CN115896248A

CN115896248A - 一种基于石墨烯纳米传感器的卵巢癌液态活检方法

Info

Publication number: CN115896248A
Application number: CN202211481717.3A
Authority: CN
Inventors: 郑艾; 万琪; 陈亚丽; 韩玲; 国云川
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2022-11-24
Filing date: 2022-11-24
Publication date: 2023-04-04

Abstract

本发明提供一种基于石墨烯纳米传感器的卵巢癌液态活检方法，包括以下步骤：S1：液态活检，直接对患者的血液进行采集检测；S2：制备氧化石墨烯，包括采用改良的Hummers法制备氧化石墨烯及对制得的氧化石墨烯进行表征；S3：荧光光谱法检测miRNA，包括对S1穿刺活检出的卵巢组织加入两种不同的缓冲液及GO溶液来配制溶液进行荧光测定；本发明通过氧化石墨烯和DSN酶切催化循环实现放大检测miRNA的荧光生物传感器，该方法可以高灵敏地检测miRNA，并采用后加入GO，提高了灵敏度、缩短了反应时间；引入DSN，利用DSN特异的切割活性，使得一个目标的miRNA分子可以循环和多个DNA探针分子杂交，产生很多不能吸附在GO表面的短片段DNA，荧光信号放大，实现miRNA的高灵敏检测。

Description

一种基于石墨烯纳米传感器的卵巢癌液态活检方法

技术领域

本发明属于医疗领域，具体地说是一种基于石墨烯纳米传感器的卵巢癌液态活检方法。

背景技术

卵巢癌是全球第三大常见的妇科恶性肿瘤，与妇科癌症中高死亡率相关，其管理的主要挑战之一是疾病的晚期临床表现导致生存率低下，许多研究已探索了循环miRNA在卵巢癌中的诊断、预后和治疗潜力，由于肿瘤的快速更新导致高基因转录和大量由mRNA和microRNA(miRNA)组成的cfRNA进入循环，所以卵巢癌患者相对于健康人群，其miRNA含量也相对较高，以此作为依据对患者进行进一步判断；

miRNA是一种由19-25个核苷酸组成的内源性非编码小分子RNA，它在诸如细胞生长和凋亡、胚胎后期发育、神经元的极性等众多生物程序中发挥重要调控作用，成熟的miRNA是由序列较长的初级转录物经过一系列核酸酶剪切加工而成的，随后组装进RNA诱导的沉默复合体，通过碱基互补配对原则识别结合靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译，调控其蛋白表达，使细胞的生长、增殖、分化和死亡保持在正常水平，如果组织中某种或某些miRNA表达失常，可能会引起某些癌基因或抑癌基因的异常激活或失活，从而导致癌症肿瘤的发生，且miRNA表达在肿瘤发生中存在明显的组织特异性，临床上采用手术切除肿瘤标本进行分析检测存在很大的局限性，比如该手术方法增加了病人的病痛、标本来源受限且难以实现连续监测及随访等，因此在血液中检出肿瘤特异性的miRNA并将其作为肿瘤生物学标志对于肿瘤的早期诊断、预后及治疗具有至关重要的意义；

传统的检测miRNA的方法主要有三种方式：(1)Northern-b l ott i ng；(2)微阵列芯片；(3)实时荧光定量PCR，Northern-b l ot是最为经典的方法，然而该方法不仅检测灵敏度低，而且操作繁琐、耗时长、难以精确定量，实时荧光定量PCR法是目前最为常用的方法，但是该方法试剂成本较高，检测时还需要选择合适的内参，以消除样品间RNA含量的差异，微阵列芯片技术是探索基因功能的一种有力手段，该检测技术样品用量少，且可实现miRNA的高通量检测，但是它需要对待测样本进行荧光标记，给实际样品的前处理带来麻烦，并且微阵列芯片技术成本高，价格昂贵，不适用于临床实验室操作；

为了弥补这些检测方法的劣势，本发明提供了一种基于石墨烯纳米传感器的卵巢癌液态活检方法，以解决上述问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于石墨烯纳米传感器的卵巢癌液态活检方法，以解决上述背景技术中提出的问题；

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于石墨烯纳米传感器的卵巢癌液态活检方法，包括以下步骤：

S1：液态活检，直接对患者的血液进行采集检测；

S2：制备氧化石墨烯，包括采用改良的Hummers法制备氧化石墨烯及对制得的氧化石墨烯进行表征；

S3：荧光光谱法检测mi RNA，包括对S1穿刺活检出的卵巢组织加入两种不同的缓冲液及GO溶液来配制溶液进行荧光测定。

优选的，所述S2中采用Hummers法制备氧化石墨烯的材料包括：1.0g石墨粉、0.5g硝酸钠、23ml 98％H₂SO₄、3gKMnO₄及3ml 30％H₂O₂。

优选的，所述S2中对制得的氧化石墨烯进行表征所使用的仪器为：拉曼光谱仪以及傅里叶红外光谱仪；同时将表征良好的氧化石墨烯分散于水中超声2h。

优选的，所述S3中所加入的缓冲液包括：0.075UDSN、1×DSN缓冲液及178.8μL的Tri s-HC l缓冲液。

优选的，所述S3中所加入的GO溶液容积及浓度分别为1.2μL和500μg/mL。

优选的，所述1×DSN缓冲液成分为：50mmo l/L Tr i s-HC l，PH8.0；5mmo l/LMgC l ₂，1mmo l/L DTT。

优选的，所述178.8μL的Tr i s-HC l缓冲液成分为：25mmo l/L，pH7.4，50mmo l/LNaC l。

优选的，所述S3中溶液配制所用的纯水均有超纯水装置提供，并经0.1％DEPC、高温高压灭菌处理。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过氧化石墨烯和DSN酶切催化循环实现放大检测mi RNA的荧光生物传感器，该方法可以高灵敏地检测mi RNA，主要表现在：

1.以新型的纳米材料GO作为检测平台，背景信号低，方法信噪比高，并采用后加入GO，提高了灵敏度、缩短了反应时间；

2.引入DSN，利用DSN特异的切割活性，使得一个目标的mi RNA分子可以循环和多个DNA探针分子杂交，产生很多不能吸附在GO表面的短片段DNA，荧光信号放大，实现mi RNA的高灵敏检测，从而可根据检测出的数据判断是否存在患有卵巢癌。

附图说明

图1是本发明流程结构示意图；

图2是本发明原理结构示意图；

图3是本发明mi RNA检测方法的特异性分析示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。

如图1-3所示，本发明提供一种基于石墨烯纳米传感器的卵巢癌液态活检方法，包括以下步骤：S1：液态活检，直接对患者的血液进行采集检测；S2：制备氧化石墨烯，包括采用改良的Hummers法制备氧化石墨烯及对制得的氧化石墨烯进行表征，S2中采用Hummers法制备氧化石墨烯的材料包括：1.0g石墨粉、0.5g硝酸钠、23ml 98％H₂SO₄、3gKMnO₄及3ml30％H₂O₂，S2中对制得的氧化石墨烯进行表征所使用的仪器为：拉曼光谱仪以及傅里叶红外光谱仪；同时将表征良好的氧化石墨烯分散于水中超声2h，主要操作步骤为：首先取1.0g石墨粉和0.5g硝酸钠以及23mL 98％H₂SO₄，放在冰浴中反应30mi n；然后缓慢加入3g KMnO4，将温度控制在20℃以下继续反应2h，随后缓慢升温至35℃，恒温30min；而后缓慢加入46mL水，将混合液加热至98℃，恒温15min，反应结束后，移去热源，在水浴中冷却10min，用140mL水稀释反应混合液之后加入3mL 30％H₂O_2，此时混合液为亮黄色，待反应液冷却至室温时，进行抽滤；沉淀物在二次水中透析一周至pH接近中性以去除多余的酸，最后所得的产物室温条件下放置，真空干燥过夜后用拉曼光谱仪以及傅里叶红外光谱仪对制得的氧化石墨烯进行表征，表征良好的氧化石墨烯分散于水中超声2h得到均匀的棕色氧化石墨烯水溶液(500ug/mL)，放置4℃冰箱保存备用；S3：荧光光谱法检测miRNA，包括对S1穿刺活检出的卵巢组织加入两种不同的缓冲液及GO溶液来配制溶液进行荧光测定，S3中所加入的GO溶液容积及浓度分别为1.2μL和500μg/mL，S3中所加入的缓冲液包括：0.075UDSN、1×DSN缓冲液及178.8μL的Tr is-HCl缓冲液，1×DSN缓冲液成分为：50mmo l/L Tr is-HCl，PH8.0；5mmol/LMgCl₂，1mmol/L DTT，178.8μL的Tr is-HCl缓冲液成分为：25mmo l/L，pH7.4，50mmo l/LNaCl，S3中溶液配制所用的纯水均有超纯水装置提供，并经0.1％DEPC、高温高压灭菌处理，荧光光谱法检测miRNA主要操作方法为：首先取4μL探针溶液P₀(10μmo l/L)、0.075UDSN、1×DSN缓冲液以及不同浓度的miRNA共计20μL于EP管中，45℃孵育25mi n，冷却至室温，再加入178.8μL的Tr i s-HCl缓冲液，1.2μL的GO溶液(500μg/mL)，整个体系的总体积为200μL，摇匀后反应5mi n，待反应完成，进行荧光测定；

本发明方法特异性检测：多数miRNA序列仅存在1-2个碱基的不同，这对miRNA家族的鉴别检测而言是一个困扰和挑战，为评估该方法的检测特异性，实验设计在相同的反应条件下，加入相同浓度的三种不同miRNA进行检测：其中，l et-7b(T₁₎和探针完全互补、let-7c(T₂₎为单碱基错配序列、miR-21(T₃₎为完全错配的序列，实验结果如图3所示，向体系中加入1nmo l/L的mi RNA时，T₁产生了明显的荧光增强信号(ΔF＝F-F₀)，但是T₂、T₃都没有产生荧光增强信号，甚至在加大T₂、T₃量情况下(10nmo l L)，T₃依然信号微弱，T₂产生的增强信号仅约为T₁的28％，由此可见本发明所设计的试验方法选择性很高，能够实现对miRNA的特异性检测。

具体工作原理：如图1-3所示，本发明基于GO-DSN设计的荧光生物传感器实现放大检测miRNA的原理如图1所示，DSN能够选择性降解双链DNA和DNA-RNA杂交体中的DNA，对单链核酸分子几乎没有作用，所以当溶液中仅存在FAM-DNA时，DSN对其没有酶切作用，当加入GO溶液后，FAM-DNA通过π键堆积作用吸附于GO表面，由于FRET效应荧光信号被淬灭，当溶液中存在目标mi RNA时，目标分子和探针分子通过碱基互补配对原则形成稳定的DNA-RNA杂交双链，这就形成了DSN酶切作用良好的底物，当底物长度为10个碱基时，DSN开始酶切作用，底物长度越长，酶切产物为6个碱基或者更短，因此，在我们的反应体系中，探针DNA被剪切成短的核苷酸序列，mi RNA则释放到溶液中与另一个探针DNA杂交，发起下一个酶切反应，如此循环往复，少量的mi RNA可以产生很多短DNA片段和短FAM-DNA片段，加入GO溶液，由于短链核苷酸序列和GO之间微弱的分子间作用力，FAM-DNA不被吸附，仍发射出强的荧光信号，在一定反应时间内，产生的DNA片段数量和mi RNA含量成正比例关系，因此，根据检测反应前后体系荧光强度的变化，可以实现放大定量检测mi RNA的目的，从而可根据检测出的数据判断是否存在患有卵巢癌，这就是该基于石墨烯纳米传感器的卵巢癌液态活检方法的特点。

本发明的实施方式是为了示例和描述起见而给出的，尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

1.一种基于石墨烯纳米传感器的卵巢癌液态活检方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：液态活检，直接对患者的血液进行采集检测；

S3：荧光光谱法检测miRNA，包括对S1穿刺活检出的卵巢组织加入两种不同的缓冲液及GO溶液来配制溶液进行荧光测定。

2.如权利要求1所述的一种基于石墨烯纳米传感器的卵巢癌液态活检方法，其特征在于：所述S2中采用Hummers法制备氧化石墨烯的材料包括：1.0g石墨粉、0.5g硝酸钠、23ml98％H₂SO₄、3gKMnO₄及3ml 30％H₂O₂。

3.如权利要求1所述的一种基于石墨烯纳米传感器的卵巢癌液态活检方法，其特征在于：所述S2中对制得的氧化石墨烯进行表征所使用的仪器为：拉曼光谱仪以及傅里叶红外光谱仪；同时将表征良好的氧化石墨烯分散于水中超声2h。

4.如权利要求1所述的一种基于石墨烯纳米传感器的卵巢癌液态活检方法，其特征在于：所述S3中所加入的缓冲液包括：0.075UDSN、1×DSN缓冲液及178.8μL的Tris-HCl缓冲液。

5.如权利要求1所述的一种基于石墨烯纳米传感器的卵巢癌液态活检方法，其特征在于：所述S3中所加入的GO溶液容积及浓度分别为1.2μL和500μg/mL。

6.如权利要求4所述的一种基于石墨烯纳米传感器的卵巢癌液态活检方法，其特征在于：所述1×DSN缓冲液成分为：50mmol/L Tris-HCl，PH8.0；5mmol/L MgCl₂，1mmol/L DTT。

7.如权利要求4所述的一种基于石墨烯纳米传感器的卵巢癌液态活检方法，其特征在于：所述178.8μL的Tris-HCl缓冲液成分为：25mmol/L，pH7.4，50mmol/L NaCl。

8.如权利要求1所述的一种基于石墨烯纳米传感器的卵巢癌液态活检方法，其特征在于：所述S3中溶液配制所用的纯水均有超纯水装置提供，并经0.1％DEPC、高温高压灭菌处理。