CN112893864A - 一种基于发夹模板制备的银纳米团簇及其在检测氯霉素中的应用 - Google Patents

一种基于发夹模板制备的银纳米团簇及其在检测氯霉素中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于发夹模板制备的银纳米团簇及其在检测氯霉素中的应用，属于检测技术领域。本发明利用具有发夹结构的适配体DNA作为模板，与硝酸银形成银纳米团簇。利用所得银纳米团簇，将待测样品与银纳米簇混合，样品中CAP与适配体DNA的结合可能导致发夹结构的破坏，银纳米团簇的荧光发生部分猝灭；基于上述银纳米团簇的荧光变化，确定待测样品中的CAP浓度，实现CAP检测。该检测方法时间不到10分钟，灵敏度高，检出限为0.052nmol/L，且选择性和回收性实验也证明了该方法，具有非常好的应用前景。

Description

一种基于发夹模板制备的银纳米团簇及其在检测氯霉素中的 应用
技术领域
本发明涉及一种基于发夹模板制备的银纳米团簇及其在检测氯霉素中的应用，属于检测技术领域。
背景技术
抗生素作为抗菌药在世界范围内广泛应用，用于治疗疾病和促进动物生长。近年来，食品安全问题不断暴露，食品安全现状已成为越来越多人关注的焦点。抗生素的过度使用已经成为世界上最大的问题之一。因此，对食品中抗生素残留的检测是十分必要和重要的。
目前,许多标准测试方法，如高效液相色谱、气相色谱-质谱分析,电感耦合等离子体质谱法、液相色谱-质谱法和化学发光酶联免疫吸附等结果相对准确的，但这些方法的操作繁琐且昂贵，因此,开发简便、经济、便携的CAP测定替代品是十分必要的。
适配体是结合特定分子目标的双链DNA或单链RNA分子。其功能与抗体相似，具有特异性好、亲和性好、合成方法简单、稳定性好、易修饰、靶标范围广、可重复使用等优点。因此核酸适配体分析被用于各种测试，如比色分析、色谱分析、电化学传感器、生物成像等领域的应用。
DNA模板银纳米团簇(DNA-AgNCs)作为一种无标记信号载体，在生物传感器的研究中受到了广泛的关注。在此基础上，开发了一种用发夹模板银纳米团簇快速检测生牛奶中氯霉素的方法。
发明内容
本发明提供一种用发夹模板银纳米团簇快速检测生牛奶中氯霉素的方法，带有茎环结构的CAP适配体DNA可以被合成为AgNCs，CAP与其适配体的结合破坏了AgNCs，荧光明显减弱，构建一种新的基于适配体的荧光传感器，用于待测样品中氯霉素的检测。
本发明通过以下技术方案实现，
一种基于发夹模板制备的银纳米团簇的方法，所述方法是将具有发夹结构的氯霉素适配体DNA、银盐、硼氢化钠分散在溶剂中，形成反应体系，室温(20-30℃)下反应，获得发夹DNA银纳米团簇。
在本发明的一种实施方式中，所述具有发夹结构的氯霉素适配体DNA的序列为：
ACTTCAGTGAGTTGTCCCCCCCCCCGCGAGTCGGTGGTAGTT。
在本发明的一种实施方式中，所述具有发夹结构的氯霉素适配体DNA的制备过程包括：将DNA链在80-90℃下进行退火处理，然后逐步冷却至室温。
在本发明的一种实施方式中，溶剂为水和缓冲液的混合体系。其中，缓冲液选自1×TAE、1×TBE、1×TE、1×PB、1×PBS(1)、1×PBS(2)。缓冲液PBS(1)为最佳。
其中，混合体系水与缓冲液的体积比为165：20。
在本发明的一种实施方式中，所述实验缓冲液的pH为6.0-8.0中；6.5最佳。
在本发明的一种实施方式中，银盐包括硝酸银、氯化银。
在本发明的一种实施方式中，银盐在反应体系中的浓度为15-60μmol/L。具体可选45μmol/L。
在本发明的一种实施方式中，适配体DNA在反应体系中的浓度为5.0μmol/L。具体可选5μmol/L。
在本发明的一种实施方式中，硝酸银与适配体DNA的摩尔比为9:1。
在本发明的一种实施方式中，硼氢化钠在反应体系中的浓度为30μmol/L。具体可选30mmol/L。硼氢化钠用于还原体系中银离子。
在本发明的一种实施方式中，所述一种发夹结构适配体，能够对氯霉素进行特异性识别，由生工生物技术有限公司(中国上海)合成。由此，可以进一步提高本发明方法进行氯霉素浓度检测的效率和灵敏度。
本发明利用上述方法提供了一种发夹DNA银纳米团簇。
本发明还提供了利用上述发夹DNA银纳米团簇检测氯霉素的方法，所述方法包括如下过程：
将CAP样品与银纳米簇混合，获得一系列已知CAP浓度的混合样品，测定荧光强度，获得浓度为0时的荧光强度F0、以及其他已知浓度的CAP样品荧光强度F，计算得到相对荧光强度IF＝(F0-F)/F0)；利用相对荧光强度IF与CAP样品的浓度构建线性关系，获得检测模型。
在本发明的一种实施方式中，测定荧光强度是测定CAP样品与银纳米簇混合10分钟时的混合样品。
在本发明的一种实施方式中，一系列已知CAP浓度为0～100nmol/L。
在本发明的一种实施方式中，将待测CAP样品与银纳米簇混合，样品中CAP与适配体DNA的结合可能导致发夹结构的破坏，银纳米团簇的荧光发生部分猝灭；实现荧光响应。
在本发明的一种实施方式中，所述检测模型为y＝0.02867x+0.15709；其中，y为相对荧光强度，x为相应氯霉素的浓度。
在本发明的一种实施方式中，所述氯霉素及其他抗生素(加米霉素、土霉素、青霉素、博莱霉素、卡那霉素、链霉素)中，只有氯霉素与所述配体表现出特异性结合。由此，可以进一步提高本发明方法进行氯霉素浓度检测的效率和灵敏度。
有益效果：
本发明方法检测时间不超过10分钟，灵敏度高，检出限为0.052nmol/L，且选择性和回收性实验也证明了该方法具有令人满意的结果。该方法具有潜在的适用性，为基于适配体和AgNCs的无标签传感器的开发提供了一种新的策略。
附图说明
图1为实施例1中所得发夹DNA-AgNCs和无发夹结构的DNA-AgNCs的荧光光谱图。
图2为硝酸银与DNA浓度比值对荧光强度的影响比对图。
图3为不同浓度CAP下反应时间对荧光强度的影响比对图。
图4为不同缓冲液对反应前后荧光强度的影响比对图。
图5为不同pH对反应前后荧光强度的影响比对图。
图6为利用不同浓度(0.5～100nmol/L)CAP标准样品进行检测的荧光光谱图。
图7为利用不同浓度氯霉素标准样品绘制的标准曲线图。
图8为氯霉素检测的特异性评估图。
图9为对比例2中检测不同浓度卡那霉素的荧光光谱图。
具体实施方式
下述实施例中是对本发明技术方案做一步的说明，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中是对本发明技术方案做一步的说明，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
试剂准备：本发明涉及的核酸序列由生工生物技术有限公司(中国上海)合成，在超纯水中制备DNA/RNA原液，并根据波长260nm的紫外吸光度精确定量。
本发明涉及的氯霉素适配体：
研究发夹AgNCs和荧光信号的结构之间的关系通过使用包含3-12胞核嘧啶环(C)：C-r发夹会产生明显的荧光峰，且相应的波长和强度随C-碱基的环数增加而增加。可见，若颈环上富含C碱基，荧光强度会显著增强。
氯霉素适配体原序列为：
ACTTCAGTGAGTTGTCCCACGGTCGGCGAGTCGGTGGTAGTT，
修改该适配体序列，让颈环上的碱基全部为C碱基，修改后适配体序列为：
ACTTCAGTGAGTTGTCCCCCCCCCCGCGAGTCGGTGGTAGTT，
基于原序列制备具备发夹结构的DNA
ACTTCAGTGAGTTGTCCCACGGTCGGCGAGTCGGTGGTAGTT，将DNA链放入水浴锅进行95℃退火处理，5分钟，然后缓慢降温(一分钟降一度)，冷却至室温，备用。
无发夹结构的DNA：ACTTCAGTGAGTTGTCCCACGGTCGGCGAGTCGGTGGTAGTT，不用经过上述退火处理。
基于修改后的序列制备具备发夹结构的DNA：
ACTTCAGTGAGTTGTCCCCCCCCCCGCGAGTCGGTGGTAGTT，将DNA链放入水浴锅进行95℃退火处理，5分钟，然后缓慢降温(一分钟降一度)，冷却至室温，备用。
所有实验涉及的缓冲液为1×TAE,1×TBE,1×TE,1×PB,1×PBS。
其他化学品均购自国药化学试剂有限公司(中国上海)，无需进一步净化即可使用。使用的超纯水经Milli-Q A10过滤系统(18.2MU cm)净化。使用蒸馏水制备的所有溶液，使用前在4℃保存。
实施例1：合成银纳米团簇DNA-AgNCs
反应体系为200uL，其中：100μmol/L的CAP适配体DNA10uL，超纯水165uL，20uL1×PBS(1)和3mmol/L硝酸银3uL混合，4℃反应30分钟；再加入3mmol/L硼氢化钠2uL，在室温下反应9小时，获得发夹DNA银纳米团簇(发夹DNA-AgNCs)。其中，CAP适配体DNA的序列为：
ACTTCAGTGAGTTGTCCCCCCCCCCGCGAGTCGGTGGTAGTT。
通过测量CAP适配体260nm处吸光度，准确定量银纳米团簇的浓度，测得DNA-AgNCs的量子产率16.36％。
测定所得具有发夹结构的DNA-AgNCs的荧光信号，如图1所示。
替换利用具有如下原序列的DNA作为氯霉素适配体来制备DNA-AgNCs：
ACTTCAGTGAGTTGTCCCACGGTCGGCGAGTCGGTGGTAGTT，所得DNA-AgNCs的荧光信号如图1所示。
可见，具有发夹结构的DNA-AgNCs的荧光强度增强了近10倍。
实施例2：实验条件探究优化
1)硝酸银与适配体的摩尔比探究：
取12只离心管，分为4组，每组3只离心管，均加入100μmol/L的CAP适配体序列10uL、20uL 1×PBS(1)、超纯水165ul，在4组离心管中分别加入1uL，2uL，3uL，4uL的3mmol/L硝酸银，4℃反应30分钟，再分别加入3mmol/L的硼氢化钠2uL，反应9小时后测定，荧光图谱显示，结果如图2，硝酸银与适配体的摩尔比为9:1时，荧光强度达到最大。
2)反应缓冲液探究：
取18只离心管，分为6组，每组3只离心管，均加入100μmol/L的CAP适配体序列10uL、超纯水165uL、3mmol/L硝酸银3uL，每组离心管中分别加入1×TAE 20uL、1×TBE20uL、1×TE 20uL、1×PB 20uL、1×PBS(1)20uL、1×PBS(2)20uL，4℃反应30分钟，再分别加入3mmol/L的硼氢化钠2ul，反应9小时后记录荧光信号强度，然后添加1μmol/L 2uL CAP使得体系中的浓度为10nmol/L CAP，再次检测荧光信号强度。荧光图谱结果如图4所示，最佳反应缓冲液为PBS(1)。
3)反应体系pH探究：
取15只离心管，分为5组，每组3只离心管，均加入100μmol/L的CAP适配体序列10ul、超纯水165ul、3mmol/L硝酸银3uL，每组离心管中分别加入pH为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的1×PBS(1)20ul溶液，4℃反应30分钟，再分别加入3mmol/L的硼氢化钠2ul，反应9小时后记录荧光信号强度，然后添加1μmol/L 2ul CAP使得体系中的浓度为10nmol/L CAP再次检测荧光信号强度。荧光图谱结果如图5所示，最佳反应pH为6.5。
实施例3：测定方法的敏感性及标准曲线建立
检测荧光信号强度探究：取9只离心管，分为3组，每组3只离心管，均加入100μmol/L的CAP适配体序列10ul，20ul 1×PBS(1)、超纯水165ul、3mmol/L硝酸银3uL，4℃反应30分钟，再分别加入3mmol/L的硼氢化钠2ul，反应9小时后，添加0.1μmol/L、2.0μmol/L、10μmol/L 2ul CAP使得体系中的浓度为1nmol/L、20nmol/L、100nmol/L CAP检测荧光信号强度变化曲线，不同时间荧光强度变化结果如图3所示，荧光强度约600秒内趋于稳定。因此，该系统下的最佳响应时间为10分钟。
检测CAP样品方法构建：
以相对荧光强度(IF＝(F0-F)/F0)为坐标表示优化结果，其中F和F0分别表示存在CAP和不存在CAP时的荧光强度。
在上述优化的条件(实施例1)下：取42只离心管，分为14组，每组3只离心管，均加入100μmol/L的CAP适配体序列10uL、超纯水165ul、3mmol/L硝酸银3uL，pH为6.5的1×PBS(1)20uL溶液，4℃反应30分钟，再分别加入3mmol/L的硼氢化钠2uL，反应9小时后记录荧光信号强度；
然后添加0μmol/L、0.05μmol/L、0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.8μmol/L、1.0μmol/L、1.2μmol/L、1.4μmol/L、1.8μmol/L、2.0μmol/L、4.0μmol/L、8.0μmol/L、10.0μmol/L 2ul CAP使得体系中的浓度为0～100nmol/L范围内14种不同浓度(0nmol/L、0.5nmol/L、1nmol/L、2nmol/L、4nmol/L、8nmol/L、10nmol/L、12nmol/L、14nmol/L、18nmol/L、20nmol/L、40nmol/L、80nmol/L、100nmol/L)的CAP，响应10分钟，分别得到F和F0，检测结果如图6，随着CAP浓度的增加，反应体系的荧光强度显著降低。以相对荧光强度(IF＝(F0-F)/F0)呈显著的线性相关关系(R2＝0.997)，回归方程是y＝0.02867x+0.15709，线性范围为0-20nm/L，检出限(LOD)是0.052nmol/L(检出限定义为信噪比3:1时的浓度3S/K，S为空白样品的标准偏差，K为线性标定曲线斜率)，即1mL检测系统中可检测到CAP的约52pmol，结果如图7所示。
实施例4：氯霉素特异性测定
取21只离心管，分为7组，每组3只离心管，均加入100μmol/L的CAP适配体序列10ul、超纯水165ul、3mmol/L硝酸银3uL、pH为6.5的1×PBS(1)20ul，4℃反应30分钟，再分别加入3mmol/L的硼氢化钠2ul，反应9小时后记录荧光信号强度，再在每组离心管中分别加入1μmol/L 2ul使得体系中的浓度为10nmol/L的卡那霉素(KANA)、加米霉素(GAM)、博莱霉素(BLE)、链霉素(ST)、土霉素(OXY)、青霉素(PEN)、氯霉素(CAP)，记录荧光信号强度，相对荧光变化结果如图8结果表明，靶DNA和CAP具有特异的结合能力，因为只有CAP能引起靶DNA构象的变化，而其他抗生素不能与靶DNA结合。
实施例5：牛奶样品中氯霉素的测定
对不同浓度(1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L)的CAP进行了回收率试验。考虑到该方法在复杂样品中的实用性，选择牛奶作为基质。将4.0mL生乳放入15mL离心管中，稀释至10mL，加入10％三氯乙酸和氯仿混合溶液至2.0mL，涡旋搅拌1分钟，使蛋白在样品基质中沉淀。20℃超声处理15分钟，5000rpm离心10分钟，沉淀分离。其次，将上清液转移到另一个离心管中。5000rpm离心10分钟后，再次去除沉淀，用最终溶液检测。如表1所示，CAP在牛奶中的回收率在84％～102.9％之间，说明该方法具有较好的准确度，可用于实际样品的检测。
表1牛奶样品中氯霉素的测定结果
Figure BDA0002906646910000061
Figure BDA0002906646910000071
对比例1
利用具有如下序列的DNA作为氯霉素适配体：
ACTTCAGTGAGTTGTCCCACGGTCGGCGAGTCGGTGGTAGTT；
参照实施例1，制备得到相应不具备发夹结构的银纳米团簇DNA-AgNCs。
该复合物的荧光强度如图1所示，几乎无荧光，非常弱。
参照实施例3，将其应用于氯霉素检测模型构建中，发现给方法不能有效构建线性模型，无法进行定量检测。
对比例2
参照实施例1，将CAP适配体替换为卡那霉素适配体，其他条件不变，获得相应复合物：
100μmol/L的卡那霉素适配体10uL，超纯水165uL，20uL 1×PBS(1)和3mmol/L硝酸银3uL混合，4℃反应30分钟；再加入3mmol/L硼氢化钠2uL，在室温下反应9小时，获得复合物。
其中，卡那霉素适配体DNA的序列为TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA；
卡那霉素适配体DNA的制备：将适配体DNA进行退火处理，将DNA链放入水浴锅进行95度退火5分钟，然后缓慢降温(一分钟降一度)，冷却至室温，备用。
发夹结构需要非颈环处有多个碱基互补配对，从而通过氢键等增强结合力，而卡那霉素适配体的两端无法进行有效碱基互补配对。即，卡那霉素适配体不具备发夹结构。
测定该复合物的荧光强度，发现有较弱且不稳定的荧光性能。
将其应用于卡那霉素的检测，添加0μmol/L、1μmol/L、10μmol/L 2ul卡那霉素使得体系中的浓度为0nmol/L、10nmol/L、100nmol/L不同浓度的卡那霉素的，响应30分钟，监测相应的荧光强度信号(如图9所示)，结果发现：不能构建有效的线性模型，无法进行定量检测。

Claims (10)

1.一种基于发夹模板制备的银纳米团簇的方法，其特征在于，所述方法是将具有发夹结构的氯霉素适配体DNA、银盐、硼氢化钠分散在溶剂中，形成反应体系，室温下反应，获得发夹DNA银纳米团簇。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述具有发夹结构的氯霉素适配体DNA的序列为：ACTTCAGTGAGTTGTCCCCCCCCCCGCGAGTCGGTGGTAGTT。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，银盐在反应体系中的浓度为15-60μmol/L。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，适配体DNA在反应体系中的浓度为5.0μmol/L。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，硝酸银与适配体DNA的摩尔比为9:1。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，硼氢化钠在反应体系中的浓度为30μmol/L。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，银盐包括硝酸银、氯化银。
8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述溶剂为水和缓冲液的混合体系；其中，缓冲液选自1×TAE、1×TBE、1×TE、1×PB、1×PBS(1)、1×PBS(2)。
9.权利要求1-8任一项所述方法制备得到的一种发夹DNA银纳米团簇。
10.一种利用权利要求9所述的发夹DNA银纳米团簇检测氯霉素的方法，其特征在于，所述方法包括如下过程：
将一系列已知浓度的氯霉素样品与银纳米簇混合，测定荧光强度，获得浓度为0时的荧光强度F0、以及其他已知浓度的CAP样品荧光强度F，计算得到相对荧光强度IF＝(F0-F)/F0)；利用相对荧光强度IF与氯霉素样品的浓度构建线性关系，获得检测模型。
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