JPS63317089A - 抗生物質ｔａｎ−９２８およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １１直Δ扛匪氷」 本発明は、真菌感染症の治療剤として有用な新規抗生物
質ＴＡＮ−９２８およびその塩、それらの製造法ならび
にＴＡＮ−９２８生産菌に関する。

従来の技術 本発明の新規抗生物質ＴＡＮ−９２８はその物理化学的
および生物学的データなどから新規抗生物質であり、こ
のような抗真菌性抗生物質は未だ報告されていない。

発明が解決しようとする問題点 真菌によって惹起される感染症に対しては抗真菌剤投与
による化学療法が主として行われているが、従来の抗真
菌剤は副作用が強いものが多く、またそれらを長期ある
いは大量に投与することにより菌交代現象あるいは耐性
菌の出現（耐性化現象）などは現在の真菌感染症化学療
法分野で大きな問題となっている。これらの問題を解決
するために当分野では常に副作用が弱く、臨床上有効な
新規抗真菌剤が求められている。

問題点を解決するための手段 本発明者らは多数の土壌試料から微生物を分離し、それ
らの代謝産物から抗真菌剤を得るための探索研究を行っ
てきた。その結果、ある種の糸状菌が培養物中に抗真菌
活性を有する抗生物質を産生ずることを見い出し、この
抗生物質を培養物中から純粋に単離し、その理化学的お
よび生物学的性質から、当該抗生物質が新規物質である
ことを確かめ、これを抗生物質ＴＡＮ−９２８と称する
ことにした。

本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重
ねた結果、本発明を完成した。

すなわち本発明は、（１）抗生物質ＴＡＮ−９２８また
はその塩、（２）トリコデルマ属に属し、抗生物質ＴＡ
Ｎ−９２８を生産する能力を有する微生物を培地に培養
し、培養物中に抗生物質ＴＡＮ−９２８を生成蓄積せし
め、これを採取することを特徴とする抗生物質ＴＡＮ−
９２８またはその塩の製造法、および（３）抗生物質Ｔ
ＡＮ−９２８を生産する能力を有するトリコデルマ・オ
ーレオビリデに関する。

抗生物質ＴＡＮ−９２８の生産菌としては、抗生物質Ｔ
ＡＮ−９２８を生産するかぎりどのような菌株を用いて
も良いが、たとえば本発明者らが分離し、トリコデルマ
・オーレオビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ａｕｒｅ
ｏｖｉｒｉｄｅ）Ｍ　−１６１（以下Ｍ−１６１菌と略
称することもある）と名付けた菌株またはそれと類縁の
菌株などは最も有効に用いられる一例である。該Ｍ−１
６１菌は次に示すような培養所見を示す。本所見は各種
培地上２８℃で２週間観察したもので、表中（）内はカ
ラー・ハーモニー・マニュアル第４版（コンテイナー・
コーポレーション・オブ・アメリカ　１９５８年）によ
る色名の記載である。

（以　下　余　白） Ｍ−１６１菌の各種培地における培養所見Ｍ−１６１閑
の生育ｐＨ範囲はｐＨ２，７〜１）Ｈｌｏ、０．最適ｐ
ＨはｐＨ５，０〜Ｉ）８６．０である。

また、生育温度範囲は１１．５℃〜３９．０℃、最適生
育温度は３０℃〜３３℃である。Ｍ−１６１菌は輪生状
のフィアライド（Ｐｈｉａｌｉｄｅ）を形成し、卵形で
表面平滑、大きさ３５〜６μｍＸ２．５〜６μｍ（平均
３．８ｘ３．２μｍ）のフィアロスボア（Ｐｈｉａｌｏ
ｓｐｏｒｅ）を着生する。

上記Ｍ−１６１菌の形態的特徴、培養所見、生理的性質
に基き既存の菌種との比較を試みた結果、本菌をトリコ
デルマ・オーレオビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ａ
ｕｒｅｏｖｉｒｉｄｅ）と同定し、トリコデルマ・オー
レオビリデＭ−１６１と名付けた。トリコデルマ・オー
レオビリデＭ−１６１は昭和６２年５月２６日から財団
法人発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦ０　３２０６
３として、また昭和６２年６月６日から通商産業省工業
技術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）に受託番号Ｆ’
ＥＲＭ　　Ｐ−９４０２としてそれぞれ寄託されている
。

微生物の一般的性状として菌学的性質は変異しやすく、
トリコデルマ・オーレオビリデＭ−１６１もその例外で
はなく種々の変ｎ株が容易に得られる。しかしこれらの
変異株にあっても抗生物質ＴＡＮ−９２８を生産する性
質を失わないかぎり本発明の方法に使用することができ
る。もちろんそれらの変異が自然の原因に由来するもの
であっても各種変異誘起剤（例えば紫外線、エックス線
。

放射線、ニトロソグアニジン等）を用いて人工的に行な
われたものであってもさしつかえない。

本発明方法の培養に際しては、一般に微生物が同化しう
る炭素源、消化しうる窒素源および無機塩などを含有さ
せた培地が使用される。また培地には必要に応じて微量
栄養素１発育促進物質、前駆物質などの微量有効物質を
添加してらよい。一般に微生物が同化しうる炭素源とし
てはぶどう糖。

しょ糖、糖みつ、でんぷん、デキストリン、グリセリン
などがあり、消化しうる窒素源としては肉エキス、大豆
粉、コーンステイープリカー、ペプトン、カゼイン、綿
実粕など、および硝酸塩類、アンモニウム化合物などの
無機窒素化合物などがあり、それらはいずれも有効に利
用される。培養は表面培養法によってもよいが、深部通
気攪拌培養法によるのが通常である。深部通気攪拌培養
法による場合、培地の性質は中性付近にするのがよく、
培養時の温度は２０〜３６℃付近、好ましくは２４〜３
０℃に保つのかよい。しかしこれらの培養組成物。

培地の液性、培養温度、攪拌数などの培養条件は使用す
る菌株の種類や外部の条件などに応じて好ましい結果が
得られるように適宜調節１選択されることはいうまでも
ない。

本発明の抗生物質ＴＡＮ−９２８を培養物から採取する
には、後述する実施例に示すように当該物質の理化学的
性質を考慮して、微生物代謝産物を採取するのに通常用
いられる分離、精製の手段が適宜利用される。例えば、
溶剤による抽出法。

夾雑物との溶解度の差を利用する方法、或いはクロマト
グラフィーなどが単独或いは組合わせて用いられろ。ク
ロマトグラフィーで用いられる担体としては、慣用の無
機及び有機の担体１例えばシリカゲル、アルミナ、活性
炭、セルロース、ハイポーラス樹脂、デキストランゲル
等が利用される。

培養物中に生産された抗生物質ＴＡＮ−９２８を採取す
るには、あらかじめ遠心分離或いはろ過等で分離して得
られた培養上清と培養菌体からメタノール、アセトン等
の溶媒で抽出して得られる菌体抽出液を合わせて、合成
吸着剤例えば、ダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化成社製
）のカラムに吸着させた後、該カラムを段階的に含水メ
タノールで展開し、活性画分を集めて濃縮後、濃縮液を
弱酸性としてｎ−ブタノール、ｉ−ブタノール、酢酸エ
チル等の有機溶媒で抽出する。得られた抽出液を濃縮し
た後、ジエチルエーテル等の有機溶媒を加えて粗粉末を
得、次いでこれをシリカゲルのカラムクロマトグラフィ
ーに付す。カラムを酢酸エチル−イソプロピルアルコー
ル−水の混合溶媒系で展開し、後述する薄層クロマトグ
ラフィーで単一スポットを示す画分を集めて濃縮し、残
渣をエタノール−酢酸エチル等の混合溶媒で処理するこ
とにより、ＴＡＮ−９２８を白色粉末として得ることが
できる。

後記する実施例２で得られるＴＡＮ−９２８（！離体）
の物理化学的性状は次の通りである。

１）形状：白色粉末 ２）元素分析値（％）・ 実測値　　　　　計算値” Ｃ５９，７９５９，５４ １，１８，００８，０８ Ｎ　　　　２．０１　　　　２．０４ Ｓ　　　　４．５２　　　　４．６８ （１′：水分１モルを含むとして計算）３）分子量測定
値二ノナトリウム塩のＳ　Ｉ　−ＭＳ法による ｔｔ＋／ｚ　　７１２（Ｍ＋Ｈ）” ４）比旋光度；［αコ”−４８，０°（ｃｍ０．５２゜
メタノール中） ５）紫外線吸収スペクトル゛：末端吸収（メタノール中
）６）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ綻法での主要ピー
ク、ｃｍ一つ： ３４３０．２９７０．２８ｇ０，１７５０，１７００．
１６３０，１５００，１４６０゜１３７５、１３４０．
１２６０．　＋１１０，１０５５．９８０．９５０，８
８５，８４０゜７６５、．６２５，５８５゜ ７）”Ｃ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル（１００ＭＩ
Ｉｚ、重ＤＭＳＯ中、δｐｐｍ）・次のシグナルが認め
られる。

１７４．９．１６５．８．１４４．５．１３４．６．１
３１．８．１２８．２゜ｇｏ、ｒ、　７３．０．６３．
０．６２．５．６０．５．５５．５．５ｓ２（５４，５
，４２，１，４０，２，３９，４，３５，１，３４，７
，３３，１゜３２．４．３１．９．２９．７、２８．９
．２８．０．２６．８．２０．５゜２０．３．１９．７
、１９．５．１９．４．１８．８．１７、３．１５．８
゜８）溶解性： 易溶：メタノール、ジメチルスルホキンド難溶；水、酢
酸エチル、ｎ−ヘキサン ９）呈色反応： 陽性ニリンモリブデン酸、過マンガン酸カリウム。

ヨード、ブレイブ・リーバツク、エールリッヒ試薬 擬陽性；ニンヒドリン試薬 陰性；坂口、バートン、ドラーゲンドルフ試薬１０）酸
性、中性、塩基性の区別：両性１１）薄層クロマトグラ
フィー（ＴＬＣＸ担体、シリカゲルガラスプレート６０
Ｆｚｓ４．０．２５ｍｍ、西独メルク社製）： １２）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）担体：
ＩＮＥＲＴＳＩＬ　ＣＤＳ　５（４，６ｘ　１５ｏｒＩ
１ｍ）溶媒系ニア５％メタノール−０，０１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ６，３） 流速＝１ｄ／分 保持時間（ｔＲ）ニア、４分 １３）’）−（ＮＭＲス／＜クトル（９０ＭＨｚ１重メ
タノール中）：第２図に示す。

後述する実施例２で得られたＴＡＮ−９２８を６Ｎ−Ｈ
ＣＱで１１０℃、１０時間加熱加水分解すると、β−ハ
イドロキシ−Ｌ−ロイシン及びＨ２ＳＯ，の生成が認め
られ、一方、Ｔ　７’ｌ　Ｎ　−９２８を０．１Ｍリン
酸バッファー：５０％メタノール（１：　１　（Ｖ／Ｖ
）ＸｐＨ８、０）ｌテ８０℃、７時間加熱加水分解する
と、Ｃ＊ｓＨ４！Ｏｓの分子式を有するステロールが得
られた。本物質の物理化学的性質は次の通りである。

１）元素分析値：Ｃ，６７，９９；　　Ｈ，９，０６計
算値（Ｃ＊ｓＨ４＊Ｏｓ・２Ｈ２０として）：Ｃ，６７
，９９，）ｌ　、９．３７ ２）、”ＣＮＭＲスペクトル（７５ＭＨｚ、重メタノー
ル中、δｐｐＩ１）　： １６．８９．１８．１９．２０．１３．２０．４７、２
１．４９．２１．９０゜２９．４８．３０．２５．３１
．１１１４．３３．８ｇ、　３４．３１．３４．７４゜
３６．３３．４Ｇ、２２．４１．２３．４１．９４．４
４．３０．５７、４７゜５７、５：（、６２，５１，６
５，２５，６５，４３，６９，１５，１３０，２０゜１
３３．８５．１３５．９８．１４６．９５．１７８．０
３以上に示した理化学的性状から、ＴＡＮ　　９２８は
ステロール骨格を有する新規抗生物質と祠断された。

又、ＴＡＮ−９２８は酸性の官能基を有するので、自体
公知の方法によりナトリウム塩、カワウム塩、カルンウ
ム塩等の金属塩、或いはアンモニウム塩等のアミン塩な
どの薬理学的に許容される塩を形成させることかできる
。

次にＴＡＮ−９２８の抗菌作用について述べる。

ろ紙円板（東洋製作新製、直径８１）をＴＡＮ−９２８
遊離体の１０００μｇ／鑓メタノール液に浸漬し、一定
時間風乾してメタノールを消失させた後、これを各種真
菌および細菌の食菌寒天平板にはりつけ、所定濃度で所
定時間培養後、ろ紙円板のまわりに生じた生育抑制円の
直径を第１表に示す。表中“０“は阻止円の認められな
かったことを示す。用いた培地は次のとおりである。

Ａ：サブロー・デキストロース・寒天培地Ｂニトリブチ
カーゼ・ソイ・アガー（ベクトンディッキンソン社、米
国） 第１表から明らかな様に、抗生物質ＴＡＮ−９２８はあ
る種の真菌類に対して抗菌力を示す。さらにＴＡＮ−９
２８を投与量２００　ｍｇ／ｋｇでマウスに腹腔内投与
しても急性毒性は全く認められなかった。

これらのデータから明らかなようにＴＡＮ−９２８は真
菌に対して抗菌性を示し、哺乳動物に対して毒性の弱い
抗生物質であると云える。したがってＴＡＮ−９２８は
ヒトおよび家畜、家きんなどの真菌感染症の治療に用い
ることが出来る。

この治療用に、ＴＡＮ−９２８は公知の製剤化技術に従
って種々の剤形の医薬組成物に処方して用いることがで
きる。たとえばＴＡＮ−９２８を通常ｏｔ−ｔｏ冒／Ｖ
％　、好ましくは０　、５〜５　Ｗ／Ｙ％の濃度で蒸留
水などに溶解した液剤、またはワセリン、ラノリンを基
剤とし、１ｇあたりＴＡＮ−９２８を通常０．２〜ｌ　
ＯＯｍｇ、好ましくは２〜５０ｍｇ含有する軟膏剤とし
て、ヒトおよび動物の皮膚あるいは粘膜などの殺菌、消
毒に用いることができる。

抗生物質Ｔ　Ａ　Ｎ　−９２８はまた新しい医薬品の合
成中間体としても有望な化合物と考えられる。

以上述べた化学的および生物学的諸性質から明らかなご
とく、ＴＡＮ−９２１３は新規抗生物質である。

実施例 次に実施例をもってさらに詳細に本発明を説明するが、
これによって本発明が限定されるものではない。パーセ
ントは、特にことわりのないがぎり重量／容量％を示す
。

実施例１ ３ｅ容量の坂ロコルベンにグルコース２．０％。

可溶性デンプン３．０％、コーン・スヂープ・リカー１
．０％、脱脂大豆粉１．０％、ペプトン０　、５　％。

塩化ナトリウム０．３％、炭酸カルシウム０．５％（ｐ
Ｈ７調整）からなる培地５００＃ｔｆ！を成人後滅菌し
、これにトリコデルマ・オーレオビリデＭ−１６１（Ｉ
ＦＯ３２０６３，ＦＥＲＭ　　Ｐ−９４０２）株の斜面
培養から１白金耳を接種したのち１２０往復／分の往復
振盪機上２８℃で４８時間培養した。５０＆容量のステ
ンレスタンクに上記培地組成にアクトコール（消泡剤、
武田薬品工業社製）０．０５％加えた培地３０Ｑを調製
、滅菌し、先に培養した坂ロコルベンの全培養液５００
−をこれに接種して通気ｆｉ３０Ｑ／分、Ｗ１拌数２８
　Ｏｒｐｍで２８℃、４８時間深部培養を行い種培養液
を得た。

２００Ｑ容量のステンレスタンクにグルコース１．０％
、デキストリン４．０％、生大豆粉０．５％。

ペプトン０．５％、酵母エキス０．２％、硫酸マンガン
０．０５％、リン酸−カリウムＯ１１％、炭酸カルンウ
ム０．５％からなる培地（ｐＨ７，０）Ｉ　２０１２を
調製後、滅菌したものに前記種培養液６１２を接種し、
通気量１２０Ｑ／分、攪拌数２０　Ｏｒｐｍで２４℃、
５日間培養を行った。

実施例２ 実施例１の方法により２００Ｃ容量ステンレスタンク２
基の培養によって得られた培養液（１５０ｉ２）にハイ
フロス−パーセル（ジョンズ・マンビル社製、米国）を
加えてろ過し、得られたろ液を分離後、菌体を含む固形
物にメタノール（１２９１２）を加え、３０分間攪拌す
る。攪拌終了後、ろ過して得られたメタノール抽出液（
１２７１２）を、先にろ別し得られた培養ろ液（１２９
１２）と合わせて、ダイヤイオンＩ−ＩＰ−２０（２０
Ｃ，三菱化成工業１日本）のカラムに通す。カラムを３
０％（Ｖ／Ｖ）メタノール水（８０ｅ）で洗浄後、８０
　％（Ｖ／Ｖ）メタノール水（１３８Ｃ）で展開した。

活性成分を含む溶出液を２１ｆ２にまで濃縮後、ｐＨを
４．６としてｉ−ブタノール（＋０１２）で２回抽出し
、ｉ−ブタノール層を合わけて濃縮し、エーテルで処理
することにより粗粉末（５８，５ｇ）を得た。

得られた粗粉末をシリカゲル（ｔｏｏｇ）と混和した後
、シリカゲル（５００ｇ、メルク社製、西独）のカラム
クロマトグラフィーに付した。カラムを酢酸エチル−イ
ソプロピルアルコール−水（１０：に〇、５．４．０１
２）及び酢酸エヂルーイソプロピルアルコールー水（５
：Ｉ：０．５，４．０１２）で展開し、前述の薄層クロ
マトグラフィーで単一スポットを示す活性画分（４，０
＆）を集めて濃縮した後、残渣をエタノール−酢酸エチ
ルの混合溶媒で２回処理することにより、ＴＡＮ−９２
８（遊離体）の精製白色粉末（４６２ｍｇ）を得た。

発明の効果 本発明の新規抗生物質ＴＡＮ−９２８およびその塩は、
真菌に抗菌作用を示し、たとえばヒトおよび他の動物に
経口的、非経口的または外用的に投与することによって
これらの真菌感染症の治療に有利に用いることができる
。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例２で得られた抗生物質ＴＡＮ−９２８の
赤外部吸収′スペクトル（ＫＢｒ法）、第２図は１Ｈ核
磁気共鳴スペクトル（９０ＭＨｚ１重メタノール中）を
それぞれ示す。 手もに禎↑正息Ｙ（自発） ！　事件の表示 昭和６２年特許願第１５−１０９９号 ２、発明の名称 抗ノ１ミ物質Ｔ　Ａ　Ｎ　　９２８およびその製造法３
　捕「にをする者 °１［件との関係　　特許出願人 住所　　大阪市東区道修町２丁目２７番地名弥　（２９
３）武田薬品工業株式会社代表者　梅　本　純　正 ４　代理人 住所　大阪市淀用区十三本町２丁目１７番８５号５、補
正の対象 ６、補正の内容 （１）明細書第７頁第１６行のＩＩＩ；”０３２０６３
として」の後に「寄託され」を挿入する。 （２）同書第７頁第１９行の「それぞれ寄託されている
。」を「寄託され、該寄託がブダペスト条約に基づく寄
託に切換えられて受託番号ＦＥＲ〜ＩＢＰ−１８８１と
して同研究所に保管されている。」に訂正する。 （３）同調第１９頁第１８〜１９行のｒ　Ｆ　ＥＩ’ｊ
　ＭＰ−９４０２ｊをｒｌ：’ＥＲＭ　　ＢＰ−＋８８
１ｊに訂正する。 以　　−１ニ 受託番号変更届 昭和６３年７月７日 ｌ　事件の表示 昭和６２年特許願第１５４０９９号 ２、発明の名称 抗生物質ＴＡＮ−９２８およびその製造法３、手続をし
た者 事件との関係　　特許出願人 住　所　大阪市東区道修町２丁目２７番地名　称　（２
９３）　　武田薬品工業株式会社代表者　梅　本　純　
正 ４、代理人

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）遊離体として、次の物理化学的性質を有する抗生
   物質ＴＡＮ−９２８、またはその塩。 １）形状：白色粉末 ２）分子式：Ｃ＿３＿４Ｈ＿５＿３ＮＯ＿１＿０Ｓ３）
   比旋光度：［α］＾２＾４＿Ｄ−４８．０°（ｃ＝０、
   ５２、メタノール中） ４）紫外線吸収スペクトル：末端吸収（メタノール中） ５）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ錠法での主要ピーク
   、ｃｍ＾−＾１）： ３４３０、２９７０、２８８０、１７５０、１７００、
   １６３０、１５００、１４６０、１３７５、１３４０、
   １２６０、１１１０、１０５５、９８０、９５０、８８
   ５、８４０、７６５、６２５、５８５。 ６）＾１＾３Ｃ核磁気共鳴スペクトル（１００ＭＨｚ、
   重ＤＭＳＯ中、δｐｐｍ）：次のシグナルが認められる
   。 １７４．９、１６５．８、１４４．５、１３４．６、１
   ３１．８、１２８．２、８０．１、７３．０、６３．０
   、６２．５、６０．５、５５．５、５５．２、５４．５
   、４２．１、４０．２、３９．４、３５．１、３４．７
   、３３．１、３２．４、３１．９、２９．７、２８．９
   、２８．０、２６．８、２０．５、２０．３、１９．７
   、１９．５、１９．４、１８．８、１７．３、１５．８
   。 （２）トリコデルマ属に属し、抗生物質ＴＡＮ−９２８
   を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物
   中に抗生物質ＴＡＮ−９２８を生成蓄積せしめ、これを
   採取することを特徴とする抗生物質ＴＡＮ−９２８また
   はその塩の製造法。 （３）抗生物質ＴＡＮ−９２８を生産する能力を有する
   トリコデルマ・オーレオビリデ。