KR20110057141A

KR20110057141A - 안정화된 금 나노클러스터를 포함하는 조성물, 물품 및 그의 제조 방법

Info

Publication number: KR20110057141A
Application number: KR1020117004955A
Authority: KR
Inventors: 재키 와이. 잉; 지안핑 시에; 위안강 젱
Original assignee: 에이전시 포 사이언스, 테크놀로지 앤드 리서치
Priority date: 2008-08-05
Filing date: 2009-08-04
Publication date: 2011-05-31
Also published as: WO2010016803A1; EP2329251A1; US20110165689A1; CN102150034A; JP2011530699A

Abstract

본 발명은 일반적으로 금 나노클러스터, 특히 형광성 금 나노클러스터에 관한 것이다. 상기 금 나노클러스터는, 예를 들면 단백질 또는 안정화제에 의해 안정화될 수 있다. 몇몇 경우에, 금 나노클러스터는 샘플 중에 수은 이온의 존재, 부재, 및/또는 농도를 판정하기 위한 방법 또는 물품에 사용될 수 있다.

Description

안정화된 금 나노클러스터를 포함하는 조성물, 물품 및 그의 제조 방법 {METHODS, COMPOSITIONS, AND ARTICLES COMPRISING STABILIZED GOLD NANOCLUSTERS}

본 발명은 일반적으로 금 나노클러스터, 특히 형광성 금 나노클러스터에 관한 것이다. 금 나노클러스터는 예를 들면 단백질 또는 안정화제에 의해 안정화될 수 있다. 몇몇 경우에, 금 나노클러스터는 샘플 중 수은의 존재, 부재 및/또는 농도를 판정하기 위한 방법 또는 물품에서 사용될 수 있다.

관련 출원

본 출원은 2008년 8월 5일에 출원되어 공동 계류중인 미국 가특허출원 60/129,994에 대한 35 U.S.C. §119(e)에 의거한 우선권을 주장하며, 상기 가출원 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

귀금속 나노클러스터(NCs)는 전형적으로 수십 개의 금속 원자로 이루어지며, 일반적으로 그 크기가 1nm 미만이다. 금속 나노클러스터에는 자유 전자가 공간적으로 유폐되어 있어서, 분리되고 크기-조정가능한 전자 전이(electronic transition)가 초래될 수 있고, 발광 및 독특한 하전(charging) 성질과 같은 분자적 성질을 가지게 된다. 치수가 더 크고(예를 들면, 약 3∼100nm) 독성 금속종(예를 들면, 카드뮴, 납)을 함유할 수 있는 반도체 양자 도트(quantum dots; QDs)와는 대조적으로, 귀금속 나노클러스터는 초미세 크기와 무독성으로 인해 다양한 응용 분야(예를 들면, 센싱)용으로 매력적이다. 적색선 또는 근적외선 방출을 이용하여, 수은 이온의 검출과 같은 여러 가지 응용 분야에서 사용할 수 있는 형광성 금 나노클러스터를 합성하는 방법 및 기술을 개발하는 것이 관심을 끌고 있다.

일상적 수은 이온(Hg² ⁺)의 검출은 환경과 사람의 건강에 대한 수은 이온의 유해한 영향 때문에 수중 생태계 내 환경을 모니터링하는 데에 중심을 둔다. 지난 수년 동안에, 작은 유기 분자(형광단(fluorophore) 또는 발색단(chromophore)), 생물분자(단백질, 항체, 올리고뉴클레오티드, DNA 효소, 등), 및 다양한 물질(폴리머 또는 무기물)을 기재로 하여 수은 이온의 검출을 위한 여러 가지 광학적 센서 시스템이 개발되었다. 그러나, 이러한 시스템 중 많은 것들이 단순성, 감도, 선택성에 관하여 한정되어 있고, 및/또는 실제 응용(예를 들면, 수성 환경과의 비상용성) 면에서 제한되어 있다.

따라서, 향상된 방법 및 물질이 필요하다.

본 발명의 목적은, 단백질 또는 안정화제에 의해 안정화될 수 있는 금 나노클러스터, 특히 형광성 금 나노클러스터, 및 이를 이용한 샘플 중 수은의 존재, 부재 및/또는 농도를 판정하기 위한 방법 또는 물품을 제공하는 것이다.

몇몇 구현예에서, 본 발명은 조성물을 제공한다. 제1 구현예에서, 조성물은 복수 개의 금 나노클러스터 및 단백질 또는 안정화제를 포함하고, 상기 금 나노클러스터는 약 630nm 내지 약 700nm의 파장에서 1% 이상의 양자 수율로 형광을 방출할 수 있다.

몇몇 구현예에서, 본 발명은 여러 가지 방법을 제공한다. 제1 구현예에 따르면, 복수 개의 금 나노클러스터의 형성 방법은, 복수 개의 금 원자 전구체 분자 및 복수 개의 단백질 분자를 포함하는 반응 혼합물을 형성하는데, 금 원자 전구체 분자 대 단백질 분자의 비가 약 5:1 이상인 단계; 상기 반응 혼합물의 pH를 약 11보다 높게 조절하는 단계; 및 하나 이상의 단백질 분자에 의해 안정화된 복수 개의 금 나노클러스터를 형성하기에 충분한 시간 동안 상기 반응 혼합물을 적합한 온도로 유지시키는 단계를 포함하고, 상기 금 나노클러스터는 약 2nm 미만의 평균 직경을 가진다.

또 다른 구현예에서, 수은 이온의 검출 방법은, 복수 개의 금속 나노클러스터 및 단백질 또는 안정화제를 포함하는 조성물을 제공하는 단계, 수은 이온을 함유하는 것으로 의심되는 샘플에 상기 조성물을 노출시키는 단계, 및 상기 샘플이 수은을 포함하는지 여부를 판정하는 단계를 포함한다.

또 다른 구현예에서, 수은 이온의 검출 방법은, 약 630nm 내지 약 700nm의 파장에서 양자 수율이 1% 이상인 제1 형광 강도를 가진 복수 개의 금 나노클러스터를 제공하는 단계; 수은 이온을 함유하는 것으로 의심되는 샘플에 상기 나노클러스터를 노출시켜 상기 형광 강도의 변화를 판정하는 단계, 및 상기 형광 강도의 변화를 토대로 상기 샘플이 수은을 포함하는지 여부를 판정하는 단계를 포함한다.

몇몇 경우에, 수은 이온을 검출하는 방법은, 식 Au₂₅를 가지는 복수 개의 안정화된 금 나노클러스터를 포함하는 조성물을 제공하는 단계, 수은 이온을 함유하는 것으로 의심되는 샘플에 상기 조성물을 노출시키는 단계, 및 상기 샘플이 수은을 포함하는지 여부를 판정하는 단계를 포함한다.

몇몇 구현예에서, 본 발명은 여러 가지 물품을 제공한다. 몇몇 경우에, 샘플 중에 수은 이온의 존재 또는 부재를 판정하기 위한 물품은, 기판, 및 상기 기판과 관련된 조성물을 포함하고, 상기 조성물은 금 나노클러스터 및 단백질 또는 안정화제를 포함한다.

본 발명에 의하면, 단백질 또는 안정화제에 의해 안정화될 수 있는 형광성 금 나노클러스터, 및 이를 이용한 샘플 중 수은의 존재, 부재 및/또는 농도를 판정하기 위한 방법 또는 물품이 제공된다.

도 1은 본 발명의 비제한적 구현예에 따른, 소 혈청 알부민(BSA-Au-NCs)와 관련된 금 나노클러스터의 형성 과정의 개략도이다.
도 2A는 본 발명의 일 구현예에 따른, (1) BSA 분말, (2) BSA 수용액, (3) BSA-Au-NCs 수용액 및 (4) BSA-Au-NCs 분말의 사진으로서, 상부는 가시광, 하부는 UV 광 하에 촬영된 것이다.
도 2B는 (i) BSA 및 (ii) BSA-Au-NCs의 수용액의 광학적 흡수 스펙트럼(점선) 및 광전자방출 스펙트럼(실선, λ_ex=470nm)을 나타낸다. 삽입도는 BSA-Au-NCs에 있어서 약 480nm에서의 약한 흡수 피크를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 비제한적 구현예에 따른, 37℃에서 HAuCl4 및 BSA를 포함하는 반응 혼합물에 대한 광전자방출 스펙트럼(λ_ex=470nm)의 시간에 따른 변화를 나타낸다.
도 4는 (A) (ⅲ) BSA-Au-NCs에서 Au 4f의 XPS 스펙트럼 및 (B) (iv) BSA 및 (v) BSA-Au-NCs의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 나타낸다.
도 4C는 비제한적 구현예에 따른, 공기중 BSA-Au-NCs 분말의 TGA 분석을 나타낸다.
도 5는 BSA-Au-NCs의 대표적 TEM 이미지를 나타낸다.
도 6은 비제한적 구현예에 따른, (i 또는 흑색) BSA 및 (ii, 또는 회색) BSA-Au-NCs의 (A) DLS 히스토그램, (B) 퓨리에-변환 적외선(FTIR) 스펙트럼, (C) 제타 전위 결과, 및 (D) 원자외선 원편광 2색성(circular dichroism; CD) 스펙트럼을 나타낸다. (A)에서의 삽입도는 (ii) BSA(FITC 염료로 공액화된) 및 (i) BSA-Au-NCs의 전기영동 데이터(UV 광 하에서)를 나타낸다.
도 7은 (0) BSA, (1) 최적 조건에서 합성된 BSA-Au-NCs, (2) NaBH₄를 사용하여 합성된 BSA-Au-NCs, (3) NaOH를 사용하여 합성된 BSA-Au-NCs, (4) 100℃에서 합성된 BSA-Au-NCs, 및 (5) 낮은 농도의 BSA를 사용하여 합성된 BSA-Au-NCs에 대한, (A) 가시광과 (B) 자외선 광에서의 사진, (C) 광학적 흡수 스펙트럼 및 (D) 광전자방출 스펙트럼(λ_ex=470nm)을 나타낸다.
도 8은 NaOH를 사용하지 않고 합성된 BSA-Au-NCs의 TEM 이미지를 나타낸다.
도 9는 Hg² ⁺ 이온(50mM)의 (1) ??존재 및 (2) 부재 하에 (A) 광전자방출 스펙트럼(λ_ex=470nm), 및 (B) UV 광 하의 BSA-Au-NCs의 사진, 및 (C) BSA-Au-NCs의 형광 소멸(fluorescence quenching)에 의거한 Hg² ⁺ 센싱의 개략도를 나타낸다.
도 10은 (A) BSA-Au-NCs에 의해 격리된(sequestered) Hg 이온 및 (B) NaBH₄에 의해 환원된 격리된 Hg 이온의 XPS Hg 4f 스펙트럼을 나타낸다.
도 11은 Hg² ⁺ 이온의 존재 하에 BSA-Au-NCs의 대표적인 TEM 이미지를 나타낸다.
도 12는 (A) 폴리스티렌 비즈에 공액을 이룬 BSA-Au-NCs의 개략도 및 (B) 폴리스티렌 비즈에 공액을 이룬 BSA-Au-NCs의 대표적 형광 이미지를 나타낸다.
도 13은 50mM의 다양한 금속 이온의 존재 하에, BSA-Au-NCs의 수용액의 (A) UV 광에서의 사진 및 (B) λ_ex=470nm에서의 상대적 형광(I/I₀)을 나타낸다.
도 14는 (A) 여러 가지 Hg² ⁺ 농도의 존재 하에서의 BSA-Au-NCs(20nM)의 광전자방출 스펙트럼(λ_ex=470nm), 및 (B) Hg² ⁺ 농도의 함수로서 BSA-Au-NCs의 상대적 형광(I/I₀)을 나타낸다.
도 14C는 Hg² ⁺의 1∼20nM에 대한 직선적 검출 범위를 나타낸다.
도 15A는 UV 광으로 조사된 BSA-Au-NCs를 가진 테스트 스트립의 사진으로서, 테스트 스트립이 50mM의 다양한 금속 이온의 용액 중에 침지된 후의 사진을 나타낸다.
도 15B는 Hg² ⁺의 용액 중에 침지된 테스트 스트립의 사진(UV 광에서)을 나타낸다.
도 16은 (i) BSA, (ii) 인간 혈청 알부민, 및 (ⅲ) 리소자임을 이용하여 합성된 Au-NCs의 수용액의 광전자방출 스펙트럼(λ_ex=470nm)을 나타낸다.
본 발명의 다른 측면, 구현예 및 특징은 첨부된 도면과 함께 검토될 때 이하의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 첨부된 도면은 개략적인 것이며, 축척에 따라 도시된 것은 아니다. 명확성을 위해서, 모든 도면에서 모든 부분에 표지되지는 않았고, 예시가 없어도 당업자가 이해하는 데 문제가 없는 경우에는 본 발명의 각 구현예에 대해서도 마찬가지로 모든 부분을 예시하지는 않았다. 원용에 의해 본 명세서에 포함되는 모든 특허 출원 및 특허는 그 전체가 원용에 의해 포함된다. 상충되는 경우에, 정의를 포함하여 본 발명의 명세서가 우선한다.

본 발명은 일반적으로 금 나노클러스터를 포함하는 여러 가지 방법, 조성물 및 물품에 관한 것이다. 몇몇 경우에, 금 나노클러스터는 형광성이고, 높은 양자 수율을 가진 적색 에너지를 방출한다. 금 나노클러스터는, 예를 들면 본 명세서에 기재된 바와 같이, 단백질 또는 안정화제에 의해 안정화될 수 있다. 본 발명의 몇몇 측면은, 예를 들면 수은의 검출을 위해, 금 나노클러스터를 포함하는 용도에 관한 것이다.

몇몇 구현예에서, 금 나노클러스터는 복수 개의 금 원자를 포함한다. 여기서 사용되는 "나노클러스터"라는 용어는 해당 기술 분야의 통상적 의미를 가지며, 수십 개의 금속 원자를 포함하는 클러스터를 의미한다. 몇몇 경우에, 나노클러스터는 약 2개 내지 약 30개의 관련된 금 원자를 포함할 수 있다. 특별한 경우에, 나노클러스터는 약 25개의 금 원자를 포함한다. 당업자는 나노클러스터가 포함하는 금속 원자의 대략적 개수를 판정하는 방법(예; 질량 분광분석법)을 알 것이다. 몇몇 경우에, 나노클러스터는 0보다 큰 산화 상태에 있는 금 원자(예를 들면, Au⁺, Au⁺³)를 하나 이상 포함할 수 있다. 0보다 큰 산화 상태에 있는 하나 이상의 금 원자의 존재는, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 수은 이온의 검출용 금 나노클러스터의 응용에 있어서 중요한 특징일 수 있다.

몇몇 구현예에서, 본 발명의 금 나노클러스터는 발광성일 수 있다. 발광성 물질이란 전자기파의 양자를 흡수하여 해당 물질이 여기 상태 구조를 갖도록 할 수 있고, 경우에 따라서는 방사선을 방출하도록 할 수 있는 물질을 의미한다. 방출된 방사선이 발광(luminescence)일 수 있고, 여기서 "발광"이란 자외선 또는 가시적 방사선의 방출로 정의된다. 특정 형태의 발광은 가시적 방사선의 흡수와 방출 사이의 시간 간격이 10^-12초 내지 10^-7초 범위인 "형광(fluorescence)"을 포함한다. 몇몇 경우에, 광원에 노출되었을 때, 본 발명의 금 나노클러스터는 형광 에너지를 방출할 수 있다. 방출된 형광 에너지는 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 검출될 수 있다. 몇몇 경우에, 방출된 형광 에너지의 강도 및/또는 파장은, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 분석되는 샘플에 관한 정보를 제공할 수 있다.

몇몇 구현예에서, 금 나노클러스터는 약 700 내지 약 630nm의 파장, 약 680 내지 약 640nm, 약 675 내지 약 650nm, 또는 약 640 내지 약 650nm, 약 660nm, 약 670nm, 약 680nm, 약 690nm의 파장에서 광을 방출할 수 있고, 및/또는 λ_max 방출(예를 들면 최대 방출의 파장)을 가질 수 있다. 즉, 몇몇 구현예에서, 금 나노클러스터는 적색 에너지를 방출하거나 및/또는 UV-광선 하에서 적색으로 나타날 수 있다. 그러나 몇몇 경우에, 금 나노클러스터는 근적외선 영역(예; 약 700nm 내지 약 1400nm) 또는 가시광의 다른 파장 영역(예; 약 400nm 내지 약 630nm)에서 광을 방출할 수 있고, 및/또는 λ_max 방출을 가질 수 있다. 당업자라면 복수 개의 금 나노클러스터의 방출된 광 및/또는 λ_max 방출을 판정하는 방법 및 기술을 알 것이다. 예를 들면, 금 나노클러스터는 형광 분광법을 이용하여 분석될 수 있다. 그러한 분석에 있어서, 금 나노클러스터는 광원(예; 자외선 광)에 노출되는데, 광은 특정 분자에서 전자를 여기시키고, 그 결과 상대적으로 낮은 에너지의 광(예; 가시광)을 방출시킨다.

몇몇 구현예에서, 금 나노클러스터를 포함하는 조성물의 양자 수율이 판정될 수 있다. 양자 수율은 조성물에 의해 형광을 통해 방출된 광자(photon)에 대한 조성물에 의해 흡수된 광자의 비율이다. 몇몇 구현예에서, 금 나노클러스터를 포함하는 조성물은, 약 1% 이상, 약 2% 이상, 약 3% 이상, 약 4% 이상, 약 55 이상, 약 6% 이상, 약 7% 이상, 약 8% 이상, 약 9% 이상, 약 10% 이상, 또는 그 이상의 양자 수율로 에너지를 방출하고 및/또는 λ_max 방출을 가질 수 있다. 몇몇 경우에, 상기 양자 수율은 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 또는 약 3% 내지 약 10%, 약 4% 내지 약 9%, 또는 약 5% 내지 약 8%이다. 당업자는 조성물의 양자 수율을 판정하는 방법을 알 것이다. 몇몇 구현예에서, 금 나노클러스터는 약 630nm 내지 약 700nm의 파장에서, 1% 이상, 또는 여기에 기재된 값들의 임의의 다른 조합의 양자 수율로 형광을 방출할 수 있다(또는 λ_max 방출을 가질 수 있다).

몇몇 경우에, 나노클러스터는 약 0.1nm 내지 약 2nm, 약 0.1nm 내지 약 1nm, 약 0.1nm 내지 약 0.5nm, 약 0.5nm 내지 약 1nm, 등의 평균 직경을 가질 수 있다. 몇몇 경우에, 나노클러스터는 약 2nm 미만, 약 1.5nm 미만, 약 1nm 미만, 약 0.5nm 미만, 약 0.1nm 미만 등의 평균 직경을 가질 수 있다. 여기서 말하는 나노클러스터 모집단의 "평균 직경"이란 나노클러스터의 직경의 산술평균이다. 당업자는, 예를 들면, 레이저 광 산란, 다이내믹 광 산란(또는 광자 상관 분광법(photon correlation spectroscopy)), 투과 전자현미경(TEM) 등을 이용하여, 나노클러스터 모집단의 평균 직경을 판정하는 방법 및 기술을 알 것이다.

몇몇 구현예에서, 나노클러스터는 다분산계(polydisperse), 실질적으로 단일분산계(monodisperse), 또는 단일분산계(예를 들면, 직경의 균질한 분포를 가진)일 수 있다. 복수 개의 나노클러스터는, 약 10% 이하, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 약 1% 이하의 액적이 모든 나노클러스터의 평균 직경의 약 20%, 약 30%, 약 50%, 약 75%, 약 805, 약 90%, 약 95%, 약 99%, 이상 또는 이하의 직경을 가지는 직경 분포를 그 나노클러스터가 가질 경우에 실질적으로 단일분산계이다. 몇몇 구현예에서, 나노클러스터는 실질적으로 구형이다. 그러나, 다른 구현예에서, 나노클러스터는 구형, 삼각 프리즘, 입방체, 판형(예; 삼각형 판, 정사각형 판, 원판, 직사각형 판) 등을 포함하는 다양한 형상을 포함할 수 있다.

몇몇 구현예에서, 금 나노클러스터는, 예를 들면, 단백질 및/또는 안정화제와 관련되어 금 나노클러스터와 단백질 및/또는 안정화제를 포함하는 조성물을 형성함으로써 안정화될 수 있다. 몇몇 경우에, 단백질은 본 명세서에 기재된 금 나노클러스터의 형성을 보조할 수도 있다. 상기 관련은, 예를 들면, 금 나노클러스터와 단백질 또는 안정화제 사이(예를 들면, 단백질 중의 잔기와 금 원자 또는 이온 사이)의 하나 이상의 상호작용의 형성을 포함할 수 있다. 몇몇 경우에, 상기 상호작용은 이온 결합, 공유 결합(예; 탄소-탄소, 탄소-산호, 산소-규소, 황-황, 인-질소, 탄소-질소, 금속-산호, 또는 다른 공유 결합), 수소 결합(예; 수산기들, 아민기들, 카르복시기들, 티올기들, 및/또는 유사한 작용기들 사이), 배위 결합(dative bond)(예; 금속 이온과 모노덴테이트(monodentate) 또는 멀티덴테이트 리간드 사이의 착체화 또는 킬레이션), Van der Waals 상호작용 등일 수 있다. 몇몇 구현예에서, 상기 상호작용은 공유 결합이 아니다. 안정화된 금 나노클러스터의 합성 방법 및 적합한 단백질 또는 안정화제의 판정 방법은 본 명세서에 기재되어 있다.

몇몇 구현예에서, 본 발명은 금 나노클러스터의 합성 방법을 제공한다. 몇몇 경우에, 상기 방법은 단백질과 금 원자 전구체를 포함하는 반응 혼합물을 형성하는 단계, 및 이어서 상기 반응 혼합물의 pH를 조절하는 단계를 포함한다. 반응 혼합물은, 본 명세서에 기재된 바와 같은, 복수 개의 금 나노클러스터를 형성하기에 충분한 시간 동안 적합한 온도로 유지될 수 있다. 형성된 금 나노클러스터는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 성질을 특징으로 할 수 있다(예를 들면, 방출된 형광의 파장, 양자 수율, 평균 직경 등).

이론에 얽매이고 싶지 않지만, 단백질의 존재는 금 나노클러스터의 형성을 보조할 수 있다. 일례로서, 단백질 분자는 복수 개의 금 이온을 격리시킬 수 있고(예를 들면, 금 이온과 티로신과 같은 단백질에 존재하는 잔기의 결합에 의해), 그 결과 복수 개의 금 이온을 단백질 내에 가둘 수 있다. 이어서, 단백질은 금 이온을 환원시켜 분자 상태의 금 원자로 만들고, 금 원자가 서로 매우 근접해 있음으로써(예를 들면, 금 원자가 단백질 내에 갇혀 있기 때문에), 금 나노클러스터가 형성될 수 있게 된다. 몇몇 경우에, 각각의 단백질이 동일한 수의 금 이온과 결합하기 쉽기 때문에, 형성된 복수 개의 금 나노클러스터는 실질적으로 단일분산계이거나 다중분산계일 수 있다. 몇몇 구현예에서, 하나 이상(예; 1, 2, 3, 4, 5, 등)의 단백질 분자가 금 나노클러스터의 형성 이후에 금 나노클러스터와 결합된 상태로 잔존할 수 있다(예를 들면, 그 결과 안정화된 금 나노클러스터를 형성할 수 있음). 몇몇 경우에, 하나 이상의 단백질 중 적어도 일부는 본 명세서에 기재된 안정화제로 대체될 수 있다.

특정 실시예에서, 금 원자 전구체(예를 들면, Au(III) 이온을 포함하는 것)를 포함하는 용액이, 소 혈청 알부민(BSA)을 포함하는 용액에 첨가되어 반응 혼합물을 형성할 수 있다. 이 구현예에서, BSA 분자는 금 이온을 격리시켜 가둘 수 있다(예를 들면, 도 1 참조). BSA 분자의 환원 능력은 반응 혼합물의 pH를 11보다 높게 조절함으로써 활성화될 수 있다. 내포된 금 이온은 환원되어 금 나노클러스터를 형성할 수 있고, 여기서 금 나노클러스터는 BSA 분자에 의해 안정화된다.

몇몇 경우에, 단백질 및 금 원자 전구체를 포함하는 반응 혼합물이 형성될 수 있다. 단백질의 용액을 금 원자 전구체의 용액에 첨가할 수 있고, 또는 금 원자 전구체의 용액을 단백질의 용액에 첨가할 수 있다. 몇몇 경우에, 단백질과 금 원자 전구체를 고체로서 혼합한 다음, 용매를 첨가할 수 있다. 용액은 반응을 방해하지 않는 임의의 적합한 용매(예를 들면, 물) 중에서 형성될 수 있다. 상기 용액은 약 0.1M 내지 약 10M, 0.5M 내지 약 5M, 0.5M 내지 약 2M, 1M 내지 약 2M, 3M 내지 약 4M, 등의 몰 농도를 가질 수 있다.

몇몇 구현예에서, 단백질 분자에 대한 금 원자 전구체 분자의 비는 나노입자에 비해 나노클러스터의 형성을 가능하게 하는 방법의 중요한 특징이다. 이론에 얽매이고 싶지는 않지만, 상기 비는 단백질 분자에 대한 금 원자 전구체 분자의 개수 및 응집에 영향을 주기 때문에(예를 들면, 표 1에 나타낸 결과를 참조), 중요한 특징이라고 생각된다.

단백질 분자에 대한 금 원자 전구체 분자의 비를 결정하는 방법을 이하에서 상세히 설명하기로 한다. 몇몇 구현예에서, 단백질 분자에 대한 금 원자 전구체 분자의 적절한 비는 단백질 중 시스테인과 티로신 잔기의 비를 판정함으로써 결정될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 단백질에 존재하는 시스테인과 티로신 잔기 대 금 원자 전구체의 수의 비는 약 1:1 내지 약 50:1, 약 1:1 내지 약 25:1, 약 5:1 내지 약 15:1, 또는 그 중의 임의의 범위이다. 특정 구현예에서, 상기 비는 약 10:1이다. 시스테인과 티로신 잔기의 비로부터, 단백질 분자 대 금 원자 전구체 분자의 비가 결정될 수 있다. 예를 들면, 시스테인과 티로신 잔기 대 금 원자 전구체의 비가 10:1이 되도록 선택되고, 단백질이 50개의 시스테인과 티로신 잔기를 포함하는 경우에, 금 원자 전구체 분자 대 단백질 분자의 비는 약 3:1 이상, 약 5:1 이상, 약 6:1 이상, 약 7:1 이상, 약 8:1 이상, 약 9;1 이상, 약 10:1 이상, 약 12:1 이상, 약 15:1 이상, 약 20:1 이상, 또는 그 이상이다. 몇몇 경우에, 상기 비는 약 5:1 내지 약 20:1, 약 8:1 내지 약 15:1 등이다.

본 발명에 있어서 사용하기에 적합한 단백질은 복수 개(예를 들면, 적어도 약 5개, 10개, 15개, 20개, 30개, 40개, 50개 등)의 시스테인 및/또는 티로신 잔기를 포함하는 단백질을 포함한다. 단백질의 비제한적 예로는 소 혈청 알부민(BSA), 인간 혈청 알부민, 리소자임 등이 포함된다.

본 명세서에서 사용되는 금 원자 전구체란, 영보다 큰 산화 상태에 있는 금(예; Au⁺, Au⁺³)을 포함하고, 환원되어(예를 들면, 단백질에 의해) 금 원자를 형성할 수 있는 전구체 물질을 의미한다. 당업자는 적절한 금 원자 전구체로서, 예를 들면 HAuCl₄, AuCl₃, 및 AuBr₃를 알 것이다. 몇몇 경우에, 금 원자 전구체는 수화될 수 있다(예를 들면, 물을 포함하는 것).

금 원자 전구체와 단백질을 포함하는 반응 혼합물이 형성된 다음, 반응 혼합물의 pH는, 예를 들면, 염기를 반응 혼합물에 첨가함으로써 조절될 수 있다. 염기는 반응 혼합물이 형성된 직후에, 또는 약 1분 후, 약 2분 후, 약 3분 후, 약 5분 후, 약 10분 후 등에 첨가될 수 있다. 염기는 임의의 적합한 염기일 수 있고(예; NaOH), 얻고자 하는 pH로 조절하기에 적절한 임의의 몰 농도(예; 약 0.1M, 약 0.5M, 약 1M, 약 2M) 및 양으로 첨가될 수 있다. 몇몇 경우에, 첨가되는 염기의 양은, 반응 혼합물의 pH가 약 10.5 이상, 약 11 이상, 약 11.5 이상, 약 12 이상, 약 13 이상, 또는 그 이상으로 조절되는 양일 수 있다. 몇몇 경우에, 반응 혼합물의 pH는 약 11 내지 약 14, 약 12 내지 약 14, 등일 수 있다. 이론에 얽매이고 싶지는 않지만, 반응 혼합물의 pH는, 몇몇 구현예에 있어서, 반응 혼합물의 pH가 단백질에 존재하는 잔기(예를 들면, 아스파르트산 및 글루탐산 잔기 중의 카르복실기, 시스테인 중의 티올기, 리신 중의 아민기, 등)의 양자화 또는 탈양자화에 영향을 줌으로써, 단백질의 구조 및 반응성에 영향을 주기 때문에(예; 표 1에 나타낸 결과 참조), 본 발명의 중요한 특징이 될 수 있다.

반응 혼합물의 pH가 선택된 수준으로 조절된 다음, 반응 혼합물은 복수 개의 금 나노클러스터가 형성되기에 충분한 시간 동안 적합한 온도로 유지될 수 있다. 반응 혼합물은 이 기간 중에 교반(예를 들면, 교반, 진탕)될 수 있다. 당업자는 적절한 반응 온도 및 반응 시간을 결정할 수 있을 것이다. 예를 들면, 온도는 단백질의 분해나 실활(deactivation)이 일어나지 않도록 선택될 수 있다. 또 다른 예로서, 반응 온도는, 합리적인 시간 이내(예를 들면 약 48시간 미만, 약 24시간 미만, 약 12시간 미만, 등)에 반응이 진행되도록 선택될 수 있다. 몇몇 경우에, 반응은 제한형 반응물의 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 99% 이상, 또는 그 이상이 소비될 때까지 수행될 수 있다. 반응의 진행은 당업자에게 공지된 방법 및/또는 기술(예; 광전자방출 스펙트럼, 핵자기 공명, 등)을 이용하여 결정될 수 있다.

몇몇 구현예에서, 반응 혼합물은 주위 온도보다 높거나 낮은 온도에서 유지될 수 있다. 몇몇 경우에, 상기 반응은 주위 온도보다 높은 온도, 예를 들면 약 30℃, 약 35℃, 약 37℃, 약 40℃, 약 50℃, 약 60℃, 약 80℃, 약 100℃, 또는 그 이상의 온도에서 유지될 수 있다. 몇몇 경우에, 상기 반응은 약 30℃ 내지 약 40℃, 약 25℃ 내지 약 40℃, 약 25℃ 내지 약 50℃, 약 30℃ 내지 약 100℃, 등에서 수행될 수 있다.

반응 혼합물은 적합한 온도에서 약 0∼48시간, 약 2∼약 24시간, 약 4∼약 18시간, 약 8∼약 12시간, 또는 약 1시간, 약 2시간, 약 4시간, 약 8시간, 약 12시간, 약 18시간, 약 24시간, 약 36시간 또는 약 48시간, 또는 그 이상의 시간 동안 유지될 수 있다.

몇몇 구현예에서, 하나 이상의 단백질 분자와 결합된 금 나노클러스터가 형성된 다음, 하나 이상의 단백질 분자 중 하나 이상은 안정화제로 대체될 수 있다. 몇몇 경우에, 본질적으로 모든 단백질 분자는 안정화제로 대체될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 복수 개의 안정화제의 분자가 단백질-안정화된 금 나노클러스터를 포함하는 용액에 제공될 수 있고, 여기서 안정화제는 단백질에 비해 금 나노클러스터에 대한 더 큰 친화력을 가진다. 따라서, 각각 금 나노클러스터에 결합되어 있는 단백질 분자의 적어도 일부는 하나 이상의 안정화제 분자에 의해 치환될 수 있다. 몇몇 경우에, 하나 이상의 안정화제는 단백질의 치환에 이어서 금 나노클러스터와 결합된 상태로 잔존할 수 있다. 예를 들면, 몇몇 구현예에서, 단백질 분자는 시스테인 또는 글루타치온과 같은 화학적 캡핑제(capping agent)를 이용하여 추출될 수 있다. 금 나노클러스터와 안정화제의 결합에 이어서, 단백질 분자는 예를 들면 여과, 세척 및/또는 원심분리에 의해서, 안정화제에 의해 안정화된 금 나노클러스터로부터 분리될 수 있다.

나노클러스터는 임의의 시간 동안 저장되거나, 본 명세서에 언급된 응용 분야 중 하나에 즉시 사용될 수 있다. 나노클러스터는 성능 손실이 저장 기간 1개월당 10% 이하, 또는 성능 손실이 저장 기간 1개월당 5% 이하, 또는 심지어 2% 이하인 정도로, 약 1일 이상, 약 2일 이상, 약 5일 이상, 약 10일 이상, 약 1개월 이상, 약 3개월 이상, 약 6개월 이상 또는 약 1년 이상 저장될 수 있다. 본 명세서에 기재된 나노클러스터는 여러 가지 조건에서 저장될 수 있다. 몇몇 경우에, 나노클러스터는 주위 조건에서, 및/또는 대기중에 저장될 수 있다. 다른 경우에, 나노클러스터는 진공 하에 저장될 수 있다. 또 다른 경우에, 나노클러스터는 동결건조될 수 있다.

본 명세서에 기재된 금 나노클러스터는 다양한 시스템/장치에 포함되어 있을 수 있고 및/또는 특정 용도에 다양한 방법으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 금 나노클러스터는 전기적 또는 화학적 감지 장치에서 사용될 수 있는데, 상기 장치는 목표 환경에서 화학종을 정성적 및/또는 정량적으로 판정하는 데 사용될 수 있다. 즉, 상기 금 나노클러스터는 화학종과 반응하여, 금 나노클러스터의 성질의 변화를 판정하여 샘플 중에 존재하는 종의 존재, 부재 및/또는 양을 판정할 수 있다. 또 다른 예로서, 상기 금 나노클러스터는 촉매분해 및/또는 생물학적 응용 분야에 사용될 수도 있다.

몇몇 구현예에서, 본 발명은 샘플 중에 수은 이온(Hg² ⁺)을 정성적 및/또는 정량적으로 판정하기 위한 방법 및/또는 시스템을 제공한다. 수은은 광범위하게 퍼진 오염물이며, Hg² ⁺는 부식성이며 세포 독성이 높은 발암성 물질이다. Hg² ⁺의 검출 방법은 환경적 샘플의 분석용으로 특히 유용하다. 몇몇 경우에, 복수 개의 금 나노클러스터의 성질(예를 들면, 형광성)은 수은 이온을 함유하는 것으로 의심되는 샘플에 노출되기 전과 후에 판정될 수 있다. 그 성질의 변화를 판정함으로써, 정량적으로(예; 캘리브레이션 곡선과 비교함으로써) 또는 정성적으로(예; 성질의 증가 또는 감소에 의해) 분석 대상물이 샘플에 존재하는지 여부를 판정할 수 있다.

몇몇 구현예에서, 수은 이온(Hg² ⁺)의 존재는 복수 개의 금 나노클러스터의 성질을 온/오프(on/off) 분석함으로써 정성적으로 판정될 수 있다. 몇몇 경우에, 상기 검출 메커니즘은 "턴-오프(turn-off)" 검출 메커니즘으로서, 수은 이온이 부재시에, 복수 개의 금 나노클러스터는 형광 방출(또는 다른 측정가능한 성질)을 일으킬 수 있다. 수은 이온이 존재할 경우에, 복수 개의 금 나노클러스터는 하나 이상의 수은 이온과 반응하여 실질적으로 형광 방출(또는 다른 측정가능한 성질)이 감소되거나 전혀 없는 것으로 관찰되는 급랭 상태 또는 암흑 상태가 일어날 수 있다.

몇몇 구현예에서, 수은 이온의 검출 방법은, 복수 개의 금속 나노클러스터(예를 들면, 본 명세서에 기재된 것)를 제공하는 단계 및 제1 형광 강도(또는 다른 측정가능한 성질)을 판정하는 단계를 포함한다. 이어서, 복수 개의 금 나노클러스터는 수은 이온을 함유하거나 함유하는 것으로 의심되는 샘플에 노출되고, 제2 형광 강도가 판정될 수 있다. 샘플 중의 수은 이온의 존재, 부재, 및/또는 농도는 제1 및 제2 형광 강도(또는 다른 측정가능한 성질) 사이의 차를 판정함으로써 결정될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 제1 및 제2 형광 강도의 차는 상대적 형광성(예를 들면, 제2 형광 강도를 제1 형광 강도로 나눔)으로서 판정될 수 있다. 상대적 형광성은 샘플 중 수은 이온의 농도를 판정하기 위한 캘리브레이션 곡선에 비교될 수 있다.

당업자는 물질(예를 들면, 금 나노클러스터를 포함하는 조성물)의 형광성을 판정하는 방법 및 기술을 인지할 것이다. 몇몇 구현예에서, 물질은 제1 파장의 광에 의해 여기될 수 있고, 그 물질은 상대적으로 낮은 에너지의 제2 파장(예를 들면 더 긴 파장)에서 에너지를 방출할 수 있다. 몇몇 경우에, 본 명세서에 기재된 물질 및 조성물은 약 300nm 미만, 약 300∼약 500nm, 약 400∼약 500nm, 또는 약 420nm, 약 430nm, 약 440nm, 약 450nm, 약 460nm, 약 470nm, 약 480nm, 약 490nm 등의 파장을 가지는 광에 노출될 수 있다. 특정 구현예에서, 광은 약 470nm의 파장을 가진다. 상기 조성물은 본 명세서에 기재된 파장(예를 들면, 약 630nm 및 약 700nm)을 가지는 에너지를 방출할 수 있다.

몇몇 경우에, 상기 방법은 복수 개의 금 나노클러스터 및 단백질 및/또는 안정화제를 포함하는 조성물을 제공하는 단계, 상기 조성물을 수은 이온을 함유하는 것으로 의심되는 샘플에 노출시키는 단계, 및 상기 샘플이 수은 이온을 포함하는지 여부를 판정하는 단계(예를 들면, 조성물의 하나 이상의 성질의 변화를 판정함으로써)를 포함할 수 있다.

본 발명의 방법은 낮은 농도 레벨에서 샘플 중의 수은 이온의 검출을 가능하게 할 수 있다. 최근의 이론적 연구 결과, 밀폐된 셸 금속 원자들간의 분산력은 특이적이고 강하며, 특히 이들 상호작용이 Hg² ⁺(4f¹⁴5d¹⁰) 및 (4f¹⁴5d¹⁰)과 같은 중질 이온을 내포할 경우에, 상대론적 효과에 의해 크게 증폭된다는 것을 시사한다. 이론에 얽매이고 싶지는 않지만, 본 명세서에 기재된 Au-NCs의 표면은 소량의 Au⁺를 포함하며, 그 결과 Hg² ⁺와 강하고 특이적 상호작용을 가능하게 하며, 낮은 검출 한계를 제공하는 것으로 생각된다. 몇몇 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법은 샘플 중에 약 50nM 미만, 약 25nM 미만, 약 10nM 미만, 약 5nM 미만, 약 1nM 미만, 약 0.5nM 미만, 약 0.1nM 미만, 또는 약 10nM, 약 5nM, 약 1nM, 약 0.5nM, 약 0.1nM, 등의 샘플 중의 수은 이온의 검출 한계를 가질 수 있다.

몇몇 경우에, 수은 이온을 검출하는 방법 및 물품은 수은 이온에 대해 특정될 수 있다. 즉, 상기 방법 및 물품은 Ag⁺, Cu² ⁺, Zn² ⁺, Mg² ⁺, K⁺, Na⁺, Ni² ⁺, Mn² ⁺, Fe³ ⁺, Cd²⁺, Pt⁴ ⁺, Pd² ⁺, Co² ⁺, Pb² ⁺ 및 Ca² ⁺ 이온과 같은 다른 금속 이온에 대해 수은 이온을 구체적으로 검출할 수 있다. 상기 특이성은 샘플이 환경적 소스로부터 취해지는 경우에 유리하다(예를 들면, 샘플이 다른 금속 이온을 함유할 가능성이 높은 경우). 몇몇 경우에, 금 나노클러스터 또는 조성물의 형광 강도(또는 다른 성질)의 변화는 적어도 Hg⁺² 이외의 금속 이온에 노출되었을 때, 약 30% 미만, 약 20% 미난, 약 15% 미만, 약 105 미만, 약 5% 미만, 약 35 미만, 약 1% 미만 등이다. 또한, 수은 이온의 검출을 위한 방법 및 물품은 샘플 중에 함유되어 있을 수 있는 다양한 음이온(예를 들면, Cl^-, NO³ ^-, SO4² ^-, PO4³ ^-, 및 퍼버(예컨대, 2-(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐)에탄설폰산))에 대해 견실할 수 있다.

몇몇 구현예에서, 샘플 중에 수은 이온의 존재, 부재, 및/또는 농도를 판정하기 위한 물품이 제공될 수 있다. 몇몇 경우에, 상기 물품은 기판, 상기 기판과 관련된 조성물을 포함할 수 있다. 상기 조성물은 금 나노클러스터 및 단백질 또는 안정화제(예를 들면, 본 명세서에 기재된 것)를 포함할 수 있다.

몇몇 구현예에서, 상기 물품은 테스트 스트립일 수 있고, 상기 스트립은 수은 이온을 포함하는 것으로 의심되는 용액에 노출될 수 있다. 상기 테스트 스트립은 수은 이온에 노출되면 형광 방출성(또는 다른 성질)에 변화를 가질 수 있는 조성물(예를 들면, 금 나노클러스터 및 단백질 또는 안정화제를 포함하는 것)을 포함할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 형광 방출성(또는 다른 성질)에서의 변화는 샘플(예를 들면, 본 명세서에 기재된 것) 중에 수은이 존재하는지 여부를 정량적 및/또는 정성적으로 판정할 수 있다. 테스트 스트립은 임의의 적합한 크기 및/또는 형상(예; 정사각형, 직사각형, 원, 등)을 가질 수 있다. 몇몇 경우에, 테스트 스트립의 크기는 통상 사용되는 실험실 유리 기구(예; 시험관)의 입구에 끼워질 수 있는 크기일 수 있다.

몇몇 경우에, 샘플 중에 수은 이온의 존재, 부재, 및/또는 농도를 판정하기 위한 하나 이상의 테스트 스트립 및 색(또는 다른 성질) 기준을 포함하는 키트가 제공될 수 있다. 몇몇 경우에, 색 기준에 제공된 색들은 수은 이온을 함유하는 것으로 의심되거나 함유하는 샘플에 노출된 다음 테스트 스트립의 색을 비교하는 데 사용될 수 있다. 몇몇 경우에, 색 기준의 색들은 테스트 스트립의 형광 색(예를 들면, UV 광 하에 관찰된 테스트 스트립의 색)을 비교하는 데 사용될 수 있다. 테스트 스트립이 수은 이온을 함유하거나 함유하는 것으로 의심되는 샘플에 노출된 다음, 수은 이온의 존재 또는 부재를 판정하기 위해, 및/또는 샘플 중의 수은 이온의 대략적인 농도를 판정하기 위해, 테스트 스트립의 색은 색 기준과 비교될 수 있다. 예를 들면, 테스트 스트립이 정성적으로 기능하는 경우에, 색 기준은 수은 이온을 포함하지 않는 샘플에 노출되면 테스트 스트립의 색을 나타낼 수 있다. 따라서, 샘플에 노출된 다음, 테스트 스트립이 색 기준과 상이한 색을 가질 경우, 샘플은 수은을 포함한다. 테스트 스트립이 정량적으로 기능하는 경우에, 색 기준은 복수 개의 색을 나타낼 수 있고, 각각의 색은 샘플 중의 수은 이온의 대략적 농도에 관련된다. 따라서, 샘플에 노출된 다음, 테스트 스트립의 색은 색 기준과 비교되고 가장 근접한 색에 매칭됨으로써, 샘플 중 수은 이온의 대략적 농도를 표시할 수 있다. 당업자는 색 기준을 위해 적절한 색(들)을 판정하는 방법 및 기술을 알 것이다(예를 들면, 테스트 스트립을 수은 이온을 포함하는 샘플의 여러 가지 알고 있는 농도에 노출시킴으로써). 키트는 사용 설명을 추가로 포함할 수 있다. 색 기준은 테스트 스트립으로부터 완전히 분리되어 표시되거나, 테스트 스트립과 결합될 수 있다.

상기 조성물은 본 발명에 따른 테스트 스트립을 제공하기에 적합한 임의의 기판과 결합될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 기판 물질은 금 나노클러스터와 관련되거나 상기 조성물에 포함되어 있는 단백질 또는 안정화제와 결합할 수 있는 물질을 포함할 수 있다. 기판의 비제한적 예는, 예를 들면 니트로셀룰로스, 종이, 천연 또는 합성 섬유, 면, 레이온, 대마(hemp), 황마(jute), 대나무 섬유, 셀룰로스 아세테이트, 카르복시메틸화 용매-방사 셀룰로스 섬유와 같은 물질로 만들어진 스레드 및 얀, 또는 이것들의 조합을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 기판은 폴리에스테르, 폴리아미드, 폴리아크릴아미드, 폴리아세테이트, 등과 같은 폴리머, 또는 이것들의 조합을 포함할 수 있다. 기판은 다공질일 수도 있고 비다공질일 수도 있다. 조성물은 예를 들면 기판의 표면 상에 코팅되거나 기판 내에 함침될 수 있다. 기판은 가요성 및/또는 경성일 수 있다.

본 발명의 테스트 스트립의 제조에 있어서, 조성물은 당업자에게 공지된 기술을 이용하여 적합한 기판에 적용될 수 있다. 본 발명의 구현예에 있어서, 테스트 스트립의 제조 방법은, 기판에 적용될 수 있는 코팅가능한 액체 조성물을 제조하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 액체 조성물은 복수 개의 BSA-결합된 금 나노클러스터를 용매에 첨가함으로써 제조된다. 기판은 사용 전에 건조될 수 있다(예를 들면, 주변 온도에서, 상승된 온도에서, 진공 하에서). 몇몇 구현예에서, 추가적 성분이 존재할 수 있다(예를 들면, 계면활성제, 바인더, 등).

샘플은 임의의 적합한 소스로부터 얻어질 수 있다. 몇몇 구현예에서, 샘플은 화학적 샘플, 물 샘플, 추출물, 환경적 샘플(예; 환경적 소스로부터), 식품, 등을 포함할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 샘플은 수은 이온을 함유하거나 함유하는 것으로 의심될 수 있다. 샘플은 소스로부터 얻어진 상태로 직접 사용되거나, 하나 이상의 샘플의 특성을 변형하기 위해 전처리될 수 있다. 전처리의 방법은 여과, 증류, 농축, 방해 성분의 실활, 및/또는 반응제의 첨가를 수반할 수 있다. 몇몇 구현예에서, 샘플은 희석되거나 농축될 수 있다(예; 수은 이온의 농도가 너무 높아서 단순히 캘리브레이션 곡선이나 색 기준과의 비교에 의해서는 판정될 수 없는 경우에).

다음의 참고 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다: 2008년 8월 5일에 출원된, 미국 가특허출원 61/129,994, 발명자: Ying, et al., 발명의 명칭: "Protein/peptide-mediated synthesis of highly fluorescent metal nanoclusters".

본 발명의 이러한 측면 등은 이하의 실시예를 검토할 때 더욱 잘 이해될 것이며, 실시예는 본 발명의 특정 구현예들을 예시하려는 것이며, 청구의 범위에 정의된 바와 같은 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.

실시예 1

이하의 실시예는 본 발명의 몇몇 구현예에 따른 금 나노클러스터의 합성 및 성질을 설명하는 것이다.

구체적으로, 이 실시예는, 적색 방출(λ_emmax = 640nm, 양자 수율(QY) ∼6%)에 의해 생리학적 온도(37℃)에서 Au-NCs를 제조하기 위한, 통상 상업적으로 입수가능한 단백질, 소 혈청 알부민(BSA)의 바이오미네랄화(biomineralizing) 능력에 의거한 간단하고, 원-폿(one-pot), "그린" 합성 경로를 기술한다.

이 실시예에서, Au(Ⅲ) 이온은 BSA 수용액에 첨가된다. BSA 분자는, 몇몇 경우에, Au 이온을 격리시켜 그것들을 가둔다(도 1 참조). BSA 분자의 환원 능력은 반응 혼합물의 pH를 약 12로 조절함으로써 활성화되었고; 내포된 이온은 점진적으로 환원되어 원위치에서 BSA 공액화 금 나노클러스터(BSA-Au-NCs)를 형성했다. 제조된 BSA-Au-NCs는 약 25개의 금 원자(매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화-비산 시간(time of flight)(MALDI-TOF) 질량 분석법으로부터 입증됨)로 구성되었고, BSA 분자 내에서 BSA-Au-NCs로서 안정화되었다(도 1). 이 구현예에서, BSA-Au-NCs는 수용성이었고, 버퍼-안정성이고, 강산/염기와 같은 가혹한 조건의 용액 및 농축된 염(1M NaCl)에서도 안정적이었다. 상기 합성 방법은 배치에서 배치로 양호한 재현성을 가지고 그램 수준의 양까지 용이하게 스케일 업될 수 있었고, 제조된 BSA-Au-NCs는 동결 건조 후 분말로서 저장될 수 있었다. 이 기술이 가지는 양호한 생체적합성(biocompatibility)과 상당한 환경적/비용적 이점 이외에도, Au-NCs 상의 BSA 코팅층은 또한 기능성 리간드에 의한 사후-합성 표면 변형을 촉진시켰다.

전형적인 합성에 있어서, HAuCl4 수용액(5ml, 10mM, 37℃)을 강하게 교반하는 가운데 BSA 용액(5ml, 50mg/ml, 37℃)에 첨가했다. 2분이 경과된 후, NaOH 용액(0.5ml, 1M)을 도입하고, 혼합물을 37℃에서 12시간 동안 배양시켰다. 용액의 색은 옅은 황색으로부터 옅은 갈색으로 변한 다음, 짙은 갈색으로 변했다(도 2A). 구체적으로, 도 2A는 (1) BSA 분말, (2) BSA 수용액, (3) BSA-Au-NCs 수용액 및 (4) BSA-Au-NCs 분말의 사진으로서, 상부는 가시광, 하부는 UV 광 하에 촬영된 것이다. 도 2B는 (i) BSA 및 (ii) BSA-Au-NCs의 수용액의 광학적 흡수 스펙트럼(점선) 및 광전자방출 스펙트럼(실선, λ_ex=470nm)을 나타낸다. 도 2B의 삽입도는 BSA-Au-NCs에 있어서 약 480nm에서의 약한 흡수 피크를 나타낸다. 반응은 약 12시간에 완결되었는데, 이것은 형광 발생의 경시적 측정(time-course measurement)에 의해 확인되었다(도 3). 구체적으로, 도 3은 HAuCl₄ 및 BSA를 포함하는 반응 혼합물에 대한 37℃에서의 광전자방출 스펙트럼(λ_ex=470nm)의 경시적 진전을 나타낸다.

BSA-Au-NCs의 짙은 갈색 용액은 UV 광(약 365nm) 하에서 강한 적색 형광(도 2A, 저부, 3)을 방출했다. 대조적으로, 컨트롤 BSA 용액은 가시광 하에서 담황색이었고(도 2A, 상부, 2), UV 광 하에서 피크 청색 형광을 방출했는데, 이것은 아미노산 잔기에 있는 방향족 사이드 기의 특징이다(트립토판, 티로신(Tyr), 및 페닐알라닌).

형광성 Au-NCs는 각각 약 480nm 및 약 640nm에서 흡수 및 방출 피크를 나타냈다(도 2B). 광루미네슨스 양자 수율(QY)은 ∼6%였다(470nm 레이저를 사용하여 플루오레세인으로 캘리브레이션함).

BSA-Au-NCs의 산화 상태는 X선 광전자 분광법(XPS)에 의해 판정되었다. Au 4f_7/2 스펙트럼은 84.0eV 및 85.1eV의 결합 에너지에 집중된 2개의 뚜렷한 성분(도 4B에서 각각 라인 ii 및 i)으로 디콘볼루션(deconvolution)될 수 있었고, 이것은 각각 Au(0) 및 Au(I)에 할당될 수 있었다. 구체적으로, 도 4는 (A) (ⅲ) BSA-Au-NCs에서 Au 4f의 XPS 스펙트럼 및 (B) (iv) BSA 및 (v) BSA-Au-NCs의 MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 나타낸다.

Au 코어의 표면에 존재하는 소량의 Au(I)(∼17%)는 티올-보호된 BSA-Au-NCs의 구조적 검토에서 앞에 기재된 바와 같이, 나노클러스터를 안정화하는 데 도움을 주었다. 제조된 BSA-Au-NCs는 BSA 모노머에 존재하는 35개의 티올기(35개의 시스테인(Cys) 잔기로부터)를 고려할 때 유사한 구조를 가질 수 있었다. BSA-Au-NCs는 약 640nm에서 광전자방출 피크를 가지는데, 이는 구형 젤륨(Jellium) 모형에 의거한 Au₂₅ 클러스터가 존재한다는 것을 나타낸다. 제조된 Au-NCs의 크기는 MALDI-TOF 질량 분석법에 의해 추가로 확인되었다. 윤곽이 뚜렷한 단백질 구조는 MALDI-TOF 질량 분석법에 의한 캡슐화 나노클러스터의 분석을 가능하게 했다. AuCl⁴ ^-을 갖지 않은 BSA의 스펙트럼은, BSA 분자량에 해당하는 m/z∼66kDa(도 4B)에서 하나의 피크를 나타냈다. 제조된 BSA-Au-NCs는 ∼5kDa의 피크 변위를 나타냈는데, 이것은 Au-NC의 25개 금 원자에 기인할 수 있다. BSA-Au-NCs의 열 중력(TGA) 분석도 뒷받침하는 증거를 제공했다(도 4C). 구체적으로, 도 4C는 공기 중 BSA-Au-NCs 분말의 TGA 분석을 나타낸다. 25개의 원자를 가진 Au-NCs는 매우 안정하다고 보고되어 있으며, 이것은 셸 클로징(shell closing)과 기하학적 기여를 가진 가장 보편적인 매직 클러스터 크기에 해당한다.

pH 범위가 넓은(3∼12) 용액, 또는 다양한 완충 용액(예; 50mM의 HEPES 버퍼(pH 7.65)), 또는 고농도의 염을 함유하는 용액(예; 1M의 NaCl) 중의 BSA-Au-NCs에 있어서 형광 성질에는 명백한 차이가 관찰되지 않았다. 용매는 동결 건조에 의해 제거될 수 있었고, BSA-Au-NCs는 2개월 이상 동안 고체 형태로 저장될 수 있었고(도 2A, 4), 필요시에는 언제나 재분산될 수 있었다. BSA-Au-NCs는 Au-S 결합과 단백질의 조합에 의해(예; BSA 중 35개의 Cys 잔기를 통해), 그리고 단백질의 벌크성(bulkiness)으로 인한 입체적 보호에 의해 안정화된 것일 수 있다. BSA-Au-NCs의 높은 안정성은 시험관 내 및 생체 내 바이오이미징(bioimaging) 용도에서의 그의 이용을 크게 촉진시킬 수 있다. BSA 분자 중에 Au-NCs(∼0.8nm)를 캡슐화하는 것(도 5의 대표적 TEM 이미지 참조)은 BSA 비계(scaffold)의 구조에 대해 별로 영향이 없다(도 6 참조). 구체적으로, 도 6은 (i 또는 흑색) BSA 및 (ii, 또는 회색) BSA-Au-NCs의 (A) DLS 히스토그램, (B) 퓨리에-변환 적외선(FTIR) 스펙트럼, (C) 제타 전위 결과, 및 (D) 원자외선 원편광 2색성(CD) 스펙트럼을 나타낸다. (A)에서의 삽입도는 (ii) BSA(FITC 염료로 공액화된) 및 (i) BSA-Au-NCs의 전기영동 데이터(UV 광 하에서)를 나타낸다.

BSA 분자가 형광성 Au-NCs를 어떻게 "바이오미네랄화"하는가는 분자 레벨에서 명확하지 않았지만, 이를 밝혀주는 몇 가지 실험적 관찰이 있었다. 이론에 얽매이고 싶지는 않지만, 단백질의 응답 가능한 잔기에 의한 캡슐화 Au 이온의 원위치 환원 및 NaOH의 첨가는 모두, 몇몇 구현예에서 BSA-Au-NCs의 형성을 위해 중요했다. BSA-Au-NCs 합성의 경우와 동일한 반응 용액 중의 여분의 환원제인 수소화붕소나트륨(NaBH₄)을 첨가함으로써 컨트롤 실험을 실행했다. 얻어진 BSA-Au-NCs는 매우 약한 적색 형광을 방출했다(QY∼0.1%, 표 1 및 도 7). 구체적으로, 도 7은 (0) BSA, (1) 최적 조건에서 합성된 BSA-Au-NCs, (2) NaBH₄를 사용하여 합성된 BSA-Au-NCs, (3) NaOH를 사용하여 합성된 BSA-Au-NCs, (4) 100℃에서 합성된 BSA-Au-NCs, 및 (5) 낮은 농도의 BSA(2.5mg/ml)를 사용하여 합성된 BSA-Au-NCs에 대한, (A) 가시광과 (B) 자외선 광에서의 사진, (C) 광학적 흡수 스펙트럼 및 (D) 광전자방출 스펙트럼(λ_ex=470nm)을 나타낸다. 최근의 연구 결과, Tyr 또는 Tyr 잔기를 함유하는 통상적 펩티드가 그것의 페놀기를 통해 Au(Ⅲ) 또는 Ag(I) 이온을 환원시킬 수 있고; 그의 환원 능력은 반응 pH를 Tyr의 pK_a보다 높게(∼10) 조절함으로써 크게 향상될 수 있는 것으로 밝혀졌다. NaOH의 첨가도 필요했는데, NaOH를 첨가하지 않았을 때에는 불규칙하거나 판 형태를 가진 큰 나노입자(>20nm)만 얻어졌고(도 8 참조; NaOH를 사용하지 않고 합성된 BSA-Au-NCs의 TEM 이미지를 나타냄), 이들 나노입자는 형광을 나타내지 않았다. 높은 양자 수율로 형광성 Au-NCs를 합성하는 데에는 반응 온도가 중요한 고려사항이었다. 반응은 여러 가지 온도(25℃, 37℃ 및 100℃)에서 수행되었고, Au-NCs는 25℃에서 매우 느리게 형성되었으며; 12시간의 반응 후에도 클러스터를 검출되지 않았다. 생리학적 온도(37℃)에서의 반응은 합리적인 환원 반응속도를 나타냈다. 반응은 12시간 내에 완결되었고, 높은 양자 수율(∼6%)의 BSA-Au-NCs가 얻어졌다. 반응 온도가 100℃로 상승되었을 때, 반응 속도는 급격시 증가되었다. 반응은 수분 내에 완결되었지만, 제조된 BSA-Au-NCs는 비교적 낮은 QY(∼0.5%, 표 1 및 도 7 참조)를 가졌다. Au 전구체에 대한 BSA 농도의 비가 중요했다. 고정된 Au 전구체 농도(5mM)에서, Au-NCs의 효과적인 보호를 위해서는 높은 BSA 농도(10∼25mg/ml)(여기서 아미노산 잔기의 농도는 ∼20mM 내지 50mM)가 필요했다. Au 전구체 농도를 일정하게(5mM) 유지하면서 BSA 농도를 2.5mg/ml까지 감소시킨 결과, 형광성이 없는 큰 나노입자가 생성되었다(표 1 및 도 7).

여러 가지 반응 조건에서 합성된 BSA - Au - NCs 의 광학적 성질

합성 조건	λ_abs(max, nm)	λ_em(max, nm)	QY(%)
최적화 조건(예; 실시예 2 참조)	480	640	6
NaBH₄ 사용	530	683	0.1
NaOH 첨가하지 않음	520, 584, 667	-	-
100℃에서 합성	544	660	0.5
낮은 BSA 농도(2.5mg/ml)에서 합성	530	-	-

표 1에서, BSA-Au-NCs의 QY는 470nm 여기 하에서 BSA-Au-NCs와 기준물(염기성 에탄올 중 플루오레세인 용액, QY=97%)의 형광 강도의 적분치를 측정함으로써 판정되었다. 스펙트럼 측정을 위한 BSA-Au-NCs는 탈이온수로 희석하여 470nm에서 ∼0.1의 흡광도를 수득했다.

결론적으로, 이 실시예는 Au 전구체를 원위치에서 격리시키고 환원하기 위한 통상적 단백질을 이용하여 적색 방출을 가진 Au-NCs를 제조하는 새로운 방법을 예시했다. 제조된 BSA-Au-NCs는 용액(수용액 또는 완충 용액) 및 고체 형태 모두에 있어서 안정적이었다. 발광성 Au-NCs는 약 25개의 금 원자(Au₂₅)로 이루어졌다. 실험 조건은 BSA-Au-NCs를 높은 QY로 유도하도록 최적화되었다. 프로토콜 및 생성물은 형광성 BSA-Au-NCs를 제조하기 위한 간단한 "그린(green)" 방법을 제공할 뿐 아니라 단백질/펩티드와 Au 이온의 상호작용(바이오미네랄화 또는 생체 모방형(biomimetic) 미네랄화)이 단백질-Au-NC의 생성을 위해 사용될 수 있다는 것을 예시하기 때문에 중요하다.

실시예 2

다음의 실시예는 실시예 1에서 제조되고 사용된 금 나노클러스터에 관한 추가적 실험 정보를 설명하는 것이다.

모든 화학약품을 Sigma-Aldrich사로부터 구입했고, 입수된 상태로 사용되었다. Millipore 초순수(18.2M)가 사용되었다.

적색 형광성 Au - NCs 의 합성. 모든 유리기구는 왕수(HCl:HNO₃ 체적비 = 3:1)로 세척되었고, 에탄올과 초순수로 헹구었다. 전형적인 실험에서, HAuCl₄ 수용액(5ml, 10mM, 37℃)를 강하게 교반하면서 BSA 용액(5ml, 50mg/ml, 37℃)에 첨가했다. 2분 후에 NaOH 용액(0.5ml, 1M)을 도입하고, 강하게 교반하면서 37℃에서 12시간 동안 반응을 진행시켰다.

물질 특성. 각각, Agilent 8453 UV-가시광 분광계 및 Jobin Yvon Horiba Fluorolog 형광 분광계를 사용하여 흡수 스펙트럼 및 광전자방출 스펙트럼을 얻었다. BSA-Au-NCs 및 BSA 수용액의 DLS 분석을 BI-200SM 레이저 광 산란 시스템(Brookhaven Instruments Corporation)을 사용하여 실행했다. ELAN 9000/DRC ICP-MS 시스템으로 원소 분석을 실행했다. BSA 및 BSA-Au-NCs의 분자량은 Bruker Daltonics Autoflex II TOF-TOF 시스템 상의 MALDI-TOF 질량 분석법으로 분석했다. 투과 전자 현미경검사(TEM) 및 XPS를 각각, 200kV에서 FEI Tecnai TF-20 전계방출 고해상도 투과 전지 현미경, 및 VG ESCALAB MKII 분광계로 실행했다. Au 4f 코어 레벨의 좁은 스캔 XPS 스펙트럼은, Cls(284.5eV)의 결합 에너지를 캘리브레이트하기 위해 우발적 탄소를 사용하여, XPSPEAK 소프트웨어(Version 4.1)에 의해 디콘볼루션되었다.

실시예 3

다음의 실시예는 본 발명의 비제한적 구현예에 따른 금 나노클러스터를 이용한 수은 이온(Hg⁺²)의 검출을 설명한다. 수은 이온(Hg⁺²)의 일상적 검출은 환경과 인간의 건강에 대해 수은 이온이 가지는 유해한 영향 때문에, 수중 생태계 내 환경적 모니터링의 중요한 측면이다.

이론에 얽매이고 싶지는 않지만, 최근의 이론적 연구는, 폐각(closed shell) 금속 원자들간의 분산력은 매우 특이적이고 강하며, 특히 이들 상호작용이 Hg²⁺(4f¹⁴5d¹⁰) 및 Au+(4f¹⁴5d¹⁰)와 같은 중질 이온을 내포할 때 상대적 효과에 의해 크게 증폭된다고 시사한다. 따라서, Hg² ⁺-Au⁺ 상호작용의 이용은 Hg² ⁺ 검출에 있어서 무라벨(label-free) 접근을 위해 매력적이다. 실시예 1에서 설명한 바와 같이, 단백질-템플레이티드(protein-templated) 방법을 이용하여 금 나노클러스터(BSA-Au-NCs)를 합성했다. 제조된 BSA-Au-NCs는 25개의 금 원자(Au25)로 이루어졌으며, 강한 적색 형광(λ_emmax=640nm)을 방출했다. 클러스터 코어의 표면은 Hg² ⁺와 강하고 특이적인 상호작용을 가질 수 있는 소량의 Au⁺(∼17%)에 의해 안정화된다. 이 실시예에서, BSA-Au-NCs의 형광을 소멸시키기 위해 금속 친화적 Hg² ⁺-Au⁺ 상호작용에 의존하는 Hg² ⁺의 검출을 위한 기술이. 도 9에 나타낸 바와 같이 제시된다. 도 9는 Hg² ⁺ 이온(50mM)의 (1) 부재 및 (2) 존재 하에, (A) 광전자방출 스펙트럼(λ_ex=470nm), 및 (B) UV 광 하의 Au-NCs의 사진, 및 (C) 높은 친화력의 금속 친화성 Hg² ⁺-Au⁺ 결합으로부터 얻어지는 Au-NCs의 형광 소멸에 의거한 Hg² ⁺ 센싱의 개략도를 나타낸다. 이러한 1단계 방법은 간단하고, 빠르며, 높은 성택성 및 감도를 가진다. 더 나아가, 이러한 방법은 일상적 Hg² ⁺ 모니터링을 촉진시키는 종이 테스트 스트립으로서 이용될 수 있다(이하에 나타낸 바와 같음).

형광성 BSA-Au-NCs를 합성하고, 실시예 4에 기재된 공정에 따라 정제했다. Au-NCs 수용액(∼20mM)에 Hg² ⁺ 이온(50mM)을 첨가한 다음, BSA-Au-NCs의 적색 형광(도 9B, 1)은 광전자방출 스펙트럼에서도 입증된 바와 같이(도 9A), 수초 내에 완전히 소멸되었다(도 9B, 2). BSA-Au-NCs의 형광 소멸은 Hg² ⁺와 Au⁺의 상호작용에 기인했다. BSA-Au-NCs의 적색 형광은 Hg² ⁺ 이온의 존재 하에, BSA-Au-NCs 용액에 강한 환원제(예; 수소화붕소나트륨)을 첨가함으로써 부분적으로 회수될 수 있었다(도 9A 및 9B, 3). 이론에 얽매이고 싶지 않지만, 수소화붕소나트륨은 Hg² ⁺를 Hg⁰으로 환원시키고, Hg⁰가 Au⁺와의 약한 결합 에너지를 가지기 때문에 형광성 Au-NCs에 대해 더 낮은 소멸 효율성을 가지는 것으로 생각된다. Hg의 산화 상태는 X선 광전자 분광법(XPS)에 의해 확인되었다(도 10). 구체적으로, 도 10은 (A) BSA-Au-NCs에 의해 격리된 Hg 이온 및 (B) NaBH₄에 의해 환원된 격리된 Hg 이온의 XPS Hg 4f 스펙트럼을 나타낸다.

BSA-Au-NCs 용액에 Hg² ⁺ 이온을 첨가하는 것은 BSA-Au-NCs의 크기에 효과가 거의 없고(도 11), 형광 소멸에 대한 BSA-Au-NCs 응집의 효과를 배제시킨다. 도 11은 Hg² ⁺ 이온의 존재 하에 BSA-Au-NCs의 대표적인 TEM 이미지로서, 클러스터 크기가 ∼0.8nm인 것을 나타낸다. 또한, 제조된 BSA-Au-NCs의 응집은 BSA-Au-NCs의 형광에 대해 무시할 만한 효과를 가진다(도 12). 도 12는 (A) 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드(EDC)법을 통한 폴리스티렌 비즈(1mm)에 공액을 이룬 BSA-Au-NCs의 개략도 및 (B) 폴리스티렌-BSA-Au-NCs의 대표적 형광 이미지를 나타낸다.

Hg² ⁺-Au⁺ 상호작용의 높은 특이성은 환경적으로 관련된 다른 금속 이온에 비해 Hg² ⁺를 검출하는 데 있어서 이 방법의 우수한 선택성을 제공한다. 도 13A는 BSA-Au-NCs의 형광성이 50M의 Ag⁺, Cu² ⁺, Zn² ⁺, Mg² ⁺, K⁺, Na⁺, Ni² ⁺, Mn² ⁺, Fe³ ⁺, Cd² ⁺, Pt⁴⁺, Pd² ⁺, Co² ⁺, Pb² ⁺ 및 Ca² ⁺ 이온에 의해 소멸되지 않았음을 나타낸다. 오직 Hg² ⁺ 이온만이 BSA-Au-NCs 형광성을 거의 100% 소멸시켰다(도 13B). 이러한 검출 선택성은 육안으로 가시화될 수 있다(도 13B). 구체적으로, 도 13은 50mM의 다양한 금속 이온의 존재 하에, Au-NCs의 수용액(20mM)의 (A) UV 광에서의 사진 및 (B) λ_ex=470nm에서의 상대적 형광(I/I₀)을 나타낸다.

또한, 제조된 Au-NCs는 다양한 음이온(예를 들면, Cl^-, NO₃ ^-, SO₄ ² ^-, 및 PO₄ ³ ^-) 및 완충제(예를 들면, 2-(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐)에탄설폰산(HEPES))에 대해 견실하므로, 이 방법은 다양한 환경으로부터 채취한 샘플을 시험하기에 적합하다. Hg² ⁺와 Au⁺의 강한 결합 에너지는 또한 이 방법을 매우 민감성인 것으로 만들었다. 이론적으로, BSA-Au-NCs의 형광성은 NC 표면 상의 하나의 Au⁺ 이온과의 상호작용을 통해 Hg² ⁺ 이온에 의해 소멸될 수 있었다. 분석의 감도를 평가하기 위해서, 20nM의 Au-NCs를 함유하는 일련의 용액에 여러 가지 농도의 Hg² ⁺(0.05∼100nM)를 첨가했다. 도 14에 나타낸 바와 같이, BSA-Au-NCs의 형광성은 Hg² ⁺ 농도가 증가됨에 따라 감소되었다. Hg² ⁺에 대한 BSA-Au-NCs의 형광성은 1∼20nM의 Hg² ⁺ 농도 범위에 걸쳐 직선적으로 감소되었다. 구체적으로, 도 14는 (A) 여러 가지 Hg² ⁺ 농도의 존재 하에서의 BSA-Au-NCs(20nM)의 광전자방출 스펙트럼(λ_ex=470nm), 및 (B) Hg² ⁺ 농도의 함수로서 BSA-Au-NCs의 상대적 형광(I/I₀)을 나타낸다. 도 14C는 Hg² ⁺의 1∼20nM에 대한 직선적 검출 범위를 나타낸다. 노이즈에 대한 신호의 비가 3일 때, Hg² ⁺에 대한 검출 한계(LOD)는 0.5nM(0.1ppb)으로 추정되었는데, 이것은 미국 환경보호국(EPA)에 의해 허용된 음용수 중 수은의 최대 레벨(2.0ppb)보다 훨씬 높은 것이었다.

금 나노클러스터를 이용한 Hg² ⁺의 검출은 종이 테스트 스트립 시스템까지 확장되었다. BSA-Au-NCs는 니트로셀룰로스 스트립 상에 분산되었다. 이어서 BSA 비계에 의해 캡슐화되었고, 이것은 니트로셀룰로스 멤브레인에 내포되었다. 비결합성 BSA-Au-NCs는 물로 헹구어져 제거되었다. Hg² ⁺ 검출을 위한 이 종이 테스트 스트립 시스템의 선택성은 테스트 스트립을 50mM의 농도에서 다양한 금속 이온의 용액 중에 침지함으로써 평가되었다. Hg² ⁺ 이온 용액에 침지된 테스트 스트립만이 UV 광 하에서 약한 녹색(니트로셀룰로스 멤브레인의 바탕색이었음)을 띠었다(도 15A). 구체적으로, 도 15A는 UV 광으로 조사된 BSA-Au-NCs를 가진 테스트 스트립의 사진으로서, 테스트 스트립이 50mM의 다양한 금속 이온의 용액 중에 침지된 후의 사진을 나타낸다. 모든 다른 테스트 스트립은 BSA-Au-NCs와 관련된 강한 적색 형광을 방출했다. 테스트 스트립은 또한, 도 15B에 나타난 바와 같이, 다양한 농도(2mM(어두운 녹색), 200nM(자주색), 20nM(자주색-분홍색), 및 2nM(분홍색))의 Hg² ⁺ 이온 용액 중에 침지된 후, 여러 가지 색을 발생했다(녹색으로부터 자주색가지). 구체적으로, 도 15B는 Hg²⁺의 용액 중에 침지된 테스트 스트립의 사진(UV 광에서)을 나타낸다. 따라서, 그러한 테스트 스트립은 Hg² ⁺ 이온 농도를 시각적으로 신속히 추정하는 데 이용될 수 있다.

이 실시예는, 비제한적 구현예에 따라, 수성 매체 중 형광성 BSA-Au-NCs를 이용하여 높은 선택성과 감도로 Hg² ⁺ 이온을 검출하는 새롭고 간단한 방법을 예시한다. 감지 메커니즘은, BSA-Au-NCs의 형광성을 효과적으로 소멸시키는, 높은 친화력의 금속친화성 Hg² ⁺-Au⁺ 상호작용을 토대로 했다. BSA-Au-NCs는 다른 금속 이온에 비해 Hg² ⁺ 에 대해 두드러지게 높은 선택성을 나타냈으며, 0.5nM와 같이 낮은 농도에서도 Hg² ⁺ 이온을 검출했다. 이 공정은 친환경적 화학반응을 수반하는 것이 주목할 점이었고, Hg²⁺ 이온의 신속한 일상적 모니터링을 위한 간단한 종이 테스트 스트립 시스템으로서 개발될 수 있었다.

실시예 4

이하의 실시예는 실시예 3에서 제조되고 사용된 금 나노클러스터에 관한 추가적 실험 정보에 대해 기술한다.

실시예 5

시시예 4에 기재된 공정을 이용하여, BSA 대신에 인간 혈청 알부민(HSA) 또는 리소자임(LYS)을 사용하여 Au-NCs를 합성했다. (i) BSA, (ii) HSA, 및 (ⅲ) LYS를 사용하여 합성된 Au-NCs의 수용액의 광전자방출 스펙트럼(λ_ex=470nm)이 도 16에 나타나 있다.

이상과 같이, 본 발명의 몇 가지 구현예가 본 명세서에 기재되고 예시되었지만, 당업자는 본 명세서에 기재된 기능을 실행하고 및/또는 결과 및/또는 하나 이상의 이점을 얻기 위한 다양한 다른 수단 및/또는 구조를 용이하게 인지할 것이며, 그러한 변경 및/또는 변형은 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 간주된다. 보다 일반적으로, 당업자는 본 명세서에 기재된 모든 파라미터, 치수, 물질, 및 구성은 예시적인 것을 의미하며, 실제의 파라미터, 치수, 물질 및/또는 구성은 본 발명의 교시가 사용되는 특정 응용 분야(들)에 의존할 것임을 용이하게 이해할 것이다. 당업자는, 일상적인 실험만을 이용하여도, 본 명세서에 기재된 본 발명의 특정 구현예들에 대한 많은 등가물을 인지하거나 확인할 수 있을 것이다. 따라서, 전술한 구현예들은 예를 들기 위해 제시되었을 뿐이며, 첨부된 청구의 범위 및 그의 등가물 내에서, 구체적으로 기재되고 청구된 것 이외에 본 발명이 실시될 수 있는 것으로 이해해야 한다. 본 발명은 본 명세서에 기재된 각각의 개별적인 특징, 시스템, 물품, 물질, 키트, 및/또는 방법에 관한 것이다. 또한, 그러한 특징, 시스템, 물품, 물질, 키트, 및/또는 방법이 서로 모순되지 않는다면, 그러한 특징, 시스템, 물품, 물질, 키트, 및/또는 방법 중 둘 이상의 임의의 조합이 본 발명의 범위에 포함된다.

본 명세서 및 청구의 범위에 사용된 부정관사 "a" 및 "an"은 달리 명시되지 않은 한, "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해해야 한다.

본 명세서 및 청구의 범위에 사용된 "및/또는"이라는 용어는 결합된 엘리먼트들, 즉 몇몇 경우에는 결합되어 존재하고 다른 경우에는 택일적으로 존재하는 엘리먼트들 중 "어느 하나 또는 둘 모두"를 의미하는 것으로 이해해야 한다. 달리 명시되지 않은 한, 구체적으로 확인된 엘리먼트와 관련되는지 여부에 관계없이, "및/또는" 문구에 의해 구체적으로 확인된 엘리먼트를 제외한 다른 엘리먼트들이 선택적으로 존재할 수 있다. 따라서, 비제한적 예로서, "A 및/또는 B"라는 표현은, "포함하는(comprising)"과 같은 열려 있는 언어와 관련하여 사용될 때에는, 일 구현예에서는 B를 포함하지 않은 A(선택적으로는 B 이외의 엘리먼트를 포함)를 의미할 수 있고; 다른 구현예에서는 A를 포함하지 않은 B(선택적으로는 A 이외의 엘리먼트를 포함)를 의미할 수 있고; 또 다른 구현예에서는 A와 B 모두(선택적으로는 다른 엘리먼트를 포함)를 의미할 수 있다.

본 명세서 및 청구의 범위에서 사용되는 용어로서, "또는"은 전술한 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해해야 한다. 예를 들면, 목록 중의 아이템을 분리할 때, "또는"이나 "및/또는"은 포괄적인 것으로, 즉 적어도 하나를 포함하되, 엘리먼트의 수 또는 목록 중 하나보다 많은 것도 포함하고, 선택적으로는 수록되지 않은 추가적 아이템도 포함하는 것으로 해석되어야 한다. "∼중 오직 하나" 또는 "∼중 정확히 하나"와 같은 상반되게 명시되는 용어만, 또는 청구의 범위에서 사용될 대의 "∼로 구성되는"이라는 용어는 엘리먼트의 수 또는 목록 중 정확히 하나의 엘리먼트를 포함하는 것을 의미할 것이다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용되는 "또는"이라는 용어는, "∼ 중 어느 하나", "∼ 중 오직 하나" 또는 "∼ 중 정확히 하나"와 같은 배타적 용어가 앞에 왔을 때 배타적인 대안(즉 "어느 하나 또는 다른 것이되 둘 모두는 아님")을 나타내는 것으로만 해석되어야 한다. "본질적으로 ∼으로 구성되는"이라는 표현은, 청구의 범위에서 사용될 때, 특허 분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 가진다.

본 명세서 및 청구의 범위에서 사용되는 용어로서, 하나 이상의 엘리먼트의 목록을 지칭하는 "적어도 하나"라는 용어는 엘리먼트의 목록 중 임의의 하나 이상의 엘리먼트로부터 선택되는 적어도 하나의 엘리먼트를 의미하지만, 엘리먼트의 목록 내에 구체적으로 수록된 각각의 그리고 모든 엘리먼트 중 적어도 하나를 반드시 포함하는 것은 아니며, 엘리먼트의 목록에 있는 엘리먼트들의 임의의 조합을 반드시 배제하는 것은 아닌 것으로 이해해야 한다. 이러한 정의는 또한, "적어도 하나"라는 용어가 지칭하는 엘리먼트의 목목 내에 구체적으로 확인되는 엘리먼트가 아닌 엘리먼트가, 구체적으로 확인된 엘리먼트에 관련되는지 여부와 관계없이, 선택적으로 존재할 수 있다는 것을 허용한다. 따라서, 비제한적 예로서, "A 및 B 중 적어도 하나)(또는 동등하게, "A 또는 B 중 적어도 하나", 또는 동등하게 "A 및/또는 B 중 적어도 하나")라는 표현은, 일 구현예에서는 적어도 하나, 선택적으로는 둘 이상을 포함하여, B가 존재하지 않는 A(및 선택적으로는 B를 제외한 엘리먼트를 포함); 또 다른 구현예에서는 적어도 하나, 선택적으로는 둘 이상을 포함하여, A가 존재하지 않는 B(및 선택적으로는 A를 제외한 엘리먼트를 포함); 또 다른 구현예에서는 적어도 하나, 선택적으로는 둘 이상을 포함하여, A, 및 적어도 하나, 선택적으로는 둘 이상을 포함하여, B(및 선택적으로는 다른 엘리먼트를 포함); 등을 의미할 수 있다.

청구의 범위와 상기 상세한 설명에서, "포함하는", "가지는", "함유하는", "내포하는", "보유하는", 등과 같은 모든 전이구(transitional phrase)는 개방형으로, 즉 포함하되 제한되지 않는 것을 의미한다고 이해해야 한다. "구성하는" 및 "본질적으로 구성하는"이라는 용어만dl 미국 특허청의 특허 심사 절차(MPEP), 제2111.03 섹션의 매뉴얼에 제시된 바와 같이, 폐쇄형 또는 준폐쇄형 전이구이다.

Claims

복수 개의 금 나노클러스터(gold nanocluster); 및
단백질 또는 안정화제
를 포함하고,
상기 금 나노클러스터는 약 630nm 내지 약 700nm의 파장에서 1% 이상의 양자 수율로 형광을 방출할 수 있는,
조성물.
복수 개의 금 나노클러스터를 형성하는 방법으로서,
복수 개의 금 원자 전구체 분자 및 복수 개의 단백질 분자를 포함하는 반응 혼합물을 형성하는 단계로서, 금 원자 전구체 분자 대 단백질 분자의 비가 약 5:1 이상인 형성 단계;
상기 반응 혼합물의 pH를 약 11보다 높게 조절하는 단계; 및
하나 이상의 단백질 분자에 의해 안정화된 복수 개의 금 나노클러스터를 형성하기에 충분한 시간 동안 상기 반응 혼합물을 적합한 온도로 유지시키는 단계
를 포함하고,
상기 금 나노클러스터는 약 2nm 미만의 평균 직경을 가지는,
금 나노클러스터의 형성 방법.
수은 이온을 검출하는 방법으로서,
약 2nm 미만의 평균 직경을 가지는 복수 개의 금속 나노클러스터 및 단백질 또는 안정화제를 포함하는 조성물을 제공하는 단계;
수은 이온을 함유하는 것으로 의심되는 샘플에 상기 조성물을 노출시키는 단계; 및
상기 샘플이 수은을 포함하는지 여부를 판정하는 단계
를 포함하는 수은 이온의 검출 방법.
수은 이온을 검출하는 방법으로서,
약 630nm 내지 약 700nm의 파장에서 양자 수율이 1% 이상인 제1 형광 강도를 가진 복수 개의 금 나노클러스터를 제공하는 단계;
수은 이온을 함유하는 것으로 의심되는 샘플에 상기 클러스터를 노출시켜 상기 형광 강도의 변화를 판정하는 단계; 및
상기 형광 강도의 변화를 토대로 상기 샘플이 수은을 포함하는지 여부를 판정하는 단계
를 포함하는 수은 이온의 검출 방법.
수은 이온을 검출하는 방법으로서,
식 Au₂₅를 가지는 복수 개의 안정화된 금 나노클러스터를 포함하는 조성물을 제공하는 단계;
수은 이온을 함유하는 것으로 의심되는 샘플에 상기 조성물을 노출시키는 단계; 및
상기 샘플이 수은을 포함하는지 여부를 판정하는 단계
를 포함하는 수은 이온의 검출 방법.
샘플 중에 수은 이온의 존재 또는 부재를 판정하기 위한 물품으로서,
기판; 및
금 나노클러스터 및 단백질 또는 안정화제를 포함하는, 상기 기판과 관련된 조성물
을 포함하는, 물품.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 금 나노클러스터가 약 25개의 금 원자를 포함하는, 조성물, 수은 이온의 검출 방법 또는 물품.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단백질이 소 혈청 알부민인, 조성물, 수은 이온의 검출 방법 또는 물품.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단백질이 인간 혈청 알부민인, 조성물, 수은 이온의 검출 방법 또는 물품.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단백질이 리소자임인, 조성물, 수은 이온의 검출 방법 또는 물품.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 금 나노클러스터가 약 2nm 미만의 평균 직경을 가지는, 조성물, 수은 이온의 검출 방법 또는 물품.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 금 나노클러스터가 약 1nm 미만의 평균 직경을 가지는, 조성물, 수은 이온의 검출 방법 또는 물품.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 금 나노클러스터가 실질적으로 단일분산계(monodisperse)인, 조성물, 수은 이온의 검출 방법 또는 물품.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 금 나노클러스터가 약 630nm 내지 약 700nm의 파장에서 형광을 방출할 수 있는, 조성물, 수은 이온의 검출 방법 또는 물품.
.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 금 나노클러스터가 1% 이상의 양자 수율로 형광을 방출할 수 있는, 조성물, 수은 이온의 검출 방법 또는 물품.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 금 나노클러스터가 3% 이상의 양자 수율로 형광을 방출할 수 있는
, 조성물, 수은 이온의 검출 방법 또는 물품.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 금 나노클러스터가 6% 이상의 양자 수율로 형광을 방출할 수 있는
, 조성물, 수은 이온의 검출 방법 또는 물품.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
적어도 2시간 동안 30℃ 이상의 온도로 상기 반응 혼합물을 가열하는 단계를 포함하는, 수은 이온의 검출 방법.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
약 37℃의 온도에서 적어도 약 8시간 동안 상기 반응 혼합물을 가열하는 단계를 포함하는, 수은 이온의 검출 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 금 나노클러스터를 안정화시키는 하나 이상의 단백질 분자를 안정화제로 대체하는 단계를 추가로 포함하는, 수은 이온의 검출 방법.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 안정화제가 시스테인 또는 글루타치온인, 조성물, 수은 이온의 검출 방법 또는 물품.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
수은 이온의 검출 한계가 약 5nM 미만인, 수은 이온의 검출 방법 또는 물품.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
수은 이온의 검출 한계가 약 1nM 미만인, 수은 이온의 검출 방법 또는 물품.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
수은 이온의 검출 한계가 약 0.5nM 미만인, 수은 이온의 검출 방법 또는 물품.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
샘플이 수은 이온을 포함하는지 여부를 판정하는 단계가, 상기 조성물 또는 상기 금 나노클러스터의 형광의 변화를 판정하는 단계를 포함하는, 수은 이온의 검출 방법.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 금 나노클러스터 또는 상기 조성물의 형광 강도의 변화는, Ag⁺, Cu² ⁺, Zn²⁺, Mg² ⁺, K⁺, Na⁺, Ni² ⁺, Mn² ⁺, Fe³ ⁺, Cd² ⁺, Pt⁴ ⁺, Pd² ⁺, Co² ⁺, Pb² ⁺ 또는 Ca² ⁺로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 금속 이온에 노출되었을 때 20% 미만인, 수은 이온의 검출 방법.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
샘플 중의 수은 이온의 농도의 척도(measure)를 판정하는 단계를 추가로 포함하는, 수은 이온의 검출 방법.
제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 샘플 중의 수은 이온의 농도의 척도는 상기 조성물 또는 상기 금 나노클러스터의 형광의 변화에 의거하여 결정되는, 수은 이온의 검출 방법.
제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 샘플이 환경적 소스로부터 얻어지는, 수은 이온의 검출 방법.
제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 기판이 니트로셀룰로스를 포함하는, 물품.
제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 반응 혼합물의 pH가 약 12보다 높게 조절되는, 수은 이온의 검출 방법.
제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 반응 혼합물의 pH가, 상기 반응 혼합물에 염기를 제공함으로써 조절되는, 수은 이온의 검출 방법.
제33항에 있어서,
상기 염기가 NaOH인, 수은 이온의 검출 방법.