CN110438115A - 一种提高铅DNAzyme稳定性的固定化酶方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于环境监测技术领域,提供一种提高铅DNAzyme稳定性的固定化酶方法及应用。在常温常压下,利用仿生矿化的方法,在水相中合成沸石咪唑酯骨架‑8固定化的生物复合材料。相对于游离的DNAzyme来说,ZIF‑8保护层增加了DNAzyme对抗极端环境的能力,如DNA水解酶,扩展了铅DNAzyme的检测领域。建立了基于DNAzyme@ZIF‑8生物复合材料的荧光传感方法,实现了铅离子的灵敏检测。
Description
技术领域
本发明属于环境监测技术领域,涉及一种提高铅DNAzyme稳定性的固定化酶方法及应用。
背景技术
由于工业活动的增加,自然环境中的重金属污染逐渐成为一个严重的问题。通常,金属离子可分为必需离子和非必要离子。非必需的重金属,如镉(Cd),汞(Hg),砷(As)和铅(Pb),即使微量接触,也具有高毒性和致癌性。虽然需要铜(Cu)和锌(Zn)等基本金属来维持生命活动,但这些必需金属在过量时也是有毒的。此外,由于它们不可生物降解和在食物链中的积累的性质,对人类健康和环境都可能会构成严重威胁。因此,必须在环境、食品和饮用水中量化这些金属浓度。
传统的定量方法,如原子吸收/发射光谱,电感耦合等离子体/原子发射光谱和冷气相原子荧光光谱(CVAFS),已广泛应用于检测金属离子。虽然这些技术具有高选择性和敏感性,但它们需要复杂且昂贵的仪器,尤其是用于从水样中提取金属离子的复杂化学过程,金属离子的形态可能会发生变化。此外,传统方法不能用作现场原位实时检测,同时大规模测定重金属可能会耗费大量人力、财力和实践。相比之下,传感器具有很大的现场原位实时检测多种重金属的潜力。纳米技术的快速发展为传感器的性能(灵敏度,选择性和再现性)提高提供了新的机会。
最近,已经对DNAzymes进行了许多研究,特别是具有RNA切割性能的DNAzymes。DNAzymes最重要的实际应用之一是金属离子检测,因为它们具有很高的金属离子选择性,例如报道的Pb2+DNAzyme对于Pb2+的选择性是其他竞争金属离子选择性的大约400,000倍(Chem.Commun.46(2010)3896–3898),UO2 2+DNAzyme对于UO2 2+的选择性是其他竞争金属离子选择性的约1,000,000倍(ChemBioChem 10(2009)486–492)。这种金属选择性可以在许多其他DNA酶中找到。因此,利用DNAzymes已经构建了很多荧光、比色和电化学传感器,适用于各种金属离子的检测,如Hg2+,Pb2+,UO2 2+,Mg2+,Zn2+等。然而天然酶对外界环境太敏感而不能应用于各种催化领域,特别是在工业中。实际上,有一系列因素导致酶失活,例如,极端pH(强酸和强碱),热,蛋白酶,表面活性剂等,DNAzymes也是如此。因此,酶的稳定性的提高是非常值得关注的。通常,有三种方法可以改善酶的稳定性:固定化,非共价修饰,化学修饰。在这三种方法中,由于普遍适用性,分离方便性,固定化是最重要和最实用的方法。迄今为止,如石墨烯、水凝胶、有机微粒、介孔二氧化硅、金属有机骨架(MOFs)等具有大比面积和空隙体积的各种纳米材料是酶固定化的理想材料(Nature Catalysis,2018,1(9):689-695)。
本发明中利用沸石咪唑酯骨架-8的多孔结构,实现了对铅DNAzyme的固定(DNAzyme@ZIF-8)。沸石咪唑酯骨架结构(ZIFs)材料作为MOFs材料的一类,是由过渡金属原子与咪唑或咪唑衍生物连接而生成的一类新型的、具有沸石拓扑结构的多孔材料,为固定化天然酶提供了有效的结合位点。ZIFs不仅具有MOFs的优点,而且同MOFs材料相比,具有更优良的热稳定性和水溶液稳定性。通过ZIF-8固定DNAzyme提升了DNAzyme的环境稳定性,建立了一种通用型的荧光分析方法用于铅离子的检测。
发明内容
本发明解决了DNAzyme存在的稳定性不足的缺陷,通过沸石咪唑酯骨架-8(ZIF-8)实现了DNAzyme的固定(DNAzyme@ZIF-8),并将其应用于铅离子的荧光检测。
本发明中,在常温常压下合成了ZIF-8固定化DNAzyme的生物复合材料。相对于游离的DNAzyme来说,ZIF-8保护层增加了DNAzyme对抗极端环境的能力,如DNA水解酶。建立了基于DNAzyme@ZIF-8生物复合材料的荧光传感方法,反应体系的荧光强度在一定范围内与铅离子的浓度正相关,从而为铅离子的定量分析提供依据。
本发明的技术方案:
一种提高铅DNAzyme稳定性的固定化酶方法,步骤如下:
(1)制备铅DNAzyme:将序列1FAM标记的铅DNAzyme底物链及等量序列2BHQ1标记的铅DNAzyme酶链在25-35℃下混合均匀合后,放入水浴锅中,加热至95℃,保持5-10min后自然冷却至室温,形成部分杂交的双链铅DNAzyme;
(2)制备沸石咪唑酯骨架-8固定化铅DNAzyme(DNAzyme@ZIF-8):DNAzyme与2-甲基咪唑在水中充分搅拌混合,形成混合液A;Zn(NO3)2·6H2O溶于水中形成溶液B;之后,将混合液B缓慢倒入混合液A中,得到的混合液在室温下搅拌12-24h;其中Zn(NO3)2·6H2O和2-甲基咪唑的摩尔比例为1:35-1:140;用高纯水和乙醇将得到的混合物离心清洗3-5次后冷冻干燥12-24h得到粉末状物质,将其研磨并置于-4~-20℃的条件下冷冻保存;
一种提高铅DNAzyme稳定性的固定化酶的应用,铅离子的定量检测:将上一步制备的DNAzyme@ZIF-8材料与HEPES缓冲液混合,其中,HEPES缓冲液中HEPES的浓度为20-50mM,Nacl的浓度为20-50mM,MgCl2的浓度为1-5mM,HEPES缓冲液的pH=7-8;之后向混合液中加入50-550nM硝酸铅溶液,混合物在25-37℃下反应2-4h后,转移到石英比色皿中,记录体系荧光强度随发射波长的变化曲线。
所述的DNA序列如下:
序列1:5’-FAM-CTCACTAT/rA/GGAAGAGATGATGTCTGT-3’;
序列2:5’-ACAGACATCATCTCTGAAGTAGCGCCGCCGTATAGTGAG-BHQ1-3’。
本发明的有益效果:
(1)当加入的2-甲基咪唑和Zn(NO3)2·6H2O摩尔比例为1:70时,铅DNAzyme浓度为25μM,反应时间和温度分别为4h和37℃时,该沸石咪唑酯骨架-8固定化铅DNAzyme的反应体系对铅离子的线性检测范围在50-550nM,检测限为39.27nM。
(2)本发明中沸石咪唑酯骨架-8固定铅DNAzyme的方法是在常温常压下通过简单的物理搅拌进行的,不需要高压、高温等复杂的合成条件。
(3)该沸石咪唑酯骨架-8固定化铅DNAzyme的荧光检测体系可以通过更换DNAzyme的种类,实现其他目标物的检测,即具有通用性检测的功能。
(4)本发明中沸石咪唑酯骨架-8固定铅DNAzyme的方法增加了铅DNAzyme对抗DNA水解酶的稳定性,使其可在水体中检测铅离子的同时,扩宽其应用范围到细胞中铅离子的检测。
附图说明
图1是本发明所述的基于沸石咪唑酯骨架-8固定铅DNAzyme的制备过程与检测机理示意图。
图2是本发明获得的沸石咪唑酯骨架-8固定铅DNAzyme与游离的铅DNAzyme经DNase I处理后稳定性的对比。
图3是本发明获得的沸石咪唑酯骨架-8固定铅DNAzyme应用于铅离子检测的标准工作曲线。
图4是本发明获得的沸石咪唑酯骨架-8固定铅DNAzyme应用于铅离子检测的标准线性曲线。
图中:
具体实施方式
以下结合技术方案具体说明本发明的具体实施方式。
实施例1
配置水样中铅离子含量的测定:
(1)铅DNAzyme的制备:
将50μL 50μM序列1FAM标记的铅DNAzyme底物链及等量等浓度序列2BHQ1标记的铅DNAzyme酶链进行混合后,放入水浴锅中,加热至95℃,保持5分钟后自然冷却至室温,形成部分杂交的双链铅DNAzyme。
(2)制备沸石咪唑酯骨架-8固定化铅DNAzyme(DNAzyme@ZIF-8):
取0.28g 2-甲基咪唑溶解于1ml水中,与步骤(1)中的铅DNAzyme充分搅拌混合,形成混合液A。取0.015g Zn(NO3)2·6H2O溶于0.1mL水中,充分搅拌,形成溶液B。之后,将混合液B快速倒入混合液A中,得到的混合液在室温下搅拌12h。之后,混合物经高纯水离心清洗3次,冷冻干燥24h,将得到的粉末研磨,-20℃下冷冻保存。
(3)铅离子的定量检测:
取不同浓度的硝酸铅溶液(50nM-5mM),室温下与50mM的HEPES缓冲液(50mMNaCl,5mM MgCl2,pH=7.60)混合。加入一定量DNAzyme@ZIF-8,使反应体系中铅DNAzyme的终浓度为100nM。
(4)检测方法:步骤(3)中的混合物在37℃下反应4h后,转移到石英比色皿中,记录体系荧光强度随铅离子浓度的变化曲线(图3)。
(5)标准工作曲线的绘制
步骤(4)中随着样品中铅离子浓度的增加,反应体系在522nm处的荧光强度不断增加,在50-550nM范围内,反应体系的荧光强度与铅离子浓度有良好的线性关系,线性相关系数R2=0.99(图4)。
(6)配置水样中铅离子的测定:
用HEPES缓冲溶液配置铅离子浓度为50nM的水样。将样品用于步骤(3)方法进行检测,检测结果与步骤(5)得到的标准工作曲线对比,计算出铅离子的浓度。实验结果测出卡那霉素含量56.125nM,回收率为112.25%。相对标准偏差RSD为3.25%(n=5)。
实施例2
配置水样中铅离子含量的测定:
(1)铅DNAzyme的制备:
将50μL 50μM序列1FAM标记的铅DNAzyme底物链及等量等浓度序列2BHQ1标记的铅DNAzyme酶链进行混合后,放入水浴锅中,加热至95℃,保持5分钟后自然冷却至室温,形成部分杂交的双链铅DNAzyme。
(2)制备沸石咪唑酯骨架-8固定化铅DNAzyme(DNAzyme@ZIF-8):
取0.28g 2-甲基咪唑溶解于1ml水中,与步骤(1)中的铅DNAzyme充分搅拌混合,形成混合液A。取0.015g Zn(NO3)2·6H2O溶于0.1mL水中,充分搅拌,形成溶液B。之后,将混合液B快速倒入混合液A中,得到的混合液在室温下搅拌12h。之后,混合物经高纯水离心清洗3次,冷冻干燥24h,将得到的粉末研磨,-20℃下冷冻保存。
(3)沸石咪唑酯骨架-8固定化铅DNAzyme(DNAzyme@ZIF-8)的酶切稳定性研究:分别取不同浓度的DNAzyme@ZIF-8与等物质的量的铅DNAzyme与1μL浓度为6U DNase I在37℃下孵化10min,测定其抗DNase I的能力,铅DNAzyme在DNase I处理后,荧光逐渐恢复;DNAzyme@ZIF-8荧光强度基本保持稳定。铅DNAzyme及其酶复合物经过DNase I处理后,利用PBS(10mM,pH=7.40)离心(8000r/min)洗涤3次。之后,测定铅DNAzyme及其酶复合物处理前后催化活性的变化,分别取铅DNAzyme、DNAzyme@ZIF-8与50mM的HEPES缓冲液(50mMNaCl,5mM MgCl2,pH=7.60)混合后,加入1μM铅离子反应4h后转移到石英比色皿中,室温下测量体系在522nm处的荧光强度,并与其未处理前原始荧光强度对比。铅DNAzyme经DNase I处理后已失去活性,而DNAzyme@ZIF-8由于ZIF-8的保护,仍能保持原活性的91.3±1.4%。
(4)铅离子的定量检测:
取不同浓度的硝酸铅溶液(50nM-5mM),室温下与50mM的HEPES缓冲液(50mMNaCl,5mM MgCl2,pH=7.60)混合。加入一定量DNAzyme@ZIF-8,使反应体系中铅DNAzyme的终浓度为100nM。
(5)检测方法:步骤(3)中的混合物在37℃下反应4h后,转移到石英比色皿中,记录体系荧光随铅离子浓度的变化曲线(图3)。
(6)标准工作曲线的绘制
步骤(4)中随着样品中铅离子浓度的增加,反应体系在522nm处的荧光强度不断增加,在50-550nM范围内,反应体系的荧光强度与铅离子浓度有良好的线性关系,线性相关系数R2=0.99(图4)。
(7)配置水样中铅离子的测定:
用HEPES缓冲溶液配置铅离子浓度为500nM的水样。将样品用于步骤(4)方法进行检测,检测结果与步骤(6)得到的标准工作曲线对比,计算出铅离子的浓度。实验结果测出卡那霉素含量521.15nM,回收率为104.23%。相对标准偏差RSD为1.85%(n=5)。
Claims (2)
1.一种提高铅DNAzyme稳定性的固定化酶方法,其特征在于,步骤如下:
(1)制备铅DNAzyme:将序列1 FAM标记的铅DNAzyme底物链及等量序列2 BHQ1标记的铅DNAzyme酶链在25-35℃下混合均匀后,放入水浴锅中,加热至95℃,保持5-10min后自然冷却至室温,形成部分杂交的双链铅DNAzyme;
(2)制备沸石咪唑酯骨架-8固定化铅DNAzyme:DNAzyme与2-甲基咪唑在水中充分搅拌混合,形成混合液A;Zn(NO3)2溶于水中形成溶液B;之后,将溶液B缓慢倒入混合液A中,得到的混合液在室温下搅拌12-24h;其中Zn(NO3)2和2-甲基咪唑的摩尔比为1:35-1:140;依次用高纯水和乙醇将得到的混合物离心清洗3-5次后冷冻干燥12-24h得到粉末状物质DNAzyme@ZIF-8,将其研磨并置于-4~-20℃的条件下冷冻保存;
所述的序列1:5’-FAM-CTCACTAT/rA/GGAAGAGATGATGTCTGT-3’;
所述的序列2:5’-ACAGACATCATCTCTGAAGTAGCGCCGCCGTATAGTGAG-BHQ1-3’。
2.一种提高铅DNAzyme稳定性的固定化酶的应用,其特征在于,水样中铅离子的定量检测:将DNAzyme@ZIF-8材料与HEPES缓冲液混合,其中,HEPES缓冲液中HEPES的浓度为20-50mM,NaCl的浓度为20-50mM,MgCl2的浓度为1-5mM,HEPES缓冲液的pH=7-8;之后向混合液中加入50-550nM硝酸铅溶液,混合物在25-37℃下反应2-4h后,转移到石英比色皿中,记录体系荧光强度随发射波长的变化曲线。
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