CN111592875B - 一种荧光纤维素酶铂纳米簇及制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种绿色简单高效的荧光铂纳米簇及制备方法和应用，制备方法包括如下步骤：将纤维素酶溶液与H2PtCl6溶液进行混合，涡旋器充分混匀5～10min；NaOH溶液调节pH值为8～13，涡旋器再次混匀5～10min；将所制备的样品在水浴锅避光反应6～24h可得。该纳米簇在305nm的紫外灯照射下呈现蓝色荧光，其最大激发波长为350nm，最大发射波长为440nm。本发明还建立了一种使用该荧光纤维素酶铂纳米簇检测实际样品中氨苄西林浓度的检测方法，该方法稳定、快捷、灵敏，且特异性强、重现性好，可用于环境、食品、医药、农业生产等领域对氨苄西林含量的监测。

Description

一种荧光纤维素酶铂纳米簇及制备方法和应用
技术领域
本发明涉及功能荧光纳米材料的制备和应用领域，更具体地，涉及一种荧光纤维素酶铂纳米簇及其制备方法和应用。
背景技术
纤维素酶(Cellulase)主要来源于黑曲霉和木霉，是水解纤维素生成葡萄糖和低聚合度纤维的一组酶的总称，包括葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和纤维二糖酶3个主要组分。目前，纤维素酶已被广泛应用于纺织、日用化工、造纸、食品发酵、工业洗涤、烟草、石油开采、废水处理及饲料等领域，其应用前景十分广阔。
金属纳米簇具有优异的光学稳定性、大的斯托克斯位移和较低的毒性，可应用于金属离子、生物小分子、药物检测等分析检测领域以及生物成像等方面。其中，超小型的铂纳米簇因其较高的催化活性及良好的生物相容性被认为是生物传感和荧光检测等光学和生物应用方面最有前景的候选材料。但是相对于金、银纳米簇材料，关于铂纳米簇的研究应用还相对少见。发掘制备新型铂纳米簇，研究铂纳米簇物理化学性质，探索其潜在应用，对纳米技术及分析检测领域的快速发展都有着重要的意义。
氨苄西林(Ampicillin，Amp)是临床上常用的广谱抗生素，又名氨苄青霉素、安比西林，对革兰氏阴性菌和阳性菌均可产生不同程度的抑制作用。Amp是畜牧养殖过程中常用β-内酰胺类抗生素药物之一，由于其可被作为饲料添加剂使用，导致动物源性食品中会有大量氨苄青霉素残留，因此，氨苄青霉素滥用问题已得到广泛关注。2002年我国农业部第235号公告规定氨苄青霉素在牛奶中的最高残留限量(Maximumresidue limits，MRLs)为10μg·kg-1，可食组织中MRLs为50μg·kg-1。但是用于其浓度检测的紫外分光光度法、荧光法、高效液相色谱-紫外检测法等方法存在检测限过高、特异性差、仪器昂贵等缺陷。因此，建立操作简单、特异性强、成本低的氯霉素残留的检验方法是非常必要的。
发明内容
本发明目的是提供一种纤维素酶铂纳米簇(Cellulase-PtNCs)。
本发明的一种纤维素酶铂纳米簇，其是以纤维素酶和高价铂配合物为原料制备，所述纤维素酶铂纳米簇的粒径小于5nm。
优选所述纤维素酶铂纳米簇的荧光最大激发波长为350nm，最大发射波长为440nm，所述高价铂配合物为H2PtCl6。
本发明的另一个目的是提供所述的纤维素酶铂纳米簇的制备方法。所述方法是将纤维素酶的水溶液与高价铂配合物的水溶液进行混合，然后加NaOH溶液调节pH值为8～13，避光水浴反应完全后即得。
优选所述制备方法包括如下步骤：
(1)制备浓度为0.5-2mM的纤维素酶的水溶液；
(2)制备浓度为25-100mM的H2PtCl6的水溶液；
(3)将H2PtCl6溶液加入纤维素酶水溶液中，使纤维素酶与H2PtCl6两者的摩尔比为1.5:1-4:1，充分混匀；
(4)向步骤(3)得到的混合溶液中添加NaOH调节溶液pH值至8～13，充分混匀2～20min；
(5)将步骤(4)得到的混合溶液在25℃～65℃条件下避光水浴6～24h后即得；
(6)将步骤(5)得到的混合溶液离心后取上清液并置于4℃冰箱避光保存备用。
进一步，优选步骤(1)所述的纤维素酶水溶液的浓度为1mM。
进一步优选为步骤(2)所述的H2PtCl6水溶液的浓度为25mM。
进一步优选为步骤(3)所述的纤维素酶与H2PtCl6两者的摩尔比为3.5:1。
进一步优选为步骤(4)所述的pH值为12。
进一步优选为步骤(5)所述的反应温度为37℃，反应时间为12h。
本发明还有一个目的是提供所述纤维素酶铂纳米簇在氨苄西林检测中的应用。
本发明发现氨苄西林能够使本发明制备的纳米簇的荧光淬灭。通过对氨苄西林进行浓度梯度检测发现，Cellulase-PtNCs对氨苄西林具有特异的选择性和高敏感性。
本发明对氨苄西林检测采用荧光分光光度法，首先向铂纳米簇体系中加入一系列不同浓度的氨苄西林溶液，优选检测标准体系为1mL，其中不同浓度的氨苄西林50μL，上述纤维素酶铂纳米簇水溶液50μL，加水补足至1mL，25℃水浴5min后，在激发光波长为350nm的条件下，检测溶液在440nm的发射光的峰高。
优选其检测氨苄西林的线性范围为0.05-1mg/mL，检测限为0.02mg/mL。
优选其应用范围包括牛奶和肉类中氨苄西林的检测。肉类包括鱼肉、牛肉、鸡肉和猪肉等。
有益效果
本发明提供了一种新型的荧光铂纳米簇。它是以纤维素酶为原料制备的，具备较强的发光性能，超小尺寸，荧光稳定性高等特点的铂纳米簇，其制备方法具有操作简单，成本低廉，效率高，制备过程无污染等优点。此外本发明还设计了一种新型的基于所述纤维素酶铂纳米簇作为荧光探针的检测体系，可定量检测氨苄西林浓度，其方法简便、灵敏、准确、耗时短、易实现，不需要昂贵的仪器。将此检测方法应用于环境监测，食品医药和农业生产等领域，可带来可观的社会经济效益和环保效益。
附图说明
以下，结合附图详细说明本发明的具体实施方式。
图1为实施例1所制的纤维素酶铂纳米簇的透射电镜图。
图2为实施例1所制的纤维素酶铂纳米簇的荧光光谱图。
图3为实施例1所制的纤维素酶铂纳米簇的紫外-可见吸收光谱图。
图4为实施例1所制的纤维素酶铂纳米簇的红外光谱图。
图5为实施例1所制的纤维素酶铂纳米簇应用于Amp检测的荧光光谱图。
图6为实施例1所制的纤维素酶铂纳米簇应用于Amp检测的线性关系图。
具体实施方式
下面结合说明书附图介绍本发明的较佳实施例，举例证明本发明可以实施，通过向本领域中的技术人员完整介绍本发明，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，其保护范围并非仅限于文中提到的实施例，本文的附图和说明本质上是举例说明而不是限制本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的原材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到或已公开。
实施例1：纤维素酶铂纳米簇的制备，具体步骤如下：
(1)取纤维素酶加入纯水中制备成1mM的纤维素酶溶液；
(2)制备浓度为25mM的H2PtCl6的水溶液；
(3)将H2PtCl6溶液加入到纤维素酶溶液中，使其中的纤维素酶与H2PtCl6两种纯原料的摩尔比例为3.5:1，涡旋器充分混匀，混匀时间为5min；
(4)随后加入1M浓度的NaOH的水溶液于步骤(3)得到的溶液中调节溶液的pH为12，涡旋器迅速混匀，混匀时间为5min；
(5)在避光的条件下，将所制备的样品置于水浴锅内，温度设置37℃，反应时间为12h，得到铂纳米簇的聚合物。5,000rpm/min离心10min后，取上清液并置于4℃冰箱避光保存备用。
取实施例1所制的纤维素酶铂纳米簇(在冰箱中放置的备用的上清液)用去离子水稀释20倍后，取10μL滴于铜网，美国FEI Tecnai G-20型透射电子显微镜(TransmissionElectron Microscope,TEM)，加速电压100kV。其形貌如图1所示，呈大小均匀的球形，其粒径大小均在5nm以下。
如图2所示：荧光光谱表明所制的纤维素酶包裹的铂纳米簇，其荧光最佳激发波长在350nm处，荧光最佳发射波长在440nm处。
本实施例的纤维素酶铂纳米簇在302nm的紫外灯照射下呈现蓝色荧光。如图3所示：纤维素酶铂纳米簇的紫外吸收曲线300-350nm附近具有较宽的吸收峰，而作为原料的纤维素酶在此处没有，证明本发明以纤维素酶为模板制备了纤维素酶铂纳米簇是不同于纤维素酶的新物质。
如图4所示：原料纤维素酶和实施例1所制的纤维素酶铂纳米簇在1000-1500cm-1有明显不同，证明本发明以纤维素酶为模板制备了纤维素酶铂纳米簇是不同于纤维素酶的新物质。
实施例2：纤维素酶铂纳米簇的制备，具体步骤如下：
(1)取纤维素酶加入纯水中制备成0.5mM的纤维素酶溶液；
(2)制备浓度为100mM的H2PtCl6的水溶液；
(3)将H2PtCl6溶液加入到纤维素酶溶液中，纤维素酶与H2PtCl6的摩尔比例为0.5:1，涡旋器充分混匀，混匀时间为5min；
(4)随后加入1M浓度的NaOH溶液于步骤(3)得到的溶液中调节pH为12，涡旋器充分混匀，混匀时间为5min；
(5)在避光的条件下，将所制备的样品置于水浴锅内，温度设置37℃，反应时间为12h，得到铂纳米簇的聚合物，5,000rpm/min离心10min后，取上清液并置于4℃冰箱避光保存备用。
实施例3：纤维素酶铂纳米簇的制备，具体步骤如下：
(1)取纤维素酶加入纯水中制备成2mM的纤维素酶溶液；
(2)将50mM的H2PtCl6溶液加入到纤维素酶溶液中，纤维素酶与H2PtCl6的摩尔比例为3:1，涡旋器充分混匀，混匀时间为5min；
(3)随后加入1M浓度的NaOH溶液于步骤(2)得到的溶液中调节pH为12，涡旋器迅速混匀，混匀时间为5min；
(4)在避光的条件下，将所制备的样品置于水浴锅内，温度设置60℃，反应时间为8h，得到铂纳米簇的聚合物，5,000rpm/min离心10min后，取上清液并置于4℃冰箱避光保存备用。
实施例4：纤维素酶铂纳米簇的制备，具体步骤如下：
(1)取纤维素酶加入纯水中制备成2mM的纤维素酶溶液；
(2)将100mM的H2PtCl6溶液加入到纤维素酶溶液中，保证纤维素酶与H2PtCl6的摩尔比例为3:1，涡旋器充分混匀，混匀时间为5min；
(3)随后加入1M浓度的NaOH溶液于步骤(2)得到的溶液中调节pH为10，涡旋器迅速混匀，混匀时间为5min；
(4)在避光的条件下，将所制备的样品置于水浴锅内，温度设置37℃，反应时间为12h，得到铂纳米簇的聚合物，5,000rpm/min离心10min后，取上清液并置于4℃冰箱避光保存备用。
实施例5：纤维素酶铂纳米簇的制备，具体步骤如下：
(1)取纤维素酶加入纯水中制备成1.5mM的纤维素酶溶液；
(2)将25mM的H2PtCl6溶液加入到纤维素酶溶液中，保证纤维素酶与H2PtCl6的摩尔比例为4:1，涡旋器充分混匀，混匀时间为5min；
(3)随后加入1M浓度的NaOH溶液于步骤(2)得到的溶液中调节pH为12，涡旋器迅速混匀，混匀时间为5min；
(4)在避光的条件下，将所制备的样品置于水浴锅内，温度控制在37℃，反应时间为12h，得到铂纳米簇的聚合物，5,000rpm/min离心10min后，取上清液并置于4℃冰箱避光保存备用。
实施例6：纤维素酶铂纳米簇对氨苄西林的检测
检测标准体系为1mL，其中不同浓度的氨苄西林溶液50μL，上述实施例1制得的纤维素酶铂纳米簇溶液50μL，加去离子水补足，25℃水浴5min。氨苄西林在总体系的终浓度为0.05mg/mL，0.1mg/mL，0.15mg/mL，0.3mg/mL，0.4mg/mL，0.6mg/mL，0.8mg/mL，1mg/mL，1.5mg/mL。25℃水浴5min后，使用F-4500荧光分光光度计检测，在激发光波长为350nm的条件下，检测混合溶液在440nm的发射光的峰高，记录数据，绘制标准曲线。
图5显示，纤维素酶铂纳米簇的荧光强度随氨苄西林浓度的增大，而呈稳定上升趋势。如图6所示，当氨苄西林水溶液的浓度为0.05-1mg/mL时，荧光强度和氨苄西林浓度呈现良好的线性关系，y＝0.50668x+1.03931(R2＝0.99034)，氨苄西林浓度的检测限为0.02mg/mL。由此可见，本发明制备得到的纤维素酶铂纳米簇对氨苄西林的检测的选择性和灵敏性都很高，可以用来检测实际样品中氨苄西林的含量。
实施例7：纤维素酶铂纳米簇在实际样品中检测氨苄西林的应用
(1)实际样品的准备：
为了验证纤维素酶铂纳米簇对氨苄西林在实际应用中的可行性，将其应用于动物性食品中氨苄西林含量的测定。选定了六种实际样品：纯牛奶，鱼肉，牛肉，鸡肉，猪肉以及长江水。纯牛奶直接量取10μL倒入EP管中，用超纯水稀释400倍后混匀备用。将鱼肉，牛肉，鸡肉，猪肉四种肉类样品分别称取30g，与100mM的磷酸盐缓冲液(pH＝7.0～7.2)等体积混合后置于绞肉机中搅碎，将肉浆转移至新的离心管中置于4℃冰箱保存，静置一段时间后取上清液10,000rpm离心10min，最后将所有样品的上清液通过0.45mm膜滤器过滤，稀释400倍后于4℃冰箱中保存备用。将长江水样10,000rpm离心10min，0.22μm滤膜抽滤，并储存在4℃冰箱中备用。共制得6种待测样品。
(2)实际样品的检测：
检测标准体系为1mL，其中实施例1所制得纤维素酶铂纳米簇溶液50μL，上述的待测样品950μL。在25℃水浴5min后，使用F-4500荧光分光光度计检测，在激发光波长为350nm的条件下，检测混合溶液在440nm的发射光的峰高,，记录数据，将测试结果带入绘制的标准曲线中计算。
将六种待测样品分别按照上述方法进行检测，实验独立重复3次。六种样品的检测结果均为0mg/mL。
(3)检测加标回收率：
检测标准体系为1mL，其中不同浓度的氨苄西林溶液50μL，实施例1所制得纤维素酶铂纳米簇溶液50μL，加入上述的待测样品900μL补足至1mL，25℃水浴5min，使用F-4500荧光分光光度计检测，在激发光波长为350nm的条件下，测定上述所得混合溶液在440nm的发射光的峰高，记录数据，实验独立重复3次。将测试结果带入绘制的标准曲线中计算，同时对实际样品中氨苄西林的回收率进行计算。从表1可以看出，回收率在95％以上的可接受范围内。说明该方法是有效的，可应用于实际样品中氨苄西林的检测。
表1Cellulase-Pt NCs对各样品中氨苄霉素的检测
Figure BDA0002381041500000091

Claims (3)

1. 一种纤维素酶铂纳米簇在氨苄西林检测中的应用，其特征是所述纤维素酶铂纳米簇以纤维素酶和高价铂配合物为原料制备, 所述高价铂配合物为 H2PtCl6, 所述纳米簇的制备方法包括如下步骤：
（1）制备浓度为 0.5-2 mM 的纤维素酶的水溶液；
（2）制备浓度为 25-100 mM 的 H2PtCl6 的水溶液；
（3 ）将 H2PtCl6 溶液加入纤维素酶水溶液中，使纤维素酶与 H2PtCl6 两者的摩尔比为
1.5:1-4:1，充分混匀；
（4）向步骤(3)得到的混合溶液中添加 NaOH 调节溶液 pH 值至 8~13，充分混匀 2~20min；
（5）将步骤(4)得到的混合溶液在 25℃~65℃条件下避光水浴 6~24 h 后即得；
（6）将步骤(5)得到的混合溶液离心后取上清液并置于 4℃冰箱避光保存备用。
2.如权利要求 1 所述的纤维素酶铂纳米簇在氨苄西林检测中的应用，其特征是检测氨苄西林的线性范围为 0.05-1 mg/mL，检测限为 0.02 mg/mL。
3. 如权利要求 1 所述的纤维素酶铂纳米簇在氨苄西林检测中的应用，其特征是其应用范围包括牛奶和肉类中氨苄西林的检测。
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