CN104198517B - 联合使用不同核的一维核磁共振混合物定量方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种联合使用不同核的一维核磁共振定量分析方法测定复杂混合物中含不同元素的多个单体化合物含量的方法及其应用。即使在某种特定核的一维核磁共振图谱中混合物中各化合物的特征信号峰出现重叠现象，该方法也可能快捷且准确地测定混合物中多个单体化合物的绝对浓度。该方法的关键因素之一在于使用一种由多种元素组成的化合物作为不同核的核磁图谱的通用定量内标，此内标在不同核的一维核磁共振图谱中起到“定量桥梁”的作用。如果只关注某些化合物的相对浓度比例，该方法测定相对浓度比例的结果，与内标本身的浓度无关，也不受其称量误差影响。

Description

联合使用不同核的一维核磁共振混合物定量方法

技术领域

本发明属于分析化学方法领域，具体涉及一种利用核磁共振技术测定混合物中各种化合物含量的方法，更具体地说，涉及一种联合使用不同核的一维核磁共振方法测定混合物中含不同元素的多个化合物的含量的方法。

背景技术

核磁共振(NMR)在化学结构研究中已经成为一种必不可少的工具，因为它能够提供化学结构最详细的、最真实可靠的信息。除了定性，核磁共振还常用于定量分析，因为它有很多独特的优点：如不需要破坏化合物的结构，实验简单，以及信号的积分面积与自旋核的数量直接成正比等。

此前，已有单独采用氢、碳、磷、氟的一维核磁共振谱图进行定量分析的报道。其中，氢谱最常用，因为氢核在天然产物、代谢物以及合成的化合物中普遍存在，灵敏度极高。但是，对于混合物，氢谱通常信号较多，谱宽较窄，或因化学位移差别较小，从而导致信号重叠(或部分重叠)，因此仅依靠氢谱难以精确测定复杂混合物中单体化合物的含量，例如仅用氢谱很难准确测定生物样品中胆碱、磷酸胆碱和甘油磷酸胆碱的含量。

之前，为了克服生物样品中胆碱、磷酸胆碱及甘油磷酸胆碱因其氢谱中信号严重重叠而难以准确定量的问题，有报道采用磷编辑氢谱的方法，但该方法使用氢谱中信号强度较弱的亚甲基信号定量分析，强度仅是甲基信号的九分之二，并且该方法中使用磷滤波进一步降低信号强度。此外，为解决氢谱因信号重叠而难以用来进行定量分析的问题，二维核磁共振实验也是一个选择，例如¹³C-¹H HSQC实验。但经过二维脉冲系列，理论计算核磁信号的衰减因子相当复杂，其结果因化合物的环境不同等多种因素的影响而具有一定的不可靠性，且相对于一维实验，二维核磁共振实验的时间通常较长。因此有必要探索一种更为快捷简便，能够对混合物样品中单体，比如生物样品中各胆碱化合物(胆碱、磷酸胆碱和甘油磷酸胆碱)进行准确定量的方法。

发明内容

本发明的目的是，采用一种快捷简便的一维核磁共振实验方案准确测定混合物中多个单体化合物的含量，以解决常规氢谱中由于信号重叠而影响单个化合物的准确定量的问题。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

一种联合使用不同核的一维核磁共振方法，联合使用不同核的一维核磁共振图谱对复杂混合物中多个单体化合物进行定量分析或浓度测定，包括同时联合使用多种核的一维核磁共振图谱，并使用含有多种元素的同一化合物作为不同核的一维核磁共振定量分析的单一通用内标。

根据所述的方法，使用某种含有不同元素的化合物作为联合使用不同核的一维核磁共振方法的单一通用定量内标。

根据所述的方法，联合使用氢谱和磷谱定量分析方法，以三甲基氧膦作为单一通用内标。

根据所述的方法，联合使用氢谱、磷谱和氟谱定量分析方法，以同时含有氢、磷、氟元素的四甲基六氟磷酸铵作为单一通用内标。

根据所述的方法，该方法只关注待测混合物中某些化合物的相对浓度比例，计算相对浓度比例所得的结果，与内标本身的浓度无关，也不受通用内标的称量误差影响，能准确测定每种单体化合物的浓度或相对比例。

所述的一种联合使用不同核的一维核磁共振方法在测定混合物样品中化合物浓度中的应用，该方法使用在某种特定核的一维核磁共振图谱中出现特征信号峰重叠因而难以对各组分单体进行准确定量时，测定混合物中单体化合物中多种元素组成浓度。

所述的一种联合使用不同核的一维核磁共振方法在测定混合物样品中化合物浓度中的应用，用同时含有氢、磷元素的三甲基氧膦和叔丁基磷酸作为联合氢谱与磷谱进行定量分析的通用内标；用同时含有氢、磷、氟元素的四甲基六氟磷酸铵作为联合氢谱、磷谱与氟谱进行定量分析的通用内标。

所述的一种联合使用不同核的一维核磁共振方法在测定混合物样品中化合物浓度中的应用，由于测定混合物中某些化合物的相对浓度比例，计算相对浓度比例所得的结果时，与内标本身的浓度无关，不受通用内标的称量误差影响，能准确测定每种单体化合物的浓度或相对比例。

本发明中测定复杂混合物中含不同元素的多个化合物的含量，采用联合使用几种不同核的一维核磁共振定量的分析方法，例如同时使用氢谱、磷谱、氟谱或者其他核的核磁谱。该方法的关键技术因素之一在于使用一种含有多种元素的化合物作为通用定量内标，例如三甲基氧膦((CH₃)₃P(O),TMPO)或者四甲基六氟磷酸铵(N⁺(CH₃)₄PF₆ ^-)，此通用内标在不同核的一维核磁共振图谱中起到“定量桥梁”的作用。

本发明是在下述发现的基础上完成的：通常一维核磁共振谱图常因为信号的重叠而难以用来精确定量混合物中单个化合物的含量。如果这些化合物是由多种不同元素组成，如氢、碳、磷等，使用单一通用定量内标，以不同核的核磁共振图谱，比如氢谱和磷谱分别进行定量，所获得的结果具有很好的一致性。据此，我们发明一种联合使用不同核的一维核磁共振方法定量分析混合物中多个化合物的含量，该方法的关键因素之一是使用一种含多种元素的化合物作为单一的通用定量内标。

在某一种核的谱图中有严重的信号重叠，该发明的方法也能快捷简便且准确地确定混合物中单个化合物的绝对浓度。对这些化合物，如果只关注他们之间的相对浓度(比如只是化合物之间的浓度比例具有一定的生物学或生理、病理学意义等)，那么计算化合物之间的相对浓度所得的结果是不受通用内标称量误差的影响，只与各个化合物(含通用内标)在不同核的一维图谱中的积分信号强度相关。在这些不同核的一维核磁共振定量分析中，使用单一的通用内标起到“定量桥梁”的作用。

与现有技术相比，该发明方法的优点在于：

(1)样品准备简单：该方法的关键因素之一是使用一种含多种元素的化合物作为单一的通用定量内标。采用单一内标，只需一次即可制备好待测核磁样品。将待测混合物样品溶解并与内标标准浓度的母液混合均匀即可直接进行核磁共振实验，虽然采用不同核的一维核磁图谱进行定量，但无需多次制备待测试样品。相反，如果针对不同核的一维核磁定量，采用不同内标则必须多次准备样品。(2)测量实验时间相对较短：使用单一内标的同一核磁样品进行不同核的一维核磁定量测试，实验上无需多次锁场、调谐、匀场等操作而耗费时间。在扫描次数、充分的扫描间隔时间等参数相同的情况下，与二维定量核磁实验(比如¹³C-¹H HSQC)相比，该发明方法所需核磁机时通常要短得多。(3)各个单体化合物的浓度可根据样品中化合物的特征核磁信号的积分与其浓度的正比关系直接计算获得。(4)即使在某种单一核的谱图中有严重的信号重叠问题，该发明的实验方案也有对混合物中多个化合物进行准确定量的可能。(5)如果只关注化合物之间的相对浓度比例，采用该发明实验方案，所获得的结果是不受通用内标的称量误差的影响。

附图说明

图1一维氢谱和一维磷谱定量结果。其中(A)是叔丁基磷酸(TBPA)和三甲基氧膦(TMPO)模式混合物的一维核磁共振定量氢谱。化学位移在1.512ppm(TMPO的三个甲基氢信号)和1.069ppm(TBPA的叔丁基氢信号)的特征峰被用来定量分析。(B)是叔丁基磷酸(TBPA)和三甲基氧膦(TMPO)模式混合物的一维核磁共振定量磷谱。化学位移在53.079ppm(TMPO)和36.792ppm(TBPA)的特征峰被用来定量分析。(C)是以TMPO为内标，一维核磁共振定量氢谱测量所得的TBPA的摩尔浓度与其理论的质量(称量)摩尔浓度的相关性。(D)是以TMPO为内标，一维核磁共振定量磷谱测量所得的TBPA的摩尔浓度与其理论的质量(称量)摩尔浓度的相关性。

图2一维氢谱和一维磷谱定量结果对比。以三甲基氧膦(TMPO)作为单一通用定量内标，一维核磁共振定量氢谱和磷谱分别测量叔丁基磷酸(TBPA)的浓度，所得结果具有高度相关性(相关系数为0.996，线性回归方程为C_P,TBPA＝0.9947C_H,TBPA)，说明使用单一通用内标，一维核磁共振氢谱和磷谱定量结果的一致性。

图3联合应用氢谱和磷谱定量分析方法，以三甲基氧膦(TMPO)为单一通用内标测量胆碱(Choline)、磷酸胆碱(PC)、甘油磷酸胆碱(GPC)混合物中各组分的含量。其中(A)是胆碱、磷酸胆碱、甘油磷酸胆碱和内标三甲基氧膦(模式混合物的一维核磁共振定量氢谱。胆碱、磷酸胆碱、甘油磷酸胆碱的甲基信号较强，但信号重叠严重，对重叠区域区间(2.67-3.36ppm)的甲基氢信号峰进行总体积分，对内标三甲基氧膦的特征甲基氢信号峰(1.5142ppm)进行单独积分用来定量分析。(B)是胆碱、磷酸胆碱、甘油磷酸胆碱和内标三甲基氧膦模式混合物的一维核磁共振定量磷谱。PC、GPC和TMPO的磷信号积分强度用来定量分析。

具体实施方式

下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。

本发明实施例的核磁共振测试实验和图谱处理及数据分析按以下方法进行：

1、核磁共振测试实验：

该发明所涉及的所有的核磁共振实验均在25°(298K),在Bruker AvanceIII400MHz核磁谱仪(配备Smartprobe5mm双共振探头)上进行。

磷去耦的一维氢谱核磁共振实验采用Bruker标准脉冲序列“zgig”，氢与磷的中心频率分别设在4.7ppm和27.0ppm。扫描间隔时间，d1，设为25s(大于5倍的样品中最长的氢核的T₁时间)以确保所有自旋核能够充分弛豫恢复，达到准确定量的要求。氢核的T₁时间采用经典的翻转-恢复实验(inversion-recovery，使用Bruker标准脉冲序列“t1ir1d”)测定。实验谱宽设为21.0ppm，扫描次数(NS)设为4，32K个数据点,总实验时间约2.5分钟。

氢去耦的一维磷谱核磁共振实验采用Bruker标准脉冲序列“zgig”，氢与磷的中心频率分别设在4.7ppm和27.0ppm。同样使用Bruker标准脉冲序列“t1ir1d”测定磷核的T₁时间，与上述实验不同，扫描间隔时间，d1，设为65s(大于5倍的样品中最长的磷核的T₁时间)以确保所有自旋核能够充分弛豫恢复，达到准确定量的要求。实验谱宽设为100.0ppm，扫描次数(NS)设为16，64K个数据点,总实验时间约22.5分钟。

2、图谱处理及数据分析：

定量分析前，使用Bruker Topspin软件对傅里叶转换的图谱进行自动相位和基线校正。

核磁共振定量方法的理论基础是谱图中某个特征峰的强度(I)直接与相关自旋核的数量(N)或相关化合物的浓度成正比，即

I_H.S∝N_H.S＝n_H/S·C_s·V (1)

式中I_H.S是化合物S在定量氢谱中某个特征化学位移值的积分峰强度(下标S代表化合物S，H代表其氢谱)；N_H.S是混合样品中化合物S在该特征化学位移值所对应的氢核总数量；n_H/S是每一分子化合物S在该化学位移处所含氢原子的数量，例如对甲基基团，氢原子的数量n_H/S是3；C_s是化合物S的摩尔浓度；V是样品体积。同样，对于内标，其某个特征峰的强度也满足以下公式：

I_H，Ref∝N_H，Ref＝n_H/Ref·C_Ref·V (2)

如果没有信号重叠问题且内标浓度已知，从氢谱中某些特征峰的积分强度很容易计算出化合物S的浓度C_S，即

从而得到

$C_s=\frac{n_{H/\mathrm{Ref}}\·I_{H.S}}{n_{H/S}\·I_{H.\mathrm{Ref}}}{C}_{\mathrm{Ref}}---\left(4\right)$

同样，假设内标浓度已知，从一维定量磷谱中的某些特征峰的强度也很容易计算出化合物S的浓度C_S，即

$C_s=\frac{n_{P/\mathrm{Ref}}\·I_{P.S}}{n_{P/S}\·I_{P.\mathrm{Ref}}}{C}_{\mathrm{Ref}}---\left(5\right)$

实施例1：

三甲基氧膦和叔丁基磷酸模式混合物中叔丁基磷酸的浓度测定与一致性比较：

为了验证联合使用一维核磁共振氢谱和磷谱作为定量分析方法的可行性，本发明使用一系列变化浓度比例的三甲基氧膦((CH₃)₃P(O),TMPO)和叔丁基磷酸((CH₃)₃CP(O)(OH)₂TBPA)的模式混合物为研究对象，先验证分别使用一维核磁共振氢谱和磷谱定量所得结果的一致性。

使用试剂及样品制备：纯度为98％的三甲基氧膦和叔丁基磷酸分别购于Adamas-beta(瑞士巴塞尔)和Across(美国新泽西)。99.9％的重水(D₂O)购于CIL(CambridgeIsotope Laboratories；美国马萨诸塞)。所使用分析天平的称量精度为±0.1mg。称量177.5mg的三甲基氧膦和279.5mg的叔丁基磷酸分别放入10ml容量瓶中，加重水定容,得到母液浓度分别为188.91mM和198.34mM。再以不同浓度比(1:0.105,1:0.525,1:1.05,1:2.10,1:4.20,1:6.30,1:8.40,1:10.50,1:21.00,1:42.00)混合三甲基氧膦和叔丁基磷酸得到最终的核磁样品，其中浓度比为1:21.00、1:42.00的样品中三甲基氧膦的浓度分别为4.723mM和2.362mM，其余样品中三甲基氧膦的浓度均为9.446mM。相应的叔丁基磷酸的浓度则为：0.9917mM，4.9585mM，9.917mM，19.834mM，39.668mM，59.502mM，79.336mM，99.17mM，99.17mM，99.17mM。用这些不同浓度比例的混合物样品进行磷去耦的氢谱和氢去耦的磷谱核磁共振定量实验。

混合物样品中三甲基氧膦和叔丁基磷酸的信号强度通过使用核磁软件Mnova(西班牙，Mestrelab)进行分峰拟合获得。氢谱选择三甲基氧膦(看作浓度已知的内标)的甲基氢信号(化学位移1.512ppm)和叔丁基磷酸(看作浓度待测的化合物)的甲基氢信号(化学位移1.069ppm)为特征峰进行定量分析，对应的n_H/Ref和n_H/S均为9(图1A)。根据已知的三甲基氧膦(内标)的浓度，可由公式(4)计算得到叔丁基磷酸的浓度，并与理论的质量(称量)浓度进行比较，结果显示较高的一致性(图1C)。理论质量浓度为99.17mM的叔丁基磷酸分别以浓度为2.362mM，4.723mM和9.446mM三甲基氧膦为内标测量三次，由公式(4)计算得到的浓度分别是91.56mM、97.83mM和104.49mM，测量的相对误差为1.22％(取三次测量的平均值97.96mM，计算其与理论值99.17mM的差再除以理论值99.17mM而得到)，相对精度为6.52％(由三次测量浓度的STD值除以理论浓度值99.17mM而得到)。

同样，三甲基氧膦和叔丁基磷酸在磷谱中的特征峰的化学位移分别为53.079ppm和36.792ppm(图1B)，对应的n_P/Ref和n_P/S均为1。磷谱中三甲基氧膦依旧可以作为已知浓度的内标，叔丁基磷酸的浓度可以由公式(5)计算得到，与理论的质量(称量)浓度进行比较，结果也显示较高的一致性(图1D)。与定量氢谱相对应，理论质量浓度为99.17mM的叔丁基磷酸分别以上述不同浓度的三甲基氧膦为内标在磷谱中也测量三次，由公式(5)计算得到的浓度分别是91.72mM、95.13mM、110.81mM，计算得到的测量相对误差为0.05％，相对精度为10.27％。以上实验结果说明使用一维核磁共振氢谱和磷谱定量所得的结果具有高度的一致性。

值得提及的是，以上结果也显示模式混合物中样品化合物(叔丁基磷酸)的绝对浓度能够被准确测量的动态范围大约是100倍(从0.9917mM到99.17mM)，而样品(叔丁基磷酸)和内标(三甲基氧膦)的摩尔浓度比例的动态范围更大，大约是420倍(从1:0.105到1:42.00)。

以三甲基氧膦为内标，以叔丁基磷酸为待测化合物，图2对比从一维定量氢谱测量所得的浓度与从一维定量磷谱测量所得到的浓度，对二者进行线性回归，得到的相关系数是0.996，相应的回归方程是C_P,TBPA＝0.9947C_H,TBPA，这说明用同一化合物(比如，三甲基氧膦)作为一维氢谱和磷谱进行定量分析的通用内标，测量所得到的绝对浓度具有高度的一致性，也进一步说明了以单一化合物作为通用定量内标，联合使用一维氢谱和磷谱进行定量分析的可行性。

实施例2：

测定胆碱、磷酸胆碱和甘油磷酸胆碱模式混合物中各组分化合物的绝对浓度：

为了进一步验证联合使用核磁共振一维氢谱和磷谱进行定量分析的可行性，本发明选择胆碱、磷酸胆碱和甘油磷酸胆碱模式混合物为研究实例，以三甲基氧膦为氢谱和磷谱的通用定量内标，准确测定了其中各组分化合物的绝对浓度和相对浓度比例。

使用试剂及样品制备：纯度为99％的氯化胆碱及纯度为98％的氯化磷酸胆碱钙盐四水合物和甘油磷酸胆碱均购买于Adamas-beta(瑞士巴塞尔)。称量74.9mg的氯化胆碱、54.8mg氯化磷酸胆碱钙盐四水合物及48.1mg的甘油磷酸胆碱分别溶于2ml重水中得到最终浓度分别为265.546mM、81.436mM、91.630mM的母液。混合三甲基氧膦(母液浓度为188.91mM)、氯化胆碱、氯化磷酸胆碱钙盐四水合物及甘油磷酸胆碱的母液各50ul，加入800ul重水中得到1000ul的最终模式混合物样品。取其中的600ul加入核磁管进行核磁测试。

一维氢谱显示胆碱、磷酸胆碱和甘油磷酸胆碱的甲基氢信号重叠严重(图3A)，我们采用对这些化合物的甲基氢信号进行一起积分，而对孤立的三甲基氧膦的甲基氢信号进行单独积分。磷谱中，对各自分开的磷酸胆碱(3.1834ppm)、甘油磷酸胆碱(-0.1240ppm)和内标三甲基氧膦(53.0613ppm)的磷信号进行单独积分(胆碱由于缺乏磷原子而不产生磷谱信号)。同时，在氢谱和磷谱中，我们分别随机选取一段噪音区间(氢谱：2.2768ppm-2.5279ppm，磷谱：30.455ppm-33.781ppm)进行积分以衡量噪音积分对信号强度的影响，与内标(三甲基氧膦)的氢谱和磷谱的信号强度对比，噪音积分的相对强度分别为-0.0021和0.0026，说明在定量氢谱和磷谱中，由于噪音积分对最终胆碱类化合物浓度测定的影响是几乎可以忽略不计的(图3)。

基于已知的内标化合物(三甲基氧膦)的浓度(C_TMPO)，根据定量磷谱中所得到的积分信号强度，可以直接计算出磷酸胆碱和甘油磷酸胆碱的浓度：

$C_{\mathrm{PC}}=\frac{n_{P/\mathrm{TMPO}}\·I_{P.\mathrm{PC}}}{n_{P/\mathrm{PC}}\·I_{P.\mathrm{TMPO}}}{C}_{\mathrm{TMPO}}---\left(6\right)$

$C_{\mathrm{GPC}}=\frac{n_{P/\mathrm{TMPO}}\·I_{P.\mathrm{GPC}}}{n_{P/\mathrm{GPC}}\·I_{P.\mathrm{TMFO}}}{C}_{\mathrm{TMPO}}---\left(7\right)$

式中I_P.PC、I_P.GPC和I_P.TMPO分别是磷谱中磷酸胆碱(PC，化学位移3.1834ppm)、甘油磷酸胆碱(GPC，化学位移-0.1240ppm)和三甲基氧膦(TMPO，化学位移53.0613ppm)的特征信号峰的积分面积；n_P/PC、n_P/GPC和n_P/TMPO均为1，因为每分子的磷酸胆碱、甘油磷酸胆碱和三甲基氧膦中仅含有一个磷原子；C_TMPO是已知的三甲基氧膦的浓度。

在氢谱中，尽管胆碱、磷酸胆碱和甘油磷酸胆碱的甲基氢信号重叠严重，但它们总的积分面积(2.67-3.36ppm区间涵盖所有甲基信号的积分)与三种化合物总的甲基氢数量成正比，即

I_H，C+PC+GPC∝N_H，C+PC+GPC＝(n_H/C·C_C+n_H/PC·C_PC+n_H/GPC·C_GPC)·V (8)

式中，I_H,C+PC+GPC是氢谱中胆碱(C)、磷酸胆碱(PC)和甘油磷酸胆碱(GPC)在甲基信号重叠区间的积分总面积；N_H,C+PC+GPC是这三种胆碱类化合物所含总的甲基氢数量；n_H/C、n_H/PC和n_H/GPC分别是每分子的胆碱、磷酸胆碱和甘油磷酸胆碱所含甲基氢的数目，其值均为9。C_C、C_PC和C_GPC分别是胆碱、磷酸胆碱和甘油磷酸胆碱的摩尔浓度；V是样品的体积。

以三甲基氧膦为内标，结合公式(2)和(8)，可以得到：

$\frac{I_{H,C+\mathrm{PC}+\mathrm{GPC}}}{I_{H,\mathrm{TMPO}}}=\frac{(n_{H/C}\·C_C+n_{H/\mathrm{PC}}\·C_{\mathrm{PC}}+n_{H/\mathrm{GPC}}\·C_{\mathrm{GPC}})\·V}{n_{H/\mathrm{TMPO}}\·C_{\mathrm{TMPO}}\·V}=\frac{(n_{H/C}\·C_C+n_{H/\mathrm{PC}}\·C_{\mathrm{PC}}+n_{H/\mathrm{GPC}}\·C_{\mathrm{GPC}})}{n_{H/\mathrm{TMPO}}\·C_{\mathrm{TMPO}}}---\left(9\right)$

式中I_H,TMPO是三甲基氧膦甲基氢特征峰(化学位移1.5142ppm)的积分峰强度，由于n_H/C、n_H/PC、n_H/GPC和n_H/TMPO均为9，上式可简写为：

$C_C+C_{\mathrm{PC}}+C_{\mathrm{GPC}}=\frac{I_{H,C+\mathrm{PC}+\mathrm{GPC}}}{I_{H,\mathrm{TMPO}}}\·C_{\mathrm{TMPO}}---\left(10\right)$

结合基于定量磷谱的公式(6)和(7)和定量氢谱中所得到的积分信号强度(包含信号重叠区间的总积分和对分开的氢信号进行单独积分)，可以计算出胆碱的浓度为：

$\begin{array}{c}{C}_C=\frac{I_{H,C+\mathrm{PC}+\mathrm{GPC}}}{I_{H,\mathrm{TMPO}}}\·C_{\mathrm{TMPO}}-C_{\mathrm{PC}}-C_{\mathrm{GPC}}\\ =(\frac{I_{H,C+\mathrm{PC}+\mathrm{GPC}}}{I_{H,\mathrm{TMPO}}}-\frac{n_{P/\mathrm{TMPO}}\·I_{P.\mathrm{PC}}}{n_{P/\mathrm{PC}}\·I_{P.\mathrm{TMPO}}}-\frac{n_{P/\mathrm{TMPO}}\·I_{P.\mathrm{GPC}}}{n_{P/\mathrm{GPC}}\·I_{P.\mathrm{TMPO}}})\·C_{\mathrm{TMPO}}\end{array}---\left(11\right)$

如果仅依靠一维氢谱，由于核磁信号在甲基区域(2.67-3.36ppm)的重叠严重(图3A)，很难通过简单的积分(或峰拟合)准确得到胆碱、磷酸胆碱和甘油磷酸胆碱各自的信号强度，因而也很难计算出胆碱、磷酸胆碱和甘油磷酸胆碱准确的绝对浓度。公式(11)充分证实了联合使用核磁共振氢谱和磷谱准确测定复杂混合物中各组分化合物绝对浓度的可行性。

用上述制备的胆碱(理论质量摩尔浓度13.277mM)、磷酸胆碱(理论质量摩尔浓度4.027mM)和甘油磷酸胆碱(理论质量摩尔浓度4.581mM)模式混合物样品，联合使用核磁共振定量氢谱和磷谱，以三甲基氧膦(理论摩尔浓度9.446mM)为单一通用定量内标，测量模式混合物中各组分化合物的绝对浓度，根据公式(6)、(7)和(11)计算所得的浓度分别为14.097mM、4.214mM和4.450mM，对应的相对测量误差(测量值与理论值的差值除以理论值)分别为6.03％、3.48％和2.88％。

实施例3：

测定模式混合物中各组分化合物的相对浓度比例及联合使用不同核的核磁共振定量方法的扩展：

在某些情况下，混合物中几种化合物的相对浓度比例具有一定生物学或生理、病理的医学意义。比如，胆碱、磷酸胆碱、甘油磷酸胆碱被认为是人类肿瘤组织及细胞中最重要的代谢物，组织提取物的体外研究表明这些磷酸衍生物可以指示某些疾病的病情。有研究表明这些代谢物的相对比例及浓度与癌症的发展程度相关，例如乳腺癌等。但在一维氢谱中，他们的核磁信号相互重叠，因而单纯基于氢谱难以准确测定这些胆碱类化合物中每种单体化合物的浓度或相对比例。联合使用核磁共振一维定量氢谱和磷谱进行定量分析，如果只关注上述模式混合物中他们之间的相对浓度，同时使用定量氢谱和磷谱中测量的积分信号强度，根据公式(6)、(7)和(11)可以计算得到：

$\begin{array}{c}{C}_C:C_{\mathrm{PC}}:C_{\mathrm{GPC}}=(\frac{I_{H,C+\mathrm{PC}+\mathrm{GPC}}}{I_{H,\mathrm{TMPO}}}-\frac{n_{P/\mathrm{TMPO}}\·I_{P.\mathrm{PC}}}{n_{P/\mathrm{PC}}\·I_{P.\mathrm{TMPO}}}-\frac{n_{P/\mathrm{TMPO}}\·I_{P.\mathrm{GPC}}}{n_{P/\mathrm{GPC}}\·I_{P.\mathrm{TMPO}}})C_{\mathrm{TMPO}}\\ :\frac{n_{P/\mathrm{TMPO}}\·I_{P.\mathrm{PC}}}{n_{P/\mathrm{PC}}\·I_{P.\mathrm{TMPO}}}{C}_{\mathrm{TMPO}}:\frac{n_{P/\mathrm{TMPO}}\·I_{P.\mathrm{GPC}}}{n_{P/\mathrm{GPC}}\·I_{P.\mathrm{TMPO}}}{C}_{\mathrm{TMPO}}\\ =(\frac{I_{H,C+\mathrm{PC}+\mathrm{GPC}}}{I_{H,\mathrm{TMPO}}}-\frac{n_{P/\mathrm{TMPO}}\·I_{P.\mathrm{PC}}}{n_{P/\mathrm{PC}}\·I_{P.\mathrm{TMPO}}}-\frac{n_{P/\mathrm{TMPO}}\·I_{P.\mathrm{GPC}}}{n_{P/\mathrm{GPC}}\·I_{P.\mathrm{TMPO}}}):\frac{n_{P/\mathrm{TMPO}}\·I_{P.\mathrm{PC}}}{n_{P/\mathrm{PC}}\·I_{P/\mathrm{TMPO}}}:\frac{n_{P/\mathrm{TMPO}}\·I_{P.\mathrm{GPC}}}{n_{P/\mathrm{GPC}}\·I_{P.\mathrm{TMPO}}}\end{array}---\left(12\right)$

由公式(12)可以看出，计算相对浓度比例所得的结果与内标本身的浓度无关，即不受通用内标的称量误差影响。这种情况下，在不同核的一维定量核磁共振谱图中，由不同元素组成的单一通用内标起到“定量桥梁”的作用。

对非常复杂的混合物样品，如果其氢谱中特征信号重叠或者部分重叠，但是其磷谱或者氟谱中的特征峰能较好的分开，则可以以含有氢、磷、氟等元素的单一化合物作为通用定量内标(比如四甲基六氟磷酸铵(N⁺(CH₃)₄PF₆ ^-)可以作为氢谱、磷谱和氟谱定量分析的通用内标)，联合使用定量核磁共振氢谱、磷谱和氟谱准确测定复杂混合物中多个单体组分化合物的绝对浓度。四甲基六氟磷酸铵(N⁺(CH₃)₄PF₆ ^-)适合作为氢谱、磷谱和氟谱定量分析的通用内标是因为它在氢谱、磷谱和氟谱中都仅有一个较强的化学位移信号。

本发明提供的一种联合使用不同核的一维核磁共振定量分析的方法，用于测定复杂混合物中含不同元素的多个单体化合物的含量。该方法的关键因素之一在于使用一种由多种元素组成的化合物作为不同核的核磁图谱的通用定量内标，例如三甲基氧膦((CH₃)₃P(O),TMPO)或者四甲基六氟磷酸铵(N⁺(CH₃)₄PF₆ ^-)，此内标在不同核的一维核磁共振图谱中起到“定量桥梁”的作用。即使在某种特定核的一维核磁共振图谱中，混合物中各化合物的特征核磁信号出现重叠现象，该实验方案也可能快捷简便且准确的测定混合物中多个单体化合物的绝对浓度。如果只关注待测混合物中某些化合物的相对浓度比例，计算所得的结果与内标本身的浓度无关，即也不受通用内标的称量误差影响。以三甲基氧膦((CH₃)₃P(O),TMPO)通用定量内标，以胆碱、磷酸胆碱和甘油磷酸胆碱模式混合物为实例，本发明测定了各组分的绝对浓度及其相对比例，从而验证了这种联合使用不同核的一维核磁共振定量分析的实验方案在测定复杂混合物中多个单体化合物含量的应用中的可行性和实用性。本发明这种联合使用不同核的一维核磁共振图谱进行定量分析的实验方案将为测定复杂混合物中单体化合物含量提供又一种有价值的选择。

Claims (3)

1.一种联合使用不同核的一维核磁共振方法，其特征在于,联合使用不同核的一维核磁共振图谱对复杂混合物中多个单体化合物进行定量分析或浓度测定，包括同时联合使用多种核的一维核磁共振图谱，并使用含有多种元素的同一化合物作为不同核的一维核磁共振定量分析的单一通用内标，使用某种含有不同元素的化合物作为联合使用不同核的一维核磁共振方法的单一通用定量内标，联合使用氢谱和磷谱定量分析方法，以三甲基氧膦作为单一通用内标，其中的核磁共振测试实验和图谱处理及数据分析按以下方法进行：所有的核磁共振实验均在25°，298K,在Bruker Avance III 400MHz核磁谱仪，配备Smartprobe5mm双共振探头上进行，磷去耦的一维氢谱核磁共振实验采用Bruker标准脉冲序列“zgig”，氢与磷的中心频率分别设在4.7ppm和27.0ppm；扫描间隔时间，d1，设为25s，以大于5倍的样品中最长的氢核的T₁时间，氢核的T₁时间采用经典的翻转-恢复实验测定，实验谱宽设为21.0ppm，扫描次数设为4，32K个数据点,总实验时间2.5分钟；氢去耦的一维磷谱核磁共振实验采用Bruker标准脉冲序列“zgig”，氢与磷的中心频率分别设在4.7ppm和27.0ppm；同样使用Bruker标准脉冲序列“t1ir1d”测定磷核的T₁时间，描间隔时间，d1，设为65s，以大于5倍的样品中最长的磷核的T1时间，实验谱宽设为100.0ppm，扫描次数设为16，64K个数据点,总实验时间22.5分钟；所述的图谱处理及数据分析采用：定量分析前，使用Bruker Topspin软件对傅里叶转换的图谱进行自动相位和基线校正，谱图中某个特征峰的强度(I)直接与相关自旋核的数量(N)或相关化合物的浓度成正比，即

I_H.S∝N_H.S＝n_H/S·C_E·V (1)

式中I_H.S是化合物S在定量氢谱中某个特征化学位移值的积分峰强度，下标S代表化合物S，H代表其氢谱；N_H.S是混合样品中化合物S在该特征化学位移值所对应的氢核总数量；n_H/S是每一分子化合物S在该化学位移处所含氢原子的数量，对甲基基团，氢原子的数量n_H/S是3；C_s是化合物S的摩尔浓度；V是样品体积；对于内标，其某个特征峰的强度也满足以下公式：

I_H.Ref∝N_H.Ref＝n_H/Ref·C_Ref·V (2)

没有信号重叠问题且内标浓度已知，从氢谱中某些特征峰的积分强度很容易计算出化合物S的浓度C_S，即

$\frac{I_{H.S}}{I_{H.\mathrm{Re}f}}=\frac{n_{H/S}\·C_s\·V}{n_{H/\mathrm{Re}f}\·C_{\mathrm{Re}f}\·V}=\frac{n_{H/S}\·C_s}{n_{H/\mathrm{Re}f}\·C_{\mathrm{Re}f}}---\left(3\right)$

从而得到

$C_s=\frac{n_{H/\mathrm{Re}f}\·I_{H.S}}{n_{H/S}\·I_{H.\mathrm{Re}f}}{C}_{\mathrm{Re}f}---\left(4\right)$

同样，假设内标浓度已知，从一维定量磷谱中的某些特征峰的强度也很容易计算出化合物S的浓度C_S，即

$C_o=\frac{n_{P/\mathrm{Re}f}\·I_{P.S}}{n_{P/S}\·I_{P.\mathrm{Re}f}}{C}_{\mathrm{Re}f}---\left(5\right).$

2.如权利要求1所述的一种联合使用不同核的一维核磁共振方法，其特征在于，以叔丁基磷酸为待测化合物，对比从一维定量氢谱测量所得的浓度与从一维定量磷谱测量所得到的浓度，对二者进行线性回归，得到的相关系数是0.996，相应的回归方程是C_P,TBPA＝0.9947C_H,TBPA。

3.如权利要求1所述的一种联合使用不同核的一维核磁共振方法，其特征在于，使用试剂及样品制备：称量74.9mg的氯化胆碱、54.8mg氯化磷酸胆碱钙盐四水合物及48.1mg的甘油磷酸胆碱分别溶于2ml重水中得到最终浓度分别为265.546mM、81.436mM、91.630mM的母液；混合三甲基氧膦，母液浓度为188.91mM、氯化胆碱、氯化磷酸胆碱钙盐四水合物及甘油磷酸胆碱的母液各50ul，加入800ul重水中得到1000ul的最终模式混合物样品，取其中的600ul加入核磁管进行核磁测试。