CN111253930A - 一种荧光金纳米簇及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种金纳米簇及制备方法和应用,制备方法为:将木聚糖酶溶液与HAuCl4溶液进行混合,涡旋器充分混匀5~10min;加NaOH溶液调节pH值为8~13,涡旋器再次混匀5~10min;然后在水浴锅避光反应6~24h可得。本发明的金纳米簇对Hg2+响应灵敏,检测体系操作简便、可控、耗时短,可应用于环境水样和土样中Hg2+含量的检测。同时本发明还提供了一种利用荧光法检测氯霉素的方法,通过金纳米簇荧光探针与标准曲线结合,使得检测过程简便快捷,检测成本低,可用于牛奶和肉类中氯霉素含量的检测。该方法具有检测限低,检测范围广,灵敏度高等优点,可为动物性食品中氯霉素含量的检测提供新思路。
Description
技术领域
本发明属于纳米簇制备领域,具体涉及一种荧光金纳米簇及其制备方法与应用。
背景技术
木聚糖是一种多聚五碳糖,是植物细胞中主要的半纤维素成分。木聚糖酶(Xylanase)可由细菌、放线菌、真菌等多种微生物产生,主要是由β-1,4-D-内切木聚糖酶和β-1,4-D-内切木糖苷酶组成。木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚木糖和木糖的专一性复合水解酶系。随着生物技术的不断发展和进步,木聚糖酶被用于不同的工业过程,包括作为小麦面粉的添加剂以改良面制品色香味的质量、结合果胶酶和纤维素酶澄清果汁和葡萄酒、作为饲料工业的食品添加剂等。除此之外,木聚糖酶在造纸和纺织等行业也有良好的应用,从而证明了对木聚糖酶的研究是合理的。如何开发木聚糖酶的新的应用,也是目前需要解决的一个问题。
氯霉素(Chloroamphenicol,Cap)是一种有效的广谱抗生素,常用于动物各种传染性疾病的治疗,对多种病原菌有较强的抑制作用,被广泛应用于家畜和家禽的疾病预防和治疗。但由于氯霉素对人体产生严重的毒副作用,是多个国家禁止使用的兽用药物,而我国农业部公告第235号《动物性食品中兽药最高残留限量》附录4也规定氯霉素在所有动物性食品中是禁止使用的药物,并不得检出。传统的氯霉素残留检测技术包括微生物学方法、放射免疫法、色谱法和酶免疫分析法等方法存在特异性差、灵敏度差、应用范围窄、仪器昂贵、操作繁琐等问题。因此,建立灵敏度高、特异性强、简便易行的氯霉素残留的检验方法是非常必要的。
发明内容
为了解决上述技术问题,本发明提供一种荧光金纳米簇及其制备方法和应用。本发明将木聚糖酶与HAuCl4反应,成功制备了一种木聚糖酶金纳米簇荧光探针(Xylanase-AuNCs)。制备方法过程简单,易操作,成本低。
本发明的一个目的是提供一种荧光金纳米簇,其由木聚糖酶包裹,其粒径小于5nm,其荧光最大激发波长为480nm,最大发射波长为630nm。
本发明的另一个目的是提供所述荧光金纳米簇的制备方法,其包括如下步骤:
一、制备浓度为0.25-1mM的木聚糖酶水溶液;
二、制备浓度为25-100mM的HAuCl4的水溶液;
三、将HAuCl4溶液加入木聚糖酶水溶液中,使其中木聚糖酶与HAuCl4两者的摩尔为0.5:1-3:1,充分混匀;
四、向步骤三得到的混合溶液中添加NaOH调节溶液pH值至8-13,涡旋器充分混匀5-10min;
五、将步骤四得到的混合溶液在25℃~65℃条件下水浴6~24h后即得。
所述步骤一中的木聚糖酶水溶液的浓度为0.25mM;步骤二中的HAuCl4水溶液浓度为25mM;步骤三中的木聚糖酶与HAuCl4两者的摩尔为1:1;
所述步骤四中调节溶液pH值至12,所用NaOH为浓度为1M的NaOH的水溶液;步骤五的水浴温度为37℃,水浴时间为12h。
本发明还有一个目的是提供所述的荧光金纳米簇在Hg2+检测中的应用。
本发明发现Hg2+能够使本发明制备的纳米簇的荧光淬灭。通过对Hg2+进行浓度梯度检测发现,木聚糖酶金纳米簇对Hg2+具有特异的选择性和高敏感性。
优选其检测Hg2+的线性范围为0.25μM-3μM,检测限为0.03μM。
优选其应用范围包括在环境水样和土样中的Hg2+的检测。
本发明对Hg2+检测采用荧光分光光度法,首先向金纳米簇体系中加入一系列不同浓度的Hg2+溶液,优选检测标准体系为1mL,其中不同浓度的Hg2+50μL,Xylanase-Au NCs 50μL,加水补足至1mL,25℃水浴5min后,在激发光波长为480nm的条件下,检测溶液在610nm的发射光的峰高。
本发明还有一个目的是提供所述的荧光金纳米簇在氯霉素检测中的应用。
本发明通过实验发现氯霉素能够使本发明的纳米簇的荧光淬灭。通过对氯霉素进行浓度梯度检测发现,木聚糖酶金纳米簇对氯霉素具有特异的选择性和高敏感性。
优选其检测氯霉素的线性范围为25μg/mL-170μg/mL,检测限为3.85μg/mL。
优选其应用范围包括牛奶和肉类中氯霉素的检测。所述肉类包括猪肉、牛肉、鸡肉、鱼肉等。
本发明对氯霉素检测采用荧光分光光度法,首先向金纳米簇体系中加入一系列不同浓度的氯霉素溶液,优选检测标准体系为1mL,其中不同浓度的氯霉素50μL,Xylanase-AuNCs 50μL,加水补足至1mL,25℃水浴5min后,在激发光波长为480nm的条件下,检测溶液在610nm的发射光的峰高。
有益效果
1、本发明将木聚糖酶与HAuCl4反应,成功制备了一种木聚糖酶金纳米簇荧光探针(Xylanase-Au NCs)。制备方法过程简单,易操作,成本低。本发明制备的木聚糖酶金纳米簇,既可以应用于实际样品中氯霉素的检测,又可以应用于实际样品中Hg2+的检测,检测过程均操作简便、检测效率高、检测结果灵敏度强、准确度高,检测范围宽,无需借助其他精密贵重仪器。
2、本发明提供的氯霉素检测方法的建立对市场监控动物性产品质量也具有重要意义。
附图说明
图1为实施例1所制的Xylanase-Au NCs的透射电镜图。
图2为实施例1所制的Xylanase-Au NCs的荧光光谱图。
图3为实施例1所制的Xylanase-Au NCs的紫外-可见吸收光谱图。
图4为实施例1所制的Xylanase-Au NCs的红外光谱图。
图5为实施例1所制的Xylanase-Au NCs应用于检测Hg2+的荧光光谱图。
图6为实施例1所制的Xylanase-Au NCs应用于检测Hg2+的线性关系图。
图7为实施例1所制的Xylanase-Au NCs应用于检测氯霉素的荧光光谱图。
图8为实施例1所制的Xylanase-Au NCs应用于检测氯霉素的线性关系图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步阐述,举例证明本发明可以实施,通过向本领域中的技术人员完整介绍本发明,使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现,其保护范围并非仅限于文中提到的实施例,本文的附图和说明本质上是举例说明而不是限制本发明。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中的木聚糖酶购自上海源叶生物科技有限公司。其它所用的原材料、试剂和设备等,如无特殊说明,均可从商业途径得到或已公开。
下面结合实施例对本发明做详细的说明。
实施例1:Xylanase-Au NCs的制备
取木聚糖酶加入超纯水中制备成0.25mM的木聚糖酶溶液,制备浓度为25mM的HAuCl4水溶液加入上述木聚糖酶溶液中,使其中的木聚糖酶和HAuCl4的摩尔质量比为1:1。涡旋器充分混匀5min后加入1M浓度的NaOH的水溶液,使混合溶液的pH值为12,涡旋器再次混匀5min。将Eppendorf管在避光的条件下置于37℃水浴锅中12h,得到浓度为0.16mM的金纳米簇的聚合物,5,000rpm离心10min,取上清液置于4℃冰箱避光保存备用。
本实施例金纳米簇的透射电镜图(TEM)如图1所示,从图1可知,金纳米簇大小均一呈分散状态,粒径小于5nm;
本实施例金纳米簇的荧光激发发射光谱图如图2所示,从图2中可知,荧光金纳米簇的最大激发波长在480nm处,最大发射波长在630nm处;
本实施例铂纳米簇的紫外吸收光谱图如图3所示,从图3中可知,实施例1所制的Xylanase-Au NCs在300nm处具有明显的吸收峰,而原料Xylanase在此处没有最大吸收,证明实施例1所制的Xylanase-Au NCs和Xylanase本身不是同一种物质。
本实施例金纳米簇在自然光下为浅黄色,在365nm的紫外灯下为红色;
本实施例金纳米簇的红外光谱图如图4所示,Xylanase和实施例1所制的Xylanase-Au NCs在1000-1500cm-1处有明显不同,证明实施例1所制的Xylanase-Au NCs和Xylanase本身不是同一种物质。
实施例2:Xylanase-Au NCs的制备
取木聚糖酶加入超纯水中制备成1mM的木聚糖酶溶液,制备浓度为25mM的HAuCl4水溶液加入上述木聚糖酶溶液中,使其中的木聚糖酶和HAuCl4的摩尔质量比为0.8:1。涡旋器充分混匀5min后加入1M的NaOH溶液,使混合溶液的pH值为10,涡旋器再次混匀5min。将Eppendorf管在避光的条件下置于37℃水浴锅中12h,得到金纳米簇的聚合物,5,000rpm离心10min,取上清液置于4℃冰箱避光保存备用。
实施例3:Xylanase-Au NCs的制备
取木聚糖酶加入超纯水中制备成1mM的木聚糖酶溶液,制备浓度为25mM的HAuCl4的水溶液加入上述木聚糖酶溶液中,使其中的木聚糖酶和HAuCl4的摩尔质量比为1.5:1。涡旋器充分混匀5min后加入1M浓度的NaOH溶液,使混合溶液的pH值为12,涡旋器再次混匀5min。将Eppendorf管在避光的条件下置于30℃水浴锅中24h,得到金纳米簇的聚合物,5,000rpm离心10min,取上清液置于4℃冰箱避光保存备用。
实施例4:Xylanase-Au NCs的制备
取木聚糖酶加入超纯水中制备成0.5mM的木聚糖酶溶液,制备浓度为25mM的HAuCl4的水溶液加入上述木聚糖酶溶液中,使得木聚糖酶和HAuCl4的摩尔质量比为2:1。涡旋器充分混匀5min后加入1M浓度的NaOH溶液,使混合溶液的pH值为10,涡旋器再次混匀5min。将Eppendorf管在避光的条件下置于65℃水浴锅中6h,得到金纳米簇的聚合物,5,000rpm离心10min,取上清液置于4℃冰箱避光保存备用。
实施例5:Xylanase-Au NCs的制备
取木聚糖酶加入超纯水中制备成0.5mM的木聚糖酶溶液,制备浓度为25mM的HAuCl4的水溶液加入上述木聚糖酶溶液中,使其中的木聚糖酶和HAuCl4的摩尔质量比为3:1。涡旋器充分混匀5min后加入1M浓度的NaOH溶液,使混合溶液的pH值为12,涡旋器再次混匀5min。将Eppendorf管在避光的条件下置于37℃水浴锅中20h,得到金纳米簇的聚合物,5,000rpm离心10min,取上清液置于4℃冰箱避光保存备用。
实施例6:实施例1所制的Xylanase-Au NCs应用于Hg2+离子的检测
向金纳米簇体系中加入一系列不同浓度的Hg2+离子溶液,其中不同浓度Hg2+溶液50μL,Xylanase-Au NCs 50μL,加超纯水补足至1mL,25℃水浴5min后,在激发光波长为480nm的条件下,检测溶液在610nm的发射光的峰高。结果显示,Xylanase-Au NCs荧光淬灭程度随Hg2+离子浓度的增大而增强(图5),其相对荧光强度线性检测曲线为y=0.26259x+1.08854(R2=0.99239),所构建的检测Hg2+离子的线性范围为0.25μM-3μM,其检测限为0.03μM(图6)。结果表明,实施例1所制的Xylanase-Au NCs对Hg2+离子具有高度选择性,因此本发明所制的金纳米簇荧光探针同样可用于分析检测实际样品中Hg2+离子的含量。
实施例7:实施例1所制的Xylanase-Au NCs对环境样品的检测
为了更清楚的说明本发明实施例的应用方案,证实Xylanase-Au NCs作为探针检测Hg2+的实用性,下面将详细介绍Hg2+对实际水样检测过程。分别从芜湖市采集了长江水、镜湖水和自来水样本以及芜湖县的葡萄种植园的土样和芜湖县的农田土样。将取自不同环境中的3个水样分别10,000rpm离心10min,0.22μm滤膜抽滤,并储存在4℃冰箱中备用。将上述不同环境中的2个土样分别置于60℃烘箱烘干2h,加去离子水稀释10倍溶解后10,000rpm离心10min,取上清液储存在4℃冰箱中备用,得两个土样的待测样品。加上上述3个环境水样的待测样品共计制得5个待测样品。
(1)实际环境样品的检测:
检测体系为1mL,其中50μL Xylanase-Au NCs溶液,950μL的待测样品;将此体系于25℃水浴5min,在激发光波长为480nm的条件下,检测溶液在610nm的发射光的峰高;将测试结果带入实施例6绘制的标准曲线中计算。
将上述五种待测样品分别按照上述方法进行检测,实验独立重复3次。五种待测样品的检测结果均为0μM。
(2)检测加标回收率:
分别在0.35μM、0.5μM和0.7μM的Hg2+浓度下,对上述五种待测样品进行加标样中Hg2+的回收率检测。检测标准体系为1mL,其中50μL Xylanase-Au NCs,900μL待测样品,50μL不同浓度的Hg2+溶液,25℃水浴5min,在激发光波长为480nm的条件下,检测溶液在610nm的发射光的峰高,实验独立重复3次。表1是标准加入不同浓度系列的Hg2+后的结果,可以看出,回收率可以达到95%以上。说明该方法在实际水样和土样中的应用效果良好。
表1 Xylanase-Au NCs对各样品中Hg2+的检测
实施例8:实施例1所制的Xylanase-Au NCs应用于氯霉素的检测
向金纳米簇体系中加入一系列不同浓度的氯霉素溶液,其中不同浓度的氯霉素溶液50μL,Xylanase-Au NCs 50μL,加超纯水补足至1mL,25℃水浴5min后,在激发光波长为480nm的条件下,检测溶液在610nm的发射光的峰高。结果显示,Xylanase-Au NCs荧光淬灭程度随氯霉素浓度的增大而增强(图7),其相对荧光强度线性检测曲线为y=0.00307x+0.92781(R2=0.99132),所构建的检测氯霉素的线性范围为25μg/mL-170μg/mL,其检测限为3.85μg/mL(图8)。结果表明,实施例1所制的Xylanase-Au NCs对氯霉素具有高度选择性,因此本发明所制的金纳米簇荧光探针同样可用于分析检测实际样品中氯霉素的含量。
实施例9:实施例1所制的Xylanase-Au NCs对纯牛奶和肉类的检测
为了更清楚的说明本发明实施例的应用方案,证实Xylanase-Au NCs作为探针检测氯霉素的实用性,下面将详细介绍氯霉素对纯牛奶和肉类样品的检测过程。分别从芜湖市菜市场购买了纯牛奶,鱼肉,牛肉,鸡肉和猪肉。将纯牛奶样品直接稀释400倍后储存在4℃冰箱备用。将上述四种不同的肉类样品分别与100mM的磷酸盐缓冲液(pH=7.0~7.2)等体积混合后置于绞肉机中搅碎,将肉浆转移至新的离心管中置于4℃冰箱保存,静置一段时间后取上清液10,000rpm离心10min,最后将四种样品的上清液分别通过0.45mm膜滤器过滤,稀释400倍后于4℃冰箱中保存备用。
(1)实际样品的检测:
检测体系为1mL,其中50μL Xylanase-Au NCs溶液,950μL待测的纯牛奶稀释液或肉类稀释液;将此体系于25℃水浴5min,在激发光波长为480nm的条件下,检测溶液在610nm的发射光的峰高;将测试结果带入实施例8绘制的标准曲线中计算。
将纯牛奶稀释液或肉类稀释液按照上述方法进行检测,实验独立重复3次。五种稀释液样品的检测结果均为0μg/mL。
(2)检测加标回收率:
分别在25μg/mL、50μg/mL和70μg/mL的氯霉素浓度下,对上述五种稀释液样品进行加标样中氯霉素的回收率检测。检测标准体系为1mL,其中50μL Xylanase-Au NCs,900μL的稀释液样品,50μL不同浓度的氯霉素溶液,25℃水浴5min,在激发光波长为480nm的条件下,检测溶液在610nm的发射光的峰高,实验独立重复3次。表2是标准加入不同浓度系列的氯霉素后的结果,可以看出,回收率可以达到95%以上。说明该方法在实际样品中的应用效果良好。
表2 Xylanase-Au NCs对各样品中氯霉素的检测
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种荧光金纳米簇,其特征在于其由木聚糖酶包裹,其粒径小于5nm,其荧光最大激发波长为480nm,最大发射波长为630nm。
2.根据权利要求1所述的荧光金纳米簇的制备方法,其特征在于所述方法包括如下步骤:
一、制备浓度为0.25-1mM的木聚糖酶水溶液;
二、制备浓度为25-100mM的HAuCl4的水溶液;
三、将HAuCl4溶液加入木聚糖酶水溶液中,使其中木聚糖酶与HAuCl4两者的摩尔为0.5:1-3:1,充分混匀;
四、向步骤三得到的混合溶液中添加NaOH调节溶液pH值至8-13,涡旋器充分混匀5-10min;
五、将步骤四得到的混合溶液在25℃~65℃条件下水浴6~24h后即得。
3.根据权利要求2所述的荧光金纳米簇的制备方法,其特征在于所述步骤一中的木聚糖酶水溶液的浓度为0.25mM;步骤二中的HAuCl4水溶液浓度为25mM;步骤三中的木聚糖酶与HAuCl4两者的摩尔为1:1。
4.根据权利要求2所述的荧光金纳米簇的制备方法,其特征在于所述步骤四中调节溶液pH值至12,所用NaOH为浓度为1M的NaOH的水溶液;步骤五的水浴温度为37℃,水浴时间为12h。
5.根据权利要求1至4任意之一所述的荧光金纳米簇在Hg2+检测中的应用。
6.根据权利要求5所述的荧光金纳米簇在Hg2+检测中的应用,
其特征在于其检测Hg2+的线性范围为0.25μM-3μM,检测限为0.03μM。
7.根据权利要求6所述的荧光金纳米簇在Hg2+检测中的应用,其特征在于应用范围包括在环境水样和土样中的Hg2+的检测。
8.根据权利要求1-4任意之一所述的荧光金纳米簇在氯霉素检测中的应用。
9.根据权利要求8所述的荧光金纳米簇在氯霉素检测中的应用,其特征在于其检测氯霉素的线性范围为25μg/mL-170μg/mL,检测限为3.85μg/mL。
10.根据权利要求9所述的荧光金纳米簇在氯霉素检测中的应用,其特征在于在其应用范围包括牛奶和肉类中氯霉素的检测。
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