CN108210923A - 一种荧光染料与考马斯亮蓝共结合的血清白蛋白纳米粒及其制备方法和在肿瘤诊疗中应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于荧光染料(fluorescent dyes,FD)与(coomassie brilliant blue，CBB)共结合的血清白蛋白(serum albumin,SA)纳米粒的制备方法，包括以下步骤：S101:将考马斯亮蓝溶液与血清白蛋白溶液按照质量比1:5‑1:40混合，后搅拌反应0.5‑15h；S102:后过滤，洗涤，分散得到中间产物；S103:往中间产物加入其重量百分比为1‑10％的荧光染料，搅拌反应0.5‑15h；S104:过滤后制得血清白蛋白纳米粒。采用本发明的一种血清白蛋白纳米粒的制备方法，工艺流程简单，可操作性强，工艺重复性好，制备的荧光染料和考马斯亮蓝共结合的血清白蛋白纳米粒具有优良的抗肿瘤效果，且选择性高、毒副作用小。
Description
技术领域
本发明涉及新型有机纳米材料，尤其是应用在医疗领域的纳米材料，具体是一种基于荧光染料与考马斯亮蓝共结合的血清白蛋白纳米粒及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤是威胁人类健康和生命的疾病之一，目前化疗仍是肿瘤治疗的手段。但临床上使用的化疗药物毒副作用不容忽视。目前公开的血清白蛋白的抗肿瘤纳米药物粒子大多通过装载传统细胞毒类化疗药物实现，如中国专利CN201610228149.4公开了一种抗肿瘤药与MRI造影剂共传递白蛋白纳米粒及其制备方法，通过药物与载体间的静电吸附和配位作用，以及载体自身氨基酸残基的交联实现载药，具体为药物与造影剂共传递白蛋白纳米粒的最优制备工艺及其在肿瘤诊疗结合方面的作用。由于传统细胞毒化疗抗肿瘤药物往往对正常细胞存在毒副作用，尽管利用靶向技术可以提高这些药物在肿瘤细胞中的浓度从而起到降低毒副作用的效果，但一些器官如肝脏、脾脏不可避免地吸收纳米药物，从而对这些器官产生依然存在潜在危险。
另外还有中国专利CN201510566206.5公开了具有近红外光热效应的铜基人血白蛋白纳米复合物及其制备方法和应用，通过控制蛋白浓度、铜盐浓度、反应溶液pH、反应时间和反应温度，诱导无机铜基纳米复合物的生长，合成出以人血白蛋白为骨架、包裹硫化铜或硒化铜纳米复合物的铜基纳米结构，该具有近红外光热效应的铜基人血白蛋白纳米复合物可用于光热治疗，实现肿瘤高效热消除，为无机纳米复合材料，生物相容性差，也不能直接化学治疗。
至今还未发现基于荧光染料与考马斯亮蓝共结合的血清白蛋白纳米粒的制备及应用研究。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种基于荧光染料与考马斯亮蓝共结合的血清白蛋白纳米粒的制备方法，解决现有技术存在的问题。
本发明采用的技术手段如下：
一方面，一种基于荧光染料与考马斯亮蓝共结合的血清白蛋白纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
S101:将考马斯亮蓝溶液与血清白蛋白溶液按照质量比1:5-1:40混合，后搅拌反应0.5-15h；
S102:后超滤或透析，洗涤，分散得到中间产物；
S103:往中间产物加入其重量百分比为1-10％的荧光染料，搅拌反应0.5-15h；
S104:超滤或透析后制得荧光染料与考马斯亮蓝共结合的血清白蛋白纳米粒。
优选地，S101步骤的反应在4℃～50℃下进行；S103步骤的反应在4℃～30℃下进行。
优选地，S102和S104步骤中，超滤或透析均采用截留分子量为10-50KD的超滤管或透析袋进行。
优选地，S102步骤中，选用二甲基亚砜或二甲基甲酰胺洗涤，使用磷酸缓冲液分散。
优选地，荧光染料包括Cy3-NHS、Cy5-NHS、Cy5.5-NHS、Cy7-NHS、异硫氰酸荧光素和异硫氰酸罗丹明B中的一种或多种。
优选地，血清白蛋白选用人血清白蛋白、鼠血清白蛋白、牛血清白蛋白、马血清白蛋白和兔源血清白蛋白中的一种。
优选地，考马斯亮蓝包括G250和R250中的一种。
另一方面，提供一种荧光染料与考马斯亮蓝共结合血清白蛋白纳米粒的应用。
本发明的一种血清白蛋白纳米粒，最大的特点在于该纳米粒子可高效杀死肿瘤细胞而不对正常细胞产生明显影响。可用于非实体瘤和实体瘤的化学治疗，其中非实体瘤包括各类白血病；实体瘤包括肝癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌或黑色素瘤。
另外本发明的荧光染料与考马斯亮蓝共结合血清白蛋白纳米粒，还能用于实体瘤示踪，其中实体瘤包括肝癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌。
本发明的荧光染料与考马斯亮蓝共结合血清白蛋白纳米粒，也可用于实体瘤的光热消融治疗，其中实体瘤包括肝癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌或黑色素瘤。
综上所述，本发明的一种荧光染料与考马斯亮蓝共结合血清白蛋白纳米粒的制备方法工艺流程简单，可操作性强，工艺重复性好，制备的荧光染料和考马斯亮蓝共结合的血清白蛋白纳米粒不需要额外装载化疗药物，本身可以广普地杀死肿瘤细胞，对正常细胞则没有明显毒性，是一种潜在的更为安全的抗肿瘤药物。
本发明公开了一种荧光染料与考马斯亮蓝共结合的血清白蛋白纳米粒子的制备方法，用该方法获得的纳米粒子最大的特点在于该粒子本身能高效诱导实体和非实体肿瘤细胞凋亡，但对正常细胞没有明显影响，因此相较于传统化疗药物，更为安全；此外，该纳米粒子还对实体瘤具有荧光示踪与光热治疗效果。由于采用血清白蛋白为主要组分，且血清白蛋白有无免疫反应、组织相容性好、在体内可降解等特点，该纳米粒子具有良好的生物安全性。因此，在生物医学方面的应用，具有非常重要的科学意义和应用价值。
附图说明
图1为本发明的一种荧光染料与考马斯亮蓝共结合的血清白蛋白纳米粒的制备方法的流程图；
图2、本发明制备得到的荧光染料与考马斯亮蓝共结合的血清白蛋白纳米粒子透射电镜TEM图及粒径分布统计；
图3、本发明制备得到的荧光染料与考马斯亮蓝共结合的血清白蛋白纳米粒子可见-近红外吸收谱；
图4、本发明制备得到的荧光染料与考马斯亮蓝共结合的血清白蛋白纳米粒子的荧光光谱；
图5、本发明制备得到的荧光染料与考马斯亮蓝共结合的血清白蛋白纳米粒子光热升降温曲线；
图6、荧光染料与考马斯亮蓝共结合的血清白蛋白纳米粒体外选择性肿瘤细胞增殖毒性实验结果；
图7、荧光染料与考马斯亮蓝共结合的血清白蛋白纳米粒体内成像结果；
图8、在小鼠血液中注射可表达荧光素酶(Luc)的4T1肿瘤细胞(4T1-Luc)后再注射Cy5.5-MSA-G250纳米粒子，肿瘤细胞的转移得到有效抑制；
图9、荧光染料与考马斯亮蓝共结合的血清白蛋白纳米粒抑制体内白血病细胞(Luc标记的L1210细胞)的生长；(a)注射药物组；(b)注射PBS组；
图10、荧光染料与考马斯亮蓝共结合的血清白蛋白光热处理小鼠4T1移植瘤后小鼠的肿瘤生长情况。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例一：如图1，一种荧光染料与考马斯亮蓝共结合的血清白蛋白纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
S101:将考马斯亮蓝G250溶液与人血清白蛋白(HSA)溶液按照质量比1:10混合，在25℃下搅拌反应7h；
S102:后用截留分子量为30KD的超滤管超滤，除掉滤液，用体积30％的二甲基亚砜洗涤2次，使用磷酸缓冲液分散(PBS)，得到中间产物G250-HSA；
S103:往中间产物G250-HSA加入重量百分比为4％的荧光染料Cy5.5-NHS，并在25℃下搅拌7h；
S104:采用截留分子量为30kD的透析袋透析48h后制得本发明的Cy5.5荧光染料及考马斯亮蓝G250共结合的人血清白蛋白纳米粒(Cy5.5-HSA-G250)。
实施例二：一种荧光染料与考马斯亮蓝共结合的血清白蛋白纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
S101:将考马斯亮蓝G250溶液与鼠血清白蛋白(MSA)溶液按照质量比1:40混合，在4℃下搅拌反应15h；
S102:后用截留分子量为10KD的超滤管超滤，除掉滤液，用其体积30％的二甲基甲酰胺(DMF)洗涤3次，使用磷酸缓冲液分散(PBS)，得到中间产物MSA-G250；
S103:往中间产物MSA-G250加入重量百分比为1％的荧光染料Cy5.5-NHS，并在4℃下搅拌15h；
S104:采用截留分子量为10kD的透析袋透析48h后制得本发明的Cy5.5荧光染料及考马斯亮蓝(G250)共结合的鼠血清白蛋白纳米粒(Cy5.5-MSA-G250)。
实施例三：一种荧光染料与考马斯亮蓝共结合的血清白蛋白纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
S101:将考马斯亮蓝G250溶液与牛血清白蛋白(BSA)溶液按照质量比1:5混合，在50℃下搅拌反应0.5h；
S102:后用截留分子量为50KD的超滤管超滤，除掉滤液，用其体积40％的二甲基甲酰胺(DMF)洗涤3次，使用磷酸缓冲液分散(PBS)，得到中间产物BSA-G250；
S103:往中间产物BSA-G250加入重量百分比为10％的荧光染料Cy7-NHS，并在30℃下搅拌0.5h；
S104:采用截留分子量为50kD的透析袋透析48h后制得本发明的荧光染料Cy7-NHS及考马斯亮蓝(G250)共结合的牛血清白蛋白纳米粒(Cy7-BSA-G250)。
实施例四：一种荧光染料与考马斯亮蓝共结合的血清白蛋白纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
S101:将考马斯亮蓝G250溶液与马血清白蛋白(ESA)溶液按照质量比1:20混合，在40℃下搅拌反应5h；
S102:后用截留分子量为10KD的透析袋透析48h，使用磷酸缓冲液分散(PBS)，得到中间产物ESA-G250；
S103:往中间产物ESA-G250加入重量百分比为5％的荧光染料Cy5-NHS，并在20℃下搅拌8h；
S104:采用截留分子量为50kD的超滤膜超滤后制得本发明的荧光染料Cy5-NHS及考马斯亮蓝G250共结合的马血清白蛋白纳米粒(Cy5-ESA-G250)。
实施例五：一种血清白蛋白纳米粒的制备方法，包括以下步骤：一种血清白蛋白纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
S101:将考马斯亮蓝R250溶液与兔血清白蛋白(RSA)溶液按照质量比1:30混合，在30℃下搅拌反应12h；
S102:后用截留分子量为50KD的透析袋透析48h，使用磷酸缓冲液分散(PBS)，得到中间产物RSA-R250；
S103:往中间产物RSA-R250加入重量百分比为8％的异硫氰酸荧光素(FITC)，并在10℃下搅拌12h；
S104:采用截留分子量为50kD的透析袋除掉滤液后制得本发明的异硫氰酸荧光素及考马斯亮蓝(R250)共结合的兔血清白蛋白纳米粒(FITC-RSA-R250)。
在本发明的实施例中，荧光染料还可以采用异硫氰酸罗丹明B、Cy3-NHS等具有荧光性质的有机染料。
本发明的荧光染料和考马斯亮蓝共结合的血清白蛋白纳米粒(FD-SA-CBB)，包括但不仅限于Cy5.5-HSA-G250、Cy5.5-MSA-G250、Cy7-BSA-G250、Cy5-BSA-G250和FITC-RSA-R250中的一种。
实施例六：本发明的荧光染料和考马斯亮蓝共结合的血清白蛋白纳纳米粒(FD-SA-CBB)的性能测试
将Cy5.5-MSA-G250纳米粒进行透射电镜TEM测试，可见-近红外吸收光谱测试、荧光发光光谱测试和光热性能测试，其透射电镜TEM图谱如图2，所制备的Cy5.5-MSA-G250纳米粒尺寸在15-45nm，平均尺寸在30nm，尺寸小且分散均匀；可见-近红外吸收光谱如图3，可吸收560-700nm的红光；荧光发光光谱结果如图4，可发出波长为650-750nm的荧光；如图5，当纳米粒子在波长为660nm红光照射下，可快速将光能转化成热能，使溶液温度升高，当无光照时，温度恢复。
实施例七：Cy5.5-MSA-G250纳米粒在体外的选择性验证治疗肿瘤实验
将不同浓度Cy5.5-MSA-G250纳米粒子与接种在96孔板的肿瘤细胞(如：4T1，HeLa,MGC-803，Hepa1-6，LLC，MFC)及正常细胞(如：Balb 3T3，L929，HFF1，WI38)共育48小时，用CCK-8试剂测定细胞活力，可见在高纳米粒子浓度下(12mg L-1，以G250计)试验肿瘤细胞相对活力几乎为零；而正常细胞可保持80％以上活力，如图6，说明体外选择性杀死多种肿瘤细胞但对正常细胞毒性较小。
实施例八：本发明的荧光染料和考马斯亮蓝共结合的血清白蛋白纳米粒Cy5.5-MSA-G250对实体瘤的示踪应用
如图7，将Cy5.5-MSA-G250纳米粒子尾静脉注射乳腺癌模型小鼠，剂量为200mgkg-1。24小时后通过小动物活体成像仪，在荧光染料作用下下，可见肿瘤处荧光明显增强，说明可以利用本发明Cy5.5-MSA-G250纳米粒子对乳腺癌进行荧光示踪。
在另外的实施例中，本发明的荧光染料和考马斯亮蓝共结合的血清白蛋白纳米粒Cy5.5-MSA-G250对肝癌、肺癌、胃癌、肠癌或黑色素瘤等实体瘤均起到示踪应用。
实施例九：本发明的荧光染料和考马斯亮蓝共结合的鼠血清白蛋白纳米粒Cy5.5-MSA-G250对循环体系中的肿瘤细胞的化学治疗应用
如图8，分别给实验小鼠尾静脉注射105个Luc标记的4T1肿瘤细胞后，设计四组实验，第一组注射剂量为8mg kg-1的考马斯亮蓝溶液(G250)，第二组注射血清白蛋白考马斯亮蓝结合物溶液(SA-G250)，并确保G250剂量相同(即8mg kg-1G250，此时血清白蛋白剂量为200mg kg-1)，第三组静脉注射Cy5.5-MSA-G250纳米粒子，并确保G250剂量相同(即8mg kg- 1G250，此时血清白蛋白剂量为200mg kg-1)，第四组为对照组，无治疗。用小动物成像仪检测体内肿瘤细胞生长情况，发现注射Cy5.5-MSA-G250纳米粒子治疗组，体内肿瘤细胞受到明显抑制，甚至没有检测到肿瘤细胞。
在另外的实施例中，采用本发明的荧光染料和考马斯亮蓝共结合的鼠血清白蛋白纳米粒Cy5.5-MSA-G250对肝癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌或黑色素瘤等实体瘤均起到化学治疗作用。
实施例十：本发明的荧光染料和考马斯亮蓝共结合的人血清白蛋白纳米粒Cy5.5-HSA-G250对白血病的化学治疗应用
先给DBA/2实验小鼠注射106个Luc标记的L1210白血病细胞，设计两组实验，一组注射Cy5.5-HSA-G250纳米粒子(剂量为200mg kg-1)，另外一组则注射PBS。注射药物9天后用小动物成像仪检测体内白血病细胞生长情况，发现注射Cy5.5-HSA-G250纳米粒子治疗组，体内肿瘤细胞较少，甚至部分小鼠检测不到肿瘤细胞存在，如图9。
实施例十一：本发明的荧光染料和考马斯亮蓝共结合的血清白蛋白纳米粒FD-SA-CBB对实体瘤的光热消融治疗应用
将Cy5.5-MSA-G250纳米粒子尾静脉注射乳腺癌模型小鼠，剂量为200mg kg-1。24小时后用660nm红光照射肿瘤，强度为1.27W cm-2，照射时间为10min，并示踪测量肿瘤大小，设计四组实验，(a)注射药物组(200mg kg-1)；(b)注射PBS组；(c)注射药物并照射激光组；(d)照射激光组(1.27W cm-2)。各药物组剂量为200mg kg-1，激光强度为1.27W cm-2，激光照射时间为8分钟。对于药物处理并照射激光组，激光照射发生在注射药物24小时后，经过相应的处理后，可见肿瘤生长受到明显抑制，说明注射纳米粒子并用红光照射的治疗组小鼠肿瘤治疗效果明显，如图10。
在另外的实施例中，本发明的其他荧光染料和考马斯亮蓝共结合的血清白蛋白纳米粒Cy5.5-MSA-G250对肝癌、肺癌、胃癌、肠癌或黑色素瘤等实体瘤均起到光热消融治疗作用。
在另外实施例中，将本发明的荧光染料和考马斯亮蓝共结合的血清白蛋白纳米粒Cy5.5-HSA-G250、Cy5.5-MSA-G250、Cy7-BSA-G250、Cy5-BSA-G250和FITC-RSA-R250中的任意一种进行性能检测和应用实验，均获得一致的实验结果。
综上所述，本发明的一种血清白蛋白纳米粒的制备方法工艺流程简单，可操作性强，工艺重复性好，制备的荧光染料和考马斯亮蓝共结合的血清白蛋白纳米粒具有优良的抗肿瘤效果。
进一步地，FD-SA-CBB纳米粒子对肿瘤细胞具有高毒性而对正常细胞影响较小，从而可以克服目前细胞毒化疗药物毒副作用大的缺点。此外，本发明提出的FD-SA-CBB纳米粒子可实现实体瘤荧光示踪、化学治疗及光热治疗，以确保疗效。因此，此类材料在生物医学方面的应用，具有非常重要的科学意义和应用价值。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。
Claims (10)
1.一种基于荧光染料与考马斯亮蓝共结合的血清白蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S101:将考马斯亮蓝溶液与血清白蛋白溶液按照质量比1:5-1:40混合，后搅拌反应0.5-15h；
S102:后超滤或者透析，洗涤，分散得到中间产物；
S103:往中间产物加入其重量百分比为1-10％的荧光染料，搅拌反应0.5-15h；
S104:超滤或透析后制得血清白蛋白纳米粒。
2.根据权利要求1所述的一种荧光染料与考马斯亮蓝共结合的血清白蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于：所述S101步骤的反应在4℃～50℃下进行；S103步骤的反应在4℃～30℃下进行。
3.根据权利要求1所述的一种荧光染料与考马斯亮蓝共结合的血清白蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于：所述S102和S104步骤中，超滤或透析均采用截留分子量为10-50KD的超滤管或透析袋进行。
4.根据权利要求1所述的一种荧光染料与考马斯亮蓝共结合的血清白蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于：所述S102步骤中，选用二甲基亚砜或二甲基甲酰胺洗涤，使用磷酸缓冲液分散。
5.根据权利要求1所述的一种荧光染料与考马斯亮蓝共结合的血清白蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于：所述荧光染料包括Cy3-NHS、Cy5-NHS、Cy5.5-NHS、Cy7-NHS、异硫氰酸荧光素和异硫氰酸罗丹明B中的一种。
6.根据权利要求1所述的一种荧光染料与考马斯亮蓝共结合的血清白蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于：所述血清白蛋白选用人血清白蛋白、鼠血清白蛋白、牛血清白蛋白、马血清白蛋白和兔源血清白蛋白中的一种。
7.一种荧光染料与考马斯亮蓝共结合的血清白蛋白纳米粒，其特征在于：根据权利要求1-6的任一项权利要求1所述的方法制备而得。
8.一种权利要求7所述荧光染料与考马斯亮蓝共结合的血清白蛋白纳米粒，其特征在于：用于实体瘤示踪，其中实体瘤包括肝癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌或黑色素瘤。
9.一种权利要求7所述荧光染料与考马斯亮蓝共结合的血清白蛋白纳米粒，其特征在于：用于非实体瘤和实体瘤的化学治疗，其中非实体瘤包括各类白血病；实体瘤包括肝癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌或黑色素瘤。
10.一种权利要求7所述荧光染料与考马斯亮蓝共结合的血清白蛋白纳米粒，其特征在于：用于实体瘤的光热消融治疗，其中实体瘤包括肝癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌或黑色素瘤。
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Inventor after: Zhang Liming Inventor after: Lv Zhuoxuan Inventor after: Wang Dai Inventor after: Tan Guanghong Inventor after: Huang Fengying Inventor after: Cao Rong Inventor before: Zhang Liming Inventor before: Lv Zhuoxuan Inventor before: Tan Guanghong Inventor before: Huang Fengying Inventor before: Cao Rong |
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| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |