CN104634806B

CN104634806B - 利用亚甲基二膦酸外标法定量液态31p核磁共振的方法

Info

Publication number: CN104634806B
Application number: CN201510052943.3A
Authority: CN
Inventors: 金熠; 梁新强; 刘于; 傅朝栋; 李亮; 叶玉适
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2015-02-02
Filing date: 2015-02-02
Publication date: 2017-01-04
Anticipated expiration: 2035-02-02
Also published as: CN104634806A

Abstract

本发明涉及利用亚甲基二膦酸（MDP）作外标定量环境样品的液态³¹P核磁共振（NMR）的方法。试验前将封装了MDP水溶液的玻璃毛细管与装有确定浓度磷酸二氢钾溶液的核磁管组成共轴套管体系，计算套管体系校正系数。试验时用碱性提取剂溶解样品，持续振荡后离心得到浸提液，将浸提液冷冻干燥；所得粉末溶解于重溶液中，重溶解后连同玻璃毛细管转移至核磁管中，根据³¹P NMR谱图上MDP与待测磷化合物的峰面积比计算各磷组分的浓度。利用含MDP溶液的毛细管作为液态³¹P NMR的外标测定环境样品中的磷浓度，不易受共存离子的干扰，不与特征峰化学位移重叠，并且免去了用等离子体光谱仪法或化学法等测定重溶解液中总磷的步骤，适于多种环境样品中磷组分的测定分析。

Description

利用亚甲基二膦酸外标法定量液态31P核磁共振的方法

技术领域

本发明涉及³¹P核磁共振对环境样品中磷组分含量的测定，尤其涉及一种利用亚甲基二膦酸外标法定量液态³¹P核磁共振的方法。

背景技术

磷(P)是土壤中的大量元素之一，是生物生长发育所必需的一种营养元素，也是可能造成水体(湖泊、水库、河流等)富营养化的限制性元素。地壳中磷的平均含量为1.2g kg^-1,其中的95％存在于磷灰石矿物中。深入了解各种环境样品中磷组分的含量对明确磷素的生物地球化学循环具有重要的意义。根据浸提剂对磷素的不同提取能力，传统化学分级方法可以将磷素分为不同活性的无机磷与有机磷，如活性磷(容易被植物吸收利用)、中活性磷(较易被植物吸收利用)、中稳磷(较难被植物吸收利用)以及蓄闭态磷(无法被植物吸收利用)；但是传统化学分级提取步骤繁琐且对于磷素的具体成分依然不够明确。近年来³¹P核磁共振(³¹P NMR)技术作为分析环境样品中不同磷素组分的有效手段，是一种可定性或定量磷素形态的先进波谱技术，得到了很快发展，在化学、生物、食品、农业等领域得到了较广泛的应用。目前³¹P NMR技术主要分为液态核磁和固态核磁两种方法，根据磷化合物的不同化学位移可以确定磷素的具体种类信息；液态³¹P NMR技术在分析样品中有机磷的形态时，具有明显的应用优势。与化学提取分级法、高效液相色谱法(HPLC)等方法相比，液态³¹P NMR技术对样品前处理步骤较少，能一次性获取多个磷化合物或者有机官能团的信息。液态³¹P NMR定性检测环境样品中的磷化合物可以分为无机磷和有机磷两大类。无机磷主要包括正磷酸盐、焦磷酸盐和多聚磷酸盐等，有机磷主要包括膦酸酯、正磷酸单酯、正磷酸二酯等。然而，仍然有一部分学者认为液态NMR试验受到扫描次数、弛豫时间、溶液性质等条件的影响，只能定性或半定量待测化合物，定量分析仍然存在较大偏差。这主要是因为在定量过程中其它物质和杂质干扰较多，分离杂质的步骤复杂而且可能造成待测物的损失。利用外标法则能较好地解决这个问题。对于液态核磁共振外标分析法，外标准物封存在毛细管中，不易受共存离子的干扰，避免了与待测物质之间发生化学反应，不与特征峰化学位移重叠，能够显著提高核磁共振定量分析的灵敏度、精确度、准确度及分析速度。Eva Lo’Pez-Rituerto等在2009年应用¹H NMR定量分析法，采用标准物质的外标法，研究了葡萄酒发酵过程中的酒精和苹果乳酸含量的变化，对乙醇、乙酸等实现了准确定量，较好地研究了葡萄酒的发酵过程。然而不同于H谱的是，利用³¹P NMR在对环境样品中磷组分进行测定时弛豫时间更长，影响³¹P NMR谱图上峰面积的因素很多，化学位移偏差较大，试验中外标准物的选取对试验结果的影响很大

发明内容

本发明目的在于提供一种利用亚甲基二膦酸外标法定量液态³¹P核磁共振的方法，能够利用套管体系避免共存离子之间的干扰，根据峰面积比例关系准确计算出各个磷组分的含量，操作方法简便，适用于推广和应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

利用亚甲基二膦酸外标法定量液态³¹P核磁共振的方法包括以下步骤：

(1)首先将含有亚甲基二膦酸水溶液的玻璃点样毛细管装入含有准确浓度磷酸二氢钾重水溶液的标准核磁管，组成共轴套管体系；根据³¹P NMR图谱上亚甲基二膦酸出峰的积分面积(A_s)、磷酸二氢钾出峰的积分面积(A_x)及磷酸二氢钾浓度(C_x)计算套管体系校正系数a,校正系数的计算公式为：

(2)试验时用碱性提取剂溶解待测环境样品，在15～20℃避光条件下持续振荡16～20小时，而后在1500*g下离心20分钟得到浸提液，将浸提液在-20℃下预冻25-30分钟，再用冷冻干燥机抽真空冷冻干燥12～24小时至粉末状，将所得粉末称重后溶解于重溶液中；

(3)粉末重溶解后连同步骤(1)中所述同一玻璃点样毛细管转移至核磁管中，于600MHz的核磁共振仪上进行³¹P NMR分析测定；根据³¹P NMR谱图上MDP出峰的积分面积(A_S)与待测样品中磷化合物出峰的积分面积(A_x _’)逐一计算不同磷组分的浓度(C_x _’)，C_x _’的计算公式为：

C_{x^{'}} = a \times \frac{A_{x^{'}}}{A_{s}} .

所述外标采用平直均匀的玻璃点样毛细管，长100mm，内径0.5mm；其一端用火焰烧结，再将亚甲基二膦酸水溶液用注射器注于毛细管中，加至液面距毛细管上端1cm处，用火焰烧结进行永久密封供后续定量试验使用。

所述亚甲基二膦酸水溶液是将亚甲基二膦酸晶体溶于去离子水中配制而成，其浓度为10～20mmol L^-1。

所述磷酸二氢钾重水溶液的准确浓度为10mmol L^-1；所述碱性提取剂为浓度0.25mol L^-1的NaOH溶液和0.05mol L^-1Na₂EDTA溶液混合液。

所述重溶液是由10mol L^-1NaOH、0.05mol L^-1Na₂EDTA和D₂O组成的混合液。

本发明具有以下有益效果：

(1)本发明采用外标法定量分析环境样品中磷组分的含量，由于含外标准物的玻璃点样毛细管不与待测溶液直接接触，避免了标准物与待测样品之间共存离子的干扰，不影响待测磷组分的测定。

(2)本发明采用亚甲基二膦酸作为外标准物，其化学位移在17.43ppm附近，属于膦酸酯区域，不与常规磷组分出峰位置重合，提高了环境样品磷组分分析时的准确性。

(3)本发明采用NaOH-Na₂EDTA混合液对环境样品中的磷组分进行提取，通过Na₂EDTA的螯合作用提取与磷组分螯合的化合物，降低了³¹P NMR的峰宽，提高了浸提比例和磷组分解析时的准确性。

附图说明

图1：为本发明实施例提供的利用亚甲基二膦酸作外标的五种环境样品(土壤、猪粪、猪粪生物炭、水稻秸秆、稻田田面水)的液态³¹P NMR谱图。

具体实施方式

本发明采用玻璃点样毛细管封装亚甲基二膦酸水溶液作为外标,与含有待测环境样品的核磁管组成套管体系从而定量分析磷组分的含量；采用NaOH–EDTA溶液溶解浸提环境样品，得到含磷的浸提液；将浸提液离心后冷冻干燥，得到干燥的粉末样品；将粉末重新溶解于重溶解液后与亚甲基二膦酸外标同时转移到核磁共振管中，进行³¹P NMR上机试验，即可定量分析计算样品中各种磷组分的含量。

具体方法详述如下：

(1)套管体系的制备：称取一定质量的亚甲基二膦酸晶体，溶于去离子水中配制成浓度为10～20mmol L^-1的亚甲基二膦酸水溶液；取长为100mm，内径0.5mm的平直均匀玻璃点样毛细管，将其一端用火焰烧结，再用注射器将亚甲基二膦酸水溶液注于毛细管中，加至液面距毛细管上端约1cm处，用火焰烧结进行永久密封。准确称取0.034g磷酸二氢钾晶体溶于25mL重水中，配制成10mmol L^-1的磷酸二氢钾重水溶液；将含亚甲基二膦酸的玻璃点样毛细管与磷酸二氢钾重水溶液转移至核磁管中，组成套管体系。

碱性浸提剂的制备：称取5.0g NaOH和9.306g Na₂EDTA溶于400ml去离子水，再定容至500mL，配制成浓度为0.25mol L^-1的NaOH溶液和0.05mol L^-1Na₂EDTA溶液混合液作为环境样品的碱性提取剂。

重溶解液的制备：称取10g NaOH固体和0.4653g Na₂EDTA粉末溶解于25mL去离子水中得到10mol L^-1NaOH和0.05mol L^-1Na₂EDTA混合液。

(2)套管体系校正系数的测定及磷上机样品的制备：将含有亚甲基二膦酸水溶液的玻璃点样毛细管装入含有准确浓度磷酸二氢钾重水溶液的标准核磁管，组成共轴套管体系；根据 ³¹P NMR图谱上亚甲基二膦酸峰的积分面积(A_s)、磷酸二氢钾峰的积分面积(A_x)及磷酸二氢钾浓度(C_x)计算套管体系校正系数a,校正系数的计算公式为：

根据样品总磷含量称取样品，倒入50mL离心管中，加入25mL NaOH–EDTA浸提液，在15～20℃振荡浸提16～20h，在1500*g下离心20min后，温度保持在20～25℃，使样品中的磷组分充分溶解而被浸提出来；将上清液转移至另一干燥的50mL离心管中，在–20℃超低温冰箱中预冻25～30分钟，然后用冷冻干燥机抽真空冷冻12～24h至粉末状。将冷冻干燥的粉末充分混匀，取100～200mg粉末置于5mL离心管中，加入0.6mL重溶解液和1.0mL D₂O(起到锁定信号的作用)后在漩涡振荡器上振荡10min，再在1500*g下离心20～30min，离心时保持20℃。

3)磷组分的液态³¹P NMR测定：将离心后的上清液和亚甲基二膦酸玻璃毛细管转移至5mm核磁管中，于600MHz核磁共振仪(BRUKER Ascend 600)上进行液态³¹P NMR测定，核磁共振试验参数为：共振频率为242.9MHz，脉冲角90°，获取时间0.68s，延迟时间4.0s，温度25℃，旋转频率10Hz，在化学位移–25ppm至25ppm范围内扫描7800次，时间约12h，即可得到样品磷组分的液态³¹P NMR谱图。根据³¹P NMR谱图上亚甲基二膦酸的峰积分面积(A_S)与待测样品中磷化合物的峰积分面积(A_x _’)逐一计算不同磷组分的浓度(C_x _’)，C_x _’的计算公式为：

C_{x^{'}} = a \times \frac{A_{x^{'}}}{A_{s}} .

实施例

称取一定质量的亚甲基二膦酸晶体溶于去离子水中配制成浓度为10～20mmol L^-1亚甲基二膦酸水溶液。准确称取0.034g磷酸二氢钾晶体溶于25mL重水中，配制成10mmol L^-1的磷酸二氢钾重水溶液；取均匀平直的长为100mm，直径1mm玻璃点样毛细管，将其一端用火焰烧结，再将10m mol L^-1亚甲基二膦酸水溶液用注射器注于毛细管中，加至液面距毛细管上端约1cm处，用火焰烧结进行永久密封作为外标。称取5.000g NaOH和9.306g Na₂EDTA，溶于400ml去离子水，最后定容至500mL。称取10.000g NaOH固体和0.4653g Na₂EDTA粉末溶解于25mL去离子水中得到10mol L^-1NaOH和0.05mol L^-1Na₂EDTA混合液。

测试样品中磷组分含量前，将含有亚甲基二膦酸水溶液的玻璃点样毛细管装入含有准确浓度磷酸二氢钾重水溶液的标准核磁管，组成共轴套管体系；在600MHz核磁共振仪(BRUKER Ascend 600)上测试样品30分钟，根据³¹P NMR图谱上亚甲基二膦酸峰的积分面积(A_s)、磷酸二氢钾峰的积分面积(A_x)及磷酸二氢钾浓度(C_x)计算套管体系校正系数a,

校正系数的计算公式为：

测试环境样品磷组分时，取用的五种环境样品分别是稻田田面水、猪粪、土壤、水稻秸秆以及猪粪生物质炭。对于五种环境样品的处理分别是：将稻田田面水在-20℃下预冻30分钟，然后在冷冻干燥仪中冻干成粉末状；将风干后的猪粪、土壤剔除杂质后磨细过2mm筛；将风干水稻秸秆剪成1cm后用粉碎机粉碎均匀过0.5mm筛；将猪粪生物质炭磨细过1mm筛。称取稻田田面水、土壤及水稻秸秆各2g、猪粪样品1g以及猪粪生物质炭样品0.5g分别放入50mL离心管，加入25mL NaOH–EDTA溶液，在摇床上缓慢振荡16～20h后在1500*g下离心20分钟，离心时保持20～25℃，使样品中的磷被充分浸提出来。离心后，取上清液在–20℃超低温冰箱中预冻25～30分钟，取出后在冷冻干燥仪中冻干12～24h至粉末状。离心管中的冻干粉末充分混匀，准确称量100～200mg置于5mL离心管中，加入重溶解液及1mL D₂O后在漩涡振荡器上振荡10min，再在1500*g下离心20～30min，离心时保持20℃。将离心后的上清液和亚甲基二膦酸玻璃毛细管转移至5mm核磁管中，于核磁共振仪上进行³¹P NMR测定，核磁共振试验参数为：共振频率为242.9MHz，脉冲角90°，获取时间0.68s，延迟时间4.0s，温度25℃，旋转频率10Hz，在化学位移–25ppm至25ppm范围内扫描7800次，时间约12h，即可得各个样品的液态³¹P NMR谱图。

利用600MHz核磁共振仪测定的实施例中不同环境样品的液态³¹P NMR图谱(见图1)，采用Mestrelab Research公司开发的MestReNova(Mnova NMR 6.2.0)，在4Hz线宽下对图谱进行数据分析。对亚甲基二膦酸的峰面积归一化，依据图谱上其余各峰与亚甲基二膦酸的峰面积的比值，依据公式定量计算各含磷化合物的浓度，

计算公式为：

C_{x^{'}} = a \times \frac{A_{x^{'}}}{A_{s}} .

由图1和表1,2可知，在五种测试的环境样品中：正磷酸盐的含量最高，若将其化学位移固定在6.0ppm时，亚甲基二膦酸的出峰位置也较稳定，化学位移在17.29～17.64ppm。各样品³¹P NMR图谱上，亚甲基二膦酸外标附近区域没有其他化合物的峰，表明利用亚甲基二膦酸作³¹P NMR的外标准物质量较好，图谱清晰且杂峰少，提高了图谱的准确性。

表1 ³¹P NMR谱图上检测到磷组分的化学位移

*正磷酸盐的化学位移统一固定在6.0ppm。

表2 液态³¹P NMR检测的五种环境样品中磷素组分的含量(mg P kg^-1)及百分比

*括号中的值为各磷组分占样品全磷的百分比。

图1中1～5分别代表利用亚甲基二膦酸作外标的稻田田面水、猪粪、土壤、水稻秸秆、猪粪生物质炭等五种环境样品的液态³¹P NMR图谱。

Claims

1.一种利用亚甲基二膦酸外标法定量液态³¹P核磁共振的方法，其特征是包括以下步骤：

(1)首先将含有亚甲基二膦酸水溶液的玻璃点样毛细管装入含有准确浓度磷酸二氢钾重水溶液的标准核磁管，组成共轴套管体系；根据³¹P NMR图谱上亚甲基二膦酸出峰的积分面积A_s、磷酸二氢钾出峰的积分面积A_x及磷酸二氢钾浓度C_x计算套管体系校正系数a,校正系数的计算公式为：

(2)试验时用碱性提取剂溶解待测环境样品，在15～20℃避光条件下持续振荡16～20小时，而后在1500×g下离心20分钟得到浸提液，将浸提液在-20℃下预冻25-30分钟，再用冷冻干燥机抽真空冷冻干燥12～24小时至粉末状，将所得粉末称重后溶解于重溶液中；所述重溶液是由10mol L^-1NaOH、0.05mol L^-1Na₂EDTA和D₂O组成的混合液；

(3)粉末重溶解后连同步骤(1)中同一所述玻璃点样毛细管转移至核磁管中，于600MHz的核磁共振仪上进行³¹P NMR分析测定；根据³¹P NMR谱图上MDP出峰的积分面积A_S与待测样品中磷化合物出峰的积分面积A_x’逐一计算不同磷组分的浓度C_x’，C_x’的计算公式为：

2.根据权利要求1所述利用亚甲基二膦酸外标法定量液态³¹P核磁共振的方法，其特征是：步骤(1)中外标采用平直均匀的玻璃点样毛细管，长100mm，内径0.5mm；其一端用火焰烧结，再将亚甲基二膦酸水溶液用注射器注于毛细管中，加至液面距毛细管上端1cm处，用火焰烧结进行永久密封供后续定量试验使用。

3.根据权利要求1所述利用亚甲基二膦酸外标法定量液态³¹P核磁共振的方法，其特征是：所述亚甲基二膦酸水溶液是将亚甲基二膦酸晶体溶于去离子水中配制而成，其浓度为10～20mmol L^-1。

4.根据权利要求1所述利用亚甲基二膦酸外标法定量液态³¹P核磁共振的方法，其特征是：所述磷酸二氢钾重水溶液的准确浓度为10mmol L^-1；所述碱性提取剂为浓度0.25mol L^-1的NaOH溶液和0.05mol L^-1Na₂EDTA溶液混合液。