CN105126113B

CN105126113B - 一种转铁蛋白修饰的中空介孔硫化铜/青蒿琥酯纳米粒的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN105126113B
Application number: CN201510549228.0A
Authority: CN
Inventors: 侯琳; 单晓宁; 张振中; 冯倩华; 郝丽莎; 袁玉洁; 王用超
Original assignee: Zhengzhou University
Current assignee: Zhengzhou University
Priority date: 2015-08-31
Filing date: 2015-08-31
Publication date: 2018-10-23
Anticipated expiration: 2035-08-31
Also published as: CN105126113A

Abstract

本发明涉及转铁蛋白修饰的中空介孔硫化铜/青蒿琥酯纳米粒的制备方法及其应用，可有效解决同时具有靶向、光热治疗、光动力学治疗、光声成像、药物治疗和产生DMR效应，实现诊断和治疗一体化的问题，方法是，先合成中空介孔硫化铜纳米颗粒，在中空介孔结构的硫化铜内部负载药物青蒿琥酯，再通过静电吸附修饰上转铁蛋白，制得转铁蛋白修饰的中空介孔硫化铜/青蒿琥酯纳米粒，本发明合成工艺简单，通过癌周注射后，将抗癌药物传送到癌症部位，进一步提高治疗效果，减小对正常组织和细胞的毒副作用，具有红外光热治疗作用，还可进行光动力学治疗、光声成像，实现光热治疗‑光动力学治疗‑化疗‑肿瘤诊断综合治疗一体化，是治疗肿瘤药物上的一大创新。

Description

一种转铁蛋白修饰的中空介孔硫化铜/青蒿琥酯纳米粒的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及医药，特别是一种转铁蛋白修饰的中空介孔硫化铜/青蒿琥酯纳米粒的制备方法及其应用。

背景技术

光热治疗技术是一种新兴的微创技术，是利用光热转换材料把近红外激光的能量转换成热能，实现局部高温，从而杀死癌细胞，而对正常组织细胞基本上没有影响，因此在肿瘤治疗上具有良好的应用前景。CuS纳米作为一种新的光热转换材料，具有很强的近红外吸收和高的光热转换效率，并且CuS纳米粒子能够被生物体所降解，无明显生物毒性，因此作为光热转换材料在肿瘤治疗方面获得了广泛的关注。硫化铜纳米粒在近红外光下可以进行光催化效应产生活性氧进行光动力学治疗；利用硫化铜纳米粒子在近红区域的吸收特性，将该粒子作为成像造影剂应用于光声成像以及X光成像对肿瘤部位进行诊断治疗。通过将光热治疗、光动力学治疗、化疗、光声成像结合起来可有效降低副作用，并增强肿瘤治疗效果。

青蒿琥酯(Artesunate，AS)是从天然植物青蒿中提取的一种含内过氧化基团的倍半萜内酯化合物，是目前常用的抗疟特效药之一。20世纪90年代以来，科学家发现除良好抗疟性之外，青蒿琥酯对多种肿瘤细胞的生长具有显著的抑制作用，而对正常组织细胞的毒性较低，同时与传统化学治疗药物有协同增效作用且无交叉耐药性。青蒿琥酯抗肿瘤作用的机理包括抑制或杀伤肿瘤细胞、阻滞细胞周期、抑制血管生成、Fe²⁺诱导的细胞凋亡等，其中Fe²⁺诱导的细胞凋亡机理被广泛接受，即Fe³⁺与Tf形成的全铁转铁蛋白(holo－Tf)进入细胞的胞吞体后Tf的构象发生改变形成脱铁转铁蛋白(apo－Tf)，并释放出Fe³⁺；释放的Fe³ ⁺在铁还原酶STEAP3的作用下生成Fe²⁺，使AS内的过氧键断裂，产生大量自由基，破坏细胞膜和生物大分子，引起DNA断裂，从而诱导细胞凋亡。由此可见，如果将光热治疗和化疗纳米平台修饰靶向基团转铁蛋白，可以靶向将抗癌药物青蒿琥酯和光热试剂硫化铜传输到癌症部分，从而进一步提高治疗效果，减小对正常组织和细胞的毒副作用。但至今未见有此技术的公开报导。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种转铁蛋白修饰的中空介孔硫化铜/青蒿琥酯纳米粒的制备方法及其应用，可有效解决同时具有靶向、光热治疗、光动力学治疗、光声成像、药物治疗和产生DMR效应，实现诊断和治疗一体化的问题。

本发明解决的技术方案是，首先合成中空介孔硫化铜纳米颗粒，在中空介孔结构的硫化铜内部负载药物青蒿琥酯，再通过静电吸附修饰上转铁蛋白，制得转铁蛋白修饰的中空介孔硫化铜/青蒿琥酯纳米粒，具体步骤如下：

(1)、将0.8-0.9g的CuSO₄·5H₂O溶解于180-220ml水中，搅拌加入4.5-5.5g聚乙烯吡咯烷酮，室温反应10～20min，加入1-2g氢氧化钠，搅拌均匀，滴加10-20ml水合肼，搅拌10～15min，再加入1.2-1.4g硫酸铵，搅拌1h，用超纯水离心水洗至中性，冷冻干燥46-50h，得到中空介孔硫化铜纳米颗粒；

(2)、将中空介孔硫化铜纳米颗粒25-35mg分散于pH7～9的磷酸盐缓冲液25-30ml中，搅拌下加入110-130mg青蒿琥酯，继续搅拌24h，得负载药物青蒿琥酯的硫化铜纳米粒(AS/CuS)；

(3)、将10-20mg转铁蛋白加入pH7～9的磷酸盐缓冲液8-12ml中，搅拌溶解，随后加入到上述的负载药物青蒿琥酯的硫化铜纳米粒(AS/CuS)中，搅拌24h，用质量浓度20％乙醇透析12h，除去游离的青蒿琥酯，即得转铁蛋白修饰的中空介孔硫化铜/青蒿琥酯纳米粒(AS/Tf-CuS)。

所述的转铁蛋白为单链糖蛋白，分子量为7.5～7.9万，铁含量为300～600ppm；

所述的转铁蛋白修饰的中空介孔硫化铜/青蒿琥酯纳米粒粒径为190-200nm；

所述的青蒿琥酯的载药量为23％～27％，转铁蛋白与硫化铜的质量比为1:2～4。

本发明方法制备的转铁蛋白修饰的中空介孔硫化铜/青蒿琥酯纳米粒可用于红外光热治疗，同时还可以进行光动力学治疗、光声成像，光热治疗-光动力学治疗-化疗-肿瘤诊断综合治疗一体化治疗，实现在制备肿瘤光热治疗-光动力学治疗-化疗-诊断综合一体化药物中的应用。

本发明合成工艺简单，通过癌周注射后，产生了DMR效应(Diffusion MolecularRetention)，即经历缓慢的血管摄取和广泛的间隙扩散，通过在癌细胞膜表面大量表达的转铁蛋白受体识别后保留在肿瘤部位，将抗癌药物青蒿琥酯传送到癌症部位，利用转铁蛋白与青蒿琥酯的协同增效实现靶向抗肿瘤作用，从而进一步提高治疗效果，减小对正常组织和细胞的毒副作用，不仅具有红外光热治疗作用，同时还可以进行光动力学治疗、光声成像，实现光热治疗-光动力学治疗-化疗-肿瘤诊断综合治疗一体化，是治疗肿瘤药物上的一大创新，经济和社会效益巨大。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。

实施例1

本发明在具体实施中，可由以下步骤实现：

(1)、将0.85g的CuSO₄·5H₂O溶解于200ml水中，搅拌加入5.0g聚乙烯吡咯烷酮，室温反应10～20min，加入1.5g氢氧化钠，搅拌均匀，用注射器滴加15ml水合肼，搅拌10～15min，再加入1.38g硫酸铵，搅拌1h，用超纯水离心水洗至中性，冷冻干燥48h，得中空介孔硫化铜纳米颗粒；

(2)、将中空介孔硫化铜纳米颗粒30mg探头超声分散于pH7～9的磷酸盐缓冲液28ml中，搅拌下加入120mg青蒿琥酯，搅拌24h，得负载药物青蒿琥酯的硫化铜纳米粒(AS/CuS)；

(3)、将15mg转铁蛋白加入pH7～9的磷酸盐缓冲液10ml中，搅拌溶解，随后加入到上述的负载药物青蒿琥酯的硫化铜纳米粒(AS/CuS)中，搅拌24h，用质量浓度20％乙醇透析12h，除去游离的青蒿琥酯，即得转铁蛋白修饰的中空介孔硫化铜/青蒿琥酯纳米粒(AS/Tf-CuS)。

实施例2

本发明在具体实施中，也可由以下步骤实现：

(1)、将0.8g的CuSO₄·5H₂O溶解于180ml水中，搅拌加入4.5g聚乙烯吡咯烷酮，室温反应10～20min，加入1g氢氧化钠，搅拌均匀，用注射器滴加10ml水合肼，搅拌10～15min，再加入1.2g硫酸铵，搅拌1h，用超纯水离心水洗至中性，冷冻干燥46-50h，得到中空介孔硫化铜纳米颗粒；

(2)、将中空介孔硫化铜纳米颗粒25mg探头超声分散于pH7～9的磷酸盐缓冲液25ml中，搅拌下加入110mg青蒿琥酯，继续搅拌24h，得负载药物青蒿琥酯的硫化铜纳米粒(AS/CuS)；

(3)、将10mg转铁蛋白加入pH7～9的磷酸盐缓冲液8ml中，搅拌溶解，随后加入到上述的负载药物青蒿琥酯的硫化铜纳米粒(AS/CuS)中，搅拌24h，用质量浓度20％乙醇透析12h，除去游离的青蒿琥酯，即得转铁蛋白修饰的中空介孔硫化铜/青蒿琥酯纳米粒(AS/Tf-CuS)。

实施例3

本发明在具体实施中，还可由以下步骤实现：

(1)、将0.9g的CuSO₄·5H₂O溶解于220ml水中，搅拌加入5.5g聚乙烯吡咯烷酮，室温反应10～20min，加入2g氢氧化钠，搅拌均匀，用注射器滴加20ml水合肼，搅拌10～15min，再加入1.4g硫酸铵，搅拌1h，用超纯水离心洗至中性，冷冻干燥46-50h，得到中空介孔硫化铜纳米颗粒；

(2)、将中空介孔硫化铜纳米颗粒35mg探头超声分散于pH7～9的磷酸盐缓冲液30ml中，搅拌下加入130mg青蒿琥酯，继续搅拌24h，得负载药物青蒿琥酯的硫化铜纳米粒(AS/CuS)；

(3)、将20mg转铁蛋白加入pH7～9的磷酸盐缓冲液12ml中，搅拌溶解，随后加入到上述的负载药物青蒿琥酯的硫化铜纳米粒(AS/CuS)中，搅拌24h，用质量浓度20％乙醇透析12h，除去游离的青蒿琥酯，即得转铁蛋白修饰的中空介孔硫化铜/青蒿琥酯纳米粒(AS/Tf-CuS)。

本发明在中空介孔硫化铜表面修饰转铁蛋白，利用转铁蛋白释放的Fe³⁺在铁还原酶STEAP3的作用下生成Fe²⁺，使AS内的过氧键断裂，产生大量自由基，破坏细胞膜和生物大分子，引起DNA断裂，从而诱导细胞凋亡，同时将硫化铜纳米颗粒的近红外吸收功能及癌周注射产生的DMR效应结合起来，建立了同时实现靶向、光热治疗、光动力学治疗、光声成像、药物治疗和产生DMR效应六重功效的药物，将硫化铜显著的光热敏感性、强大的药物负载特性，转铁蛋白独特的肿瘤细胞靶向性、青蒿琥酯的抗肿瘤活性、良好的生物相容性有机的整合于一体，既可克服传统光热疗、化疗技术的非靶向性难题，降低治疗过程中对正常组织的损伤，与传统光热疗法相比具有高效、可控的优势，并且，其光热治疗与化疗技术的结合更体现癌症综合治疗，并经实验取得了非常满意的有益技术效果，有关资料如下：

一、转铁蛋白修饰的中空介孔硫化铜/青蒿琥酯纳米粒的表征：

1、转铁蛋白修饰的硫化铜/青蒿琥酯纳米粒中青蒿琥酯含量的测定

采用紫外分光光度法，于292nm波长处测定青蒿琥酯的含量，以式(1)计算样品的载药量，载药量达到25％左右：

2、转铁蛋白修饰的中空介孔硫化铜/青蒿琥酯纳米粒粒径和电位的测定

取适量转铁蛋白修饰的硫化铜/青蒿琥酯纳米粒分散于水中，用Nano-ZS90型激光纳米粒度分析仪测得其粒径和电位分别为190nm和10.2±2.5mV。

二、转铁蛋白修饰的中空介孔硫化铜/青蒿琥酯纳米粒的药物释放实验

取1ml已知药物含量的AS/Tf-CuS、AS/CuS、AS溶液置于透析袋里(截留分子量MW＝3500)，在50ml的释放介质中释药，释放介质为含有20％乙醇的pH为7.4的PBS溶液(乙醇：PBS，v/v＝1:4)。固定恒温振荡器的温度为37.0±0.5℃，转速为100r/min。于0.5，1，2，4，8，12，24，36，48h取样，每次取样同时补充同等体积的释药介质，高效液相测定青蒿琥酯释药量，计算累积释药百分率。以时间为横坐标，累积释药百分率为纵坐标作图，比较三组中青蒿琥酯的释药特征。数据结果表明，在24h时，AS组在释放介质中的累积释药百分率是98％，AS/CuS组的累积释药百分率是68％，AS/Tf-CuS组在释放介质中的累积释药百分率是51％，表明制剂组对药物有很明显的缓释作用。

三、转铁蛋白修饰的中空介孔硫化铜/青蒿琥酯纳米粒的体外热疗实验

配制一系列浓度的转铁蛋白修饰的中空介孔硫化铜/青蒿琥酯纳米粒溶液，硫化铜浓度分别为：200ug/ml、100ug/ml、50ug/ml、20ug/ml、0ug/ml。采用808nm近红外激光以2W/cm²的能量密度进行照射，并于0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5min分别测量溶液的温度，记录结果显示，浓度为200ug/ml、100ug/ml、50ug/ml、20ug/ml、0ug/ml时，5min内温度分别升高了43.6℃，34.3℃，27.8℃，18.2℃，2.3℃。结果表明，转铁蛋白修饰的中空介孔硫化铜/青蒿琥酯纳米粒具有优良的光热转化作用，并且其光热转换效应呈现浓度依赖性。

四、转铁蛋白修饰的中空介孔硫化铜/青蒿琥酯纳米粒的细胞增殖抑制实验

采用SRB法，选择对数生长期的MCF-7人乳腺癌细胞，调整细胞数为5×10⁴/ml接种于96孔培养板，每孔100μ1(边缘孔用无菌PBS填充)，细胞贴壁生长24h后加药，依次为空白组、CuS组、Tf-CuS组、AS组、AS/CuS组、AS/Tf-CuS组，药物终浓度设为25μg/ml，并分设激光组(2W/cm²，3min)和非激光组。每组设6个复孔。24h后，每孔加入50μl 4℃预冷的50％三氯乙酸(TCA)固定细胞，固定10min后移入4℃冰箱固定1h，取出弃去固定液，用去离子水洗5遍，甩干，室温自然干燥。室温晾干后，每孔加入SRB染液50μ1，室温避光放置15～30min染色，弃染液，用1％的冰醋酸洗5遍，室温干燥。之后，用150μl非缓冲Tris碱液(10mM，pH＝10.5)溶解与细胞蛋白结合的染料，摇床微振荡(37℃，100rpm，10min),于酶标仪515nm波长处测每个小孔的OD值，计算肿瘤细胞生长抑制率(％)＝(1-实验组OD值/对照组OD值)×100％，计算得到CuS组、CuS-laser组、Tf-CuS组、Tf-CuS-laser组、AS组、AS-laser组、AS/CuS组、AS/CuS-laser组、AS/Tf-CuS组、AS/Tf-CuS-laser组各组的细胞生长抑制率分别为：3.1％，20.2％，5.4％，24.6％，15.8％，16.4％，25.2％，45.3％，47.4％，77.7％。结果表明，载体CuS及Tf-CuS在实验剂量下对细胞无明显毒性，但在近红外光(808nm)照射下有明显的光热效应；在无近红外光照射时制剂组与原料药组的细胞毒性差别不大，而在近红外光照射时AS/Tf-CuS对细胞杀伤效果最强，则是化疗与热疗协同治疗的结果。

五、转铁蛋白修饰的中空介孔硫化铜/青蒿琥酯纳米粒的细胞摄取实验

选择对数生长期的MCF-7人乳腺癌细胞，以3*10⁵个/孔接种于6孔板，每孔2ml，贴壁生长24h后加药，依次为FITC组、AS/CuS-FITC组、AS/Tf-CuS-FITC组，药物终浓度设为25μg/ml，孵育时间设为0.5h，1h，2h。加药后在37℃，5％CO₂条件下培养后，将孔内含药培养基弃去，每孔用1ml PBS洗2～3遍，加入500μl不含EDTA的胰酶消化细胞，加1ml培养基终止消化，吹打，直至细胞与壁分离，将细胞悬液移入10ml离心管中，离心弃去上清，加PBS重悬，用流式细胞仪测定，发现MCF-7人乳腺癌细胞0.5h对FITC、AS/CuS-FITC和AS/Tf-CuS-FITC的摄取量分别为：2.1％、9.7％和36.9％；1h时的摄取量分别为：2.5％、19.0％和69.6％；2h时的摄取量分别为：2.8％、47.4％和99.7％。结果表明，AS/CuS-FITC和AS/Tf-CuS-FITC纳米制剂的细胞摄取相对较快，其中AS/Tf-CuS-FITC的靶头转铁蛋白(Tf)可被癌细胞表面的转铁蛋白受体识别，经受体介导内吞入细胞内部，2h时MCF-7人乳腺癌细胞对AS/Tf-CuS-FITC摄取量为99.7％。

六、转铁蛋白修饰的中空介孔硫化铜/青蒿琥酯纳米粒的药效学试验

昆明小鼠(雌性，3～4周龄)，在小鼠的右上肢背部皮下接种S-180腹水瘤细胞，7天后测量肿瘤体积，取72只肿瘤体积≥100mm³且肿瘤体积和体重相似的小鼠，将其随机分为12组，每组6只。具体分组如下，静脉注射组：Tf-CuS/AS组，Tf-CuS/AS-laser组；癌周注射组：生理盐水组、生理盐水-laser组、Tf-CuS组、Tf-CuS-laser组、AS组、AS-laser组、AS/CuS组、AS/CuS-laser组、Tf-CuS/AS组、Tf-CuS/AS-laser组，激光组使用的光源为808nm近红外激光，功率为2W/cm²，给药3h后激光照射肿瘤部位，一次照射时间为1min，每两天给药一次，共给药7次,给药剂量均为15mg/kg。整个实验过程中保证小鼠每日正常饮食，每两天对小鼠进行称重，并使用数显游标卡尺测量荷瘤小鼠肉瘤的长径(A)与短径(B)，按公式肿瘤体积V＝A×B²/2计算肿瘤体积。记录的数据显示，静脉注射组：Tf-CuS/AS组，Tf-CuS/AS-laser组的抑瘤率分别为38.98％，61.14％；癌周注射组：Tf-CuS组、Tf-CuS-laser组、AS组、AS-laser组、AS/CuS组、AS/CuS-laser组、AS/Tf-CuS组、AS/Tf-CuS-laser组各组的抑瘤率分别为8.32％，30.24％，19.27％，22.87％，22.83％，39.61％，46.92％，74.89％。结果表明，癌周注射组Tf-CuS/AS-laser组的药效显著，说明Tf-CuS/AS癌周注射肿瘤靶向产生的DMR效应和808nm激光热疗联合可以显著增强肿瘤的治疗效果。

实验表明，本发明具有以下突出的有益技术效果：

(1)应用癌周注射的给药方式，产生DMR效应，可以靶向将抗癌药物青蒿琥酯和光热试剂硫化铜传输到癌症部位，从而进一步提高治疗效果，减小对正常组织和细胞的毒副作用。

(2)第一次将CuS纳米颗粒的近红外吸收功能及转铁蛋白与青蒿琥酯的协同增效功能与DMR效应结合起来，建立了一种可同时实现靶向、光热治疗、光动力学治疗、光声成像、药物治疗和产生DMR效应六重功效的方法，有望为疾病的早期诊断和治疗等领域提供技术基础，具备显著的经济效益和社会效益。

(3)引入的转铁蛋白增加了CuS的生物相容性，提高了药物的负载率，不仅使制剂具有靶向性，同时与药物青蒿琥酯产生协同增效功能。

(4)AS/Tf-CuS纳米粒的制备方法简单，成本低廉，易于大规模制备，经济和社会效益巨大。

Claims

1.一种转铁蛋白修饰的中空介孔硫化铜/青蒿琥酯纳米粒的制备方法，其特征在于，首先合成中空介孔硫化铜纳米颗粒，在中空介孔结构的硫化铜内部负载药物青蒿琥酯，再通过静电吸附修饰上转铁蛋白，制得转铁蛋白修饰的中空介孔硫化铜/青蒿琥酯纳米粒，具体步骤如下：

（1）、将0.8-0.9g的CuSO₄·5H₂O溶解于180-220ml水中，搅拌加入4.5-5.5g聚乙烯吡咯烷酮，室温反应10～20min，加入1-2g氢氧化钠，搅拌均匀，滴加10-20ml水合肼，搅拌10～15min，再加入1.2-1.4g硫酸铵，搅拌1h，用超纯水离心水洗至中性，冷冻干燥46-50h，得到中空介孔硫化铜纳米颗粒；

（2）、将中空介孔硫化铜纳米颗粒25-35mg分散于pH7～9的磷酸盐缓冲液25-30ml中，搅拌下加入110-130mg青蒿琥酯，继续搅拌24h，得负载药物青蒿琥酯的硫化铜纳米粒；

（3）、将10-20mg转铁蛋白加入pH7～9的磷酸盐缓冲液8-12ml中，搅拌溶解，随后加入到上述的负载药物青蒿琥酯的硫化铜纳米粒中，搅拌24h，用质量浓度20%乙醇透析12h，除去游离的青蒿琥酯，即得转铁蛋白修饰的中空介孔硫化铜/青蒿琥酯纳米粒；

所述的青蒿琥酯的载药量为23%～27%，转铁蛋白与硫化铜的质量比为1:2～4。

2.根据权利要求1所述的转铁蛋白修饰的中空介孔硫化铜/青蒿琥酯纳米粒的制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：

（1）、将0.85g的CuSO₄·5H₂O溶解于200ml水中，搅拌加入5.0g聚乙烯吡咯烷酮，室温反应10～20min，加入1.5g氢氧化钠，搅拌均匀，用注射器滴加15ml水合肼，搅拌10～15min，再加入1.38g硫酸铵，搅拌1h，用超纯水离心水洗至中性，冷冻干燥48h，得中空介孔硫化铜纳米颗粒；

（2）、将中空介孔硫化铜纳米颗粒30mg探头超声分散于pH7～9的磷酸盐缓冲液28ml中，搅拌下加入120mg青蒿琥酯，搅拌24h，得负载药物青蒿琥酯的硫化铜纳米粒；

（3）、将15mg转铁蛋白加入pH7～9的磷酸盐缓冲液10ml中，搅拌溶解，随后加入到上述的负载药物青蒿琥酯的硫化铜纳米粒中，搅拌24h，用质量浓度20%乙醇透析12h，除去游离的青蒿琥酯，即得转铁蛋白修饰的中空介孔硫化铜/青蒿琥酯纳米粒。

3.根据权利要求1所述的转铁蛋白修饰的中空介孔硫化铜/青蒿琥酯纳米粒的制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：

（1）、将0.8g的CuSO₄·5H₂O溶解于180ml水中，搅拌加入4.5g聚乙烯吡咯烷酮，室温反应10～20min，加入1g氢氧化钠，搅拌均匀，用注射器滴加10ml水合肼，搅拌10～15min，再加入1.2g硫酸铵，搅拌1h，用超纯水离心水洗至中性，冷冻干燥46-50h，得到中空介孔硫化铜纳米颗粒；

（2）、将中空介孔硫化铜纳米颗粒25mg探头超声分散于pH7～9的磷酸盐缓冲液25ml中，搅拌下加入110mg青蒿琥酯，继续搅拌24h，得负载药物青蒿琥酯的硫化铜纳米粒；

（3）、将10mg转铁蛋白加入pH7～9的磷酸盐缓冲液8ml中，搅拌溶解，随后加入到上述的负载药物青蒿琥酯的硫化铜纳米粒中，搅拌24h，用质量浓度20%乙醇透析12h，除去游离的青蒿琥酯，即得转铁蛋白修饰的中空介孔硫化铜/青蒿琥酯纳米粒。

4.根据权利要求1所述的转铁蛋白修饰的中空介孔硫化铜/青蒿琥酯纳米粒的制备方法，其特征在于，由以下步骤实现：

（1）、将0.9g的CuSO₄·5H₂O溶解于220ml水中，搅拌加入5.5g聚乙烯吡咯烷酮，室温反应10～20min，加入2g氢氧化钠，搅拌均匀，用注射器滴加20ml水合肼，搅拌10～15min，再加入1.4g硫酸铵，搅拌1h，用超纯水离心洗至中性，冷冻干燥46-50h，得到中空介孔硫化铜纳米颗粒；

（2）、将中空介孔硫化铜纳米颗粒35mg探头超声分散于pH7～9的磷酸盐缓冲液30ml中，搅拌下加入130mg青蒿琥酯，继续搅拌24h，得负载药物青蒿琥酯的硫化铜纳米粒；

（3）、将20mg转铁蛋白加入pH7～9的磷酸盐缓冲液12ml中，搅拌溶解，随后加入到上述的负载药物青蒿琥酯的硫化铜纳米粒中，搅拌24h，用质量浓度20%乙醇透析12h，除去游离的青蒿琥酯，即得转铁蛋白修饰的中空介孔硫化铜/青蒿琥酯纳米粒。

5.权利要求1或2-4任一项所述方法制备的转铁蛋白修饰的中空介孔硫化铜/青蒿琥酯纳米粒在制备肿瘤光热治疗-光动力学治疗-光声成像-化疗-诊断综合一体化药物中的应用。