión aplicado requiere un intercambio entre el ligando y la diana. Por lo tanto, la ventana de afinidad en la que pueden controlarse las interacciones está limitada y hace que el procedimiento no sea adecuado para ligandos con una afinidad muy elevada o muy escasa.
Se ha sugerido también una forma diferente de realizar el mismo experimento por A. Chen y col., J. Am. Chem. Soc. 122 (2000), 414-415. Aquí, el mecanismo se invierte en comparación con la técnica de bombeo de EON, en concreto para detectar señales transferidas de un ligando unido a la molécula diana. Se usa un filtro T2 para suprimir las señales diana mientras se mantienen las señales de los ligandos. El resultado es que la intensidad de señal de los ligandos no unidos disminuye debido a la relajación y al bombeo de EON. Para detectar esta diferencia en la pérdida de intensidad de señal, es necesario un espectro de referencia en el que se registre la pérdida de intensidad de señal debido a la relajación. El uso de un filtro T2 limita este procedimiento a sistemas con diferencias relativamente grandes en la relajación T2 entre la diana y el ligando. Esto a su vez requiere que los ligandos estén en equilibrio rápido entre el estado libre y unido. Esto limita el intervalo de afinidades medibles con este procedimiento.
Mayer y col., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 38 (1999), 1784-1788 describen un procedimiento en el que se satura selectivamente una resonancia de diana resuelta. Esto a su vez da como resultado la saturación de la molécula diana completa y cualquier ligando unido a la misma debido a mecanismos de difusión de espín eficaces. Por consiguiente, se aplica un filtro de relajación que permite la observación única de las señales de los ligandos afectados. Se registra un espectro de referencia con irradiación fuera de resonancia y se resta para poner de manifiesto las señales del ligando unido. Puesto que las intensidades del ligando unido pueden traducirse en distancias, el sitio de unión puede cartografiarse. La desventaja de este procedimiento es que mezclas más complejas sólo pueden examinarse usando espectros de RMN 2D. Si sólo están disponibles cantidades pequeñas de diana y/o ligando, el procedimiento requiere mucho tiempo. Además, no pueden medirse ligandos de alta afinidad, debido al filtro de relajación aplicado. Shuker y col., Science 274 (1996), 1531-1534 describen el denominado procedimiento de REA por RMN (REA = relación estructura-actividad) en el que se controlan los cambios de desplazamiento químico en una molécula diana marcada con 15N como una diferencia entre la molécula diana libre y una molécula diana con un ligando unido a la misma. Estos cambios de desplazamiento químico se cartografían sobre la estructura de la diana y los sitios de unión se caracterizan. Los ligandos identificados individualmente con afinidad hacia sitios de unión diferentes en la diana pueden unirse químicamente para dar como resultado un ligando de alta afinidad optimizado. El procedimiento se limita a moléculas diana marcadas con 15N. Además, debe conocerse la asignación espectral de la diana.
El documento WO-A1-97/18471 desvela un procedimiento para explorar supuestos ligandos que se basa en la generación de un primer espectro de correlación de RMN 15N/1H 2D de una proteína enriquecida isotópicamente con 15N y un segundo espectro de correlación de
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RMN N/H 2D del complejo de ligando/proteína enriquecido isotópicamente con N. Los cambios del espectro proteico se usan después para identificar el sitio de unión del ligando. De nuevo, este procedimiento se limita a las dianas proteicas enriquecidas isotópicamente con 15N.
El documento WO-A1-00/62074 desvela un procedimiento similar que se basa en y limitado a moléculas diana enriquecidas isotópicamente con 13C.
El documento WO-A1-02/33406 desvela un procedimiento para identificar una molécula de unión usando proteínas marcadas con 13C/15N, en el que los aminoácidos marcados al menos una vez aparecen en las inmediaciones directas de la proteína, generando un primer espectro de RMN tipo HNCO de la diana marcada y un segundo espectro de RMN tipo HNCO del complejo de ligando/diana marcada. Los cambios en el desplazamiento químico se usan después para identificar supuestas moléculas de unión. La desventaja del procedimiento se debe a su limitación a moléculas diana proteicas marcadas de forma especial.
Las desventajas encontradas por los procedimientos de la técnica anterior descritos anteriormente se deben a interferencias de fondo y/o limitaciones de la sensibilidad. Para suprimir las señales de fondo, esos procedimientos implican el uso de los denominados filtros de RMN que, por ejemplo, pueden usarse para suprimir selectivamente señales de la diana y del ligando, respectivamente. Dichos filtros ponen restricciones a los tamaños moleculares y ventanas de afinidad de unión y, por lo tanto, limitan los procedimientos de la técnica anterior. Las limitaciones de sensibilidad pueden ser problemáticas por varias razones: para aliviar dichas limitaciones, son necesarias grandes cantidades de diana o ligando. Las grandes cantidades de ligando necesarias para los procedimientos descritos anteriormente pueden generar demandas de solubilidad rigurosas en los ligandos ensayados y de este modo hacer aún más difícil diseñar bibliotecas de ligando. Además, la reacción puede tener lugar por lo tanto en condiciones que difieran de las condiciones fisiológicas. Las grandes cantidades de diana necesarias hacen que esos ensayos basados en RMN sean muy costosos e incluso dificulten el ensayo de algunas dianas, ya que no pueden expresarse en cantidades lo bastante grandes. La baja sensibilidad da como resultado además un muestreo experimental prolongado, haciendo que los procedimientos de la técnica anterior requieran mucho tiempo y por lo tanto no sean útiles como procedimientos de alto rendimiento.
Por lo tanto, existía la necesidad de proporcionar un procedimiento de exploración basado en RMN que supere las desventajas de la técnica anterior como se ha resumido anteriormente.
Esto se consigue por medio del procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1.
Las ventajas del procedimiento de acuerdo con la invención son que no están presentes señales de fondo ya que sólo se detecta la especie hiperpolarizada —la diana o el ligando. Esto permite la recogida de datos de RMN sin la aplicación de filtros de RMN. Por lo tanto, la ventana de afinidad no está limitada en el procedimiento de la invención. Además, son necesarias menores cantidades de moléculas de diana o ligando debido a la sensibilidad claramente aumentada del procedimiento de la invención en comparación con los procedimientos de la técnica anterior. Esto a su vez hace que las demandas de solubilidad de la diana/ligando sean menos rigurosas y hace posible realizar el procedimiento a concentraciones más fisiológicamente relevantes. Debido a la sensibilidad aumentada, es posible además combinar la etapa de exploración y optimización en un procedimiento de descubrimiento de fármacos por exploración para compuestos farmacológicos potentes directamente entre una combinación de compuestos menos potentes sin la necesidad de la optimización de fármacos. La generación de espectros de acuerdo con el procedimiento de la invención puede realizarse mediante RMN unidimensional y los espectros pueden adquirirse en una sola exploración. Esto hace que el procedimiento sea extremadamente rápido y por lo tanto adecuado para usarlo en un procedimiento de exploración de alto rendimiento. Puede volverse razonable además explorar simplemente compuestos de ligando individuales en lugar de bibliotecas de ligandos, obteniendo de este modo una información más exacta y fiable.
Los términos usados por toda esta memoria descriptiva tienen sus significados aceptados habitualmente. En una definición más específica, la “diana, molécula diana o compuesto diana” se refiere a cualquier biomolécula, preferentemente una biomolécula seccionada del grupo constituido por proteínas, glicoproteínas, lipoproteínas, ácidos nucleicos, por ejemplo, ADN o ARN, polipéptidos, glicopolipéptidos, lipopolipéptidos, péptidos y partes o fragmentos de los mismos. La diana puede ser una diana de origen natural, por ejemplo, que puede obtenerse por aislamiento de un organismo natural, preferentemente animales o seres humanos, u obtenerse por expresión por un microorganismo modificado genéticamente, por ejemplo, bacterias. Dichas dianas pueden modificarse adicionalmente, por ejemplo, tratándolas con enzimas o compuestos químicos. La diana también puede ser una diana sintetizada químicamente tal como ADN sintetizado químicamente, ARN, péptido o polipéptido.
En una definición más específica, el “ligando, molécula de ligando o compuesto de ligando” se refiere a cualquier molécula que puede unirse a una diana. El ligando puede ser una proteína, una glicoproteína, una lipoproteína, un polipéptido, un glicopolipéptido, un lipopolipéptido, un péptido, un carbohidrato, un ácido nucleico, por ejemplo, ADN o ARN o una parte, un fragmento o un complejo del mismo, o cualquier otro compuesto químico de interés. Preferentemente, el ligando es una molécula orgánica relativamente pequeña, particularmente una molécula orgánica pequeña de menos de 2000 Da. Se prefieren especialmente moléculas de fármaco. El ligando puede ser un ligando de origen natural, por ejemplo, que puede obtenerse por aislamiento de un organismo natural, preferentemente de plantas, animales o seres humanos, u obtenerse por expresión mediante microorganismos modificados genéticamente, por ejemplo, bacterias. Dichos ligandos pueden modificarse además, por ejemplo, por tratamiento de los mismos con enzimas o compuestos químicos. El ligando también puede ser un compuesto sintetizado químicamente, tal como un ADN, ARN, péptido o polipéptido o una molécula orgánica pequeña químicamente sintetizada.
En el procedimiento de acuerdo con la invención, se usa al menos un ligando o diana hiperpolarizado.
Si un ligando está hiperpolarizado, puede ser un ligando (por ejemplo, ligando A) o una mezcla de moléculas de ligando diferentes (por ejemplo, ligandos A, B, C...), por ejemplo una biblioteca de ligandos.
El término “hiperpolarización” significa aumentar la polarización nuclear de núcleos activos en RMN presentes en el ligando o la diana, es decir, 13C y/o 15N.
El enriquecimiento puede incluir enriquecimientos selectivos de uno o más sitios dentro de la molécula diana o de ligando o un enriquecimiento uniforme de todos los sitios. El enriquecimiento puede conseguirse por síntesis química o marcaje biológico, siendo este último especialmente útil para enriquecer isotópicamente moléculas diana. Se conocen en la técnica procedimientos adecuados. En resumen, una molécula diana que se expresa por un microorganismo (modificado genéticamente) puede enriquecerse uniformemente por, por ejemplo, cultivo del microorganismo en un medio nutritivo que contiene nutrientes enriquecidos
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uniformemente con C o N, como glucosa enriquecida con C o NH4Cl. Puede conseguirse un enriquecimiento selectivo cultivando el microorganismo en un medio nutritivo que contiene, por ejemplo, aminoácidos enriquecidos con 13C o 15N como alanina o leucina. Por lo tanto, la diana estará específicamente enriquecida con 13C en esos restos aminoacídicos contenidos dentro de la diana expresada. Preferentemente, las moléculas diana y de ligando se enriquecen isotópicamente de forma selectiva, preferentemente en posiciones con T, tiempo de relajación, prolongado. Convenientemente, las moléculas de ligando y diana de acuerdo con la invención son moléculas enriquecidas isotópicamente con un enriquecimiento de al menos el 10%, más convenientemente de al menos 25%, preferentemente de al menos el 75%, más
preferentemente de al menos el 90%, que se aproxima idealmente al 100%.
De acuerdo con la presente invención, las moléculas diana y de ligando se enriquecen
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selectivamente con C y/o N, preferentemente con C o N, prefiriéndose particularmente con 13C.
Existen varias formas para hiperpolarizar núcleos activos en RMN, siendo formas preferidas transferencia de polarización a partir de un gas noble, por "fuerza bruta”, PND y refrigeración de espín, explicándose todas a continuación.
Una forma preferida de hiperpolarizar los núcleos activos en RMN que contienen compuestos de sonda de acuerdo con la invención es la transferencia de polarización a partir de un gas noble hiperpolarizado. Los gases nobles que tienen espín nuclear distinto de cero pueden estar hiperpolarizados, es decir, tener su polarización aumentada por encima de la polarización de equilibrio, por ejemplo, mediante el uso de luz circularmente polarizada. Un gas noble hiperpolarizado, preferentemente 3He o 129Xe, o una mezcla de dichos gases, puede usarse de acuerdo con la presente invención para efectuar la hiperpolarización de los núcleos activos en RMN presentes en los compuestos de sonda y/o ensayo. La hiperpolarización también puede conseguirse usando un gas noble hiperpolarizado enriquecido artificialmente, preferentemente 3He o 129Xe. El gas hiperpolarizado puede estar en la fase gas, puede estar disuelto en un líquido o el propio gas hiperpolarizado puede servir como disolvente. Como alternativa, el gas puede condensarse sobre una superficie sólida enfriada y usarse de esta forma o permitir que se sublime. Cualquiera de estos procedimientos puede permitir la mezcla íntima necesaria del gas hiperpolarizado con la molécula a hiperpolarizar. En algunos casos, liposomas o microburbujas pueden encapsular el gas noble hiperpolarizado.
Otra forma preferida para hiperpolarizar núcleos activos en RMN de acuerdo con la invención es que se transmite polarización a dichos núcleos activos en RMN por equilibrado termodinámico a una temperatura muy baja y a alto campo. La hiperpolarización en comparación con el campo de funcionamiento y la temperatura del espectrómetro de RMN se efectúa mediante el uso de un campo muy alto y una temperatura muy baja (fuerza bruta). La potencia de campo magnético usada debería ser tan alta como sea posible, convenientemente superior a 1 T, preferentemente superior a 5 T, más preferentemente de 15 T o más y especialmente preferentemente de 20 T o más. La temperatura debería ser muy reducida, por ejemplo, de -268,8ºC (4,2 K) o menos, preferentemente de -271,5ºC (1,5 K) o menos, más preferentemente -272ºC (1,0 K) o menos, especialmente preferentemente de -272,9ºC (100 mK) o menos.
Otra forma preferida de hiperpolarizar núcleos activos en RMN de acuerdo con la invención es el procedimiento de PND (polarización nuclear dinámica) efectuado por un agente de PND. Los mecanismos de PND incluyen el efecto de Overhauser, el efecto sólido y el efecto de mezcla térmica. Pueden usarse muchos compuestos paramagnéticos conocidos como agentes de PND, por ejemplo, metales de transición tales como iones cromo (V), radicales libres orgánicos tales como radicales nitróxido y radicales tritilo (documento WO-A-98/58272) u otras moléculas que tengan asociados electrones libres. Preferentemente, se usan radicales con baja relaxividad como agentes de PND. Cuando el agente de PND es un radical libre paramagnético, el radical puede prepararse convenientemente in situ a partir de un precursor de radical estable mediante una etapa de generación de radicales poco antes de la polarización, o como alternativa mediante el uso de radiación ionizante. Durante el procedimiento de PND, se suministra energía, normalmente en forma de radiación microondas, que inicialmente excitará las especies paramagnéticas. Tras la desintegración hasta el estado fundamental, existe una transferencia de polarización a los núcleos activos en RMN del material diana. El procedimiento puede utilizar un campo magnético moderado o alto y una temperatura muy baja, por ejemplo, realizando el procedimiento de PND en helio líquido y un cambio magnético de aproximadamente 1 T o superior. Como alternativa, se consigue un campo magnético moderado y puede emplearse cualquier temperatura a la que se consiga un aumento de RMN suficiente para permitir que se realicen los estudios deseados. El procedimiento puede realizarse usando un primer imán para proporcionar el campo magnético de polarización y un segundo imán para proporcionar el campo primario para espectroscopía de RMN. Como alternativa, tanto la polarización PND como la espectroscopía de RMN pueden realizarse en un solo imán.
Otra forma preferida de hiperpolarizar núcleos activos en RMN de acuerdo con la invención es el procedimiento de refrigeración de espín. Este procedimiento abarca la polarización de espín de un compuesto sólido o sistema mediante polarización por refrigeración de espín. El sistema se adultera con o mezcla íntimamente con materiales paramagnéticos adecuados tales como iones Ni2+ , lantánido o actínido en forma cristalina con un eje de simetría de orden de tres o más. La instrumentación es más simple que la necesaria para PND sin necesidad de un campo magnético uniforme, puesto que no se aplica un campo de excitación de resonancia. El procedimiento se realiza girando físicamente la muestra alrededor de un eje perpendicular a la dirección del campo magnético. El requisito previo para este procedimiento es que la especie paramagnética tenga un factor g altamente anisotrópico. Como resultado de la rotación de la muestra, la resonancia paramagnética electrónica se pondrá en contacto con los espines nucleares, conduciendo a una disminución en la temperatura de espín nuclear. La rotación de la muestra se realiza hasta que la polarización de espín nuclear haya alcanzado un nuevo equilibrio.
El procedimiento de PND es el procedimiento más preferido para hiperpolarización de acuerdo con la invención.
Algunas de las técnicas de hiperpolarización descritas anteriormente, por ejemplo, PND, fuerza bruta o transferencia de refrigeración de espín, son ventajosos cuando transfieren la polarización a una muestra en estado sólido. Si la muestra no es sólida, puede congelarse de forma convencional en un disolvente o mezcla de disolventes apropiada antes de la hiperpolarización por uno de los procedimientos que deben realizarse en el estado sólido. Se ha descubierto que las mezclas de disolventes son particularmente adecuadas, especialmente si la mezcla forma un vidrio amorfo, por ejemplo, que comprende glicerol, propanodiol o glicol. Dicha matriz amorfa se emplea preferentemente en la hiperpolarización PND para asegurar una distribución homogénea de los compuestos en el sólido.
La polarización de los núcleos activos en RMN puede medirse por su factor de potenciación en comparación con el equilibrio térmico en el campo y temperatura del espectrómetro. Convenientemente, el factor de potenciación para cualquier núcleo activo en RMN es de al menos 10, preferentemente de al menos 50 y, más preferentemente, de al menos 100.
Si la hiperpolarización se realiza mediante un procedimiento que requiere que la muestra esté en estado sólido, el al menos un ligando hiperpolarizado o la diana hiperpolarizada se llevan preferentemente a solución después de la etapa de hiperpolarización. Son disolventes adecuados los que son útiles para estudiar la interacción entre ligando y diana en la etapa b) y c) del procedimiento acuerdo con la invención. Dichos disolventes son, por ejemplo, tampones deuterados y no deuterados, como tampones fosfato, y pueden contener pequeñas cantidades de disolventes orgánicos tales como DMSO, metanol y ácido acético.
En el procedimiento de acuerdo con la invención, los compuestos hiperpolarizados (es decir, ligando o ligandos o diana) se ponen en contacto con compuestos no hiperpolarizados (es decir, ligando o ligandos o diana) para formar una mezcla. La cantidad de diana/ligando hiperpolarizado necesaria depende del factor de potenciación, de la clase de información que debería proporcionar el ensayo y de la amplitud de línea de los picos.
Si el compuesto hiperpolarizado es un ligando, entonces dicho ligando se pone en contacto con una diana o con una diana y al menos un ligando adicional que es diferente del ligando hiperpolarizado. En el primer caso, por ejemplo es posible investigar si un ligando específico se une a una diana, obteniendo información acerca de la afinidad del ligando, por ejemplo, calculando las constantes de unión, distancias de unión y/o obteniendo información estructural tal como la orientación relativa del ligando unido con respecto a la molécula diana o la identificación de epítopes en la diana a la que se une el ligando. Es posible además identificar, por ejemplo, un potente inhibidor de una enzima, por ejemplo, si el ligando hiperpolarizado es un sustrato conocido para una enzima (diana) y la mezcla contiene una pluralidad de supuestos inhibidores (ligandos), controlando cambios en la velocidad de conversión de la enzima. En el segundo caso, por ejemplo, es posible hiperpolarizar un ligando conocido para una diana específica y, por lo tanto, identificar ligandos con mayor afinidad hacia la diana de una pluralidad de ligandos diferentes. Se obtiene información acerca de la afinidad del ligando unido, por ejemplo, calculando las constantes de unión y/o obteniendo información estructural tal como las distancias de unión, la orientación relativa del ligando unido con respecto a la molécula diana o la identificación de epítopes en la diana a la que se une el ligando.
Si más de un ligando está hiperpolarizado, entonces dichos ligandos se ponen en contacto con una diana para formar una mezcla. Por lo tanto, es posible identificar el ligando con la mayor afinidad hacia una diana específica entre una pluralidad de ligandos diferentes, por ejemplo, una biblioteca de ligandos. Es posible además obtener información acerca de la afinidad del ligando, por ejemplo, calculando las constantes de unión y/o obteniendo información estructural tal como distancias de unión, la orientación relativa del ligando unido con respecto a la molécula diana o la identificación de epítopes en la diana a la que se une el ligando.
Si el compuesto hiperpolarizado es una diana, entonces dicha diana se pone en contacto con al menos un ligando. Por lo tanto, es posible investigar si un ligando específico se une a la diana el ligando o identificar el ligando con la mayor afinidad hacia la diana entre una pluralidad de ligandos diferentes, por ejemplo, una biblioteca de ligandos. Es posible además obtener información acerca de la afinidad del ligando, por ejemplo, calculando las constantes de unión y/u obteniendo información estructural tal como las distancias de unión, la orientación relativa del ligando unido con respecto a la molécula diana o la identificación de epítopes en la diana a la que se une el ligando.
Para la formación de la mezcla, los compuestos hiperpolarizados, así como los compuestos no hiperpolarizados, se disuelven preferentemente en un disolvente adecuado, como tampones adecuados. En una realización preferida, una solución del compuesto hiperpolarizado se transfiere directamente a una solución de los compuestos no hiperpolarizados. La formación de una mezcla puede conseguirse por varios medios conocidos en la técnica, tales como agitación, agitación vorticial, sonicación, etc.
El espectro de RMN generado a partir de la mezcla puede ser un espectro de RMN uni-, bi-o multidireccional, preferentemente un espectro de RMN unidimensional del núcleo activo. El espectro puede adquirirse en una sola exploración o en varias exploraciones, en cualquier combinación de pulsos de gradiente y RF, dependiendo de los parámetros de RMN a extraer y de la información a obtener. Dichos parámetros son, por ejemplo, desplazamiento químico, aumento de la amplitud de línea, acoplamiento dipolar o escalar. En una realización preferida, se usan ángulos de rotación reducidos en la generación del espectro de RMN. Por lo tanto, es posible estudiar el comportamiento dinámico de la interacción entre un ligando y una diana o el destino dependiente del tiempo de una reacción química. Puede ser información adicional a obtener las constantes de unión para determinar la afinidad de unión, las distancias de unión o información estructural tal como la orientación relativa de un ligando unido con respecto a la molécula diana, o la identificación de epítopes en la diana a la que se une un ligando. Dicha información estructural puede obtenerse, por ejemplo, controlando los EON de transferencia (Efectos de Overhauser Nucleares) desde el compuesto hiperpolarizado (por ejemplo, espines de 13C hiperpolarizados en un ligando) hasta el compuesto no hiperpolarizado (por ejemplo, los protones de una diana). Los EON de un espín nuclear hiperpolarizado a un espín nuclear no hiperpolarizado darán como resultado una transferencia parcial de la gran polarización no en equilibrio del primero al último y, por lo tanto, causarán una potenciación transitoria de las señales de RMN correspondientes. Este cambio en la señal de RMN, que puede observarse fácilmente usando RMN unidimensional, es una forma conveniente de cartografiar las interacciones dipolares entre un espín nuclear hiperpolarizado y otros. Como los EON pueden ser intra-o intermoleculares, esta técnica podría usarse, por ejemplo, para cartografiar el sitio de unión en una diana después de ponerla en contacto con un ligando hiperpolarizado. Preferentemente, la muestra se mantiene en condiciones optimizadas para el T1 más prolongado posible, es decir, a una temperatura tan alta como sea posible y con el uso de disolventes deuterados.
El espectro de RMN generado a partir de la mezcla se compara con un espectro de referencia del al menos un ligando hiperpolarizado o de la diana hiperpolarizada.
Para el espectro de referencia del al menos un ligando hiperpolarizado o de la diana hiperpolarizada, los compuestos se miden en su estado libre, es decir, antes de ponerse en contacto con la diana o al menos un ligando. Las condiciones para generar dicho espectro de referencia deberían estar tan próximas a las condiciones de generación del espectro de RMN de la mezcla. Preferentemente, las condiciones son idénticas con respecto a, por ejemplo, disolventes, pH y parámetros espectrales como, por ejemplo, longitud de pulso. El espectro de referencia puede ser un espectro de RMN uni-, bi-o multidimensional, preferentemente un espectro de RMN unidimensional del agente activo de elección. El espectro puede adquirirse en una sola exploración o en varias exploraciones en cualquier combinación de pulsos de gradiente y RF. Preferentemente, la muestra se mantiene en condiciones optimizadas durante el T1 más prolongado que sea posible, es decir, a una temperatura tan alta como sea posible y con el uso de disolventes deuterados.
Puede realizarse una comparación por simple evaluación visual de los espectros, por ejemplo, de si un pico ha aparecido o desaparecido. Convenientemente, la comparación se realiza de una forma asistida por ordenador, por ejemplo, calculando un espectro de diferencia entre el espectro de RMN de la mezcla y el espectro de referencia. Preferentemente, pueden controlarse cambios de desplazamiento químico, aumento de la amplitud de línea, diferencias de tiempo de relajación o diferencias de efecto EON. Si un ligando está en intercambio rápido
o intermedio con la diana, la posición y amplitud de la señal de RMN controlada se ve afectada por el aumento de la amplitud del intercambio. La señal o señales de RMN se producen en algún punto entre la posición de los desplazamientos químicos en el ligando libre y en el ligando unido y la amplitud de la señal o señales se aumenta más o menos. Cuando el ligando está estrechamente unido a la diana, de modo que es aplicable el “límite de intercambio lento”, se obtendrán dos conjuntos distintos de señales de RMN, en concreto un conjunto que surge de la fracción libre del ligando y un conjunto que surge de la fracción unida del ligando. Las intensidades relativas de estas dos señales reflejan las fracciones libre y unida del ligando correspondiente. Por lo tanto, es posible identificar, por ejemplo, ligandos que se unen a la diana, identificar ligandos con mayores afinidades de unión a una diana, determinar constantes de unión o identificar inhibidores enzimáticos potentes, agonistas o antagonistas. Es posible además obtener información estructural acerca de la interacción entre el ligando y la diana, tal como distancias de unión, orientación relativa del ligando con respecto a la molécula diana o la identificación de epítopes en la diana a la que se une el ligando. Una forma de obtener información estructural de un complejo de ligando-diana por RMN es aprovechar los acoplamientos dipolares a través del espacio entre espines nucleares del ligando y de la diana, respectivamente. En el caso de un constituyente, por ejemplo, el ligando hiperpolarizado o la diana hiperpolarizada, una gran polarización no en equilibrio está presente en ciertos sitios. Estos podrían ser, por ejemplo, uno o más sitios enriquecidos con 13C o 15N en el ligando. De acuerdo con los EON, el acoplamiento dipolar entre espines nucleares da origen a la relajación cruzada entre los espines acoplados. La relajación cruzada dipolar puede producir por lo tanto una transferencia parcial de la polarización aumentada del ligando a la diana y viceversa. Estos índices de relajación cruzada, que pueden obtenerse a partir de los cambios transitorios en la polarización nuclear de los sitios correspondientes, están en función de la distancia entre los espines acoplados, del tiempo de correlación de reorientación y de las proporciones giromagnéticas de los espines nucleares implicados. Conociendo estos últimos parámetros y observando el patrón de potenciación inducido por EON de señales de RMN individuales, es posible por lo tanto calcular las distancias a través del espacio y cartografiar los sitios de unión. Dicha información estructural puede obtenerse, por ejemplo, controlando los EON de transferencia del compuesto hiperpolarizado (por ejemplo, los espines de 13C hiperpolarizados en un ligando) al compuesto no hiperpolarizado (por ejemplo, los protones de una diana). Aparte de identificar con precisión bolsillos de unión en la diana a partir de la identificación de las interacciones implicadas en la unión, estos EON reflejan las distancias de unión entre el ligando y la diana.
La presente invención es útil para el descubrimiento de fármacos con ayuda de RMN, preferentemente en procedimientos de exploración y/u optimización basados en RMN en el descubrimiento de fármacos.
Otro aspecto más de la invención es el uso de ligandos hiperpolarizados enriquecidos isotópicamente en ensayos de competición de ligando.
El enriquecimiento puede incluir enriquecimientos selectivos de uno o más sitios dentro de la molécula de ligando o enriquecimiento uniforme de todos los sitios. El enriquecimiento puede conseguirse por síntesis química o marcaje biológico. Se conocen en la técnica procedimientos adecuados. Preferentemente, las moléculas de ligando se enriquecen isotópicamente de forma selectiva, preferentemente en posiciones con un tiempo de relajación T1 prolongado. Convenientemente, las moléculas de ligando de acuerdo con la invención son moléculas enriquecidas isotópicamente con un enriquecimiento de al menos el 10%, más convenientemente de al menos el 25%, preferentemente de al menos el 75%, más preferentemente de al menos el 90%, aproximándose idealmente al 100%.
En una realización preferida de la presente invención, los ligandos se enriquecen
13151315
selectivamente con C y/o N, preferentemente con C o N, particularmente preferentemente con 13C.
El ensayo de competición de ligando puede usarse para identificar inhibidores, antagonistas o agonistas de una molécula diana específica. Por lo tanto, es posible identificar compuestos farmacológicos potentes. Ejemplos Ejemplo 1
Los dominios SH2 son módulos de aproximadamente 100 aminoácidos que se unen a motivos peptídicos que contienen fosfotirosina (pY) específicos. Estos dominios se encuentran en un gran número de proteínas implicadas en la transducción de señales. Debido a que los dominios SH2 desempeñan un papel fundamental en una diversidad de rutas de transducción de señales, los dominios SH2 han sido dianas de considerables intentos de diseño de fármacos. Sin embargo, los determinantes del reconocimiento de pY por dominios SH2 no se conocen bien todavía. Por lo tanto, es de interés identificar los atributos de pY necesarios para una interacción de alta afinidad con dominios SH2.
El propósito del experimento era ilustrar el control de las diferencias de desplazamiento químico de un ligando enriquecido entre el estado unido y libre y de este modo determinar si la unión tiene lugar y determinar la afinidad de unión.
Diana: dominio de homología Src 2 de unión de hormona de crecimiento.
Ligando: (1-13)C-Ac-EpYINQ-NH2 Ejemplo 1.1
Se disolvieron 19 nmol de ligando en 12 µl de agua y se mezclaron con 15,6 mg de una solución de glicerol que contenía radical tritilo 30 mM. La muestra líquida se congeló como gotas en nitrógeno líquido. La muestra se colocó en el polarizador y se hiperpolarizó durante una noche (17 h) a 93,934 GHz y 100 mW (procedimiento PND). La muestra se llevó a solución con tampón fosfato (pH 6,5, 100 mM, 60ºC, 8,5 ml). El volumen de disolución activo era de 3 ml, con una recuperación del 90% de sustancia, proporcionando una concentración final de 5,7 µM. El ligando disuelto se inyectó directamente en un tubo de RMN de 10 mm y se transfirió rápidamente a un imán de 9,4 T con la sonda a 25ºC. Se adquirió un espectro de RMN de estado líquido en una exploración con un ángulo de pulso de 90º y un tiempo de adquisición de 1 s. Se obtuvo una señal de RMN a 176,9 ppm a partir del ligando marcado con 13C. La relación de señal respecto a interferencia (RSI) del espectro era de 50.
Se pusieron 940 µl de la solución diana (diana 100 µM, DTT 5 mM, NaCl 100 mM, fosfato 50 mM, pH 6,5) en un tubo de RMN de 10 mm con un tapón inferior, reduciendo el volumen activo a 1100 µl. El tubo se puso en un imán de 9,4 T con la temperatura de la sonda equilibrada a 25ºC. Se conectó un tubo a la parte inferior del tubo de RMN para permitir la inyección de la solución de ligando en la solución diana.
Se disolvieron 0,32 µmol de ligando en 20 µl de agua y se mezclaron (1:1 p/p) con una solución de glicerol que contenía tritilo 30 mM. La muestra líquida se congeló como gotas en nitrógeno líquido. La muestra se colocó en el polarizador y se hiperpolarizó durante una noche (17 h) a 93,934 GHz y 100 mW (procedimiento PND). La disolución se realizó con tampón fosfato (pH 6,5, 100 mM, 50ºC, 7 ml). El volumen de disolución activo era de 1,5 ml con una recuperación de aproximadamente el 70% de sustancia. Se cargó una jeringa de 1 ml completamente (volumen: 1100 µl) con la solución de ligando, se inyectó rápidamente un total de 160 µl de la solución de ligando en la solución diana, dando como resultado una concentración de ligando total de 24 µM.
Se generó un espectro de RMN usando los mismos parámetros espectrales que para el espectro de referencia. El tiempo de adquisición era de 1 s, la RSI era de 20. El espectro de RMN mostraba dos señales, una del ligando no unido (176,94 ppm) y otra del ligando unido (176,2 ppm).
En este ejemplo, la relación de la concentración de diana respecto a ligando era de 4:1. Puesto que se sabe que el ligando está en intercambio lento con la diana, se esperaba que se observase tanto una señal del ligando libre como una señal del ligando unido. Variando la concentración del ligando respecto a la diana en el ensayo sería por lo tanto posible medir la afinidad de unión cuantificando las cantidades relativas del ligando libre y unido visibles en los espectros, basándose en el conocimiento de las concentraciones de ligando/diana usadas en el ensayo. Ejemplo de Comparación 1.2
Para una comparación de sensibilidad, se realizó el mismo experimento con RMN convencional. Se adquirieron espectros de RMN 13C ID del ligando en el estado libre y en una mezcla con la diana con una frecuencia de 13C de 75,436 MHz en un Varian [NOVA]. Los datos se recogieron con puntos de datos de 32 k, 4096 perturbaciones transitorias, amplitud espectral de 20000 Hz y un tiempo de adquisición de 800 ms. La concentración del ligando era de 0,8 mM. La concentración del ligando y de la diana en la mezcla era de 0,6 mM cada uno. El tiempo de adquisición total era de aproximadamente 8 horas para cada espectro y las señales en los espectros resultantes apenas eran detectables.
En el procedimiento de la invención (ejemplo 1.1) puede usarse una concentración de ligando 30 veces inferior en comparación con la concentración de ligando en procedimientos convencionales (ejemplo 1.2). Además, el tiempo de adquisición de los espectros de RMN de acuerdo con el procedimiento de la invención es extremadamente corto (1 s en comparación con 8 horas), por consiguiente esto supondrá menos requisitos de estabilidad para el sistema. Los espectros mostraban una RSI superior que los espectros adquiridos en el procedimiento convencional. Ejemplo 2
Dependiendo de la velocidad de asociación/disociación de un ligando de unión entre otros ligandos, el espectro de RMN de la mezcla de ligandos/diana mostrará cambios (cambios de desplazamiento químico o aumento de la amplitud de línea) en comparación con el espectro de la mezcla de ligando libre. Por lo tanto, un espectro de diferencia pondrá de manifiesto el agente de unión en la mezcla como el compuesto que cambia una de estas propiedades tras su unión a la diana. En este ejemplo, el aumento de la amplitud de línea de la señal del ligando indica la unión a la diana.
El propósito del experimento era ilustrar la identificación de un agente de unión no enriquecido en una mezcla de ligandos no enriquecidos. Diana: Albúmina Sérica Humana. Ligandos: ácido salicílico y ácido ascórbico.
Se sabe que el ácido salicílico se une con afinidad µM a la diana mientras que el ácido ascórbico se une con afinidad mM. Ejemplo 2.1
2.1.1 Adquisición del espectro de referencia de los ligandos hiperpolarizados libres. Se disolvieron 5 mg de ácido ascórbico y 5 mg de ácido salicílico en 1 ml de agua. Se mezclaron 20 µl de esta solución con 26 mg de una solución de glicerol que contenía radical tritilo 30 mM. La muestra líquida se congeló como gotas en nitrógeno líquido y se hiperpolarizó en 6 horas (procedimiento PND). La disolución se realizó con tampón fosfato (pH 7,6, 100 mM, 60ºC, 8,5 ml). El volumen de disolución activo era de 3 ml (recuperación del 90% de sustancia), proporcionando una concentración final de 0,17 mM con respecto al ácido ascórbico y de 0,19 mM con respecto al ácido salicílico. La solución se transfirió directamente a un tubo de 10 mm y se transfirió rápidamente al imán de 9,4 T. El tiempo de adquisición era de 1 s, la RSI era de 55. El espectro mostraba señales que se originaban a partir de tanto el ácido ascórbico como el ácido salicílico.
La preparación de los ligandos y la hiperpolarización se llevaron a cabo como se describe en el 2.1. La solución de ligando se inyectó directamente en un tubo de 10 mm que contenía 10 mg de albúmina sérica humana (concentración final 50 µM, aproximadamente 1/4 de la cantidad de ligandos presentes). Se adquirió un espectro de RMN en las mismas condiciones que se describen en el 2.1, la RSI era de 50.
En este espectro las señales del ácido salicílico desaparecieron tras la unión a la diana debido a la ampliación del intercambio. Las señales del agente de unión más débil ácido ascórbico permanecieron en el espectro. Ejemplo de comparación 2.2
Para una comparación de sensibilidad, se realizó el mismo experimento con RMN convencional. Se prepararon dos muestras, una muestra de referencia con 1 mM de cada ligando en tampón fosfato pH 7,5 y una muestra de la mezcla de diana/ligandos con la misma cantidad de ligandos y diana 0,2 mM. Se adquirieron los espectros HSQC 1H-13C bidimensionales de cada muestra en un espectrómetro de RMN de 500 MHz Bruker Avance equipado con una sonda de resonancia triple inversa. Se adquirió el espectro de tipo HSQC ya que no podía llevarse a cabo un espectro de carbono detectado directamente dentro de un intervalo de tiempo razonable. La adquisición de cada espectro llevó 10 horas y las señales obtenidas apenas eran detectables. La muestra de referencia mostraba las señales esperadas para ambos ligandos. La muestra de la mezcla de diana/ligandos mostraba señales sólo para el ligando de baja afinidad ácido ascórbico. Se aumentó la amplitud de las señales del ácido salicílico más allá de la detección debido a la ampliación del intercambio.
De nuevo, con procedimientos convencionales, tenían que usarse concentraciones de ligando mucho mayores. El tiempo de adquisición es extremadamente prolongado (10 horas en comparación con 1 s) y la RSI es reducida (3 en comparación con 50). Ejemplo 3
Los mismos ligandos/diana que en el ejemplo 2 se usaron con la excepción de que se usó ácido salicílico enriquecido con 13C. Por lo tanto, sólo se controló el destino del ligando marcado como un indicador para la presencia/ausencia de un ligando de mayor afinidad presente en una mezcla de ligando.
El propósito del experimento era ilustrar el control del desplazamiento de un agente de unión marcado con isótopo por un agente de unión de mayor afinidad a partir de una combinación de ligandos de no unión.
Se disolvieron 5 mg de ácido salicílico (marcado con 13C en posición carbonilo) en 100 ml de agua. Se mezclaron 20 µl de esta solución con 26,6 mg de solución de glicerol que contenía radical tritilo 30 mM. La muestra líquida se congeló como gotas en nitrógeno líquido. La muestra se hiperpolarizó durante una noche (17 horas) (procedimiento PND). La muestra se disolvió en tampón (tampón fosfato 100 mM, pH 7,6, 60ºC, 8,5 ml), se recogió en un tubo de 10 mm y se transfirió rápidamente a un imán de 9,4 T. Se recogió un espectro de RMN 13C de solución ID de una sola exploración (tiempo de adquisición: 1 s, pulso de 90º). El espectro mostraba un solo pico de ácido salicílico, la RSI era de 40. Esta RSI se espera de acuerdo con la dilución de 100 veces del material enriquecido con 13C en comparación con el experimento de RMN usando el material con 13C de abundancia natural en 2.1.1.
La preparación del ácido salicílico marcado con 13C y la hiperpolarización se llevaron a cabo como se describe en el 3.1. Después de la disolución, la muestra se recogió en un tubo de RMN de 10 mm que contenía una solución concentrada de diana y el segundo ligando ácido ascórbico. El tubo de RMN se transfirió rápidamente al imán y se generó un espectro de RMN como se describe en el 3.1. No eran visibles picos en el espectro, indicando que se había aumentado la amplitud de la señal del ácido salicílico más allá de la detección como consecuencia de su unión a la diana.
El experimento podía llevarse a cabo de la misma forma, pero en lugar de ácido ascórbico, que es un agente de unión más débil que el ácido salicílico, podía usarse un ligando que tuviera una mayor afinidad de unión que el ácido salicílico. El espectro adquirido a partir de la mezcla mostraría una señal del ácido salicílico marcado, indicando que ha tenido lugar una competición puesto que el ligando con mayor afinidad estaba unido a la diana y, por lo tanto, el ácido salicílico estaría libre en solución.
En conclusión, este ensayo mostraba que una señal de un ligando marcado aparecía en el espectro cuando estaba presente un ligando con mayor afinidad de unión mientras que la señal desaparecía cuando sólo estaban presentes ligandos con menor afinidad que el ligando marcado. Ejemplo 4
Un ensayo de exploración rápido y robusto para inhibidores puede ser de gran importancia en la terapia farmacológica. Que éste es el caso puede ilustrarse mediante el patógeno humano, Helicobacter pylori. El patógeno desempeña un papel destacado en la patogénesis de la úlcera péptica y del cáncer gástrico. La bacteria contiene la enzima ureasa (una enzima que no está presente en animales superiores). La ureasa cataliza la hidrólisis de urea a amoniaco y carbamato. El amoniaco generado por ureasa eleva el pH del estómago y de este modo protege a la bacteria. La terapia disponible actual usa una combinación de antibióticos e inhibidores de la bomba de protones. Debido a la emergencia de cepas resistentes a antibióticos, existe la urgente necesidad de un nuevo tratamiento. Una posibilidad es la inhibición de la potente actividad de ureasa de H. pylori.
El propósito del experimento era ilustrar la identificación de un inhibidor enzimático potente en una mezcla de ligandos con características de unión desconocidas por control de cambios en la velocidad de conversión en una reacción enzimática. Enzima (diana): Ureasa. Sustrato (ligando): urea marcada con 13C.
Se mezclaron 16,4 µmol de urea marcada con 13C 1:1 (p/p) con una solución de glicerol que contenía radical tritilo 30 mM. La muestra líquida se congeló como gotas en nitrógeno líquido. La muestra congelada se hiperpolarizó durante una hora (procedimiento PND). La muestra se disolvió en un tampón fosfato (10 mM, pH 7,6, 100ºC, 8,5 ml) (volumen de disolución activo de 3 ml) y se transfirieron 500 µl a un tubo de RMN de 10 mm que contenía 2,5 ml de una solución (mismo tampón que para la urea) que contenía 12 unidades de ureasa (0,1 mg). Se recogieron una serie de 40 espectros 13C unidimensionales como uno cada 3 s, con un ángulo de rotación reducido (15º). Los espectros resultantes mostraban la conversión del sustrato en función del tiempo, es decir, la formación del producto intermedio dióxido de carbono y, posteriormente, la formación del producto final bicarbonato.
Es posible calibrar el ángulo de rotación, y se conoce la velocidad de relajación para la urea. Por lo tanto, la desintegración de la señal de sustrato puede usarse para calcular la velocidad de la conversión enzimática (velocidad de reacción). Otra forma de calcular la velocidad de reacción para el sistema es variar la concentración de enzima mientras se mantiene constante la concentración de sustrato.
Esta última estrategia se usó en una serie de experimentos que se realizaron como se ha descrito anteriormente, sólo se variaba la concentración de ureasa. Se realizaron tres experimentos con 10 unidades, 12 unidades y 14 unidades de ureasa. La actividad de ureasa se representó en función de la concentración. A partir de esta representación, se extrajo directamente la constante de velocidad de reacción. Las intensidades de señal de RMN de la urea en los experimentos individuales se han usado para calcular la actividad enzimática. Basándose en estos experimentos, se determinó que la constante de velocidad para el sistema era k = 0,0019 s-1 .
Se realizaron una nueva serie de experimentos para ensayar el sistema como una exploración posible para determinar inhibidores enzimáticos. En estos experimentos, la concentración tanto de sustrato (urea) como de enzima se mantuvo constante y se añadió ácido acetohidroxámico, un compuesto que se sabe que es un inhibidor de ureasa, en concentraciones variables.
Se realizaron experimentos como se describe en el 4.1 con el tubo de RMN que contiene 2,5 ml de solución de 12 unidades de ureasa (0,1 mg) y ácido acetohidroxámico. Se realizaron cuatro experimentos variando la concentración de ácido acetohidroxámico de aproximadamente 10-6-10-4 M. Como se ha descrito anteriormente, la actividad se calculó usando las intensidades de RMN de la señal de urea en los 4 experimentos. Representando la actividad en función de la concentración variada de ácido acetohidroxámico era posible determinar la concentración de ácido acetohidroxámico necesaria para inhibir la reacción enzimática hasta la mitad de la actividad (valor CL50). A partir de esta representación, se estimó que el valor de CL50 era de 5 ⋅ 10-5 M.
Ejemplo 5
Para obtener información estructural más específica sobre la interacción entre el ligando y la diana y al mismo tiempo preservar la alta sensibilidad del ensayo exploración, puede ser posible observar cambios en la diana en lugar del ligando.
El propósito del experimento era ilustrar la detección de un agente de unión en una mezcla de agentes de no unión por control de cambios de desplazamiento químico en la diana tras la unión del ligando o identificar con precisión los restos implicados en el sitio de unión a diana.
En un ensayo de REA por RMN convencional (véase, Shuker y col. Science 274 (1996), 1531-1534), los objetivos eran detectar un ligando de una combinación de ligandos que se une a una diana, caracterizar el sitio de unión en la diana y medir la afinidad de unión. La unión se determinó por observación de cambios de desplazamiento químicos de 15N o 1H-amida en espectros HSQC 5N/1H 2D. Un espectro de referencia de la diana en solitario se comparó con el espectro de la mezcla de ligandos/diana. Posteriormente se usó deconvolución para identificar la interacción de ligando-diana particular.
Las etapas en un ensayo de REA por RMN 1D de acuerdo con la invención son las siguientes:
Después de la hiperpolarización de la diana (procedimiento PND), la muestra diana se disuelve en tampón y se recoge un espectro de RMN 15N de solución 1D. Este espectro sirve como espectro de referencia.
Después de la hiperpolarización de la diana, la muestra diana se disuelve en tampón y se transfiere a una mezcla de ligandos (= agentes de unión potenciales). Se recoge un espectro de RMN 15N de solución 1D y se compara con el espectro de referencia. El espectro de diferencia pone de manifiesto cambios de desplazamiento químico si un ligando que se une a la diana estaba presente en la mezcla de ligando.
Dependiendo del conocimiento anterior de la diana en el ensayo, los cambios de desplazamiento químico pueden proporcionar información estructural. Ejemplo 6
Se ha obtenido una transferencia intramolecular de polarización desde un carbono de abundancia natural 13C hasta sitios adyacentes de protones en la misma molécula utilizando el efecto EON.
Se polarizó una muestra de 50 mg de 1,1-Bis(hidroximetil)ciclopropano que contenía
radical tritilo 15 mM mediante el procedimiento PND en 13C en el estado sólido a 93,91 GHz y
100 mW. Después de la disolución en D2O la muestra se transfirió al imán de 9,4 T y se
5 adquirió un espectro de RMN 1H. Durante el transporte de la muestra (después de la disolución hasta que se adquirió el espectro de RMN) los protones se polarizaron negativamente debido a la transferencia de polarización desde el 13C unido que se polariza positivamente por PND en el estado sólido. El mecanismo de transferencia es a través del efecto de Overhauser, es decir, impulsado por relajación. La potenciación de los protones directamente unidos a 13C se midió a
10 aproximadamente 200 veces.
Claims (9)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Procedimiento basado en RMN para identificar ligandos que se unen a una diana que
es una biomolécula, comprendiendo dicho procedimiento a) hiperpolarizar al menos un ligando o una diana, en el que dicho ligando o dicha diana se enriquecen isotópicamente de forma selectiva con núcleos activos en RMN 13C y/o 15N; b) formar una mezcla por contacto del al menos un ligando hiperpolarizado con una diana, o con una diana y al menos un ligando adicional, o poner en contacto la diana hiperpolarizada con al menos un ligando, c) generar un espectro de RMN de la mezcla y d) comparar dicho espectro de RMN con un espectro de referencia del al menos un ligando hiperpolarizado o de la diana hiperpolarizada, respectivamente. -
- 2.
- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el ligando se selecciona del grupo que consiste en proteínas, glicoproteínas, lipoproteínas, polipéptidos, glicopolipéptidos, lipopolipéptidos, péptidos, carbohidratos, ácidos nucleicos y moléculas orgánicas pequeñas.
-
- 3.
- Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 2, en el que el ligando es una molécula orgánica pequeña de menos de 2000 Da.
-
- 4.
- Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, en el que se usa más de un ligando hiperpolarizado.
-
- 5.
- Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4, en el que la diana se selecciona del grupo que consiste en proteínas, glicoproteínas, lipoproteínas, ácidos nucleicos, polipéptidos, glicopolipéptidos, lipopolipéptidos y péptidos.
-
- 6.
- Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5, en el que el enriquecimiento es un enriquecimiento con 13C.
-
- 7.
- Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 6, en el que el espectro de RMN generado es un espectro de RMN unidimensional.
-
- 8.
- Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 7, en el que el espectro de RMN
22 generado se genera usando ángulos de rotación reducidos. -
- 9.
- Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 8, en el que la comparación con el espectro de referencia muestra una diferencia de desplazamiento químico, una diferencia de tiempo de relajación o una diferencia de efecto EON.
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