CN104801722A - 一种人血清白蛋白金纳米簇的制备方法 - Google Patents

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张娣
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Abstract

本发明属纳米材料技术领域，具体涉及一种人血清白蛋白金纳米簇的制备方法。包括如下步骤：1)将氯金酸溶液缓慢加入到人血清白蛋白溶液中，剧烈搅拌后加入NaOH溶液调节pH值为11～12.5，于室温～37℃下，选择超声开-关比例对混合溶液进行超声，得到金纳米簇溶液；2)将金纳米簇溶液与ZnCl2溶液进行共轭沉淀，离心后取沉淀并用蒸馏水洗涤，再将沉淀物重新溶入PBS缓冲液中，于PBS缓冲液、去离子水中分别透析后得到人血清白蛋白金纳米簇溶液。本发明采用人血清白蛋白代替异源蛋白作为保护剂和还原剂来制备金簇，消除了人体的免疫原性，在短时间内可以制备出粒径小且分布均一，量子产率高，具有强烈近红外荧光的金纳米簇。

Description

一种人血清白蛋白金纳米簇的制备方法
技术领域
本发明属纳米材料技术领域，具体涉及一种人血清白蛋白金纳米簇的制备方法。
背景技术
癌症，又称为恶性肿瘤，严重威胁着人类的健康和性命，在当今医学上仍被看作不治之症。在癌症的治疗过程中，对肿瘤细胞进行有效的初期诊断和实时追踪，是提升其治愈率和存活率的重要手段。而一些传统荧光成像诊断材料在一定的光激发下很轻易地被漂白，成分上具有毒性，生物相容性、稳定性差，对肿瘤进行诊断成像的同时，对其它正常组织也造成了严重的伤害。
随着纳米科技的快速发展，纳米材料与医学的联系亦愈发紧密。金纳米簇是近几年来发展比较快的一种新型荧光纳米材料，由于具有粒径小，抗光漂白，斯托克位移大，毒性低，高强荧光，良好的生物相容及合成条件简单等优点，在近红外分子成像和医学诊断等方面具有潜在的发展前景。而当前的一些关于金纳米簇制备方法及其性能的研究存在以下几个方面的问题：(1)以牛血清蛋白/谷胱甘肽等异源蛋白作为还原剂和保护价剂来制备金纳米簇是最为常见的方法之一，但这种异源蛋白质在进入人体后会诱发抗体抗原反应而被清除，引起免疫原性，甚至会导致过敏反应；(2)水浴法也是制备金纳米簇最为常见的方法，但反应时间耗时过长，通常需要24h，量子产率低；此外，金纳米簇的粒径、量子产率、最大发射峰的波长等均会对金纳米簇的荧光特性造成一定的影响，如何快速制备出具有优异荧光特性的金纳米簇仍是亟待解决的问题；(3)可见光区成像：可见光区成像会存在许多的问题，比如遭受活体组织中内源性物质的吸收、散射等对光学成像会造成一定的影响；而在近红外波段(650nm～900nm)，组织的吸收、散射现象及本身的自发荧光很低，在此波长范围内组织的自发荧光对被监控的生物体的影响甚微，能显著提高成像的准确度和灵敏度。
发明内容
本发明针对现有技术存在的不足，目的在于提供一种人血清白蛋白金纳米簇(HSA-AuNCs)的制备方法。
为解决上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：
一种人血清白蛋白金纳米簇的制备方法，它包括如下步骤：
1)将氯金酸溶液缓慢加入到人血清白蛋白(HSA)溶液中，剧烈搅拌混合均匀，然后加入NaOH溶液调节pH值为11～12.5，于室温～37℃下，选择合适的超声开-关比例，对混合溶液施加一定功率的超声，即可得到深褐色的金纳米簇溶液；
2)将步骤1)制备好的金纳米簇溶液与ZnCl2溶液共轭沉淀得到浑浊溶液，离心后取沉淀，采用蒸馏水洗涤，然后将沉淀重新溶入PBS缓冲液中，于PBS缓冲液、去离子水中分别透析后得到清亮的棕色溶液，即为人血清白蛋白金纳米簇溶液。
按上述方案，步骤(1)中所述超声的开-关比例为5:5～9:1，即超声开5～9min，关1～5min，多次重复循环，共超声30～120min。
按上述方案，步骤(1)中所述超声的开-关比例为7:3，即超声开7min，关3min，多次重复循环，共超声90min。
按上述方案，步骤(1)中所述氯金酸溶液的浓度为10g/L，用量为1.03mL；所述人血清白蛋白溶液的浓度为50mg/mL，用量为2.5mL；所述NaOH溶液的浓度为1mol/L，加入量为0.25mL。
按上述方案，步骤(2)中所述金纳米簇溶液与ZnCl2溶液的体积比为1:1，所述ZnCl2溶液的浓度为10g/L。
按上述方案，步骤(2)中所述离心的转速为2000rpm，离心时间为15min。
按上述方案，所述PBS缓冲液的pH值为7.4。
本发明的有益效果是：
(1)本发明利用超声化学具有强激发能量的特性对物质的化学反应进行加速，提高反应产率，采用人血清白蛋白(HSA)代替牛血清白蛋白等异源蛋白作为保护剂和还原剂来制备金簇，消除了人体的免疫原性，在短时间内成功制备出了粒径小且分布均一，量子产率高，具有强烈近红外荧光的金纳米簇，并且该金纳米簇在模拟人体环境中比较稳定。
(2)本发明初次尝试将制备得到的人血清白蛋白金纳米簇进行近红外成像测试，结果显示，人血清白蛋白金纳米簇能够发出明亮的近红外荧光，具有潜在的分子成像应用前景。
附图说明
图1为实施例3制备的人血清白蛋白金纳米簇的粒径表征图。
图2为实施例1～5制备的人血清白蛋白金纳米簇的荧光测试光谱图。
图3为本发明制备的人血清白蛋白金纳米簇置于pH值为7.4的缓冲溶液中随时间延长变化的荧光光谱图。
图4为本发明制备的人血清白蛋白金纳米簇置于等渗溶液中随时间延长变化的荧光光谱图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1
利用超声优化制备人血清白蛋白为模板的金纳米簇(HSA-AuNCs)的方法，它包括如下步骤：
1)将1.03mL氯金酸溶液(10g/L)缓慢加入到2.5mL人血清白蛋白(HSA)溶液(50mg/mL)中，剧烈搅拌混合均匀，然后加入0.25mL 1mol/L的NaOH，搅拌几分钟彻底混合后，室温下，对其施加功率为150W的超声，设定超声的开关时间比例为5:5，即超声开5min，关5min，多次循环重复，超声一小时即可得到深褐色金簇溶液；
2)取3ml制备好的金簇溶液装入玻璃瓶中，迅速注入3ml 10g/L的ZnCl2溶液，共轭沉淀得浑浊溶液，2000rpm下离心15min；然后取沉淀用蒸馏水洗涤，整个过程重复三次；然后将沉淀物重新溶入1ml PBS(PH＝7.4)缓冲液中，于PBS缓冲液中透析两天，去离子水中透析两天，得到清亮的棕色溶液，即为人血清白蛋白金纳米簇。
实施例2
利用超声优化制备人血清白蛋白为模板的金纳米簇(HSA-AuNCs)的方法，它包括如下步骤：
1)将1.03mL氯金酸溶液(10g/L)加入到2.5mL人血清白蛋白(HSA)溶液(50mg/mL)中，剧烈搅拌混合均匀，然后加入0.25mL 1mol/L的NaOH，搅拌几分钟彻底混合后，室温下，对其施加功率为150W的超声，设定超声的 开关时间比例为6:4，即超声开6min，关4min，多次循环重复，超声一小时即得到褐色溶液；
2)取3ml制备好的金簇溶液装入玻璃瓶中，迅速注入3ml 10g/L的ZnCl2溶液，共轭沉淀得浑浊溶液，2000rpm下离心15min，然后取沉淀用蒸馏水洗涤，整个过程重复三次；然后将沉淀物重新溶入1ml PBS(PH＝7.4)缓冲液中，于PBS缓冲液中透析两天，去离子水中透析两天，得到清亮的棕色溶液，即为人血清白蛋白金纳米簇。
实施例3
利用超声优化制备人血清白蛋白为模板的金纳米簇(HSA-AuNCs)的方法，它包括如下步骤：
1)将1.03mL氯金酸溶液(10g/L)加入到2.5mL人血清白蛋白(HSA)溶液(50mg/mL)中，剧烈搅拌混合均匀，然后加入0.25mL 1mol/L的NaOH，搅拌几分钟彻底混合后，室温下，对其施加功率为150W的超声，设定超声的开关时间比例为7:3，即超声开7min，关3min，多次循环重复，超声一小时得到褐色溶液；
2)取3ml制备好的金簇溶液装入玻璃瓶中，迅速注入3ml 10g/L的ZnCl2溶液，共轭沉淀得浑浊溶液，2000rpm下离心15min；然后沉淀，用蒸馏水洗涤，整个过程重复三次；然后将沉淀物重新溶入1ml PBS(PH＝7.4)缓冲液中，于PBS缓冲液中透析两天，去离子水中透析两天，得到清亮的棕色溶液，即为人血清白蛋白金纳米簇。
实施例4
利用超声优化制备人血清白蛋白为模板的金纳米簇(HSA-AuNCs)的方法，它包括如下步骤：
1)将1.03mL氯金酸溶液(10g/L)加入到2.5mL人血清白蛋白(HSA)溶液(50mg/mL)中，剧烈搅拌混合均匀，然后加入0.25mL 1mol/L的NaOH，搅拌几分钟彻底混合后，室温下，对其施加功率为150W的超声，设定超声的开关时间比例为8:2，即超声开8min，关2min，多次循环重复，超声一小时即可得到褐色溶液；
2)取3ml制备好的金簇溶液装入玻璃瓶中，迅速注入3ml 10g/L的ZnCl2溶液，共轭沉淀得浑浊溶液，2000rpm下离心15min，然后取沉淀，用蒸馏水洗涤，整个过程重复三次，然后将沉淀物重新溶入1ml PBS(pH＝7.4)缓冲液中，于PBS缓冲液中透析两天，去离子水中透析两天，得到清亮的棕色溶液，即为人血清白蛋白金纳米簇。＝
实施例5
利用超声优化制备人血清白蛋白为模板的金纳米簇(HSA-AuNCs)的方法，它包括如下步骤：
1)将1.03mL氯金酸溶液(10g/L)加入到2.5mL人血清白蛋白(HSA)溶液(50mg/mL)中，剧烈搅拌混合均匀，然后加入0.25mL 1mol/L的NaOH，搅拌几分钟彻底混合后，室温下，对其施加功率为150W的超声，设定超声的开关时间比例为9:1，即超声开9min，关1min，多次循环重复，超声一小时得到褐色溶液；
2)取3ml制备好的金簇溶液装入玻璃瓶中，迅速注入3ml 10g/L的ZnCl2溶液，共轭沉淀得浑浊溶液，2000rpm下离心15min，然后取出沉淀，用蒸馏水洗涤，整个过程重复三次；然后将沉淀重新溶入1ml PBS(pH＝7.4)缓冲液中，于PBS缓冲液中透析两天，去离子水中透析两天，得到清亮的棕色溶液，即为人血清白蛋白金纳米簇。
将上述实施例3制备得到的人血清白蛋白金纳米簇进行粒径表征测试，测试结果见图1，由图1的DLS测试中可以看出，人血清白蛋白金纳米簇表现出了良好的单分散性，粒径分布比较均一，金纳米簇的平均粒径约为2.7nm。这种比生物分子还要小的尺寸，更有利于金纳米簇进入更深的组织内部，达到良好的成像效果。将上述实施例1～5制备得到的人血清白蛋白金纳米簇进行荧光测试，测试结果见图2，图2的金纳米簇荧光测试谱图可知，本发明采用合适的超声开-关时间比例可得到较高荧光强度的金纳米簇，开一关时间比例从5:5到7:3(a到c线)，金簇荧光强度是增强的，当开一关时间比例到8:2的时候，荧光峰降低，这是由于开关比列过低，超声不能提供充足的能量促使其反应，开关比例过大又会造成局部温度过高，蛋白失活，荧光强度降低，即开关比例为7:3时为最佳反应条件。
实施例6
利用超声优化制备人血清白蛋白为模板的金纳米簇(HSA-AuNCs)的方法，它包括如下步骤：
1)将1.03mL氯金酸溶液(10g/L)加入到2.5mL人血清白蛋白(HSA)溶液(50mg/mL)中，剧烈搅拌混合均匀，然后加入0.25mL 1mol/L的NaOH，搅拌几分钟彻底混合后，分别于室温或37℃下，对其施加功率为150W的超声，设定超声的开关时间比例为7:3，即超声开7min，关3min，多次循环重复，超声30min即可得到褐色溶液；
2)取3ml制备好的金簇溶液装入玻璃瓶中，迅速注入3ml 10g/L的ZnCl2溶液，共轭沉淀得浑浊溶液，2000rpm下离心15min；然后取出沉淀，用蒸馏水洗涤，整个过程重复三次；然后将沉淀重新溶入1ml PBS(pH＝7.4)缓冲液中，于PBS缓冲液中透析两天，去离子水中透析两天，得到清亮的棕色溶液，即为人血清白蛋白金纳米簇，其荧光测试结果见表1、表2。
实施例7
利用超声优化制备人血清白蛋白为模板的金纳米簇(HSA-AuNCs)的方法，它包括如下步骤：
1)将1.03mL氯金酸溶液(10g/L)加入到2.5mL人血清白蛋白(HSA)溶液(50mg/mL)中，剧烈搅拌混合均匀，然后加入0.25mL 1mol/L的NaOH，搅拌几分钟彻底混合后，分别于室温或37℃下，对其施加功率为150W的超声，设定超声的开关时间比例为7:3，即超声开7min，关3min，多次循环重复，超声60min即可得到褐色溶液；
2)取3ml制备好的金簇溶液装入玻璃瓶中，迅速注入3ml 10g/L的ZnCl2溶液，共轭沉淀得浑浊溶液，2000rpm下离心15min；然后取出沉淀，用蒸馏水洗涤，整个过程重复三次；然后将沉淀重新溶入1ml PBS(pH＝7.4)缓冲液中，于PBS缓冲液中透析两天，去离子水中透析两天，得到清亮的棕色溶液，即为人血清白蛋白金纳米簇，其荧光测试结果见表1、表2。
实施例8
利用超声优化制备人血清白蛋白为模板的金纳米簇(HSA-AuNCs)的方法，它包括如下步骤：
1)将1.03mL氯金酸溶液(10g/L)加入到2.5mL人血清白蛋白(HSA)溶液(50mg/mL)中，剧烈搅拌混合均匀，然后加入0.25mL 1mol/L的NaOH，搅拌几分钟彻底混合后，分别于室温或37℃下，对其施加功率为150W的超声，设定超声的开关时间比例为7:3，即超声开7min，关3min，多次循环重复，超声90min即可得到褐色溶液；
2)取3ml制备好的金簇溶液装入玻璃瓶中，迅速注入3ml 10g/L的ZnCl2溶液，共轭沉淀得浑浊溶液，2000rpm下离心15min；然后取出沉淀，用蒸馏水洗涤，整个过程重复三次，然后将沉淀重新溶入1ml PBS(pH＝7.4)缓冲液中，于PBS缓冲液中透析两天，去离子水中透析两天，得到清亮的棕色溶液，即为人血清白蛋白金纳米簇，其荧光测试结果见表1、表2。
实施例9
利用超声优化制备人血清白蛋白为模板的金纳米簇(HSA-AuNCs)的方法，它包括如下步骤：
1)将1.03mL氯金酸溶液(10g/L)加入到2.5mL人血清白蛋白(HSA)溶液(50mg/mL)中，剧烈搅拌混合均匀，然后加入0.25mL 1mol/L的NaOH，搅拌几分钟彻底混合后，分别于室温或37℃下，对其施加功率为150W的超声，设定超声的开关时间比例为7:3，即超声开7min，关3min，多次循环重复，超声120min即可得到褐色溶液；
2)取3ml制备好的金簇溶液装入玻璃瓶中，迅速注入3ml 10g/L的ZnCl2溶液，共轭沉淀得浑浊溶液，2000rpm下离心15min。然后取出沉淀，用蒸馏水洗涤，整个过程重复三次；然后将沉淀重新溶入1ml PBS(pH＝7.4)缓冲液中，于PBS缓冲液中透析两天，去离子水中透析两天，得到清亮的棕色溶液，即为人血清白蛋白金纳米簇，其荧光测试结果见表1、表2。
表1 室温下(23℃)不同超时间制备金簇的荧光测试
表2 37℃下不同超声时间合成金簇的荧光测试
由表1和表2可以看出，本发明中超声温度及超声时间的设置都会对金纳米簇粒径的最大发射波长，荧光强度等造成一定的影响。在超声30min后，可以检测到发射光，且在610nm处形成了一个荧光峰。荧光的强度随着超声时间增长到90min的过程中不断增强。继续超声，荧光强度反而下降。与此同时，随着超声时间增长，荧光发射波长逐渐红移(粒径增大)，显示了金纳米簇的尺寸的变化，制备出的金纳米簇最大发射波长位于640nm左右已经趋于稳定。对比表1和表2可以看出，温度较高(37℃)制备的金纳米簇其荧光强度也相对较高，本发明通过对比优化实验工艺条件发现37℃下，超声90min是制备稳定、强荧光金纳米簇的最佳反应条件。
将本发明制备的人血清白蛋白金纳米簇置于模拟人体环境(人体中最常见到的两种环境为PH＝7.4的组织液以及等渗环境)中进行稳定性测试，金纳米簇在组织中的稳定性对近红外成像的效果至关重要，结果见图3～4。如图所示，随着存放时间的的延长，无论是在缓冲溶液中还是在等渗溶液中，550nm光激发下，金纳米簇的最大发射波长均没有发生明显的变化，仍位于640nm左右，既没有发生红移也没有发生蓝移，但是由于光漂白的作用，金纳米簇的荧光强度稍微减弱，但幅度很小，说明合成的人血清白蛋白金纳米簇在模拟的人体环境中还是比较稳定的，不会发生团聚，荧光强度也不会发生显著的变化，对其成像效果影响甚微。
本发明所列举的各原料(浓度)，以及工艺参数(如温度、时间、超声开关比列等)的上下限、区间取值都能实现本发明，在此不一一列举实施例。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干改进和变换，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1. 一种人血清白蛋白金纳米簇的制备方法，其特征在于，它包括如下步骤：
1）将氯金酸溶液缓慢加入到人血清白蛋白溶液中，剧烈搅拌混合均匀，然后加入NaOH溶液调节pH值为11~12.5，于室温~37℃下，选择合适的超声开-关比例，对混合溶液施加一定功率的超声，即可得到深褐色的金纳米簇溶液；
2）将步骤1）制备好的金纳米簇溶液与ZnCl2溶液共轭沉淀得到浑浊溶液，离心后取沉淀，采用蒸馏水洗涤，然后将沉淀重新溶入PBS缓冲液中，于PBS缓冲液、去离子水中分别透析后得到清亮的棕色溶液，即为人血清白蛋白金纳米簇溶液。
2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述超声的开-关比例为5:5~9:1，即超声开5~9min，关1~5min，多次重复循环，共超声30~120min。
3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述超声的开-关比例为7:3，即超声开7min，关3min，多次重复循环，共超声90min。
4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述氯金酸溶液的浓度为10 g/L，用量为1.03 mL；所述人血清白蛋白溶液的浓度为50 mg/mL，用量为2.5 mL；所述NaOH溶液的浓度为1 mol/L，加入量为0. 25 mL。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述金纳米簇溶液与ZnCl2溶液的体积比为1:1，所述ZnCl2溶液的浓度为10 g/L。
6. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述离心的转速为2000 rpm，离心时间为15min。
7. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述PBS缓冲液的pH值为7.4。
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