CN110484594B - 一种样品中抗菌药的检测方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种样品中抗菌药的检测方法及应用。所述方法包括将样品和空白对照分别采用酸性水溶液、水、碱性水溶液进行提取，得到待测样品提取液和对照提取液，然后分别检测待测样品提取液和对照提取液的最小抑菌浓度(MIC)，并进行比较，即可得知是否存在抗菌药；所述样品为植物提取物或含有植物提取物的添加剂；所述空白对照是与所述样品具有相同植物提取物的其过饱和溶液。本发明针对样品与抗菌药在酸、碱水溶液中溶解度的差异，通过测定不同pH值提取液的最小抑菌浓度，并与对照提取液的MIC进行比较，即可判断样品中是否加有抗菌药，该方法操作简单，方便快捷，成本低，可快速对植物提取物类添加剂或保健药物中是否添加抗菌药进行排查。

Description

一种样品中抗菌药的检测方法及应用
技术领域
本发明涉及药物检测技术领域，更具体地，涉及一种样品中抗菌药的检测方法。
背景技术
植物进行光合作用后，细胞分泌芳香分子，并聚集成香囊，散布在花瓣、叶子或树干上，将香囊提炼萃取后，即为“植物精油”，又称植物提取物。植物提取物因为其种类众多、作用广，其应用价值高，在日常生活中应用的较为普遍。美国食品香料与萃取制造者协会(FEMA)认定，天然植物精油为安全无公害物质。
植物精油具有促进动物采食、提高生产性能、抗氧化和增强机体免疫等生物功能。例如，Marcincak等发现饲粮中添加止痢草精油42天后肉鸡平均体重比对照组提高了4.1％，在饲粮中添加0.5％的迷迭香或百里香叶子，可提高鸡的重量及增重，改善饲料报酬。Ali等指出在产蛋鸡饲粮中添加0.25％百里香可将种蛋受精力和孵化率提高1.77％、4.96％，研究还发现产蛋期添加植物提取物止痢草、百里香、迭迷香或者姜黄能够提高蛋鸡的生产性能，增加产蛋量、蛋重，提高饲料转化率。因此，目前将植物精油作为饲料添加剂、食品添加剂或者制备成为保健药物较为常见。
随着兽用抗菌药使用减量化行动的开展，药物饲料添加剂将在2020年全面退出，市场对饲用抗生素替代品及功能性饲料添加剂产品产生更迫切的需求，无抗的植物精油类添加剂受到重要的关注，但是，目前市面上植物精油类产品鱼龙混杂，一些企业在标榜的无抗植物提取物产品中违规添加抗菌药，给保健品市场、饲料生产厂家与养殖场带来很大风险。
为了保障植物提取物类产品的推广使用并符合无抗的安全要求，需要对该类产品进行是否含有抗菌药的检测筛查。针对植物提取物类产品，现有的检测方法适用于准确知道样品中具体含有哪一种抗菌药，这样的检测不仅需要采用专用、昂贵、大型的设备，检测成本较高，耗时较长，无法同时进行多种抗菌药的初级筛查，也很难实现大批量样品的快速简易检测，从而无法快速地判断植物提取物类产品中是否违规添加抗菌药，在实际推广应用中，在进行专业准确检测样品中含有多少量的、哪一种的抗菌药之前，更需要的是简易快速了解样品中是否添加有抗菌药(违规添加有效量)，对于现有技术所开展的样品中具体含有哪一种抗菌药以及抗菌药的含量多少的检测手段，因为检测需求、以及需要专用技术和设备等原因，现有检测方法无法推广实施。
因此，针对植物提取物，研究出一种能够简单、快速且能大批量同时筛查判断多种抗菌药的检测方法，具有十分重要实际推广应用意义。
发明内容
本发明的目的在于针对目前市场上在含有植物提取物，或其添加剂，或者其他产品中违规人为添加抗菌药物的现象、现有检测技术的不足，提供一种样品中抗菌药的检测方法。本发明针对植物提取物与抗菌药在酸、碱水溶液中溶解度的差异和最小抑菌浓度(MIC)的差别，用不同pH值水溶液对样品中抗菌药进行提取，通过比较不同提取液MIC值的差异，判断样品中是否加有抗菌药，该方法操作简单，方便快捷，成本低，不需要采用大型、昂贵的检测设备，可简便地对植物提取物类的微生物发酵饲料、饲用抗生素替代品、功能性饲料添加剂产品及保健品中是否添加抗菌药进行快速判断排查。
本发明的上述目的是通过以下方案予以实现的：
一种样品中抗菌药的检测方法，将样品和空白对照分别采用酸性水溶液、水、碱性水溶液进行提取，得到待测样品提取液和对照提取液，然后分别检测待测样品提取液和对照提取液的MIC值，并进行比较；
当待测样品提取液的MIC值明显小于对照提取液的MIC值时，则证明样品中存在抗菌药；若二者的MIC值相当，或待测样品提取液的MIC值明显大于对照提取液的MIC值时，则证明样品中不存在抗菌药；
所述样品为植物提取物或者含有植物提取物的添加剂；所述空白对照是与所述样品具有相同植物提取物的其过饱和溶液。
本发明所述检测方法是通过采用不同pH值的水溶液提取样品中易溶于水的物质，如抗菌药物，而植物提取物大多数为难溶于水的成分，而且其最小抑菌浓度通常在100μg/mL以上，远远大于一般抗菌药的最小抑菌浓度，因此，当植物提取物中人为添加了未经允许添加的抗菌药时，通过不同pH值的酸、碱溶液提取样品中的抗菌药，比较提取液与未添加抗菌药的纯植物提取物的提取液的MIC值，即可判断植物提取物中是否具有抗菌药的存在。
当样品中人为添加了有效量的抗菌药，则可通过本发明所述方法判断其中违规添加了抗菌药，所述判断过程不仅简单、快速，而且避免了大型设备的使用，检测效率高，而且成本低，为企业在实际生产过程中提供极大的便利。
优选地，所述酸性水溶液的pH值为1～4。
优选地，所述碱性水溶液的pH值为10～14。
优选地，当直接采用水进行提取时，则不需要进行pH调节。
优选地，所述样品为植物提取物或者含有植物提取物的添加剂。
优选地，植物提取物中抗菌药的检测方法包括如下步骤：
S1.取3份待测样品和3份空白对照，分别加入酸性水溶液、水、碱性水溶液进行提取，得到3份待测样品提取液和3份对照提取液；
S2.采用相同的方法检测步骤S1制得的3份待测样品提取液和3份对照提取液的MIC值，并进行比较即可。
优选地，步骤S1中，待测植物提取物与所述酸性水溶液、水或碱性水溶液的质量体积比为：0.04～0.2g/mL。
若酸性水溶液、水或碱性水溶液的添加量太少，则无法充分的提取到抗菌药；若酸性水溶液、水或碱性水溶液的添加量太多，则容易导致提取液中抗菌药的浓度太低，影响检测结果。
优选地，步骤S1是将待测样品或者空白对照，分别加入酸性水溶液、水、碱性水溶液，超声后调节各溶液pH值，然后振荡进行提取，离心处理，分别取水相过滤即得。
优选地，步骤S1中，所述超声提取的时间为10～30min，温度20～60℃。
如植物提取物中存在抗菌药，则超声是为了更充分的提取到抗菌药，但是若温度过高，则容易导致植物提取物中的组分在水溶液中的溶解度增加，则导致提取得到的待检测样品中，除了抗菌药外，植物提取物的含量也较高，最终导致检测结果不准确。
优选地，步骤S1中，所述调节各提取液pH值，其中酸性水溶液调节pH值至1～4，碱性水溶液调节pH至10～14，水溶液不需要调节pH值。
优选地，步骤S1中，振荡的速度为100～350/min，时间为10～30min；离心的转速为4000～8000rpm，时间为5～10min。
优选地，步骤S2中，MIC值的测定采用肉汤稀释法药敏试验进行检测；所述肉汤稀释法药敏试验采用大肠杆菌
Figure BDA0002171494640000041
沙门氏菌
Figure BDA0002171494640000042
或金黄色葡萄球菌
Figure BDA0002171494640000043
等进行检测。
本发明同时还保护所述方法在判断检测植物提取物类添加剂或保健药物中是否添加抗菌药方面的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明针对植物提取物与抗菌药在酸、碱水溶液中溶解度的差异和最小抑菌浓度(MIC)的差别，用不同pH值溶液提取样品中的抗菌药，通过比较样品不同提取液MIC与空白对照提取液MIC的差异，判断样品中是否加有抗菌药，该方法操作简单，方便快捷，成本低，可较简便的对植物提取物类添加剂或者植物提取物类保健药物中是否添加抗菌药进行快速排查。
附图说明
图1为试验例1中肉汤稀释法药敏试验恩诺沙星质控结果图。
图2为试验例2中香芹酚(50μg/mL)色谱图。
图3为试验例2中植物精油酸性水提取液香芹酚色谱图。
图4为试验例2中植物精油水溶液提取液香芹酚色谱图。
图5为试验例2中植物精油碱性水提取液香芹酚色谱图。
图6为试验例2中肉桂醛(20μg/mL)色谱图。
图7为试验例2中植物精油酸性水提取液肉桂醛色谱图。
图8为试验例2中植物精油水溶液提取液肉桂醛色谱图。
图9为试验例2中植物精油碱性水提取液肉桂醛色谱图。
图10为试验例2中百里香酚(50μg/mL)色谱图。
图11为试验例2中植物精油酸性水提取液百里香酚色谱图。
图12为试验例2中植物精油水溶液提取液百里香酚色谱图。
图13为试验例2中植物精油碱性水提取液百里香酚色谱图。
图14为实施例3中样品水提取液MIC试验结果。
图15为实施例3中样品酸性水提取液和碱性水提取液MIC试验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
以下实施例、试验例中，均采用肉汤稀释法测试样品的MIC值，测试的菌株为大肠杆菌
Figure BDA0002171494640000051
同样地，也可以采用沙门氏菌
Figure BDA0002171494640000052
或金黄色葡萄球菌
Figure BDA0002171494640000053
等进行测试。
实施例1一种植物精油类产品中是否人为添加抗菌药的检测
1、精密称取3份植物精油样品，每份约4g，置于50mL离心管中，分别加入超纯水、0.01mol/L盐酸溶液、0.01mol/L氢氧化钠溶液各21mL，涡旋混匀后超声30min；
2、将超声后的酸性水溶液和碱性水溶液分别用盐酸和氢氧化钠调至pH为2和12；300/min振荡30min后8000r/min离心10min，取水相备用，为待测提取溶液；
3、植物精油样品中含有香芹酚0.5％，肉桂醛0.8％；以纯的香芹酚和肉桂醛为对照样品，采用超纯水、0.01mol/L盐酸溶液、0.01mol/L氢氧化钠溶液各25mL进行提取，提取过程与植物精油样品相同，得到对比提取液；
4、采用肉汤稀释法药敏试验，检测待测提取溶液和对比提取液的MIC值，具体的操作如下：
1)将96孔板的第一列加入180μL的高压灭菌过的MH肉汤，其余各列加入100μL的MH肉汤；
2)取待测提取溶液或对比水提取液20μL加入到第一列孔中，每种提取液同时做3个平行，用可调微量排枪从第一列开始反复吹打混匀至少25次，吸取100μL至下一列，重复上述吹打混匀操作进行倍比稀释，至最后一列弃去100μL；
3)将制备好的菌液用MH肉汤稀释100倍至1×106CFU/mL；
4)各行分别加入100μL稀释好的菌液，将96孔板放入到37℃±1℃恒温培养箱中培养18～24h后取出，观察结果。
结果分析：按样品标示量香芹酚0.5％，肉桂醛0.8％计算，样品添加量为4g，以香芹酚、肉桂醛最大浓度计算，96孔板第一列香芹酚浓度约为40μg/mL，肉桂醛浓度约为64μg/mL，试验结果发现，96孔板水和酸、碱提取液第一列均出现抑菌效果，由对比提取液MIC结果可知，香芹酚40μg/mL时已没有抑菌效果，故该样品96孔板第一列澄清只与肉桂醛的作用有关，肉桂醛浓度约为64μg/mL，此浓度与肉桂醛按相同提取方法得到的对比提取液MIC(67μg/mL)结果一致，且同样水和酸、碱提取液均在第一列出现抑菌效果，也可基本排除商品中添加抗菌药。
实施例2一种植物精油类产品中是否人为添加抗菌药的检测
1、精密称取3份植物精油样品，每份约4g，置于50mL离心管中，分别加入超纯水、0.01mol/L盐酸溶液、0.01mol/L氢氧化钠溶液各25mL，涡旋混匀后超声30min；
2、将超声后的酸溶液和碱溶液分别用盐酸和氢氧化钠调至pH为2和12；300/min振荡30min后8000r/min离心10min，取水相备用，为待测水提取溶液；
3、植物精油样品中含有0.5％肉桂醛、0.5％百里香酚及辅料丙酸钙；以纯的肉桂醛和百里香酚为对照样品，采用超纯水、0.01mol/L盐酸溶液、0.01mol/L氢氧化钠溶液各25mL进行提取，提取过程与植物精油样品相同，得到对比提取液；
4、采用肉汤稀释法药敏试验，检测待测水提取溶液和对比水提取液的MIC值，具体的操作如下：
1)将96孔板的第一列加入180μL的高压灭菌过的MH肉汤，其余各列加入100μL的MH肉汤；
2)取待测提取溶液或对比水提取液20μL加入到第一列孔中，每种提取液同时做3个平行，用可调微量排枪从第一列开始反复吹打混匀至少25次，吸取100μL至下一列，重复上述吹打混匀操作进行倍比稀释，至最后一列弃去100μL；
3)将制备好的菌液用MH肉汤稀释100倍至1×106CFU/mL；
4)各行分别加入100μL稀释好的菌液，将96孔板放入到37℃±1℃恒温培养箱中培养18～24h后取出，观察结果。
结果分析：从百里香酚和肉桂醛对比水提取液的MIC试验结果可知，百里香酚的饱和酸性、水和碱性对比提取液均没有抗菌作用，肉桂醛饱和酸性、水和碱性对比提取液均表现出抑菌效果，其MIC值为67μg/mL。
按样品标示量肉桂醛含量0.5％计算分析，样品提取液在96孔板第一列肉桂醛浓度约为40μg/mL，明显小于纯的肉桂醛精油对照样的MIC值，且仅有样品的0.01mol/L氢氧化钠提取液在第一列出现抑菌效果，没有出现纯的肉桂醛精油做MIC试验时水和酸、碱提取液第一列均有抑菌效果的现象，判断该植物提取物人为添加有抗菌药，可进一步验证。
实施例3一种抗菌肽类产品是否人为添加抗菌药的检测
1、精密称取3份抗菌肽类产品，每份约4g，置于50mL离心管中，分别加入超纯水、0.01mol/L盐酸溶液、0.01mol/L氢氧化钠溶液各25mL，涡旋混匀后超声30min；
2、将超声后的酸、碱溶液分别用盐酸和氢氧化钠调至2和12；300/min振荡30min后8000r/min离心10min，取水相备用，为待测水提取溶液；
4、采用肉汤稀释法药敏试验，检测待测水提取溶液的MIC值，具体的操作如下：
1)将96孔板的第一列加入180μL的高压灭菌过的MH肉汤，其余各列加入100μL的MH肉汤；
2)取待测提取溶液20μL加入到第一列孔中，每种提取液同时做3个平行，用可调微量排枪从第一列开始反复吹打混匀至少25次，吸取100μL至下一列，重复上述吹打混匀操作进行倍比稀释，至最后一列弃去100μL；
3)将制备好的菌液用MH肉汤稀释100倍至1×106CFU/mL；
4)各行分别加入100μL稀释好的菌液，将96孔板放入到37℃±1℃恒温培养箱中培养18～24h后取出，观察结果。
结果分析：在本实施例检测方法下样品的酸、碱和水提取液中均表现出明显的抗菌效果(如图14、图15所示)，0.01mol/L盐酸提取液、水和0.01mol/L氢氧化钠提取液的抑菌效果分别相当于5μg/mL、2.5μg/mL、2.5μg/mL浓度的恩诺沙星，抑菌效果显著，表明抗菌肽类产品中极有可能有人为添加有抗菌药，有待做进一步验证。
试验例1肉汤稀释法药敏试验中以恩诺沙星为质控的MIC结果
以恩诺沙星为肉汤稀释法药敏试验质控样品，其中恩诺沙星溶液制备的过程如下：精密称取恩诺沙星约250mg，置于100mL棕色容量瓶中，加入适量0.01mol/L氢氧化钠溶液使其完全溶解，定容至刻度，摇匀后用灭菌超纯水稀释至20μg/mL，避光备用。按上述实施例1、2、3的检测方法进行最小抑菌浓度试验，结果：本发明所提供的一种样品中抗菌药的检测方法及应用恩诺沙星质控浓度为0.015μg/mL，符合恩诺沙星对大肠杆菌
Figure BDA0002171494640000071
的质控范围0.004～0.015μg/mL。
说明本发明中采用的肉汤稀释法药敏试验满足最小抑菌浓度测定要求，可以采用上述实施例1至3中的检测方法进行检测植物提取物等样品中是否人为添加了抗菌药。
试验例2一种植物提取物中植物精油单一成份提取液中植物精油含量检测
高效液相色谱法检测上述实施例1至3对照样品提取液中，肉桂醛、香芹酚与百里香酚浓度。
操作如下：取实施例1至3对照样品提取液适量，稀释一定倍数后，准确吸取对照样品提取液10μL，注入液相色谱仪中，记录色谱图。另取上述各植物精油标准品同法测定。按外标法以峰面积计算，计算提取液中各植物精油浓度。
结果：按本发明所述方法，测得肉桂醛在酸、水和碱提取液中的浓度为1617μg/mL、1614μg/mL、1332μg/mL；香芹酚在酸、水和碱提取液中的浓度为307μg/mL、432μg/mL、2033μg/mL；百里香酚在酸、水和碱提取液中的浓度为318μg/mL、323μg/mL、1409μg/mL。
试验例3一种植物提取物中植物精油单一成份提取液的MIC试验
上述实施例1至3中，肉桂醛、香芹酚、百里香酚的3种对照样品提取液抑菌结果如表1所示。
表1肉桂醛、香芹酚、百里香酚的3种对照样品提取液抑菌结果
Figure BDA0002171494640000081
根据试验例2高效液相色谱法测得的肉桂醛、香芹酚、百里香酚在酸、水和碱提取液中的浓度，计算可知肉桂醛的酸、水和碱提取液在96孔板第一列浓度分别为81μg/mL、81μg/mL、67μg/mL，香芹酚的酸、水和碱提取液在96孔板第一列浓度分别为15μg/mL、22μg/mL、102μg/mL，百里香酚的酸、水和碱提取液在96孔板第一列浓度分别为16μg/mL、16μg/mL、70μg/mL。
如表1可知，本发明所提供的前处理方法和检测方法下，百里香酚在0.01mol/L盐酸提取液、水和0.01mol/L氢氧化钠的过饱和提取液中没有抑菌效果；肉桂醛的水和酸、碱饱和提取液使96孔板第一列澄清，出现抑菌效果，表明在本试验例处理下，肉桂醛对大肠杆菌
Figure BDA0002171494640000082
的最小抑菌浓度约为67μg/mL；香芹酚的水和酸饱和提取液在96孔板上各列均浑浊，仅碱饱和提取液在第一列澄清，有抑菌效果，表明在本发明处理下，香芹酚对大肠杆菌
Figure BDA0002171494640000083
的最小抑菌浓度约为102μg/mL。
当所述样品为其他难溶于水或不溶于水的植物提取物时，也可采用上述方法进行检测是否含有人为添加的抗菌药物。
最后所应当说明的是，本发明方法适用于人为基于有效量的抗菌药具有检测灵敏度和准确率要求，对于因为产品生产线可控范围内的抗菌药痕量污染等原因导致的抗菌药含量的检测可以参照本发明思路进行调整参数以适用。例如对于恩诺沙星、氟苯尼考等抗菌药，采用本发明方法可检测的含量在0.0003％、0.16％以上。但检测范围不应作为本发明思想和保护范围。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种样品中抗菌药的检测方法，其特征在于，将样品和空白对照分别采用酸性水溶液、水、碱性水溶液进行提取，得到待测样品提取液和对照提取液，然后分别检测待测样品提取液和对照提取液的MIC值，并进行比较；
当待测样品提取液的MIC值明显小于对照提取液的MIC值时，则证明样品中存在抗菌药；若二者的MIC值相当，或待测样品提取液的MIC值明显大于对照提取液的MIC值时，则证明样品中不存在抗菌药；
所述样品为植物精油类提取物或者含有植物精油类提取物的添加剂；所述空白对照是与所述样品具有相同植物精油类提取物的其过饱和溶液。
2.根据权利要求1所述样品中抗菌药的检测方法，其特征在于，所述酸性水溶液的pH值为1～4；所述碱性水溶液的pH值为10～14。
3.根据权利要求1至2任一项所述样品中抗菌药的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.取3份待测样品和3份空白对照，分别加入酸性水溶液、水、碱性水溶液进行提取，得到3份待测样品提取液和3份对照提取液；
S2.采用相同的方法检测步骤S1制得的3份待测样品提取液和3份对照提取液的MIC值，并进行比较即可。
4.根据权利要求3所述样品中抗菌药的检测方法，其特征在于，步骤S1中，待测植物精油类提取物与所述酸性水溶液、水或碱性水溶液的质量体积比为：0.04～0.2g/mL。
5.根据权利要求3所述样品中抗菌药的检测方法，其特征在于，步骤S1是将待测样品或者空白对照，分别加入酸性水溶液、水、碱性水溶液，超声后，调节溶液pH，振荡后离心处理，分别取水相过滤即得。
6.根据权利要求5所述样品中抗菌药的检测方法，其特征在于，所述提取采用超声提取，超声提取的时间为10～30min，温度20～60℃；所述离心处理的转速为4000～8000rpm，时间为5～10min；所述超声后调节溶液pH值，酸性溶液pH调至1～4，碱性溶液pH调至10～14，水溶液不需要调节pH值；所述振荡的速度为100～350/min，时间为10～30min。
7.根据权利要求3所述样品中抗菌药的检测方法，其特征在于，步骤S2中，MIC值的测定采用肉汤稀释法药敏试验进行检测；所述肉汤稀释法药敏试验采用大肠杆菌25922、沙门氏菌 14028或金黄色葡萄球菌 29213进行检测。
8.权利要求1至7任一项所述方法在判断检测植物精油类提取物类添加剂或保健药中是否添加抗菌药方面的应用。
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