CN103239737A

CN103239737A - 荧光造影剂及其制备方法

Info

Publication number: CN103239737A
Application number: CN201310153122XA
Authority: CN
Inventors: 蔡林涛; 胡德红; 盛宗海; 方胜涛; 王亚楠; 高笃阳; 龚萍; 张鹏飞
Original assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Current assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Priority date: 2013-04-27
Filing date: 2013-04-27
Publication date: 2013-08-14
Anticipated expiration: 2033-04-27
Also published as: CN103239737B

Abstract

本发明提供一种荧光造影剂，包括金纳米簇、肿瘤特异性标志物的抗体及考马斯亮蓝，金纳米簇与肿瘤特异性标志物的抗体通过点击化学方式连接，考马斯亮蓝与连接有肿瘤特异性标志物的抗体的金纳米簇通过静电方式结合。该荧光造影剂具有裸眼可视的特性。此外，本发明还提供一种荧光造影剂的制备方法，该方法工艺步骤简单，适合产业化生产。

Description

荧光造影剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种荧光造影剂及其制备方法。

背景技术

近廿年来，肿瘤死亡率急剧上升。在35至59岁的中壮年人群中，肿瘤已列居各类死因之首。有数据显示：我国肿瘤发病率约为200/10万人，每年新发病例约220万人以上，在治疗的患者约600万人以上。肿瘤已成为造成我国最佳劳动力损失、医疗费用上涨的一大原因。尽管已经研究出了一些预防肿瘤的化学药物，但至今仍没有一种有效控制肿瘤的一级预防措施。所以，当前乃至将来相当长一段时间内，早期诊断仍是肿瘤防治的一项基本策略。

肿瘤的诊断主要有血清学标志物（癌胚抗原(CEA)、铁蛋白和单克隆抗体等）检测和分子影像学检测两类方法。其中，应用于肿瘤诊断中分子影像学技术有光学成像技术、CT（电脑断层扫描）成像技术、MRI（磁共振成像）分子成像技术、超声分子影像技术、SPECT技术、PET技术、NIR（近红外荧光成像）技术等。近红外荧光成像虽然具有很好的效果，但是难以实现直接观察肿瘤，因为用于近红外荧光成像中的荧光造影剂需要在暗室中或较暗的光线下，用光激发才能辨别肿瘤细胞。由于近红外荧光成像很难实现直接观察肿瘤给手术操作者带来极大的不便，手术操作者通常需要是在较暗的光线下区分肿瘤组织与正常组织，切除肿瘤组织时存在较大的隐患。

发明内容

基于此，有必要提供一种具有裸眼可视特性的荧光造影剂。

一种荧光造影剂，包括金纳米簇、肿瘤特异性标志物的抗体及考马斯亮蓝，所述金纳米簇与所述肿瘤特异性标志物的抗体通过点击化学方式连接，所述考马斯亮蓝与所述连接有所述肿瘤特异性标志物的抗体的金纳米簇通过静电方式结合。

在其中一个实施例中，所述金纳米簇、所述肿瘤特异性标志物的抗体及所述考马斯亮蓝的摩尔比为1～10:1～100:1～100。

在其中一个实施例中，所述点击化学方式连接为所述金纳米簇表面修饰的叠氮基与所述肿瘤特异性标志物的抗体表面修饰的炔基发生点击化学反应而连接。

在其中一个实施例中，所述金纳米簇的粒径为0.5～2nm。

在其中一个实施例中，所述肿瘤特异性标志物的抗体为乳腺癌的抗HER2蛋白抗体、乳腺癌的抗P53蛋白抗体、乳腺癌的抗p185蛋白抗体、肺癌的CEA单克隆抗体或抗人肺癌单克隆抗体(McAb)N-35。

将上述荧光造影剂用于肿瘤的诊断中，由于肿瘤特异性标志物的抗体对肿瘤细胞具有很强的靶向性，使得肿瘤的诊断结果具有较高的准确性。由于考马斯亮蓝具有肉眼可视化的特性，上述荧光造影剂通过抗原抗体特异性结合到肿瘤细胞上，并洗涤掉没有结合的荧光造影剂，即可通过肉眼得出结果，不要使用仪器设备，即可实现对肿瘤细胞的可视化，同时实现对肿瘤细胞的可见光定位。从而手术操作者可以在正常光线下，且没有额外仪器设备的条件下，肉眼区分肿瘤组织与正常组织，进而准确切除肿瘤组织。由于金纳米簇具有近红外荧光特性，在激发光的作用下发荧光，可以实现对肿瘤细胞的荧光定位。上述荧光造影可以实现对肿瘤细胞的双重共定位，更利于综合分析判断诊断结果，从而有助于及时、正确地做出病理诊断。而且使用上述荧光造影剂进行近红外荧光成像时，不需要加一抗、酶（荧光染料）标二抗及显色剂等。进而使得近红外荧光成像的检测过程具有操作更简便，工作量更少，需要使用的试剂更少等特点，进而能有效减少检测过程的时间以及能有效节约成本。

一种荧光造影剂的制备方法，包括如下步骤：

将浓度为1～100mmol/L的氯金酸溶液与浓度为1～500mg/mL的牛血清白蛋白或人血清白蛋白溶液混合均匀，然后加入浓度为0.1～10mol/L的NaOH溶液，并于摇床中于0～100℃下温育3～100小时，得到金纳米簇，其中，所述NaOH与所述氯金酸的摩尔比为1:1～1:100；

将所述金纳米簇与经NHS预处理的叠氮化试剂按照摩尔比为1:1～1:100的比例混合，得到表面修饰有叠氮基的金纳米簇；

将肿瘤特异性标志物的抗体与炔基化试剂按照摩尔比为1:1～1:100的比例混合均匀并反应0.5小时，反应液经纯化处理后，得到表面修饰有炔基的肿瘤特异性标志物的抗体；

将所述表面修饰有叠氮基的金纳米簇与所述表面修饰有炔基的肿瘤特异性标志物的抗体按照摩尔比为1:1～1:100的比例混合均匀，并孵育0.5小时，得到连接有肿瘤特异性标志物的抗体的金纳米簇；

将考马斯亮蓝与所述连接有肿瘤特异性标志物的抗体的金纳米簇混合，并并孵育0.5小时，得到所述荧光造影剂，其中，所述考马斯亮蓝与所述金纳米簇的摩尔比为100:1～1:1。

在其中一个实施例中，所述叠氮化试剂为N₃-PEG₈-CH₂CH₂NH₂、6-TETAzide或6-HEX Azide。

在其中一个实施例中，所述炔基化试剂为DBCO-sulfo-NHS Ester或DBCO-PEG₄-NHS ester。

在其中一个实施例中，所述纯化处理的具体过程为：将反应液转入透析袋中，在室温下，于10～5000mL PBS缓冲液内透析1～300小时，每1～12小时换液一次，然后于10～5000mL双蒸馏水内透析1～12小时。

上述制备方法采用牛血清白蛋白或人血清白蛋白可控合成金纳米簇，合成得到了具有蛋白外壳、尺寸小且均一、近似球形、均匀分散的金纳米簇。从而金纳米簇具有生物相容性好等特征。分别在金纳米簇与肿瘤特异性标志物的抗体的表面修饰点击化学连接基团，从而金纳米簇与肿瘤特异性标志物的抗体通过点击化学方式连接。控制适当的酸性环境可以让肿瘤特异性标志物的抗体带上大量的正电荷，而考马斯亮蓝以负离子形式出现，从而考马斯亮蓝可以通过静电结合的方式与连接有肿瘤特异性标志物的抗体的金纳米簇连接，得到上述荧光造影剂。点击化学方式连接及静电方式结合的反应条件简单、反应时间短且反应完全，不需要额外的试剂，且符合原子经济。

附图说明

图1为一实施方式的荧光造影剂的制备方法的流程图；

图2为实施1中制备得到的荧光造影剂的表征图，其中，图2a为可见光下的表征图，图2b为紫外灯下的表征图；

图3为实施1中制备得到的荧光造影剂在小鼠的成像研究中的荧光成像结果图；

图4为实施1中制备得到的荧光造影剂在小鼠的成像研究中的可见光结果图。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例对荧光造影剂及其制备方法进行进一步的说明。

一实施方式的荧光造影剂，包括金纳米簇、肿瘤特异性标志物的抗体及考马斯亮蓝，金纳米簇与肿瘤特异性标志物的抗体通过点击化学方式连接，考马斯亮蓝与连接有肿瘤特异性标志物的抗体的金纳米簇通过静电方式结合。

在本实施方式中，金纳米簇是采用牛血清白蛋白（Albumin from bovineserum，BSA）可控合成的。合成的金纳米簇由2～30个金原子构成，粒径为0.5～2nm，尺寸均一，近似球形，具有蛋白外壳，且具有高度分散性的纳米材料。因此，上述金纳米簇具有良好的生物相容性，且具有近红外荧光特性。从而金纳米簇可以作为荧光造影剂。在其他实施方式中，也可以采用人血清白蛋白来合成金纳米簇。

其中，金纳米簇的摩尔数根据BSA的摩尔数来确定。采用紫外分光光度法来确定BSA的摩尔数，具体过程如下：

配制浓度为1.0mg/mL的BSA溶液，并于280nm处测定紫外吸收。绘制标准曲线：取6支试管，并给每支试管标号，分别为试管1、试管2……试管6，并在6支试管中分别加入配制好的BSA溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL。往体积不足5.0mL的试管中加入蒸馏水使得每支试管中含有5.0mL溶液，然后混合均匀。以试管1为空白对照，测定其他5支试管吸光度。以吸光度为纵坐标，各管的BSA浓度或BSA质量为横坐标作图，即得到标准曲线。然后采用同样的方法测定合成的金纳米簇溶液的吸光度，即可得到合成的金纳米簇溶液中的BSA的浓度或BSA的质量，从而得到BSA摩尔数，进而得到金纳米簇的摩尔数。

在本实施方式中，肿瘤特异性标志物的抗体可以是乳腺癌的抗HER2蛋白抗体、乳腺癌的抗P53蛋白抗体、乳腺癌的抗p185蛋白抗体、肺癌的CEA单克隆抗体或抗人肺癌单克隆抗体(McAb)N-35。可以理解，在其他实施方式中，肿瘤特异性标志物的抗体也可以是其他种类肿瘤的抗体。

肿瘤特异性标志物的抗体通过点击化学方式连接到金纳米簇上，得到用于肿瘤病理诊断的荧光造影剂。在本实施方式中，肿瘤特异性标志物的抗体的表面修饰有炔基，而金纳米簇的表面修饰有叠氮基，从而通过点击化学的代表反应叠氮-炔基环加成反应，得到上述用于肿瘤病理诊断的荧光造影剂。而且点击化学反应条件简单、反应时间短且反应完全，不需要额外的试剂，且符合原子经济。

考马斯亮蓝与连接有肿瘤特异性标志物的抗体的金纳米簇通过静电方式结合。考马斯亮蓝具有肉眼可视化的特性，可以用于免疫组化检测中，且考马斯亮蓝的结构中含有磺酸的钠盐，由于磺酸酸性较强，如果控制适当的酸性环境可以让蛋白质带上大量的正电荷，而考马斯亮蓝以负离子形式出现。基于正负电荷的相互作用从而使得蛋白质的表面得以吸附大量的考马斯亮蓝成份。而连接有肿瘤特异性标志物的抗体的金纳米簇在适当的酸性环境带正电荷，从而考马斯亮蓝可以通过静电方式与连接有肿瘤特异性标志物的抗体的金纳米簇连接。

由于可以在肿瘤特异性标志物的抗体的表面修饰多个炔基，也可以在金纳米簇的表面修饰多个叠氮基。而金纳米簇与肿瘤特异性标志物的抗体需要满足一定的摩尔比，从而使得连接有肿瘤特异性标志物的抗体的金纳米簇上有足够量的肿瘤特异性标志物的抗体与肿瘤细胞结合，有足够量的金纳米簇用于荧光成像。而考马斯亮蓝的用量会直接影响肉眼观察诊断结果。因此，金纳米簇、肿瘤特异性标志物的抗体及考马斯亮蓝的摩尔比对上述荧光造影剂非常重要。在本实施方式中，金纳米簇、所述肿瘤特异性标志物的抗体及所述考马斯亮蓝的摩尔比为1～10:1～100:1～100。

上述荧光造影剂具有优异的化学和物理性能，粒径小，比表面积大，悬浮稳定性好，对肿瘤细胞具有很强的靶向性。而且还可以实现对肿瘤组织术前精确定位和术中准确切除，在医学诊断学及生物医学活体成像等方面具有极大的应用前景。

本实施方式还提供一种用于肿瘤病理诊断的荧光造影剂的制备方法，如图1所示，包括如下步骤：

步骤S110，将浓度为1～100mmol/L的氯金酸溶液与浓度为1～500mg/mL的牛血清白蛋白或人血清白蛋白溶液混合均匀，然后加入浓度为0.1～10mol/L的NaOH溶液，并于摇床中于0～100℃下温育3～100小时，得到金纳米簇，其中，NaOH与氯金酸的摩尔比为1:1～1:100。

在本实施方式中，优选牛血清白蛋白来制备金纳米簇，因为牛血清白蛋白具有无毒，生物相容性好，价格相对便宜等优点。

步骤S120，将金纳米簇与经NHS预处理的叠氮化试剂按照摩尔比为1:1～1:100的比例混合，得到表面修饰有叠氮基的金纳米簇。

在本实施方式中，叠氮化试剂为N₃-PEG₈-CH₂CH₂NH₂、6-TET Azide或6-HEX Azide。购买于Click Chemistry Tools公司，货号分别为AZ103-25、50-2005-92、50-2006-92。

NHS处理的目的是活化叠氮化试剂。

步骤S130，将肿瘤特异性标志物的抗体与炔基化试剂按照摩尔比为1:1～1:100的比例混合均匀并反应0.5小时，反应液经纯化处理后，得到表面修饰有炔基的肿瘤特异性标志物的抗体。

在本实施方式中，炔基化试剂为DBCO-sulfo-NHS Ester或DBCO-PEG₄-NHS ester。购买于Click Chemistry Tools公司，货号分别为50-1941-23、10-1941-90。

纯化处理的具体过程为：将反应液转入透析袋中，在室温下，与10～5000mLPBS（Phosphate Buffered Saline，磷酸盐缓冲液）内透析1～300小时，每1～12小时换液一次。然后于10～5000mL双蒸馏水内透析1～12小时。

步骤S140，将表面修饰有叠氮基的金纳米簇与表面修饰有炔基的肿瘤特异性标志物的抗体按照摩尔比为1:1～1:100的比例混合均匀，并孵育0.5小时，得到连接有肿瘤特异性标志物的抗体的金纳米簇。

步骤S150，将考马斯亮蓝与连接有肿瘤特异性标志物的抗体的金纳米簇混合，并并孵育0.5小时，反应液经纯化处理后，得到荧光造影剂，其中，考马斯亮蓝与金纳米簇的摩尔比为100:1～1:1。

纯化处理的具体过程为：将反应液转入透析袋中，在室温下，与10～5000mLPBS内透析1～300小时，每1～12小时换液一次。然后于10～5000mL双蒸馏水内透析1～12小时。

以下为具体实施例部分：

实施例1

一、荧光造影剂的制备

1、金纳米簇的制备：于37℃下，将0.5mL浓度为50mmol/L的氯金酸溶液加入到0.5mL浓度为200mg/mL的BSA溶液中，混合均匀；然后加入0.2mL浓度为1mol/L的NaOH溶液，得到混合液；将混合液置于摇床中，于37℃下温育10小时，即得到金纳米簇。

2、金纳米簇的叠氮基修饰：将上述金纳米簇与叠氮化试剂按照摩尔比为1的比例混合，得到表面修饰有叠氮基的金纳米簇，其中，叠氮化试剂预先经NHS处理过。

3、抗HER2蛋白抗体的炔基修饰：将DBCO-sulfo-NHS Ester炔基化试剂加入抗HER2蛋白抗体中，反应30分钟，其中，DBCO-sulfo-NHS Ester炔基化试剂与抗HER2蛋白抗体的摩尔比为10:1；将反应液转入透析袋中，在室温下，于2000mLPBS内透析24小时，每12小时换液一次，然后于2000mL双蒸馏水内透析12小时，得到表面修饰有炔基的抗HER2蛋白抗体。

4、点击化学反应：将表面修饰有炔基的抗HER2蛋白抗体与表面修饰有叠氮基的金纳米簇混合并于室温下孵育半小时，得到连接有抗HER2蛋白抗体的金纳米簇。其中，表面修饰有炔基的抗HER2蛋白抗体与表面修饰有叠氮基的金纳米簇的摩尔比为1:1。

5、用于肿瘤病理诊断的荧光造影剂的制备：将1mL浓度为0.5mol/L的考马斯亮蓝溶液加入到步骤4中的溶液中于室温下孵育半小时。然后将反应液转入透析袋中，在室温下，于1000mL PBS内透析24小时，每12小时换液一次，然后于1000mL双蒸馏水内透析12小时，得到上述荧光造影剂。

如图2所示，图2a为上述制备得到的荧光造影剂在可见光下的照片；图2b为上述制备得到的荧光造影剂在荧光下的照片。其中，仪器为普通照相机，条件分别为室温。从图中可以看出，按上述方法制备得到的荧光造影剂在可见光下为亮绿色，具有良好的肉眼可视性；在紫外灯下具有较强的红色荧光，可以用于荧光成像。

二、将上述荧光造影剂用于小鼠的成像研究中

（1）、将实施例1制备的造影剂通过尾静脉注射(500mg/kg)注入荷瘤（MCF-7）小鼠体内。然后分别在注射造影剂后的5分钟、1小时、3小时、6小时、24小时、48小时及72小时时，将小鼠活体至于成像仪上成像。其中，成像仪的型号为美国CRi小动物活体成像系统Maestro^TM2Maestro^TMEX-RRO，厂商为美国CRi Maestro^TM，在注射造影剂前，先对荷瘤（MCF-7）小鼠在相同条件下成像，得到background(背景)图。背景图及不同时间的成像图，请参阅图3。

（2）、由图3可以得出，实施例1制备的造影剂在注射造影剂后的3-6小时之间，成像效果最好。将实施例1制备的造影剂通过尾静脉注射(500mg/kg)注入荷瘤（MCF-7）小鼠体内。并在注射造影剂后的3小时时，解剖小鼠，发现肿瘤被染上肉眼可见的蓝色，请参阅图4。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种荧光造影剂，其特征在于，包括金纳米簇、肿瘤特异性标志物的抗体及考马斯亮蓝，所述金纳米簇与所述肿瘤特异性标志物的抗体通过点击化学方式连接，所述考马斯亮蓝与所述连接有所述肿瘤特异性标志物的抗体的金纳米簇通过静电方式结合。

2.根据权利要求1所述的荧光造影剂，其特征在于，所述金纳米簇、所述肿瘤特异性标志物的抗体及所述考马斯亮蓝的摩尔比为1～10:1～100:1～100。

3.根据权利要求1所述的荧光造影剂，其特征在于，所述点击化学方式连接为所述金纳米簇表面修饰的叠氮基与所述肿瘤特异性标志物的抗体表面修饰的炔基发生点击化学反应而连接。

4.根据权利要求1所述的荧光造影剂，其特征在于，所述金纳米簇的粒径为0.5～2nm。

5.根据权利要求1所述的荧光造影剂，其特征在于，所述肿瘤特异性标志物的抗体为乳腺癌的抗HER2蛋白抗体、乳腺癌的抗P53蛋白抗体、乳腺癌的抗p185蛋白抗体、肺癌的CEA单克隆抗体或抗人肺癌单克隆抗体(McAb)N-35。

6.一种荧光造影剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

7.根据权利要求6所述的荧光造影剂的制备方法，其特征在于，所述叠氮化试剂为N₃-PEG₈-CH₂CH₂NH₂、6-TET Azide或6-HEX Azide。

8.根据权利要求6所述的荧光造影剂的制备方法，其特征在于，所述炔基化试剂为DBCO-sulfo-NHS Ester或DBCO-PEG₄-NHS ester。

9.根据权利要求6所述的荧光造影剂的制备方法，其特征在于，所述纯化处理的具体过程为：将反应液转入透析袋中，在室温下，于10～5000mL PBS缓冲液内透析1～300小时，每1～12小时换液一次，然后于10～5000mL双蒸馏水内透析1～12小时。