CN106770609A - 一种土壤细菌磷组分的液体31p nmr测定方法 - Google Patents

一种土壤细菌磷组分的液体31p nmr测定方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106770609A
CN106770609A CN201611094847.6A CN201611094847A CN106770609A CN 106770609 A CN106770609 A CN 106770609A CN 201611094847 A CN201611094847 A CN 201611094847A CN 106770609 A CN106770609 A CN 106770609A
Authority
CN
China
Prior art keywords
soil
bacteria
phosphorus
nmr
phosphorus component
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201611094847.6A
Other languages
English (en)
Inventor
张广娜
林祥杰
郭绍芬
胡青
贾广菊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Linyi University
Original Assignee
Linyi University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Linyi University filed Critical Linyi University
Priority to CN201611094847.6A priority Critical patent/CN106770609A/zh
Publication of CN106770609A publication Critical patent/CN106770609A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/62—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating the ionisation of gases, e.g. aerosols; by investigating electric discharges, e.g. emission of cathode
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N24/00—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects
    • G01N24/08—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects by using nuclear magnetic resonance
    • G01N24/081—Making measurements of geologic samples, e.g. measurements of moisture, pH, porosity, permeability, tortuosity or viscosity

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • High Energy & Nuclear Physics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Environmental & Geological Engineering (AREA)
  • General Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Geochemistry & Mineralogy (AREA)
  • Geology (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种土壤细菌磷组分的液体31P NMR测定方法。该方法避免了把微生物磷转化为正磷酸盐才能测定的缺憾，实现了土壤微生物磷的量化定性分析；本发明中应用土壤浸出液制作培养基，最大程度的保留了土壤细菌样品与其在土壤环境中的一致性；将土壤细菌中磷组分通过细菌富集、提取、前处理，应用液体31P NMR技术将微生物中的磷酸单酯、磷酸二酯、焦磷酸盐、膦酸盐和正磷酸盐等一一区分。通过对土壤优势细菌磷组分和土壤磷组分的31P NMR谱图对比，对明确土壤微生物磷在土壤中的转化有重要意义。

Description

一种土壤细菌磷组分的液体31P NMR测定方法
技术领域
本发明涉及土壤微生物磷组分的浸提及测定，具体为一种土壤细菌磷组分的液体31P
NMR测定方法。
背景技术
磷是所有有机生命体所必需的营养元素(Cade-Menun et al.,2006)，对植物体而言，磷既是植物体内重要有机化合物的组分，同时又以多种方式参与植物体内各种代谢过程(陆景陵，2005)。植物所需要的磷，多来源于其着生的土壤和外源磷肥的施入。土壤中的磷可分为有机磷和无机磷两大组分，其中有机磷占土壤全磷的50％～80％(Dalal,1977)。土壤中不同的磷化合物形式决定了其水解为无机磷的难易。1980年，Newman和Tate首次将31P NMR技术应用于土壤磷组分测定，目前，液体31P NMR技术在土壤磷组分中的测定应用广泛，可将土壤磷区分为核酸类、磷脂类、肌醇磷酸酯类、磷酸酰胺类、磷蛋白类、磷酸糖类、膦酸酯类等(McKelvie,2005)。土壤微生物磷库是土壤有机磷的重要组成部分，而土壤中微生物磷组分的测定方法较少。目前土壤微生物磷的测定，仅限于用熏蒸法结合钼蓝比色法测定土壤微生物量磷，因此，应用31P NMR技术，建立一种土壤微生物磷组分，特别是土壤细菌磷组分的浸提、测定方法，对于提高对土壤磷组分的认识，明确土壤微生物磷与土壤磷组分的转化关系，有重要的现实意义。
发明内容
本发明目的在于提供一种土壤细菌磷组分的液体31P NMR测定方法。该方法首先从土壤样品中富集细菌样品，将样品冷冻干燥后浸提，浸提液离心后再次进行冷冻干燥，其后应用液体31P NMR技术进行磷组分测定。本发明为分析土壤微生物中磷组分特别是细菌磷组分的组成及含量，提供一种准确、高效的测定方法。
本发明采用以下技术方案：
一种土壤细菌磷组分的液体31P NMR测定方法，它包括以下步骤：
(1)土壤细菌样品的获取：
a)将采集的土样过2mm筛，通过10-3～10-4梯度稀释后的土壤悬液涂布于LB培养基平板，30℃过夜培养12小时后挑取菌落放置于含5ml LB培养基的试管中，30℃振荡培养至试管浑浊；
b)称取1g过筛后的土样加至120ml广口瓶，然后向广口瓶中加入100ml超纯水，于150rpm振荡30min，振荡结束后在8180rpm离心15min，吸取离心上清液至250ml三角瓶，称取1g NaCl、1g蛋白胨和0.5g酵母粉加至三角瓶中，混合均匀后封口120℃灭菌，三角瓶降至室温；取下步骤a)中振荡结束的试管，然后在超净台下酒精灯旁转移其中的菌液至三角瓶中，迅速封口后，30℃振荡培养至三角瓶浑浊后离心，最后将多次离心后富集的细菌样品冷冻干燥得到细菌样品冻干粉末，备用；
(2)土壤细菌磷组分的提取：将冻干后的细菌样品称取1.5g于50ml离心管，然后向其中加入30ml NaOH-EDTA溶液，在20℃条件下低速往复振荡16h，浸提液在10000×g下离心30min，吸取上清液再次进行冷冻干燥得到土壤细菌磷组分冻干粉；
(3)土壤细菌磷的定量分析：取1ml步骤2)中未冷冻干燥前的上清液加4ml超纯水稀释后，采用ICP-MS测定细菌磷浸提液的全磷含量，用于谱图中量化分析不同磷化合物的含量；
(4)土壤细菌磷组分的液体31P NMR测定：将步骤(2)得到的土壤细菌磷组分的冻干粉末称取100mg重溶解于由0.1mL D2O和0.9mL 1.0M NaOH与100mM Na2EDTA构成的缓冲液共同组成的混合溶液中，移入5mm NMR测试管中进行谱图测定，仪器采用500M核磁测定，延迟时间2.0s，采集时间0.4s，45度脉冲6μs，化学位移范围为50ppm，扫描次数3万次左右，即可获得土壤细菌磷组分的液体31P NMR谱图。
所述步骤(1)b)中离心的具体方法为：首先，直接离心培养后的菌液，离心后取下部沉降物，加15ml用无菌水制备的浓度9‰的NaCl溶液，离心弃去上清液，此过程重复离心清洗四次后，向离心沉降物中加入15ml无菌水，继续离心清洗，弃去上清液，此过程重复三次，最后将离心后富集沉降物即为细菌样品，然后冷冻干燥。
所述NaOH-EDTA溶液为0.05M的Na2EDTA溶液和0.25M的NaOH溶液组成。
本发明的有益效果是：
1.本发明通过对土壤样品细菌富集培养，浸提并测定其磷组分，得到了土壤微生物磷组分测定的新方法，通过对土壤优势细菌磷组分和土壤磷组分的31P NMR谱图对比，对明确土壤微生物磷在土壤中的转化有重要意义。
2.本发明通过土壤细菌样品的NaOH-EDTA浸提，增加了浸提液中各磷组分的浸提比例，为获取更详尽的土壤细菌磷组分谱图，了解土壤中的细菌磷组分创造了条件。
3.本发明通过对细菌样品NaOH-EDTA浸提液的冷冻干燥，富集了细菌磷组分，为获取信噪比更好的土壤细菌磷组分谱图创造了条件。
4.本发明通过对液体31P NMR测定时相关参数的确定，提高了谱图的分辨率，增加了谱图解析时的准确性。
附图说明
图1是三种不同土壤优势细菌液体31P NMR谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。
实施例1
土壤优势细菌磷组分的液体31P NMR测定
本实施例采用土壤悬液培养富集土壤细菌样品，细菌样品离心冻干后采用NaOH–EDTA浸提离心的方法将细菌中的磷浸提出来，得到细菌磷浸提液；浸提液冷冻干燥处理后，得到粉末样品；将干燥后的粉末用0.1mL D2O和0.9mL含1.0M NaOH和100mM Na2EDTA的缓冲液重溶解后进行31P NMR上机测试，即可得到细菌磷组分的相关信息。具体方法详述如下：
(1)土壤细菌样品的获取：
a)取褐土秸秆还田后土样，过2mm筛，通过10-3～10-4梯度稀释后的土壤悬液涂布于LB培养基平板，30℃过夜培养12小时后挑取菌落放置于含5ml LB培养基的试管中，30℃振荡培养至试管浑浊；
b)称取1g过筛后的土样加至120ml广口瓶，然后向广口瓶中加入100ml超纯水，于150rpm振荡30min，振荡结束后在8180rpm离心15min，吸取离心上清液至250ml三角瓶，称取1g NaCl、1g蛋白胨和0.5g酵母粉加至三角瓶中，混合均匀后封口120℃灭菌，三角瓶降至室温；取下步骤a)中振荡结束的试管，然后在超净台下酒精灯旁转移其中的菌液至三角瓶中，迅速封口后，30℃振荡培养至三角瓶浑浊后离心，最后将多次离心后富集的细菌样品冷冻干燥得到细菌样品冻干粉末，备用；离心的具体方法为：首先，直接离心培养后的菌液，离心后取下部沉降物，加15ml用无菌水制备的浓度9‰的NaCl溶液，离心弃去上清液，此过程重复离心清洗四次后，向离心沉降物中加入15ml无菌水，继续离心清洗，弃去上清液，此过程重复三次，最后将离心后富集沉降物即为细菌样品，然后冷冻干燥。
(2)土壤细菌磷组分的提取：将冻干后的细菌样品称取1.5g于50ml离心管，然后向其中加入30ml NaOH-EDTA溶液，在20℃条件下低速往复振荡16h，浸提液在10000×g下离心30min，吸取上清液再次进行冷冻干燥得到土壤细菌磷组分冻干粉；所述NaOH-EDTA溶液为0.05M的Na2EDTA溶液和0.25M的NaOH溶液组成。
(3)土壤细菌磷的定量分析：取1ml步骤2)中未冷冻干燥前的上清液加4ml超纯水稀释后，采用ICP-MS测定细菌磷浸提液的全磷含量，用于谱图中量化分析不同磷化合物的含量；
(4)土壤细菌磷组分的液体31P NMR测定：将步骤(2)得到的土壤细菌磷组分的冻干粉末称取100mg重溶解于由0.1mL D2O和0.9mL的1.0M NaOH和100mM Na2EDTA的缓冲液，移入5mm NMR测试管中进行谱图测定，仪器采用500M核磁测定，延迟时间2.0s，采集时间0.4s，6μs脉冲(45°)，化学位移范围为50ppm，扫描次数3万次左右，即可获得土壤细菌磷组分的液体31P NMR谱图，如图1所示。图1为沂蒙山区典型石灰性褐土区设置的20％秸秆还田量的不同处理下土壤优势细菌磷组分谱图，所得谱图均较清晰，杂峰较少，化学位移表达较准确，表明其谱图准确性以及分辨率较高，质量较好。通过谱图分析细菌磷中正磷酸盐、磷酸单酯(磷酸糖、植酸盐)、磷酸二酯(DNA和磷脂)、焦磷酸盐、膦酸盐多聚磷酸盐等的峰面积，以ICP-MS中全磷含量计算，可得各组分中的磷含量。
表1液体31P NMR测定褐土秸秆还田后三种处理优势细菌NaOH–EDTA浸提液中的磷组分及其化学位移
表2褐土秸秆还田后三种处理土壤优势细菌液体31P NMR谱图磷组分分析
其中，膦酸盐1,2分别为膦酸盐在19.95ppm处和18.20ppm处出现的两个膦酸盐谱峰；nd为未检测到。
本发明开创了土壤微生物磷组分测定的新方法，避免了把微生物磷转化为正磷酸盐才能测定的缺憾，实现了土壤微生物磷的量化定性分析；本发明应用土壤浸出液制作培养基，最大程度的保留了土壤细菌样品与其在土壤环境中的一致性；本发明将土壤细菌中磷组分通过细菌富集、提取、前处理，应用液体31P NMR技术将微生物中的磷酸单酯、磷酸二酯、焦磷酸盐、膦酸盐和正磷酸盐等一一区分；本发明最大程度的保留了细菌磷组分的原有形态，并将其明确为具体磷化合物。避免了通过磷浸提的难易程度来笼统划分磷组分。

Claims (3)

1.一种土壤细菌磷组分的液体31P NMR测定方法，其特征在于，它包括以下步骤：
(1)土壤细菌样品的获取：
a)将采集的土样过2mm筛，通过10-3～10-4梯度稀释后的土壤悬液涂布于LB培养基平板，30℃过夜培养12小时后挑取菌落放置于含5ml LB培养基的试管中，30℃振荡培养至试管浑浊；
b)称取1g过筛后的土样加至120ml广口瓶，然后向广口瓶中加入100ml超纯水，于150rpm振荡30min，振荡结束后在8180rpm离心15min，吸取离心上清液至250ml三角瓶，称取1g NaCl、1g蛋白胨和0.5g酵母粉加至三角瓶中，混合均匀后封口120℃灭菌，三角瓶降至室温；取下步骤a)中振荡结束的试管，然后在超净台下酒精灯旁转移其中的菌液至三角瓶中，迅速封口后，30℃振荡培养至三角瓶浑浊后离心，最后将多次离心后富集的细菌样品冷冻干燥得到细菌样品冻干粉末，备用；
(2)土壤细菌磷组分的提取：将冻干后的细菌样品称取1.5g于50ml离心管，然后向其中加入30ml NaOH-EDTA溶液，在20℃条件下低速往复振荡16h，浸提液在10000×g下离心30min，吸取上清液再次进行冷冻干燥得到土壤细菌磷组分冻干粉；
(3)土壤细菌磷的定量分析：取1ml步骤2)中未冷冻干燥前的上清液加4ml超纯水稀释后，采用ICP-MS测定细菌磷浸提液的全磷含量，用于谱图中量化分析不同磷化合物的含量；
(4)土壤细菌磷组分的液体31P NMR测定：将步骤(2)得到的土壤细菌磷组分的冻干粉末称取100mg重溶解于由0.1mL D2O和0.9mL 1.0M NaOH与100mM Na2EDTA构成的缓冲液共同组成的混合溶液中，移入5mm NMR测试管中进行谱图测定，仪器采用500M核磁测定，延迟时间2.0s，采集时间0.4s，45度脉冲6μs，化学位移范围为50ppm，扫描次数3万次左右，即可获得土壤细菌磷组分的液体31P NMR谱图。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述步骤(1)b)中离心的具体方法为：首先，直接离心培养后的菌液，离心后取下部沉降物，加15ml用无菌水制备的浓度9‰的NaCl溶液，离心弃去上清液，此过程重复离心清洗四次后，向离心沉降物中加入15ml无菌水，继续离心清洗，弃去上清液，此过程重复三次，最后将离心后富集沉降物即为细菌样品，然后冷冻干燥。
3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述NaOH-EDTA溶液为0.05M的Na2EDTA溶液和0.25M的NaOH溶液组成。
CN201611094847.6A 2016-12-02 2016-12-02 一种土壤细菌磷组分的液体31p nmr测定方法 Pending CN106770609A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611094847.6A CN106770609A (zh) 2016-12-02 2016-12-02 一种土壤细菌磷组分的液体31p nmr测定方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611094847.6A CN106770609A (zh) 2016-12-02 2016-12-02 一种土壤细菌磷组分的液体31p nmr测定方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106770609A true CN106770609A (zh) 2017-05-31

Family

ID=58883629

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611094847.6A Pending CN106770609A (zh) 2016-12-02 2016-12-02 一种土壤细菌磷组分的液体31p nmr测定方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106770609A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107271471A (zh) * 2017-07-04 2017-10-20 中国环境科学研究院 一种湖泊沉积物中单酯磷组分的提取及磷核磁共振谱图分析方法
CN114252469A (zh) * 2021-12-09 2022-03-29 江南大学 一种同步测定细菌多糖中多糖和磷含量的定量核磁方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS63317089A (ja) * 1987-06-19 1988-12-26 Takeda Chem Ind Ltd 抗生物質ｔａｎ−９２８およびその製造法
JP2000034185A (ja) * 1998-07-21 2000-02-02 Denki Kagaku Kogyo Kk 無機組成物とその製造方法、それを用いた肥料と土壌改質剤
CN101475401A (zh) * 2009-01-05 2009-07-08 东南大学 石质文物表面防护用微生物材料的制备方法
CN102818813A (zh) * 2012-08-03 2012-12-12 中国科学院沈阳应用生态研究所 一种采用bd-液体31p nmr测定土壤磷组分的方法
CN103865824A (zh) * 2012-12-13 2014-06-18 河南省农业科学院 一种防治芝麻枯萎病的生防菌、分离方法、菌剂及其应用
CN104634806A (zh) * 2015-02-02 2015-05-20 浙江大学 利用亚甲基二膦酸外标法定量液态31p核磁共振的方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS63317089A (ja) * 1987-06-19 1988-12-26 Takeda Chem Ind Ltd 抗生物質ｔａｎ−９２８およびその製造法
JP2000034185A (ja) * 1998-07-21 2000-02-02 Denki Kagaku Kogyo Kk 無機組成物とその製造方法、それを用いた肥料と土壌改質剤
CN101475401A (zh) * 2009-01-05 2009-07-08 东南大学 石质文物表面防护用微生物材料的制备方法
CN102818813A (zh) * 2012-08-03 2012-12-12 中国科学院沈阳应用生态研究所 一种采用bd-液体31p nmr测定土壤磷组分的方法
CN103865824A (zh) * 2012-12-13 2014-06-18 河南省农业科学院 一种防治芝麻枯萎病的生防菌、分离方法、菌剂及其应用
CN104634806A (zh) * 2015-02-02 2015-05-20 浙江大学 利用亚甲基二膦酸外标法定量液态31p核磁共振的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
宋培勇: "贵州不同生境土壤中微生物结构的差异", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库 (硕士)农业科技辑》 *
张广娜等: "东北地区三种典型土壤磷组分的31P 核磁共振研究及其与土壤磷酸酶活性的关系", 《土壤通报》 *
成永旭等: "《生物饵料培养学》", 31 August 2005, 中国农业出版社 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107271471A (zh) * 2017-07-04 2017-10-20 中国环境科学研究院 一种湖泊沉积物中单酯磷组分的提取及磷核磁共振谱图分析方法
CN107271471B (zh) * 2017-07-04 2018-06-08 中国环境科学研究院 一种湖泊沉积物中单酯磷组分的提取及磷核磁共振谱图分析方法
CN114252469A (zh) * 2021-12-09 2022-03-29 江南大学 一种同步测定细菌多糖中多糖和磷含量的定量核磁方法
CN114252469B (zh) * 2021-12-09 2023-12-08 江南大学 一种同步测定细菌多糖中多糖和磷含量的定量核磁方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Christ et al. Methods for the analysis of polyphosphate in the life sciences
Zhang et al. Carbon and phosphorus exchange may enable cooperation between an arbuscular mycorrhizal fungus and a phosphate‐solubilizing bacterium
White et al. Nonselective biochemical methods for the determination of fungal mass and community structure in estuarine detrital microflora
Cade-Menun et al. Characterizing dissolved and particulate phosphorus in water with 31P nuclear magnetic resonance spectroscopy
Li et al. The influence of dissolved phosphorus molecular form on recalcitrance and bioavailability
Jarosch et al. Is the enzymatic hydrolysis of soil organic phosphorus compounds limited by enzyme or substrate availability?
Vestergren et al. High-resolution characterization of organic phosphorus in soil extracts using 2D 1H–31P NMR correlation spectroscopy
Unno et al. Metagenomic analysis of the rhizosphere soil microbiome with respect to phytic acid utilization
Schröder et al. Inorganic polyphosphates: biochemistry, biology, biotechnology
Liu et al. Molecular-level understanding of phosphorus transformation with long-term phosphorus addition and depletion in an alkaline soil
Lowe Chiral [16O, 17O, 18O] phosphate esters
CN106770609A (zh) 一种土壤细菌磷组分的液体31p nmr测定方法
Niere et al. The effect of phosphonate on the acid-soluble phosphorus components in the genus Phytophthora
Sannigrahi et al. Nature and dynamics of phosphorus-containing components of marine dissolved and particulate organic matter
Feng et al. Forms and lability of phosphorus in algae and aquatic macrophytes characterized by solution 31P NMR coupled with enzymatic hydrolysis
Zhou et al. Transformation of soil organic phosphorus along the Hailuogou post-glacial chronosequence, southeastern edge of the Tibetan Plateau
Ma et al. Characteristics of inorganic and organic phosphorus in Lake Sha sediments from a semiarid region, Northwest China: Sources and bioavailability
CN102818813A (zh) 一种采用bd-液体31p nmr测定土壤磷组分的方法
Wang et al. Microbial phosphorus mobilization strategies across a natural nutrient limitation gradient and evidence for linkage with iron solubilization traits
Sianoudis et al. Distribution of polyphosphates in cell-compartments of Chlorella fusca as measured by 31 P-NMR-spectroscopy
Herzberg et al. Trophic interactions in soils as they affect energy and nutrient dynamics. II. Physiological responses of selected rhizosphere bacteria
Floss et al. Stereochemistry of biological reactions at proprochiral centers
Van Golde et al. Phosphatidylserine and its plasmalogen analogue as major lipid constituents in Megasphaera elsdenii
CN106556639A (zh) 一种土壤真菌磷组分的液体31p nmr测定方法
CN106277363A (zh) 一种检测湖泊藻类有机磷的降解方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170531

RJ01 Rejection of invention patent application after publication