CN106770609A - 一种土壤细菌磷组分的液体31p nmr测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种土壤细菌磷组分的液体31P NMR测定方法。该方法避免了把微生物磷转化为正磷酸盐才能测定的缺憾，实现了土壤微生物磷的量化定性分析；本发明中应用土壤浸出液制作培养基，最大程度的保留了土壤细菌样品与其在土壤环境中的一致性；将土壤细菌中磷组分通过细菌富集、提取、前处理，应用液体31P NMR技术将微生物中的磷酸单酯、磷酸二酯、焦磷酸盐、膦酸盐和正磷酸盐等一一区分。通过对土壤优势细菌磷组分和土壤磷组分的31P NMR谱图对比，对明确土壤微生物磷在土壤中的转化有重要意义。

Description

一种土壤细菌磷组分的液体31P NMR测定方法
技术领域
本发明涉及土壤微生物磷组分的浸提及测定，具体为一种土壤细菌磷组分的液体31P
NMR测定方法。
背景技术
磷是所有有机生命体所必需的营养元素(Cade-Menun et al.,2006)，对植物体而言，磷既是植物体内重要有机化合物的组分，同时又以多种方式参与植物体内各种代谢过程(陆景陵，2005)。植物所需要的磷，多来源于其着生的土壤和外源磷肥的施入。土壤中的磷可分为有机磷和无机磷两大组分，其中有机磷占土壤全磷的50％～80％(Dalal,1977)。土壤中不同的磷化合物形式决定了其水解为无机磷的难易。1980年，Newman和Tate首次将31P NMR技术应用于土壤磷组分测定，目前，液体31P NMR技术在土壤磷组分中的测定应用广泛，可将土壤磷区分为核酸类、磷脂类、肌醇磷酸酯类、磷酸酰胺类、磷蛋白类、磷酸糖类、膦酸酯类等(McKelvie,2005)。土壤微生物磷库是土壤有机磷的重要组成部分，而土壤中微生物磷组分的测定方法较少。目前土壤微生物磷的测定，仅限于用熏蒸法结合钼蓝比色法测定土壤微生物量磷，因此，应用31P NMR技术，建立一种土壤微生物磷组分，特别是土壤细菌磷组分的浸提、测定方法，对于提高对土壤磷组分的认识，明确土壤微生物磷与土壤磷组分的转化关系，有重要的现实意义。
发明内容
本发明目的在于提供一种土壤细菌磷组分的液体31P NMR测定方法。该方法首先从土壤样品中富集细菌样品，将样品冷冻干燥后浸提，浸提液离心后再次进行冷冻干燥，其后应用液体31P NMR技术进行磷组分测定。本发明为分析土壤微生物中磷组分特别是细菌磷组分的组成及含量，提供一种准确、高效的测定方法。
本发明采用以下技术方案：
一种土壤细菌磷组分的液体31P NMR测定方法，它包括以下步骤：
(1)土壤细菌样品的获取：
a)将采集的土样过2mm筛，通过10-3～10-4梯度稀释后的土壤悬液涂布于LB培养基平板，30℃过夜培养12小时后挑取菌落放置于含5ml LB培养基的试管中，30℃振荡培养至试管浑浊；
b)称取1g过筛后的土样加至120ml广口瓶，然后向广口瓶中加入100ml超纯水，于150rpm振荡30min，振荡结束后在8180rpm离心15min，吸取离心上清液至250ml三角瓶，称取1g NaCl、1g蛋白胨和0.5g酵母粉加至三角瓶中，混合均匀后封口120℃灭菌，三角瓶降至室温；取下步骤a)中振荡结束的试管，然后在超净台下酒精灯旁转移其中的菌液至三角瓶中，迅速封口后，30℃振荡培养至三角瓶浑浊后离心，最后将多次离心后富集的细菌样品冷冻干燥得到细菌样品冻干粉末，备用；
(2)土壤细菌磷组分的提取：将冻干后的细菌样品称取1.5g于50ml离心管，然后向其中加入30ml NaOH-EDTA溶液，在20℃条件下低速往复振荡16h，浸提液在10000×g下离心30min，吸取上清液再次进行冷冻干燥得到土壤细菌磷组分冻干粉；
(3)土壤细菌磷的定量分析：取1ml步骤2)中未冷冻干燥前的上清液加4ml超纯水稀释后，采用ICP-MS测定细菌磷浸提液的全磷含量，用于谱图中量化分析不同磷化合物的含量；
(4)土壤细菌磷组分的液体31P NMR测定：将步骤(2)得到的土壤细菌磷组分的冻干粉末称取100mg重溶解于由0.1mL D2O和0.9mL 1.0M NaOH与100mM Na2EDTA构成的缓冲液共同组成的混合溶液中，移入5mm NMR测试管中进行谱图测定，仪器采用500M核磁测定，延迟时间2.0s，采集时间0.4s，45度脉冲6μs，化学位移范围为50ppm，扫描次数3万次左右，即可获得土壤细菌磷组分的液体31P NMR谱图。
所述步骤(1)b)中离心的具体方法为：首先，直接离心培养后的菌液，离心后取下部沉降物，加15ml用无菌水制备的浓度9‰的NaCl溶液，离心弃去上清液，此过程重复离心清洗四次后，向离心沉降物中加入15ml无菌水，继续离心清洗，弃去上清液，此过程重复三次，最后将离心后富集沉降物即为细菌样品，然后冷冻干燥。
所述NaOH-EDTA溶液为0.05M的Na2EDTA溶液和0.25M的NaOH溶液组成。
本发明的有益效果是：
1.本发明通过对土壤样品细菌富集培养，浸提并测定其磷组分，得到了土壤微生物磷组分测定的新方法，通过对土壤优势细菌磷组分和土壤磷组分的31P NMR谱图对比，对明确土壤微生物磷在土壤中的转化有重要意义。
2.本发明通过土壤细菌样品的NaOH-EDTA浸提，增加了浸提液中各磷组分的浸提比例，为获取更详尽的土壤细菌磷组分谱图，了解土壤中的细菌磷组分创造了条件。
3.本发明通过对细菌样品NaOH-EDTA浸提液的冷冻干燥，富集了细菌磷组分，为获取信噪比更好的土壤细菌磷组分谱图创造了条件。
4.本发明通过对液体31P NMR测定时相关参数的确定，提高了谱图的分辨率，增加了谱图解析时的准确性。
附图说明
图1是三种不同土壤优势细菌液体31P NMR谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。
实施例1
土壤优势细菌磷组分的液体31P NMR测定
本实施例采用土壤悬液培养富集土壤细菌样品，细菌样品离心冻干后采用NaOH–EDTA浸提离心的方法将细菌中的磷浸提出来，得到细菌磷浸提液；浸提液冷冻干燥处理后，得到粉末样品；将干燥后的粉末用0.1mL D2O和0.9mL含1.0M NaOH和100mM Na2EDTA的缓冲液重溶解后进行31P NMR上机测试，即可得到细菌磷组分的相关信息。具体方法详述如下：
(1)土壤细菌样品的获取：
a)取褐土秸秆还田后土样，过2mm筛，通过10-3～10-4梯度稀释后的土壤悬液涂布于LB培养基平板，30℃过夜培养12小时后挑取菌落放置于含5ml LB培养基的试管中，30℃振荡培养至试管浑浊；
b)称取1g过筛后的土样加至120ml广口瓶，然后向广口瓶中加入100ml超纯水，于150rpm振荡30min，振荡结束后在8180rpm离心15min，吸取离心上清液至250ml三角瓶，称取1g NaCl、1g蛋白胨和0.5g酵母粉加至三角瓶中，混合均匀后封口120℃灭菌，三角瓶降至室温；取下步骤a)中振荡结束的试管，然后在超净台下酒精灯旁转移其中的菌液至三角瓶中，迅速封口后，30℃振荡培养至三角瓶浑浊后离心，最后将多次离心后富集的细菌样品冷冻干燥得到细菌样品冻干粉末，备用；离心的具体方法为：首先，直接离心培养后的菌液，离心后取下部沉降物，加15ml用无菌水制备的浓度9‰的NaCl溶液，离心弃去上清液，此过程重复离心清洗四次后，向离心沉降物中加入15ml无菌水，继续离心清洗，弃去上清液，此过程重复三次，最后将离心后富集沉降物即为细菌样品，然后冷冻干燥。
(2)土壤细菌磷组分的提取：将冻干后的细菌样品称取1.5g于50ml离心管，然后向其中加入30ml NaOH-EDTA溶液，在20℃条件下低速往复振荡16h，浸提液在10000×g下离心30min，吸取上清液再次进行冷冻干燥得到土壤细菌磷组分冻干粉；所述NaOH-EDTA溶液为0.05M的Na2EDTA溶液和0.25M的NaOH溶液组成。
(3)土壤细菌磷的定量分析：取1ml步骤2)中未冷冻干燥前的上清液加4ml超纯水稀释后，采用ICP-MS测定细菌磷浸提液的全磷含量，用于谱图中量化分析不同磷化合物的含量；
(4)土壤细菌磷组分的液体31P NMR测定：将步骤(2)得到的土壤细菌磷组分的冻干粉末称取100mg重溶解于由0.1mL D2O和0.9mL的1.0M NaOH和100mM Na2EDTA的缓冲液，移入5mm NMR测试管中进行谱图测定，仪器采用500M核磁测定，延迟时间2.0s，采集时间0.4s，6μs脉冲(45°)，化学位移范围为50ppm，扫描次数3万次左右，即可获得土壤细菌磷组分的液体31P NMR谱图，如图1所示。图1为沂蒙山区典型石灰性褐土区设置的20％秸秆还田量的不同处理下土壤优势细菌磷组分谱图，所得谱图均较清晰，杂峰较少，化学位移表达较准确，表明其谱图准确性以及分辨率较高，质量较好。通过谱图分析细菌磷中正磷酸盐、磷酸单酯(磷酸糖、植酸盐)、磷酸二酯(DNA和磷脂)、焦磷酸盐、膦酸盐多聚磷酸盐等的峰面积，以ICP-MS中全磷含量计算，可得各组分中的磷含量。
表1液体31P NMR测定褐土秸秆还田后三种处理优势细菌NaOH–EDTA浸提液中的磷组分及其化学位移
表2褐土秸秆还田后三种处理土壤优势细菌液体31P NMR谱图磷组分分析
其中，膦酸盐1,2分别为膦酸盐在19.95ppm处和18.20ppm处出现的两个膦酸盐谱峰；nd为未检测到。
本发明开创了土壤微生物磷组分测定的新方法，避免了把微生物磷转化为正磷酸盐才能测定的缺憾，实现了土壤微生物磷的量化定性分析；本发明应用土壤浸出液制作培养基，最大程度的保留了土壤细菌样品与其在土壤环境中的一致性；本发明将土壤细菌中磷组分通过细菌富集、提取、前处理，应用液体31P NMR技术将微生物中的磷酸单酯、磷酸二酯、焦磷酸盐、膦酸盐和正磷酸盐等一一区分；本发明最大程度的保留了细菌磷组分的原有形态，并将其明确为具体磷化合物。避免了通过磷浸提的难易程度来笼统划分磷组分。

Claims (3)

1.一种土壤细菌磷组分的液体31P NMR测定方法，其特征在于，它包括以下步骤：
(1)土壤细菌样品的获取：
a)将采集的土样过2mm筛，通过10-3～10-4梯度稀释后的土壤悬液涂布于LB培养基平板，30℃过夜培养12小时后挑取菌落放置于含5ml LB培养基的试管中，30℃振荡培养至试管浑浊；
b)称取1g过筛后的土样加至120ml广口瓶，然后向广口瓶中加入100ml超纯水，于150rpm振荡30min，振荡结束后在8180rpm离心15min，吸取离心上清液至250ml三角瓶，称取1g NaCl、1g蛋白胨和0.5g酵母粉加至三角瓶中，混合均匀后封口120℃灭菌，三角瓶降至室温；取下步骤a)中振荡结束的试管，然后在超净台下酒精灯旁转移其中的菌液至三角瓶中，迅速封口后，30℃振荡培养至三角瓶浑浊后离心，最后将多次离心后富集的细菌样品冷冻干燥得到细菌样品冻干粉末，备用；
(2)土壤细菌磷组分的提取：将冻干后的细菌样品称取1.5g于50ml离心管，然后向其中加入30ml NaOH-EDTA溶液，在20℃条件下低速往复振荡16h，浸提液在10000×g下离心30min，吸取上清液再次进行冷冻干燥得到土壤细菌磷组分冻干粉；
(3)土壤细菌磷的定量分析：取1ml步骤2)中未冷冻干燥前的上清液加4ml超纯水稀释后，采用ICP-MS测定细菌磷浸提液的全磷含量，用于谱图中量化分析不同磷化合物的含量；
(4)土壤细菌磷组分的液体31P NMR测定：将步骤(2)得到的土壤细菌磷组分的冻干粉末称取100mg重溶解于由0.1mL D2O和0.9mL 1.0M NaOH与100mM Na2EDTA构成的缓冲液共同组成的混合溶液中，移入5mm NMR测试管中进行谱图测定，仪器采用500M核磁测定，延迟时间2.0s，采集时间0.4s，45度脉冲6μs，化学位移范围为50ppm，扫描次数3万次左右，即可获得土壤细菌磷组分的液体31P NMR谱图。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述步骤(1)b)中离心的具体方法为：首先，直接离心培养后的菌液，离心后取下部沉降物，加15ml用无菌水制备的浓度9‰的NaCl溶液，离心弃去上清液，此过程重复离心清洗四次后，向离心沉降物中加入15ml无菌水，继续离心清洗，弃去上清液，此过程重复三次，最后将离心后富集沉降物即为细菌样品，然后冷冻干燥。
3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述NaOH-EDTA溶液为0.05M的Na2EDTA溶液和0.25M的NaOH溶液组成。
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