CN108593696B - 一种利用定量核磁测定多肽中三氟乙酸残留的方法 - Google Patents

一种利用定量核磁测定多肽中三氟乙酸残留的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于三氟乙酸残留量检测技术领域，具体涉及一种利用定量核磁测定多肽中三氟乙酸残留的方法，采用定量核磁检测方法，使用环丙沙星作为氟谱内标物，本发明提供一种适用于检测多肽类药物中三氟乙酸含量的测定方法，具有样品消耗较低，节约测定成本，同时具有较高的检测精度的优点。

Description

一种利用定量核磁测定多肽中三氟乙酸残留的方法
技术领域
本发明属于三氟乙酸残留量检测技术领域，具体涉及一种利用定量核磁测定多肽中三氟乙酸残留的方法。
背景技术
随着生物技术与多肽合成技术的日臻成熟，越来越多的多肽药物被开发并应用于临床。因适应证广、安全性高且疗效显著，多肽药物目前已广泛应用于肿瘤、肝炎、糖尿病、艾滋病等疾病的预防、诊断和治疗，具有广阔的开发前景。在多肽药物的制备过程中需要引入三氟乙酸作为溶剂，在制备/生产结束后需要去除三氟乙酸，因为三氟乙酸作为四类溶剂，在临床使用中具有毒性，所以需要严格控制成品中性肽成品中三氟乙酸的含量。目前，针对药物和环境中三氟乙酸残留测定，常用的方法有高效液相色谱法、离子色谱法或气质联用方法等，这些方法通常具有样品消耗较多的缺点，并且实验周期长、样品易污染难回收，对于制备成本较高的多肽类药物并不适用。
因此，急需一种适用于检测多肽类药物中三氟乙酸含量的测定方法，并且应该具备样品消耗较低，节约测定成本，检测精度高的优点。
发明内容
本发明提供了如下的技术方案：
一种利用定量核磁测定多肽中三氟乙酸残留的方法，采用定量核磁检测方法，使用环丙沙星作为氟谱内标物。
一种利用定量核磁测定多肽中三氟乙酸残留的方法，包括如下步骤：
S1：仪器与溶剂的准备：
①仪器：核磁共振仪和topspin3.2在线/离线处理软件；
②溶剂：三氟乙酸钠标准品、内标物环丙沙星、氘代二甲基亚砜和多肽样品；
S2：溶液的配置：
①三氟乙酸钠母液配制：精密称取三氟乙酸钠25.00mg，置10ml容量瓶中，用DMSO-d6定容，摇匀至完全溶解，再精密移取1.0ml置10ml量瓶中，用氘代二甲基亚砜定容，摇匀，即得；
②内标环丙沙星母液配制：精密称取环丙沙星25.00mg，置10ml量瓶中，用氘代二甲基亚砜定容，摇匀，即得；
③供试品溶液配制：精密称样品多肽5.00mg，再精密移取内标环丙沙星母液0.10ml置5mm样品管中，精密加入0.50ml氘代二甲基亚砜，摇匀待测；
注：①-③中的称重的误差为±0.01mg；
S3：设定所述核磁共振仪的测定基础条件：
采用QNP探头，设定采样谱宽、采样中心频率、采样点数为、采样次数、延迟时间为和脉冲角度；
S4：使用核磁共振仪得到图谱，用手动方式依次进行相位校正、基线校正和化学位移校正，并根据所选的定量峰及积分范围进行积分。
优选的，所述内标物环丙沙星的纯度为84.20±1％。
优选的，采样谱宽为237.1714ppm，采样中心频率为-100.00ppm，采样点数为64K，采样次数为64次，延迟时间为20s，脉冲角度为90°。
本发明的有益效果是：
本发明通过实验测定得到最佳延迟时间为20s，此时间可以保证自旋核基本达到完全松弛；通过实验测得最佳采样次数为64，脉冲角度为90°，可以保证测定结构的准确性；与现有的高效液相色谱法、离子色谱法或气质联用方法相比，本发明的灵敏度高，操作简便，消耗试剂少，节约成本，重现性好，所需样品量少，测定快速，不破坏样品，适用于药物中三氟乙酸的质控，并且由于本发明选择使用环丙沙星作为氟谱内标物，使本发明具有较强的专属性。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是延迟时间的优化趋势图；
图2是采样次数优化趋势图；
图3是脉冲角度优化趋势图；
图4是专属性测试的19F-NMR图；
图5是本发明的线性与范围标准曲线图。
具体实施方式
下面结合附图描述本发明的具体实施方式。
实施例1
一种利用定量核磁测定多肽中三氟乙酸残留的方法，采用定量核磁检测方法，使用环丙沙星作为氟谱内标物。
一种利用定量核磁测定多肽中三氟乙酸残留的方法，包括如下步骤：
S1：仪器与溶剂的准备：
①仪器：核磁共振仪和topspin3.2在线/离线处理软件；
②溶剂：三氟乙酸钠标准品、内标物环丙沙星、氘代二甲基亚砜和多肽样品；
S2：溶液的配置：
①三氟乙酸钠母液配制：精密称取三氟乙酸钠25.00mg，置10ml容量瓶中，用DMSO-d6定容，摇匀至完全溶解，再精密移取1.0ml置10ml量瓶中，用氘代二甲基亚砜定容，摇匀，即得；
②内标环丙沙星母液配制：精密称取环丙沙星25.00mg，置10ml量瓶中，用氘代二甲基亚砜定容，摇匀，即得；
③供试品溶液配制：精密称样品多肽5.00mg，再精密移取内标环丙沙星母液0.10ml置5mm样品管中，精密加入0.50ml氘代二甲基亚砜，摇匀待测；
S3：设定所述核磁共振仪的测定基础条件：
采用QNP探头，设定采样谱宽、采样中心频率、采样点数为、采样次数、延迟时间为和脉冲角度；
S4：使用核磁共振仪得到图谱，用手动方式依次进行相位校正、基线校正和化学位移校正，并根据所选的定量峰及积分范围进行积分。
具体的，所述内标物环丙沙星的纯度为84.20％，采样谱宽为237.1714ppm，采样中心频率为-100.00ppm，采样点数为64K，采样次数为64次，延迟时间为20s，脉冲角度为90°。
实施例2
为了保证自旋核基本能达到完全弛豫，d1的选择尤为重要，延迟时间的选择实验：按照实施例1的测定方法进行五次测定，每次的延迟时间分别设定为2s、5s、10s、20s和40s，其他测定参数和条件相同，最后测得结构整理如图1所示，当d1≥20s时，三氟乙酸钠定量峰与内标定量峰面积比值基本无明显变化如图1所示，因此最终选定延迟时间(d1)为20s。
实施例3
采样次数会影响谱图信噪比，即图谱的信噪比与采样次数的平方根成正比，按照实施例1的测定方法进行六次测定，每次测定的采样次数分别设为2，4，8，16，32，64次时的测定结果，结果如图2所示，由图中可以看出，当采样次数为64次时，三氟乙酸钠定量峰与内标定量峰面积比值基本无明显变化，因此最终选定采样次数为64次。
实施例4
不同的脉冲角度对谱图的测定的信号质量会有一定程度的影响，故按照实施例1的测定方法进行8次测定，每次的脉冲角度分别设定为10°、20°、30°、45°、60°、70°、80°和90°，测试结果如图3所示，由图中可以看出当脉冲角度为90°时，三氟乙酸钠定量峰与内标定量峰面积比值基本无明显变化，因此最终选定脉冲角度(θ)为90°。
实施例5
分别对：
A：空白溶剂DMSO-d6，B：100％限度三氟乙酸钠溶液，C：内标环丙沙星溶液；D：多肽样品溶液，E：100％三氟乙酸钠与环丙沙星混合溶液；F：样品与环丙沙星混合溶液，G：三氟乙酸钠与样品混合溶液，H：样品与三氟乙酸钠和环丙沙星混合溶液进行核磁共振检测，测定的核磁共振氟谱如图4所示，其中，a：三氟乙酸氟谱峰；b：环丙沙星氟谱峰。
由图4中可以看出混合溶液中样品与内标、三氟乙酸钠各定量峰能够完全分离，无杂质及相互间干扰，因此本发明选择环丙沙星作为内标物对三氟乙酸进行测定具有良好的专属性。
实施例6
分别精密移取实施例1中制备的三氟乙酸钠母液0.10ml和内标环丙沙星母液0.10ml置5mm核磁管中，按照实施例4中的条件进行测定。然后以三氟乙酸钠/内标的摩尔比为横坐标(x)，定量峰面积比为纵坐标(y)进行线性拟合。结果如图5所示，以环丙沙星为内标时，三氟乙酸钠与内标的摩尔比在0.2003～2.0032范围内，Ns/NR与峰面积比AS/AR呈线性关系，且线性关系良好，计算得到的线性回归方程为：y＝0.2506x-0.0064(R2＝0.9984，n＝6)，由此可知本发明的核磁共振氟谱定量法的线性良好。
实施例7
①精密移取实施例1中制备的三氟乙酸钠母液0.10ml置5mm内径核磁管中，精密加入0.50ml氘代DMSO，摇匀，即得定量限测试液；
精密移取实施例1中制备的三氟乙酸钠母液0.05ml，再加入0.55ml氘代DMSO，摇匀，即得检出限测试液。
由结果可知，定量限浓度为8.35ug/ml，S/N＝35，检出限浓度为4.170ug/ml，S/N＝8。
②精密度
分别精密称取适量样品，再分别精密移取0.10ml三氟乙酸钠母液和0.10ml内标母液，按实施例1中的测定条件分别在日内和日间做6组测试。结果如表1和表2所示，三氟乙酸与内标盐酸吉西他滨峰面积(NR AS/NSAR)的重复性相对标准偏差(RSD)为3.0％，中间精密度的相对标准偏差(RSD)为2.8％，由此可证明本发明的精密度良好。
表1重复性试验结果
Figure GDA0001675069930000061
表2中间精密度试验结果
Figure GDA0001675069930000062
Figure GDA0001675069930000071
③回收率
精密称取适量样品，分别精密移取0.08ml、0.10ml、0.12ml三氟乙酸钠母液和0.10ml内标母液，按实施例1中的测定条件分别做3组测试。结果如表3所示，三氟乙酸与内标盐酸吉西他滨峰面积(NR AS/NSAR)的相对标准偏差(RSD)为3.1％，由此可证明本发明的精密度良好。
表3回收率试验结果
Figure GDA0001675069930000072
Figure GDA0001675069930000081
④耐用性
通过在不同温度下分别按照实施例1中的测定方法进行3次测定，观察温度(T＝298～308K)变化对实验结果的影响。结果如表4所示，由表中的数据可知当以环丙沙星作为内标时，温度的微小变化对测定结果的影响均较小，因此可以证明本发明的耐用性良好。
表4耐用性试验结果
Figure GDA0001675069930000082
⑤稳定性
精密称取多肽样品适量，再精密加入适量的内标母液、三氟乙酸钠母液作为稳定性测试液，分别在0，1，2，4，8，12h进样测定，结果如表5所示，由表中的数据可知三氟乙酸与内标环丙沙星的面积比值的RSD(n＝6)为0.8％，因此可以证明本发明的供试品溶液在室温环境中放置12h后的基本性能是稳定稳定的。
表5稳定性试验结果
Figure GDA0001675069930000083
Figure GDA0001675069930000091
⑥
取不同批次的供试品和内标，按实施例1中的测定方法分别平行配制2份供试品溶液，按照实施例2-4测定的最优条件进行测定，然后将测定的数据记录在表6中，如表6所示，每个样品平行测定2次，取平均值。按公式计算样品含量:
Figure GDA0001675069930000092
式中：
AR指加样回收率溶液中内标环丙沙星的的峰面积。
AS指加样回收率溶液液中三氟乙酸钠的峰面积。
WR指加样回收率溶液中内标环丙沙星的称样量(mg)。
WS指加样回收率溶液液中三氟乙酸钠的称样量(mg)。
MR指内标物环丙沙星的摩尔质量。
MS指三氟乙酸钠的摩尔质量。
VS1是指各浓度水平的加样的三氟乙酸钠溶液的稀释体积(mL)。
VS2是指各浓度水平的加样的三氟乙酸钠溶液的移取体积(mL)。
VR1是指各浓度水平的加样的内标环丙沙星溶液的稀释体积(mL)。
VR2是指各浓度水平的加样的内标环丙沙星溶液的移取体积(mL)。
NR指三氟乙酸钠中氟原子个数。
计算结果见表6。
表6多肽样品3个批次中三氟乙酸残留测定结果
Figure GDA0001675069930000101
从实施例2-实施例7中的检测证明数据可以看出，本发明以氘代二甲基亚砜为溶剂，选取的核磁共振的方法，然后选择最优的测试条件和定量峰，对多肽样品中三氟乙酸残留进行测定。结果显示，本发明提供的测定多肽中三氟乙酸的含量的方法特异性强。且快速准确。
注：本发明实施例中使用的试剂来源如下：
三氟乙酸钠的购买于Aladdin公司，批号为G1721080，纯度大于99.0％；
内标物环丙沙星购买于国家食品药品检定研究院，批号为130451-201203，纯度为84.20％；
氘代二甲基亚砜(99.9atom％D，Sigma-Aldrich公司)；
多肽样品由江苏吉锐生物科技有限公司提供，批号为201705001。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种利用定量核磁测定多肽中三氟乙酸残留的方法，其特征在于：采用定量核磁检测方法，使用环丙沙星作为氟谱内标物；
包括如下步骤：
S1：仪器与溶剂的准备：
①仪器：核磁共振仪和topspin3.2在线/离线处理软件；
②溶剂：三氟乙酸钠标准品、内标物环丙沙星、氘代二甲基亚砜和多肽样品；
S2：溶液的配置：
①三氟乙酸钠母液配制：精密称取三氟乙酸钠25.00mg，置10ml容量瓶中，用DMSO-d6定容，摇匀至完全溶解，再精密移取1.0ml置10ml量瓶中，用氘代二甲基亚砜定容，摇匀，即得；
②内标环丙沙星母液配制：精密称取环丙沙星25.00mg，置10ml量瓶中，用氘代二甲基亚砜定容，摇匀，即得；
③供试品溶液配制：精密称样品多肽5.00mg，再精密移取内标环丙沙星母液0.10ml置5mm样品管中，精密加入0.50ml氘代二甲基亚砜，摇匀待测；
注：①-③中的称重的误差为±0.01mg；
S3：设定所述核磁共振仪的测定基础条件：
采用QNP探头，设定采样谱宽、采样中心频率、采样点数为、采样次数、延迟时间为和脉冲角度；
S4：使用核磁共振仪得到图谱，用手动方式依次进行相位校正、基线校正和化学位移校正，并根据所选的定量峰及积分范围进行积分。
2.根据权利要求1所述的一种利用定量核磁测定多肽中三氟乙酸残留的方法，其特征在于：所述内标物环丙沙星的纯度为84.20±1％。
3.根据权利要求1所述的一种利用定量核磁测定多肽中三氟乙酸残留的方法，其特征在于：采样谱宽为237.1714ppm，采样中心频率为-100.00ppm，采样点数为64K，采样次数为64次，延迟时间为20s，脉冲角度为90°。
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