CN111375783B - 一种多功能hsa-镉纳米簇、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及金属纳米材料技术领域，具体涉及一种多功能HSA‑镉纳米簇、制备方法及其应用。该多功能HSA‑镉纳米簇以人血清白蛋白为模板与氯化镉结合制备得到，该HSA‑镉纳米簇具有荧光量子产率高、生物相容性好的特性，能够应用于环境监测以及生物医学领域。本发明还提供了一种多功能HSA‑镉纳米簇应用于铅检测的方法，该检测方法具有成本低、限制少、灵明度高、速度快的优点，并且检测过程中不受环境影响，性能稳定，重复性好，有效性高，操作简单；此外，该检测方法当存在共存元素(钴、镍、锌、汞、铬)时，能够保证检测结果的准确性，即该方法对铅的检测具有特异性。

Description

一种多功能HSA-镉纳米簇、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及金属纳米材料技术领域，具体涉及一种多功能HSA-镉纳米簇、制备方法及其应用。

背景技术

金属纳米簇通常是由几个到几百个不等的金属原子组成的荧光纳米材料，一般认为金属纳米簇是介于单个金属原子和大金属原子之间的过渡态，其尺寸较接近费曼波长，显示出不同于一般的金属纳米团的光学性质、磁学性质以及催化性质。在过去几十年中，研究者们研究出了许多关于金属纳米簇的合成方法，包括化学合成法、生物模板法、单分子合成法，其中生物模板法因其装置简单、操作容易、合成得到的纳米簇形态可控等优势得到广泛应用。生物大分子如多肽、蛋白质，可被用作模板来合成金属纳米簇。蛋白质是一类由氨基酸组成，普遍存在于机体内的生物大分子，其通过接连肽键而成。蛋白质经过空间折叠与螺旋后会形成特殊结构，进而使得金属原子(如金、银、铜原子)在空腔结构中不易团聚，可形成合适的粒径尺寸。另外，蛋白质模型中存在的官能团如巯基、氨基、羧基等，可以高效的与金属原子发生作用，使金属纳米簇稳定存在，保障其荧光发光不发生聚集而被猝灭。以蛋白质为模板制备的金属纳米簇的荧光量子产率已经得到了质的提高，量子发光效率也大有改善，不但可以保证簇优良的物理化学和光学性能，而且因为其具有蛋白质的优异的生物相容性，可以更好地应用到生物、医学、化学等领域中。人血清白蛋白 (HSA)、牛血清白蛋白(BSA)是较为常用的生物大分子模板，其中，HSA是具有一个色氨酸残基的585个氨基酸的单一多肽，其生物相容性良好、合成得到的纳米材料稳定性较好，且在合成过程中可作为稳定剂与保护剂，在金属纳米簇的合成中得到了广泛的应用，例如以HSA为模板合成得到稳定的HSA-金纳米簇(HSA-AuNCs)，该纳米材料尺寸均匀、光稳定性好；在室温下制备的以HSA为模板发强红色荧光的金属铜纳米簇，该纳米簇具有出色的灵敏性以及选择性，可以对胆红素进行高灵敏的检测。

金属纳米簇常被用于各种金属离子的检测，在对金属离子进行检测的过程中，一般是利用荧光猝灭效应或者获得荧光增强效应来对相关金属离子进行检测。现有技术中以BSA 为模板合成金纳米簇，能够通过荧光猝灭效应对微量铜离子进行定量检测；BSA稳定的金纳米簇(AuNCs)在汞离子的检测中展现出很好的选择性和灵敏度，其响应机理是汞离子与蛋白质之间由于较强的相互作用使AuNCs荧光发生猝灭，该方法对汞离子的检出限是0.5nM；以三(2-羧乙基)膦(TC离心)对BSA进行前处理后，利用NaBH₄还原变性后的 BSA模板，制备了银纳米簇，实验结果显示，该种银纳米簇作为荧光探针对汞离子检测有高选择性和高灵敏度，检测限达到10nM，并且利用溶菌酶良好的金纳米簇和二氢硫辛酸 (DHLA)稳定的银纳米簇也可用于对汞离子的检测，且都表现出了比其它文献更好的灵敏度和选择性。

铅是一种常见的污染物，对所有的生物体(包括人体、动物体、植物体)以及土壤、水源等都有很大的危害性，自然界中铅有4种稳定同位素，分别是²⁰⁴Pb、²⁰⁶Pb、²⁰⁷Pb和²⁰⁸Pb。铅是有害元素，也是重金属污染物中毒性较大的一种，对人体各个系统和器官均有毒性作用，铅随血液循环流动分布到全身各组织和器官，影响血红细胞和脑、肾、神经系统功能。并且近几年来环境问题日趋严重，人们对环境的要求也越来越高，在这样的环境下，铅检测技术作为污染检测的重要方法之一更是受到来自多方的关注。经过多年的发展，目前已经形成了多种铅检测技术，传统的铅检测方法可以分为三类，分别是物理检测法、化学检测法和生物检测法。检测技术包含光谱检测、电泳仪、液相色谱检测、双硫腙对比法，这些检测方法的准确性极高，但是检测过程复杂、费用高，在实际应用领域难以展开。在此背景下，生物检测技术应运而生。生物检测技术包括核酸检测技术、免疫检测技术以及超分子铅离子生物化学传感检测技术。核酸检测技术基于荧光能量共振转移技术来进行化学成分检测分析，通过检测分析获得寡核苷酸探针，使之与核酸相互补充反应，在生物分子的作用下，形成荧光反应，荧光反应的强弱是铅离子检测的关键环节。目前，该检测技术仍有一定的缺陷，该技术只能适用于单一离子的情况，难以避免多种离子之间的交叉反应。免疫检测技术是一种以抗原、抗体之间的特异性反应为基础搭建起来的生物化学分析方法，与其他检测方法相比具有良好的灵敏度和特异性，易于观察检测结果，不受其它条件干扰，检测结果准确。该方法根据抗体种类的不同可以分为单克隆抗体免疫检测法和多克隆抗体免疫检测法，目前成熟的检测技术有酶联免疫分析和荧光偏振免疫分析两种方法。酶联免疫分析法属于单克隆抗体检测法，这种方式通过合成铅离子抗原来免疫小鼠，该技术的关键就在于获得铅离子抗原以及铅离子的特异性抗体。特异性抗体需要经过特殊的技术获得一种叫做“铅离子-双功能螯合剂”的大分子复合物，然后将这种大分子复合物与载体蛋白结合起来进行化学反应获得铅离子免疫原性。荧光偏振免疫分析主要是依据样品中的铅离子与含过量螯合剂的溶液反应，将该复合物与已知浓度的复合物对比检测多克隆抗体中的特异性，然后通过荧光偏振仪进行分析，将检测获得的数据与标准数据进行对比，得到铅含量。与单克隆检测技术相比较，多克隆检测技术成本更低、效率更好、耗时更少，因此有很大的实际应用潜力。超分子铅离子生物化学传感检测技术将铅离子与一些物质进行选择性的结合，形成新的结合物质，建立铅离子化学传感器。该技术的原理是离子诱导效应引起超分子荧光信号的变化，荧光信号是铅离子含量的重要标志。

铅检测技术中，生物检测技术与传统检测技术相比具有成本低、限制少、灵敏度高、速度快的优点，但是生物检测技术在实际应用领域仍然存在着诸多问题，如检测器受环境影响性能不稳定、重复性差、有效性低，技术难度较高等问题，检测技术的有效发挥受到影响。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种多功能HSA-镉纳米簇及其制备方法，基于制备得到的多功能HSA-镉纳米簇(HSA-CdNCs)的荧光量子产率高、生物相容性好的特性，将HSA-镉纳米簇应用于铅检测并提供检测方法，该多功能HSA-镉纳米簇的制备方法以及应用于铅检测的方法，为其它金属纳米簇的制备以及相关金属的检测提供了新的思路。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

提供一种多功能HSA-镉纳米簇的制备方法，它包括以下步骤：

步骤一、配制镉标准溶液：将氯化镉溶解在超纯水中，配制镉标准溶液；

步骤二、配制人血清白蛋白标准溶液：将人血清白蛋白在超纯水中稀释，即得人血清白蛋白标准溶液；

步骤三、合成纳米簇：将步骤一得到的镉标准溶液与步骤二得到的人血清白蛋白标准溶液混合均匀，然后加入氢氧化钠溶液混合均匀，即得所述多功能HSA-镉纳米簇。

上述技术方案中，将步骤三制备得到的多功能HSA-镉纳米簇放置在4℃的环境中避光保存。

上述技术方案中，所述步骤一中，将氯化镉溶解在超纯水中，配制浓度为5～15mmol/L 的镉标准溶液；所述步骤二中，将人血清白蛋白在超纯水中稀释，得到质量浓度为 40～60mg/mL的人血清白蛋白标准溶液。

上述技术方案中，所述步骤三中，将步骤一得到的镉标准溶液与步骤二得到的人血清白蛋白标准溶液在室温下于磁子搅拌器上以250rpm～350rpm的速度搅拌2min～4min，然后加入浓度为0.8～1.2mol/L的氢氧化钠溶液在35℃～40℃的条件下搅拌11h～13h，即得所述多功能HSA-镉纳米簇。

上述技术方案中，所述步骤三中，将步骤一得到的镉标准溶液与步骤二得到的人血清白蛋白标准溶液放入2mL的离心管中，加入磁子，在室温下于磁子搅拌器上以 2500rpm～3500rpm的速度搅拌2min～4min，然后加入浓度为0.3～0.7mol/L的氢氧化钠溶液在50℃～60℃的条件下搅拌1.5～2.5h，即得所述多功能HSA-镉纳米簇。

上述技术方案中，所述步骤三中，镉标准溶液、人血清白蛋白标准溶液和氢氧化钠溶液的体积比为(9～11)：(9～11)：1。

本发明还提供上述方法制备得到的一种多功能HSA-镉纳米簇。

本发明还提供上述一种多功能HSA-镉纳米簇在铅检测中的应用。

本发明还提供上述一种多功能HSA-镉纳米簇检测铅离子浓度的方法，它包括以下步骤：

步骤一、配制铅标准溶液：配制不同体积的铅标准溶液；

步骤二、配制铅应用溶液：取一系列2mL离心管，向其中加入HSA-镉纳米簇和Tris-Hac 缓冲液，然后分别加入步骤一配制的不同体积的铅标准溶液，之后用超纯水定容并混合均匀，即得铅应用溶液；

步骤三、配制空白溶液：取一2mL离心管，向其中加入HSA-镉纳米簇和Tris-Hac缓冲液，之后用超纯水定容并混合均匀，即得空白溶液；

步骤四、测定荧光强度：设定荧光分光光度计为ex＝365nm，em＝485nm，分别测定步骤三得到的空白溶液和步骤二得到的铅应用溶液的吸光度(F)，计算差值，即得铅离子浓度。

上述技术方案中，所述步骤二中，HSA-镉纳米簇和Tris-Hac缓冲液和铅应用溶液的体积比为(2.5～3.5)：(0.5～1.5)：10；

所述步骤三中，HSA-镉纳米簇和Tris-Hac缓冲液和空白溶液的体积比为(2.5～3.5)： (0.5～1.5)：10。

本发明的有益效果：

本发明提供一种多功能HSA-镉纳米簇及其制备方法，以人血清白蛋白为模板与氯化镉结合制备HSA-镉纳米簇，制备得到的HSA-镉纳米簇具有荧光量子产率高、生物相容性好的特性，能够应用于环境监测以及生物医学领域。

本发明提供了一种多功能HSA-镉纳米簇应用于铅检测的方法，该检测方法具有成本低、限制少、灵明度高、速度快的优点，并且检测过程中不受环境影响，性能稳定，重复性好，有效性高，操作简单；此外，该检测方法当存在共存元素(钴、镍、锌、汞、铬) 时，能够保证检测结果的准确性，即该方法对铅的检测具有特异性。

附图说明

图1本发明的多功能HSA-镉纳米簇的TEM图。

图2为本发明的多功能HSA-镉纳米簇在荧光分光光度计中的反应原理图。

图3为本发明的铅应用溶液在荧光分光光度计中的反应原理图。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1。

一种多功能HSA-镉纳米簇，如图1所示，其制备方法包括以下步骤：

步骤一、配制镉标准溶液：将氯化镉溶解在超纯水中，配制浓度为10mmol/L的镉标准溶液；

步骤二、配制人血清白蛋白标准溶液：将人血清白蛋白在超纯水中稀释，即得质量浓度为50mg/mL的人血清白蛋白标准溶液；

步骤三、合成纳米簇：将步骤一得到的镉标准溶液1800μL与步骤二得到的人血清白蛋白标准溶液1800μL在室温下于磁子搅拌器上以300rpm的速度搅拌3min，然后加入浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液180μL在37℃的条件下搅拌12h，即得所述多功能HSA-镉纳米簇；

步骤四：将步骤三制备得到的多功能HSA-镉纳米簇放置在4℃的环境中避光保存。

实施例2。

一种多功能HSA-镉纳米簇，其制备方法包括以下步骤：

步骤一、配制镉标准溶液：将氯化镉溶解在超纯水中，配制浓度为10mmol/L的镉标准溶液；

步骤二、配制人血清白蛋白标准溶液：将人血清白蛋白在超纯水中稀释，即得质量浓度为50mg/mL的人血清白蛋白标准溶液；

步骤三、合成纳米簇：将步骤一得到的镉标准溶液1800μL与步骤二得到的人血清白蛋白标准溶液1800μL放入2mL的离心管中，加入磁子，在室温下于磁子搅拌器上以3000rpm的速度搅拌3min，然后加入0.5mol/L的氢氧化钠溶液180μL在55℃的条件下搅拌2h，即得所述多功能HSA-镉纳米簇。

步骤四：将步骤三制备得到的多功能HSA-镉纳米簇放置在4℃的环境中避光保存。

实施例3。

一种多功能HSA-镉纳米簇能够应用于铅检测，其检测方法包括以下步骤：

步骤一、配制铅标准溶液：配制不同体积的铅标准溶液；

步骤二、配制铅应用溶液：取一系列2mL离心管，向其中加入HSA-镉纳米簇150μL和浓度为50mmol/L、pH为5.5的Tris-Hac缓冲液50μL，然后分别加入步骤一配制的不同体积的铅标准溶液，之后用超纯水定容至500μL并混合均匀，即得不同浓度的铅应用溶液；

步骤三、配制空白溶液：取一2mL离心管，向其中加入HSA-镉纳米簇150μL和浓度为50mmol/L、pH为5.5的Tris-Hac缓冲液50μL，之后用超纯水定容至500μL并混合均匀，即得空白溶液；

步骤四、测定荧光强度：设定荧光分光光度计为ex＝365nm，em＝485nm，分别测定步骤三得到的空白溶液和步骤二得到的铅应用溶液的吸光度(F)，计算差值，即得铅离子浓度。

如图2所示，多功能HSA-镉纳米簇(HSA-CdNCs)在荧光分光光度计中保持强荧光，如图3所示，向图2的多功能HSA-镉纳米簇中添加铅离子，再次放入荧光分光光度计中进行检测，荧光变弱，即铅离子对HSA-镉纳米簇产生静态猝灭，铅离子与HSA表面的羟基、氨基或羰基发生作用，形成了无荧光的复合物，导致HSA-镉纳米簇的荧光强度明显降低。

实验

1.缓冲液PH值的优化

取一系列2mL离心管，依次加入制备所得的150μL HSA-镉纳米簇，pH值分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的浓度为50mM的Tris-Hac缓冲液50μL，然后加入浓度为10μg/L的铅标准溶液50μL(空白管加入同等量的超纯水)，随后用超纯水定容至500μL，混匀，配制成不同pH的铅应用溶液，20℃下反应30min后，测定铅应用溶液吸光度(F)，同时测量空白管的吸光度(F₀)，记录实验结果并计算体系的ΔF＝F－F₀。经多次实验发现：体系在pH值为5.5的时候ΔF有最优值并且较为稳定，选择体系缓冲液pH 最优值为5.5。

2.缓冲液加入量的优化

取一系列2mL离心管，依次加入制备所得的HSA-镉纳米簇150μL，分别加入50mM 的pH为5.5Tris-Hac缓冲液20μL、30μL、40μL、50μL、60μL、70μL、80μL、90μL、 100μL，加入浓度为10μg/L的铅标准溶液50μL(空白管加入同等量的超纯水)，随后用超纯水定容至500μL，混匀，配制成铅应用溶液，20℃下反应30min后，荧光分光光度计上测定铅应用溶液吸光度(F)，同时测量空白管的吸光度(F₀)，记录实验结果并计算体系的ΔF。优化出150μL HSA-镉纳米簇体系缓冲液最优加入量为50μL。

3.缓冲液浓度的优化

取一系列2mL离心管，加入150μL制备所得的HSA-镉纳米簇，再分别加入pH值为5.5浓度为20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM的Tris-Hac 缓冲液50μL，加入浓度为10μg/L的铅标准溶液50μL(空白管加入同等量的超纯水)，超纯水定容至500μL，混匀，配制成铅应用溶液，20℃下反应30min后，测定铅应用溶液吸光度(F)，同时测量空白管的吸光度(F₀)，计算体系的ΔF。优化出150μL HSA-镉纳米簇体系最优缓冲液浓度为50mM。

4.反应温度的优化

取一系列2mL离心管，依次加入150μL制备所得的HSA-镉纳米簇，pH值为5.5浓度为50mM的Tris-Hac缓冲液50μL，加入浓度为10μg/L的铅离子标准溶液50μL(空白管加入同等量的超纯水)，超纯水定容至500μL，混匀，配制成铅应用溶液，在20℃～80℃范围内每隔10℃设置一个梯度，进行反应温度优化实验，在恒温水浴锅中孵育30min后，测定铅应用溶液吸光度，计算体系的ΔF。优化出反应温度为20℃。

5.反应时间的优化

于一系列2mL离心管内，依次加入150μL制备所得的HSA-镉纳米簇，pH值为5.5 浓度为50mM的Tris-Hac缓冲液50μL，加入浓度为10μg/L的铅离子标准溶液50μL(空白管加入同等量的超纯水)，超纯水定容至500μL，混匀，配制成铅应用溶液，20℃条件下分别反应10min、20min、30min、40min、50min、60min、80min、100min、120min，在日本岛津荧光分光光度计上设定ex＝365nm，em＝485nm进行荧光值测定，计算体系的ΔF 记录实验结果。优化出反应时间为30min。

6.干扰实验

食品中主要的与铅共存元素为钴、镍、锌、汞、铬，用钴、镍、锌、汞、铬标准溶液配制混合标准溶液以模拟多元素混合样品进行测定，与铅单元素溶液测定值进行对比，测量结果如表1所示。

表1 共存元素对铅检测的影响

由表1数据可知：用10.00μg/L的铅溶液为对比，加入100倍数量级浓度的钴、镍、锌、汞、铬标准溶液进行相同实验条件处理后的测定，结果发现，加入钴、镍、锌、汞、铬标准溶液对实验体系无明显反应，因此可确定共存元素对测定结果无明显影响，该方法对铅的测定具有一定的特异性。

7.检出范围与检出限和标准曲线的绘制

我们按照前述优化检测条件进行实验，配制一系列待测溶液，测定荧光差值ΔF，建立ΔF与铅浓度间定量关系模型。结果发现：铅的ΔF值与样品中铅的浓度成线性关系，线性回归方程为Y＝4.96X-1.11，R＝0.9965，检测范围在2.0～2.0×10²μg/L。

重复测定试剂空白溶液值(m＝6，n＝11)，依据CL＝3Sb/k公式，计算出检出限为8.4×10^-1μg/L。

8.精密度实验

随机抽取一定量的自来水样品进行精密度实验，每份样品加入不同量的铅标准溶液，配制成铅含量分别为6.0μg/L、10.0μg/L和16.0μg/L的3种待测溶液，每种浓度的样品重复测定11次，分别统计数据并计算精密度。结果表明：三种浓度的RSD为3.52％、4.30％、4.63％，说明该方法有较高的精密度。

9.准确度实验

取一定量的自来水，随机分为6份样品，加入3种浓度的铅标准液，进行加标回收实验，进行样品处理并测定，见表2，结果表明直接法回收率在95.81％～108.76％之间，说明该检测方法有很高的准确度。

表2 加标回收实验结果

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (8)

1.一种多功能HSA-镉纳米簇在铅检测中的应用，其特征在于，将所述多功能HSA-镉纳米簇应用于检测铅离子浓度；

其中，所述多功能HSA-镉纳米簇的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、配制镉标准溶液：将氯化镉溶解在超纯水中，配制镉标准溶液；

步骤二、配制人血清白蛋白标准溶液：将人血清白蛋白在超纯水中稀释，即得人血清白蛋白标准溶液；

步骤三、合成纳米簇：将步骤一得到的镉标准溶液与步骤二得到的人血清白蛋白标准溶液混合均匀，然后加入氢氧化钠溶液混合均匀，即得所述多功能HSA-镉纳米簇。

2.根据权利要求1所述的一种多功能HSA-镉纳米簇在铅检测中的应用，其特征在于：将步骤三制备得到的多功能HSA-镉纳米簇放置在4℃的环境中避光保存。

3.根据权利要求1所述的一种多功能HSA-镉纳米簇在铅检测中的应用，其特征在于：所述步骤一中，将氯化镉溶解在超纯水中，配制浓度为5~15mmol/L的镉标准溶液；

所述步骤二中，将人血清白蛋白在超纯水中稀释，得到质量浓度为40~60mg/mL的人血清白蛋白标准溶液。

4.根据权利要求1所述的一种多功能HSA-镉纳米簇在铅检测中的应用，其特征在于：所述步骤三中，将步骤一得到的镉标准溶液与步骤二得到的人血清白蛋白标准溶液在室温下于磁子搅拌器上以250rpm~350rpm的速度搅拌2min~4min，然后加入浓度为0.8~1.2mol/L的氢氧化钠溶液在35℃~40℃的条件下搅拌11h~13h，即得所述多功能HSA-镉纳米簇。

5.根据权利要求1所述的一种多功能HSA-镉纳米簇在铅检测中的应用，其特征在于：所述步骤三中，将步骤一得到的镉标准溶液与步骤二得到的人血清白蛋白标准溶液放入2mL的离心管中，加入磁子，在室温下于磁子搅拌器上以2500rpm~3500rpm的速度搅拌2min~4min，然后加入浓度为0.3~0.7mol/L的氢氧化钠溶液在50℃~60℃的条件下搅拌1.5~2.5h，即得所述多功能HSA-镉纳米簇。

6.根据权利要求1所述的一种多功能HSA-镉纳米簇在铅检测中的应用，其特征在于：所述步骤三中，镉标准溶液、人血清白蛋白标准溶液和氢氧化钠溶液的体积比为（9~11）：（9~11）：1。

7.一种权利要求1所述的应用中多功能HSA-镉纳米簇检测铅离子浓度的方法，其特征在于，它包括以下步骤：

步骤一、配制铅标准溶液：配制不同体积的铅标准溶液；

步骤二、配制铅应用溶液：取一系列2mL离心管，向其中加入HSA-镉纳米簇和Tris-Hac缓冲液，然后分别加入步骤一配制的不同体积的铅标准溶液，之后用超纯水定容并混合均匀，即得铅应用溶液；

步骤三、配制空白溶液：取一2mL离心管，向其中加入HSA-镉纳米簇和Tris-Hac缓冲液，之后用超纯水定容并混合均匀，即得空白溶液；

步骤四、测定荧光强度：设定荧光分光光度计为ex=365nm，em=485nm，分别测定步骤三得到的空白溶液和步骤二得到的铅应用溶液的吸光度，计算差值，即得铅离子浓度。

8.根据权利要求7所述的一种多功能HSA-镉纳米簇检测铅离子浓度的方法，其特征在于：所述步骤二中，HSA-镉纳米簇和Tris-Hac缓冲液和铅应用溶液的体积比为（2.5~3.5）：（0.5~1.5）：10；

所述步骤三中，HSA-镉纳米簇和Tris-Hac缓冲液和空白溶液的体积比为（2.5~3.5）：（0.5~1.5）：10。

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