CN116004769A - 一种基于磁珠和氧化石墨烯的辅助作用检测miRNA Let-7a的试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学领域领域，涉及miRNA Let‑7a的检测，特别是指一种基于磁珠和氧化石墨烯的辅助作用检测miRNA Let‑7a的试剂盒及其应用。包括以下核苷酸链：A1链、A2链、A3链、AP链和荧光链，磁珠混合液，PBS缓冲液，BSA缓冲液和Cutsmart缓冲液；其中A1链序列如SEQ ID No.1所示、A2链序列如SEQ ID No.2所示、A3链序列如SEQ ID No.3所示、AP链序列如SEQ ID No.4所示、荧光链序列如SEQ ID No.5所示，其3’端修饰有FAM基团。本方法基于磁珠和氧化石墨烯辅助下的无酶放大策略的传感系统机制，可以实现对目标基因高灵敏和高选择性检测。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域领域，涉及miRNA Let-7a的检测，特别是指一种基于磁珠和氧化石墨烯的辅助作用检测miRNA Let-7a的试剂盒及其应用。
背景技术
let-7a是let-7miRNA家族的成员之一，let-7miRNA家族最初在线虫中被发现，是发育过程的主要调节因子，分布在9条不同染色体上。let-7存在多种亚型，由13个成员组成，分别为let-7a-1、let-7a-2、let-7a-3、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f-1、let-7f-2、let-7g、let-7i、miR-202和miR-98。该家族所有成员的5′端均具有“种子序列”的高度保守核苷酸序列，即“TGAGGTA”。let-7a已被发现于包括食管鳞状细胞癌、肺癌、鼻咽癌和卵巢癌等大部分人类恶性肿瘤中。let-7a作为let-7miRNA 家族的成员之一，在细胞增殖、凋亡、生长和转移等许多细胞生物学过程中发挥着重要的作用。因此，围绕let-7a基因展开基因检测具有十分重要的意义。
现有的miRNA Let-7a的检测方法并不能精确、灵敏的检测miRNA。已有研究人员通过多种恒温扩增技术，提高核酸检测的灵敏度；专利一种用于QCM检测miRNA Let-7a的试剂盒及方法，通过在QCM的基础上添加信号增强剂进而实现提高检测准确性的目的，该专利属于电化学传感器领域，其检测灵敏度有待提高；专利基于链置换和酶辅助循环信号放大的肿瘤抑制因子Let-7a检测试剂盒及其使用方法，为本课题组前期的研究成果，公开了一种在外切酶的帮助下实现对Let-7a检测的试剂盒，由于含酶的检测方法在实际检测中要求的条件比较苛刻；因此，本课题组致力于开发新的不依靠酶作用来实现提高检测miRNA Let-7a灵敏度的目的。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提出一种基于磁珠和氧化石墨烯的辅助作用检测miRNA Let-7a的试剂盒及其应用。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种基于磁珠和氧化石墨烯的辅助作用检测miRNA Let-7a的试剂盒，包括以下核苷酸链：A1链、A2链、A3链、AP链和荧光链，磁珠混合液，PBS缓冲液，BSA缓冲液和Cutsmart缓冲液；其中A1链序列如SEQ ID No.1所示、A2链序列如SEQ ID No.2所示、A3链序列如SEQ IDNo.3所示、AP链序列如SEQ ID No.4所示、荧光链序列如SEQ ID No.5所示，其3’端修饰有FAM基团。
上述磁珠混合液中的磁珠均为经修饰链霉亲和素后的磁性微珠。
上述PBS缓冲液的浓度为1mM，pH为7.4，BSA缓冲液的浓度为0.4mg/mL，Cutsmart缓冲液的浓度为10 mM。
上述的试剂盒在非疾病诊断为目的的检测miRNA Let-7a中的应用，步骤为：
（1）配制A1链溶液、A2链溶液和A3链溶液，然后经混匀孵育，得到三链复合底物溶液；
（2）向步骤（1）得到的三链复合底物溶液中加入PBS缓冲液与磁珠混合液，混匀后，震荡条件下孵育至反应完全；
（3）将步骤（2）反应后的磁反应液离心、分离磁珠，取出反应液后，向含有磁珠的反应管内加入BSA缓冲液，震荡条件下孵育至反应完全；
（4）将步骤（3）反应后的溶液离心、分离磁珠，取出反应液后，向含有磁珠的反应管内依次加入PBS缓冲液、待测溶液和AP链溶液，震荡均匀后孵育至反应完全；
（5）将氧化石墨烯溶液、荧光链溶液和Cutsmart缓冲液混合后，震荡孵育至充分结合，然后加入步骤（4）中去除磁珠的反应溶液，震荡孵育后，检测荧光强度的峰值；
（6）将步骤（5）中荧光强度的峰值代入标准曲线，计算得miRNA Let-7a的浓度。
所述步骤（1）中A1链溶液、A2链溶液和A3链溶液的浓度相同均为1-10 μM，A1链溶液的体积为6μL、A2链溶液的体积为2.5μL和A3链溶液的体积为5μL。
上述步骤（2）中磁珠混合液的浓度为5mg/mL，PBS缓冲液的pH为7.4，浓度为1mM；三链复合底物溶液的体积为3μL、PBS缓冲液的体积为150μL、磁珠混合液的体积为15μL；步骤（3）中BSA缓冲液的体积为150μL。
上述步骤（4）中PBS缓冲液的体积为160 μL，待测溶液的体积为200 μL ，AP链溶液的体积为0.9 μL，AP链溶液的浓度为10 μM。
上述步骤（5）中氧化石墨烯溶液的浓度为500 μg/μL、体积为14 μL，荧光链溶液的浓度为10 μM、体积为2 μL，Cutsmart缓冲液的浓度为10μM、体积为3μL。
上述步骤（6）中荧光强度的测试波长范围为470-650 nm，标准曲线为y=67239.30407+14881.69173x，其中y为荧光强度的峰值，x为miRNA Let-7a浓度的对数值。
检测原理：
基于磁和氧化石墨烯辅助下的无酶放大策略用于检测肿瘤抑制因子Let-7a的方法，是基于生物素标记的DNA链可以稳定地结合链霉亲和素修饰的磁性纳米粒子，从而实现对所需DNA链的筛选，进一步促进目标链的循环。目标基因Let-7a在与三链杂交后，可以通过链置换反应置换出三链结构中的A2链，并且在Ap链的协助下促进目标循环，从而产生大量A2链；然后，A2链会与荧光链杂交，使得荧光链得以脱离氧化石墨烯的吸附。当荧光链脱离氧化石墨烯后，仪器可检测到荧光信号。当不存在Let-7a时，氧化石墨烯会吸附荧光链并猝灭其荧光，因此只能检测到较低的荧光信号。荧光信号强度的变化与目标基因浓度在一定范围内存在线性相关关系。本方法基于磁性纳米材料和氧化石墨烯辅助下的无酶放大策略的传感系统机制，可以实现对目标基因高灵敏和高选择性检测。
本发明具有以下有益效果：
1、本申请通过引入磁珠混合液提高了反应速率，实现了对辅助链的特定筛选，降低了反应中背景信号的干扰；本申请设计的A1链、A2链和A3链形成的三链结构多功能实体，可以特异性识别目的基因，并且制备简单、易得，结构稳定；再结合辅助链Ap的作用，实现了目标基因的循环利用，放大了检测信号，降低了检测下限。
2、本申请试剂盒中的氧化石墨烯具有低生物毒性，结构稳定，原料价格低廉等优势，充分利用氧化石墨烯吸附单链、释放双链的特性，可以实现对目标的灵敏性检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请试剂盒的检测原理示意图。
图2为本申请实验方案中A2链在三链中比例的优化。
图3为本申请实验方案中Ap链添加量的优化。
图4为本申请实验方案可行性的荧光光谱图。
图5为本申请的检测结果图，其中A为荧光强度变化与检测目标物浓度对应的荧光吸收光谱图，B为荧光强度峰值与检测目标物浓度对数的线性图。
图6为本申请实验方法的选择性考察结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种基于磁珠和氧化石墨烯的辅助作用检测miRNA Let-7a的试剂盒，包括以下核苷酸链：A1链、A2链、A3链、AP链和荧光链，磁珠混合液，PBS缓冲液，BSA缓冲液和Cutsmart缓冲液；其中A1链序列如SEQ ID No.1所示、A2链序列如SEQ ID No.2所示、A3链序列如SEQ IDNo.3所示、AP链序列如SEQ ID No.4所示、荧光链序列如SEQ ID No.5所示，其3’端修饰有FAM基团。
具体所用DNA序列如下表：
上述磁珠混合液中的磁珠为经修饰链霉亲和素的磁珠。
上述PBS缓冲液的浓度为1mM，pH为7.4，BSA缓冲液的浓度为0.4mg/mL，Cutsmart缓冲液的浓度为10 mM。
实施例1：条件优化实验1
上述的试剂盒在非疾病诊断为目的的检测miRNA Let-7a中的应用，步骤为：
（1）取6 μL浓度为10 μMA1链溶液和5 μL浓度为10 μM A3链溶液，之后分别取1.5μL、2μL、2.5 μL、3μL、3.5μL、4μL、5μL、6μL浓度为10μM A2链溶液，然后经混匀孵育1.5 h，得到多功能三链复合底物；
（2）待步骤（1）中的反应完成时，取步骤（1）中溶液3 μL加入150 μLPBS缓冲液与15μL 5 mg/ml磁性纳米颗粒，震荡混匀，然后在震荡条件下，孵育一段时间；
（3）待步骤（2）中的反应完成时，将反应液离心，用磁铁将磁珠吸附到管壁，取走反应液，加入150 μL 0.4 mg/mlBSA缓冲液，以填充磁性纳米颗粒上未被附着的位点，然后在震荡条件下，孵育一段时间；
（4）待步骤（3）中的反应完成时，将反应液离心，用磁铁将磁珠吸附到管壁，取走反应液，重新加入160 μLPBS缓冲液，之后在步骤（3）中加入0.5 μL浓度为10 μM的含有let-7a的待测溶液。与0.9 μL浓度为10 μM Ap链溶液，震荡混匀，然后在震荡条件下，孵育一段时间；
（5）取另一反应管，在反应管中加入14 μL浓度为500 μg/μL氧化石墨烯溶液与2 μL浓度为10 μM荧光链溶液，并加入3 μL Cutsmart缓冲液，在震荡条件下，孵育一段时间；
（6）待步骤（4）中的反应完成时，将反应液离心，用磁铁将磁珠吸附到管底，取反应液添加到步骤（5）中，在震荡条件下，孵育一段时间后，采用荧光光度计检测荧光强度的变化；
结果如图2所示，本申请根据反应原理A2链会与氧化石墨烯中荧光链结合并使其脱离氧化石墨烯，因此为了使本研究获得更优的灵敏度，需要对A2链在三链中的比例进行优化。本实验在其他条件不变的情况下，仅改变A2链在三链中的比例，获得到荧光强度信噪比，从而挑选出A2的最佳比例。由图2可以看出A2在三链中的最佳比例为0.5，即A1：A2：A3=1.2:0.5:1。
实施例2：条件优化实验2
上述的试剂盒在非疾病诊断为目的的检测miRNA Let-7a中的应用，步骤为：
（1）取6 μL浓度为10 μMA1链溶液和5 μL浓度为10 μM A3链溶液，之后取2.5 μL浓度为10μM A2链溶液，然后经混匀孵育1.5 h，得到多功能三链复合底物；
（2）待步骤（1）中的反应完成时，取步骤（1）中溶液3 μL加入150 μLPBS缓冲液与15μL 5 mg/ml磁性纳米颗粒，震荡混匀，然后在震荡条件下，孵育一段时间；
（3）待步骤（2）中的反应完成时，将反应液离心，用磁铁将磁珠吸附到管壁，取走反应液，加入150 μL 0.4 mg/mlBSA缓冲液，以填充磁性纳米颗粒上未被附着的位点，然后在震荡条件下，孵育一段时间；
（4）待步骤（3）中的反应完成时，将反应液离心，用磁铁将磁珠吸附到管壁，取走反应液，重新加入160 μLPBS缓冲液，之后在步骤（3）中加入0.5 μL浓度为10 μM的含有let-7a的待测溶液。在不同试管中分别加入0.6μL、0.7μL、0.8μL、0.9 μL、1.0μL、1.2μL浓度为10 μM Ap链溶液，震荡混匀，然后在震荡条件下，孵育一段时间；
（5）取另一反应管，在反应管中加入14 μL浓度为500 μg/μL氧化石墨烯溶液与2 μL浓度为10 μM荧光链溶液，并加入3 μL Cutsmart缓冲液，在震荡条件下，孵育一段时间；
（6）待步骤（4）中的反应完成时，将反应液离心，用磁铁将磁珠吸附到管底，取反应液添加到步骤（5）中，在震荡条件下，孵育一段时间后，采用荧光光度计检测荧光强度的变化；
结果如图3所示，本申请根据反应原理Ap链会与A3链结合并促进目标链再次进入循环，为了使本研究获得更优的灵敏度，需要对Ap的添加量进行优化。本实验在其他条件不变时，改变Ap的添加量，获得到荧光强度信噪比，从而挑选出Ap的最佳添加量。由图3可以看出在200μL 反应体系中，Ap的最佳添加量为0.9 μL。
实施例3：可行性实验
上述的试剂盒在非疾病诊断为目的的检测miRNA Let-7a中的应用，步骤为：
（1）取多支试管，在其中四支中添加6 μL浓度为10 μMA1链溶液和5 μL浓度为10 μM A3链溶液，之后在三只中添加2.5 μL浓度为10μM A2链溶液，同时取另一试管不添加A2(曲线e)，然后经混匀孵育1.5 h，得到多功能三链复合底物；
（2）待步骤（1）中的反应完成时，取步骤（1）中溶液3 μL均加入150 μLPBS缓冲液与15 μL 5 mg/ml磁性纳米颗粒，震荡混匀，然后在震荡条件下，孵育一段时间；
（3）待步骤（2）中的反应完成时，将反应液离心，用磁铁将磁珠吸附到管壁，取走反应液，加入150 μL 0.4 mg/mlBSA缓冲液，以填充磁性纳米颗粒上未被附着的位点，然后在震荡条件下，孵育一段时间；
（4）待步骤（3）中的反应完成时，将反应液离心，用磁铁将磁珠吸附到管壁，取走反应液，重新加入160 μLPBS缓冲液，之后在步骤（3）中取含A2链的两只试管加入0.5 μL浓度为10 μM的含有let-7a的待测溶液另一只试管不加入目标溶液(曲线d)。在另外两只试管中一只试管加入0.9 μL浓度为10 μM Ap链溶液(曲线b)，一只试管不加入Ap(曲线c)，震荡混匀，然后在震荡条件下，孵育一段时间；
（5）取另一反应管，在反应管中加入14 μL浓度为500 μg/μL氧化石墨烯溶液与2 μL浓度为10 μM荧光链溶液，并加入3 μL Cutsmart缓冲液，在震荡条件下，孵育一段时间；
（6）待步骤（4）中的反应完成时，将反应液离心，用磁铁将磁珠吸附到管底，取反应液添加到步骤（5）中，同时向步骤4中加入同体积等浓度的A2反应液(曲线a)在震荡条件下，孵育一段时间后，采用荧光光度计检测荧光强度的变化；
结果如图4所示，根据反应中的的荧光光谱。图中曲线a为直接添加A2链到含有荧光链的氧化石墨烯中测得的曲线，曲线b为含有目标基因的反应液测得的荧光曲线，曲线c为含有目标不添加Ap的检测液测得的荧光曲线，曲线d为不含有目标基因的反应液测得的荧光曲线。曲线e为不含有A2链的反应液测得的荧光曲线。由图4可以看出，目标基因存在和不存在时的荧光强度差值明显，A2存在和不存在时的荧光强度差值同样明显，且Ap链的加入有助于促进目标链循环，最大信噪比达到2.5倍，验证了本实验方案的可行性。
实施例4：线性实验
上述的试剂盒在非疾病诊断为目的的检测miRNA Let-7a中的应用，检测原理如图1所示，步骤如下：
（1）取6 μL浓度为10 μM A1链溶液、2.5 μL浓度为10μM A2链溶液和5 μL浓度为10μM A3链溶液，然后经混匀孵育1.5 h，得到多功能三链复合底物；
（2）待步骤（1）中的反应完成时，取步骤（1）中溶液3μl加入150μlPBS缓冲液与15 μL 5 mg/ml磁性纳米颗粒，震荡混匀，然后在震荡条件下，孵育一段时间；
（3）待步骤（2）中的反应完成时，将反应液离心，用磁铁将磁珠吸附到管壁，取走反应液，加入150 μL 0.4 mg/mlBSA缓冲液，以填充磁性纳米颗粒上未被附着的位点，然后在震荡条件下，孵育一段时间；
（4）待步骤（3）中的反应完成时，将反应液离心，用磁铁将磁珠吸附到管壁，取走反应液，重新加入160 μL PBS缓冲液，之后在步骤（3）中加入0.5 μL Let-7a的标准溶液的浓度分别为80 µM，40 µM，16 µM，8 µM，4 µM，1.6 µM，0.8 µM，160 nM，80nM，40nM，16nM，8 nM，0 nM。与0.9 μL浓度为10 μM Ap链溶液，震荡混匀，然后在震荡条件下，孵育一段时间；
（5）取另一反应管，在反应管中加入14 μL浓度为500 μg/μL氧化石墨烯溶液与2 μL浓度为10 μM荧光链溶液，并加入3 μL Cutsmart缓冲液，在震荡条件下，孵育一段时间；
（6）待步骤（4）中的反应完成时，将反应液离心，用磁铁将磁珠吸附到管底，取反应液添加到步骤（5）中，在震荡条件下，孵育一段时间后，采用荧光光度计检测吸收峰的变化；
（7）根据检测到的荧光强度峰值及其对应的Let-7a的标准溶液浓度，绘制标准曲线。
结果如图5所示，图5A是按照实施例1对标准样检测得的荧光强度与检测目标物浓度对应的荧光光谱图。在5×10-13M至5×10-8M的目标基因浓度范围内，荧光强度峰值与目标基因浓度对数存在良好的线性关系，检测下限低至50pM。（图5B）。
实施例5：选择性实验
（1）取6 μL浓度为10 μMA1链溶液、2.5 μL浓度为10μM A2链溶液和5 μL浓度为10μM A3链溶液，然后经混匀孵育1.5 h，得到多功能三链复合底物；
（2）待步骤（1）中的反应完成时，取步骤（1）中溶液3 μL加入150 μLPBS缓冲液与15μL 5 mg/ml磁性纳米颗粒，震荡混匀，然后在震荡条件下，孵育一段时间；
（3）待步骤（2）中的反应完成时，将反应液离心，用磁铁将磁珠吸附到管壁，取走反应液，加入150 μL 0.4 mg/mlBSA缓冲液，以填充磁性纳米颗粒上未被附着的位点，然后在震荡条件下，孵育一段时间；
（4）待步骤（3）中的反应完成时，将反应液离心，用磁铁将磁珠吸附到管壁，取走反应液，重新加入160 μLPBS缓冲液，之后在步骤（3）中加入0.5 μL浓度为10 μM的含有let-7b,let-7c,Mi-RNA198，Mi-RNA141和Mi-RNA21的待测溶液。与0.9 μL浓度为10 μM Ap链溶液，震荡混匀，然后在震荡条件下，孵育一段时间；
（5）取另一反应管，在反应管中加入14 μL浓度为500 μg/μL氧化石墨烯溶液与2 μL浓度为10 μM荧光链溶液，并加入3 μL Cutsmart缓冲液，在震荡条件下，孵育一段时间；
（6）待步骤（4）中的反应完成时，将反应液离心，用磁铁将磁珠吸附到管底，取反应液添加到步骤（5）中，在震荡条件下，孵育一段时间后，采用荧光光度计检测荧光强度的变化；
结果如图6所示，本申请考虑到实用性的要求，考察该方法对特定目标物的特异性和选择性，选择以let-7b，let-7c，Mi-RNA198，Mi-RNA141和Mi-RNA21作为目标物，考察该方法的选择性。实验结果证实该传感系统对不同的干扰组分响应较低或基本没有响应，对特定目标物响应明显，说明其具有良好的选择性和特异性（图6）。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1. 一种基于磁珠和氧化石墨烯的辅助作用检测miRNA Let-7a的试剂盒，其特征在于，包括以下核苷酸链：A1链、A2链、A3链、AP链和荧光链，磁珠混合液，PBS缓冲液，BSA缓冲液和Cutsmart缓冲液；其中A1链序列如SEQ ID No.1所示、A2链序列如SEQ ID No.2所示、A3链序列如SEQ ID No.3所示、AP链序列如SEQ ID No.4所示、荧光链序列如SEQ ID No.5所示，其3’端修饰有FAM基团。
2. 根据权利要求1所述的基于磁珠和氧化石墨烯的辅助作用检测miRNA Let-7a的试剂盒，其特征在于：所述磁珠混合液中的磁珠为经修饰链霉亲和素的磁珠。
3. 根据权利要求2所述的基于磁珠和氧化石墨烯的辅助作用检测miRNA Let-7a的试剂盒，其特征在于：所述PBS缓冲液的浓度为1mM，pH为7.4，BSA缓冲液的浓度为0.4mg/mL，Cutsmart缓冲液的浓度为10 mM。
4. 权利要求3所述的试剂盒在非疾病诊断为目的的检测miRNA Let-7a中的应用，其特征在于，步骤为：
（1）配制A1链溶液、A2链溶液和A3链溶液，然后经混匀孵育，得到三链复合底物溶液；
（2）向步骤（1）得到的三链复合底物溶液中加入PBS缓冲液与磁珠混合液，混匀后，震荡条件下孵育至反应完全；
（3）将步骤（2）反应后的反应液离心、分离磁珠，取出反应液后，向含有磁珠的反应管内加入BSA缓冲液，震荡条件下孵育至反应完全；
（4）将步骤（3）反应后的溶液离心、分离磁珠，取出反应液后，向含有磁珠的反应管内依次加入PBS缓冲液、待测溶液和AP链溶液，震荡均匀后孵育至反应完全；
（5）将氧化石墨烯溶液、荧光链溶液和Cutsmart缓冲液混合后，震荡孵育至充分结合，然后加入步骤（4）中去除磁珠的反应溶液，震荡孵育后，检测荧光强度的峰值；
（6）将步骤（5）中荧光强度的峰值代入标准曲线，计算得miRNA Let-7a的浓度。
5. 根据权利要求4所述的试剂盒在非疾病诊断为目的的检测miRNA Let-7a中的应用，其特征在于：所述步骤（1）中A1链溶液、A2链溶液和A3链溶液的浓度相同均为1-10 μM，A1链溶液的体积为6μL、A2链溶液的体积为2.5μL和A3链溶液的体积为5μL。
6. 根据权利要求6所述的试剂盒在非疾病诊断为目的的检测miRNA Let-7a中的应用，其特征在于：所述步骤（2）中磁珠混合液的浓度为5mg/mL，PBS缓冲液的pH为7.4，浓度为1mM；三链复合底物溶液的体积为3μL、PBS缓冲液的体积为150μL、磁珠混合液的体积为15μL；步骤（3）中BSA缓冲液的体积为150μL。
7. 根据权利要求7所述的试剂盒在非疾病诊断为目的的检测miRNA Let-7a中的应用，其特征在于：所述步骤（4）中PBS缓冲液的体积为160 μL，待测溶液的体积为200 μL，AP链溶液的体积为0.9μL，AP链溶液的浓度为10 μM。
8. 根据权利要求8所述的试剂盒在非疾病诊断为目的的检测miRNA Let-7a中的应用，其特征在于：所述步骤（5）中氧化石墨烯溶液的浓度为500 μg/μL、体积为14μL，荧光链溶液的浓度为10 μM、体积为2μL，Cutsmart缓冲液的浓度为10μM、体积为3μL。
9. 根据权利要求4所述的试剂盒在非疾病诊断为目的的检测miRNA Let-7a中的应用，其特征在于：所述步骤（6）中荧光强度的测试波长范围为470-650 nm，标准曲线为y=67239.30407+14881.69173x，其中y为荧光强度的峰值，x为miRNA Let-7a浓度的对数值。
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| CN116004769A true CN116004769A (zh) | 2023-04-25 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310082688.1A Pending CN116004769A (zh) | 2023-02-08 | 2023-02-08 | 一种基于磁珠和氧化石墨烯的辅助作用检测miRNA Let-7a的试剂盒及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116004769A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115896248A (zh) * | 2022-11-24 | 2023-04-04 | 四川大学 | 一种基于石墨烯纳米传感器的卵巢癌液态活检方法 |
-
2023
- 2023-02-08 CN CN202310082688.1A patent/CN116004769A/zh active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115896248A (zh) * | 2022-11-24 | 2023-04-04 | 四川大学 | 一种基于石墨烯纳米传感器的卵巢癌液态活检方法 |
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