KR20210077596A - 방사성 할로겐이 표지된 복합체 제조용 링커화합물 및 이의 용도 - Google Patents

방사성 할로겐이 표지된 복합체 제조용 링커화합물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 방사성 할로겐을 포함하는 링커화합물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 아지도 (Azido-, N3)기 또는 아디보 (ADIBO)기가 도입된 결합물질과 클릭 반응으로 결합하기 위한, 아디보 (ADIBO)기 또는 아지도 (Azido-, N3)기를 포함하는 화합물로서, 아지도 (Azido-, N3)기 또는 아디보 (ADIBO)기가 도입 가능한 다양한 펩타이드 또는 거대 단백질에 방사성 할로겐을 표지할 수 있는 링커화합물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 화합물은 적은 개수의 백혈구를 고효율로 표지할 수 있어 적은 양의 혈액으로도 검사가 가능하고 긴 반감기로 인해 지연 영상의 관찰에 적합하며, 상기 백혈구 표지를 통해 급성 염증과 만성염증의 구별이 가능하며, 다양한 단백질에 도입 가능한 바 각종 질환에 대한 영상진단 또는 암 미세환경 형성 연구에도 유용하게 쓰일 것으로 기대된다.

Description

방사성 할로겐이 표지된 복합체 제조용 링커화합물 및 이의 용도{Linker Compounds for the Preparation of Radioactive halogen-labeled complex and Their Uses}
본 발명은 방사성 할로겐을 포함하는 링커화합물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 아지도 (Azido-, N3)기 또는 아디보 (ADIBO)기가 도입된 결합물질과 클릭 반응으로 결합하기 위한, 아디보 (ADIBO)기 또는 아지도 (Azido-, N3)기를 포함하는 화합물로서, 아지도 (Azido-, N3)기 또는 아디보 (ADIBO)기가 도입 가능한 다양한 펩타이드 또는 거대 단백질에 방사성 할로겐을 표지할 수 있는 링커화합물에 관한 것이다.
임상에서 백혈구 염증영상 진단을 위해 사용되는 대표적인 백혈구 방사성 표지 물질은 Tc-99m HMPAO와 In-111 oxine이 있다.
이중 Tc-99m HMPAO는 원래 뇌혈류 영상 평가용 방사성 의약품으로 사용되고 세포 표지기전은 상기 화합물이 백혈구의 세포막을 통과해 들어간 뒤 세포 안에서 글루타치온과 반응하여 친수성 화합물로 바뀌어 세포 내에 머무르는 것을 이용한 것이다.
그러나 표지된 상기 친수성 화합물 또는 Tc-99m HMPAO는 인체투여 후 섭취되었던 세포 밖으로 다시 분비되어 혈액으로 유리되어 대부분 담즙이나 소변으로 배설되고, 담낭, 비뇨기계, 장 등의 비특이적 방사능 영상으로 관찰되는바 장관의 농양, 염증성 대장염, 신장이나 이식신장의 감염 등의 진단 시에는 Tc-99m HMPAO을 사용하지 않는다. 또한 Tc-99m HMPAO를 사용한 표지방법은 세포 표지기전의 원리가 세포벽의 지질과 친화성을 가지는 화학구조적 특성으로 섭취되는 것이기 때문에, 전혈에서 자가백혈구를 분리 시 혈장 단백질 성분이 있을 경우 비특이적 결합이 생기고, 분리된 자가 백혈구의 개수가 충분하지 않으면 표지 수율이 낮아 환자로부터 충분한 양의 혈액을 채취하여야 한다는 단점이 있다.
한편, In-111은 백혈구에 표지할 때에 oxine과 착화합물의 형태로 사용된다. 이러한 착화합물은 지질친화성 화합물로 세포막을 통과하여 세포 내에서 oxine 등과 분리되고, 유리 In-111은 세포 내 단백질과 착화물 형태로 세포 내에 머무르게 되는 것이다. In-111은 백혈구와 비가역적 결합을 형성하기 때문에 Tc-99m HMPAO에 비해 표지가 안정적이며 표지 수율이 높으며, In-111의 2.3 일이라는 상대적으로 긴 물리적 반감기를 가지는바 1 일 내지 2 일 뒤의 지연영상 기록에 유리하다는 장점이 있으나, 상기 In-111은 In-111 oxine의 불안정성 때문에 백혈구 세포막을 통과하기 전에 혈액의 혈장에 존재하는 다수의 단백질과 복합체를 이룰 수 있기 때문에 백혈구 표지 시 혈장을 완전히 제거하고 백혈구만으로 표지를 진행하여야 한다는 단점이 있다. 또한 In-111은 사이클로트론 생산 핵종이고, 해외에서 수입되어야 하기 때문에 사용하기 최소 수일 전에 사용계획을 세우고 진행하여야 하기 때문에 언제든지 사용 가능한 Tc-99m HMPAO 표지에 비해 비용이 비싸다.
이에, 다양한 단백질에 특이적으로 표지 가능한 방사성 할로겐 도입용 링커화합물에 관한 연구가 진행 중이나 (한국공개특허공보 제10-2004-0008209호), 아직 미진한 실정이다.
본 발명자들은 타이로신 (tyrosine)을 서열상에 포함하지 않는 펩타이드에는 방사성 할로겐을 도입하는 것이 어렵다는 점에 착안하여, 상기와 같은 타이로신이 없는 펩타이드에도 표지 가능한 방사성 할로겐 표지용 링커화합물을 예의 연구한 결과, 아디보 (ADIBO)기 또는 아지도 (Azido-, N3)기를 포함하는 방사성 할로겐 표지용 신규 링커화합물을 합성하고 상기 링커를 아지도 (Azido-, N3)기 또는 아디보 (ADIBO)기를 포함하는 다양한 단백질에 도입하여 방사성 할로겐을 표지할 수 있음을 최초로 규명하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
[화학식 1]
Figure pat00001
또한 본 발명은 하기 화학식 1a로 표시되는 화합물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
[화학식 1a]
Figure pat00002
여기서, X는 방사성 할로겐이다.
또한 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 화학식 1a로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
1) 하기의 화학식 2의 3-(트리부틸스탄일)벤조산 (3-(tributylstannyl)benzoic acid)을 화학식 3의 아디보-아민 (ADIBO-amine)과 반응시키는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 생성물과 MX를 반응시키는 단계.
여기서, M은 Na이고, X는 방사성 할로겐이다.
[화학식 2]
Figure pat00003
[화학식 3]
Figure pat00004
또한 본 발명은 하기 화학식 5로 표시되는 화합물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
[화학식 5]
Figure pat00005
또한 본 발명은 하기 화학식 5a로 표시되는 화합물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
[화학식 5a]
Figure pat00006
여기서, X는 방사성 할로겐이다.
또한 본 발명은 3-아이오도벤조산 (3-Iodobenzoic acid)과 3-아지도프로필아민 (3-Azidopropylamine)을 반응시키는 단계를 포함하는, 화학식 5a로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
또한 본 발명은 상기 화학식 1 화합물과 N3기가 도입된 결합성분과 결합된 복합체를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
또한 본 발명은 상기 화학식 1a 화합물과 N3기가 도입된 결합성분과 결합된 복합체를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
또한 본 발명은 상기 화학식 5 화합물과 아디보 (ADIBO)기가 도입된 결합성분이 결합된 복합체를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
또한 본 발명은 상기 화학식 5a 화합물과 아디보 (ADIBO)기가 도입된 결합성분이 결합된 복합체를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
또한 본 발명은 상기 각각의 복합체를 포함하는, 방사면역 치료 또는 진단용 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
또한 본 발명은 상기 각각의 복합체를 포함하는, 조영제를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00007
또한 본 발명은 하기 화학식 1a로 표시되는 화합물을 제공한다.
[화학식 1a]
Figure pat00008
여기서, X는 방사성 할로겐이다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 X는 I-123, I-124, I-125, I-131, At-211 또는 Br-76인 것일 수 있다.
또한 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 화학식 1a로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공한다.
1) 하기의 화학식 2의 3-(트리부틸스탄일)벤조산 (3-(tributylstannyl)benzoic acid)을 화학식 3의 아디보-아민 (ADIBO-amine)과 반응시키는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 생성물과 MX를 반응시키는 단계.
여기서, M은 Na이고, X는 방사성 할로겐이다.
[화학식 2]
Figure pat00009
[화학식 3]
Figure pat00010
또한 본 발명은 하기 화학식 5로 표시되는 화합물을 제공한다.
[화학식 5]
Figure pat00011
또한 본 발명은 하기 화학식 5a로 표시되는 화합물을 제공한다.
[화학식 5a]
Figure pat00012
여기서, X는 방사성 할로겐이다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 X는 I-123, I-124, I-125, I-131, At-211 또는 Br-76인 것일 수 있다.
또한 본 발명은 3-아이오도벤조산 (3-Iodobenzoic acid)과 3-아지도프로필아민 (3-Azidopropylamine)을 반응시키는 단계를 포함하는, 화학식 5a로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 화학식 1 화합물과 N3기가 도입된 결합성분이 결합된 복합체를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 화학식 1a 화합물과 N3기가 도입된 결합성분이 결합된 복합체를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 화학식 5 화합물과 아디보 (ADIBO)기가 도입된 결합성분이 결합된 복합체를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 화학식 5a 화합물과 아디보 (ADIBO)기가 도입된 결합성분이 결합된 복합체를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 결합성분은 항체 또는 세포투과 펩타이드인 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 아디보 (ADIBO)기는 ADIBO-Ph-NCS와 결합함으로써 도입되는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 각각의 복합체를 포함하는, 방사면역 치료 또는 진단용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 각각의 복합체를 포함하는, 조영제를 제공한다.
본 발명자들은 타이로신 (tyrosine)을 서열상에 포함하지 않는 펩타이드에는 방사성 할로겐을 도입하는 것이 어렵다는 점에 착안하여, 상기와 같은 타이로신이 없는 펩타이드에도 표지 가능한 방사성 할로겐 표지용 링커화합물을 예의 연구한 결과, 아디보 (ADIBO)기 또는 아지도 (Azido-, N3)기를 포함하는 방사성 할로겐 표지용 신규 링커화합물을 합성하고 상기 링커를 아지도 (Azido-, N3)기 또는 아디보 (ADIBO)기를 포함하는 다양한 단백질에 도입하여 방사성 할로겐을 표지할 수 있음을 최초로 규명하였는바, 특히 본 발명에 따른 화합물은 적은 개수의 백혈구를 고효율로 표지할 수 있어 적은 양의 혈액으로도 검사가 가능하고 반감기가 길어 지연 영상의 관찰에 적합하며, 상기 백혈구 표지를 통해 급성 염증과 만성염증의 구별이 가능하며, 다양한 단백질에 도입 가능한 바 각종 질환에 대한 영상진단 또는 암 미세환경 형성 연구에도 유용하게 쓰일 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명에 따른 방사성 할로겐이 표지된 복합체 제조용 링커화합물의 전구체의 화학식을 나타낸 것이다.
도 2는 다양한 온도 조건에서, 본 발명에 따른 방사성 할로겐이 표지된 복합체 (I-TAT)의 물 (water) 속 안정도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 방사성 할로겐이 표지된 복합체 (I-TAT)와 독소루비신의 농도의존적 세포독성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 방사성 할로겐이 표지된 복합체 (125I-TAT)의 백혈구 표지 효율을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 실시예 8 에서 합성한 deglycosylated rituximab 의 LC-TOF 스펙트럼을 나타낸다.
도 6은 실시예 8에서 합성한 ADIBO-Rituximab의 LC-TOF 스펙트럼을 나타낸다.
도 7은 실시예 9에서 합성한 125I-azide 의 방사선 검출 크로마토그램을 나타낸다.
도 8은 실시예 10에서 시간 경과에 따른 125I-Rituximab의 표지 수율을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자들은 타이로신 (tyrosine)을 서열상에 포함하지 않는 펩타이드에는 방사성 할로겐을 도입하는 것이 어렵다는 점에 착안하여, 상기와 같은 타이로신이 없는 펩타이드에도 표지 가능한 방사성 할로겐 표지용 링커화합물을 예의 연구한 결과, 아디보 (ADIBO)기 또는 아지도 (Azido-, N3)기를 포함하는 방사성 할로겐 표지용 신규 링커화합물을 합성하고 상기 링커를 아지도 (Azido-, N3)기 또는 아디보 (ADIBO)기를 포함하는 다양한 단백질에 도입하여 방사성 할로겐을 표지할 수 있음을 최초로 규명하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00013
상기 화학식 1의 화합물은 하기 반응식 1에 나타낸 바와 같이, 3-(트리부틸스탄일)벤조산 (3-(tributylstannyl)benzoic acid) 및 아디보-아민 (ADIBO-amine)을 반응시키는 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.
[반응식 1]
Figure pat00014
또한 본 발명은 하기 화학식 1a로 표시되는 화합물을 제공한다.
[화학식 1a]
Figure pat00015
여기서, X는 방사성 할로겐이다.
상기 화학식 1a의 화합물은 상기 화학식 1의 트리부틸스탄일 (tributylstannyl) 대신 방사성 할로겐으로 치환할 수 있는 임의의 방법으로 제조될 수 있다.
또한 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 화학식 1a로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공한다. 1) 하기의 화학식 2의 3-(트리부틸스탄일)벤조산 (3-(tributylstannyl)benzoic acid)을 화학식 3의 아디보-아민 (ADIBO-amine)과 반응시키는 단계; 및 2) 상기 단계 1)의 생성물과 MX를 반응시키는 단계. 여기서, M은 Na이고, X는 방사성 할로겐이고, 상기 X는 I-123, I-124, I-125, I-131, At-211 또는 Br-76인 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
[화학식 2]
Figure pat00016
[화학식 3]
Figure pat00017
또한 본 발명은 하기의 화학식 5로 표시되는 화합물을 제공한다.
[화학식 5]
Figure pat00018
상기 화학식 5의 화합물은 하기 반응식 2에 나타낸 바와 같이, 3-아이오도벤조산 (3-Iodobenzoic acid)에 비스(트라이페닐포스핀)-팔라듐(II) 클로라이드 [Bis(triphenylphosphine)-palladium(II) dichloride]와 포타슘아세테이트(KOAc)를 순차적으로 가하여 3-(트리부틸스탄일)벤조산 [3-(tributylstannyl)benzoic acid] (d)를 합성하는 단계 및 상기 화합물 d와 아지도프로필아민 (Azidopropylamine)을 반응시키는 단계를 포함하는, 방법으로 제조될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
[반응식 2]
Figure pat00019
또한 본 발명은 하기 화학식 5a로 표시되는 화합물을 제공한다.
[화학식 5a]
Figure pat00020
여기서, X는 방사성 할로겐이다.
상기 화학식 5a의 화합물은 상기 화학식 5의 트리부틸스탄일 (tributylstannyl) 대신 방사성 할로겐으로 치환할 수 있는 임의의 방법으로 제조될 수 있다.
또한 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 3-아이오도벤조산 (3-Iodobenzoic acid)과 3-아지도프로필아민 (3-Azidopropylamine)을 반응시키는 단계를 포함하는, 화학식 5a로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공한다.
Figure pat00021
본 발명에 있어서, "방사성 할로겐"은, 할로겐의 방사성 동위원소를 지칭하며, 바람직하게는 I-123, I-124, I-125, I-131, At-211 또는 Br-76인 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 추후 제조하고자 하는 항체 또는 세포투과 펩타이드를 포함하는 복합체의 용도에 따라 적절한 방사성 핵종을 선택할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 화학식 1, 1a, 5 또는 5a로 표시되는 화합물은 적은 양의 시료에 대해서도 방사성 할로겐을 표시할 수 있고, 방사성 할로겐을 표적 펩타이드 또는 항체에 표지하고 정제 후에도 안정성이 높은 구조를 가지는 링커화합물이다.
전술한 바와 같이 화학식 1의 화합물 또는 상기 화합물에 방사선 할로겐이 결합된 화학식 1a의 화합물은, 상기 화합물의 아디보 (ADIBO)기와 다른 결합성분에 도입된 아지도 (Azido-, N3)기가 결합함으로써, 방사선 할로겐이 도입된 복합체의 제조에 사용될 수 있다.
또한 화학식 5의 화합물 또는 상기 화합물에 방사선 할로겐이 결합된 화학식 5a의 화합물은, 상기 화합물의 아지도 (Azido-, N3)기와 다른 결합성분에 도입된 아디보 (ADIBO)기가 결합함으로써, 방사선 할로겐이 도입된 복합체의 제조에 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 "결합성분"은, 아지도 (Azido-, N3)기 또는 아디보 (ADIBO)기가 도입될 수 있는 모든 펩타이드 또는 거대 단백질을 의미하며, 상기 결합성분은 항체 또는 세포투과성 펩타이드인 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 도입된 아지도 (Azido-, N3)기 또는 도입된 아디보 (ADIBO)기는 화학결합으로 결합성분과 연결되나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 본 발명은 상기 화학식 1 화합물과 N3기가 도입된 결합성분이 결합된 복합체를 제공한다.
본 발명에 따른 상기 화학식 1 화합물과 N3기가 도입된 결합성분이 결합된 복합체에서, 보다 구체적으로, 상기 결합성분은 하기 화학식 1″에 나타낸 바와 같이 세포투과성 펩타이드일 수 있다.
[화학식 1″]
Figure pat00022
상기 화학식 1″에서 펩타이드는 세포투과성을 가지는 임의의 펩타이드가 사용될 수 있으며, 이러한 펩타이드의 예로는 주로 세포표면에 존재하는 수용체에 특이적으로 결합하는 것으로 소마토스타틴, 봄베신, Substance P, RGD 유도체, TAT 또는 뉴로텐신이 있고, 바람직하게는 TAT일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 사용되는 펩타이드는 사용목적 및 방사성 할로겐 원소의 종류에 따라 달라질 수 있다.
상기 화학식 1의 화합물을 세포투과성 펩타이드의 아지도 (Azido-, N3) 기와 결합시킨 상기 화학식 1″의 복합체의 제조는 하기 반응식 3에 나타낸 바와 같이 수행될 수 있으며, 구체적인 반응 조건은 통상의 기술자가 적절한 조건을 선택할 수 있다.
[반응식 3]
Figure pat00023
또한 본 발명은 상기 화학식 1a 화합물과 N3기가 도입된 결합성분이 결합된 복합체를 제공한다. 보다 구체적으로, 상기 결합성분은 하기 화학식 1b'에 나타낸 바와 같이 세포투과성 펩타이드 일 수 있다.
[화학식 1b']
Figure pat00024
상기 화학식 1b'에서, X는 I-123, I-124, I-125, I-131, At-211 또는 Br-76이나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 화학식 1b'에서, 펩타이드는 세포투과성을 가지는 임의의 펩타이드가 사용될 수 있으며, 이러한 펩타이드의 예로는 주로 세포표면에 존재하는 수용체에 특이적으로 결합하는 것으로 소마토스타틴, 봄베신, Substance P, RGD 유도체, TAT 또는 뉴로텐신이 있고, 바람직하게는 TAT일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 사용되는 펩타이드는 사용목적 및 방사성 할로겐 원소의 종류에 따라 달라질 수 있다.
보다 구체적으로 본 발명의 일 실시예에서, 상기 복합체로서 3-아디보-3-옥소프로필-3'-(트리부틸스탄일) 벤조아마이드와 azido-TAT를 클릭반응을 통해 결합시킨 생성물인 하기 화학식 4를 제공하나, 본 발명은 상기 실시예에만 제한되는 것은 아니다.
[화학식 4]
Figure pat00025
본 발명에 있어서, "TAT 펩타이드"는 GRKKRRQRRRPQ의 아미노산 서열을 가지고 인간 면역 결핍 바이러스의 전사 활성화제 (TAT)로부터 유래되었으며, 세포투과성 펩타이드이다.　세포투과성 펩타이드 (Cell Penetrating Peptides, CPP)는 세포막의 친유성 장벽을 극복하고 생물학적 작용을 위해 세포 내에 큰 분자 및 작은 입자를 전달하는데 사용된다. 세포투과성 펩타이드는 세포 내부에 단백질, DNA, 항체, 조영제 (영상제), 독소 및 리포좀을 포함한 나노 특정 약물 운반체와 같은 다양한 화물 (cargo)을 전달하는 데 사용된다. 본 발명에 따라 방사선 할로겐이 도입된 TAT는 123I-TAT, 124I-TAT 125I-TAT 등으로 표시할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 화학식 1a의 화합물을 항체 또는 세포투과성 펩타이드의 아지도 (Azido-, N3) 기와 결합시킨 상기 화학식 1b 또는 화학식 1b'의 복합체의 제조는 하기 반응식 4에 나타낸 바와 같이 수행될 수 있으며, 구체적인 반응 조건은 통상의 기술자가 적절한 조건을 선택할 수 있다.
[반응식 4]
Figure pat00026
또한 본 발명은 상기 화학식 5로 표시되는 화합물과 아디보 (ADIBO)기가 도입된 결합성분이 결합된 복합체를 제공한다.
[화학식 5']
Figure pat00027
보다 구체적으로, 상기 결합성분은 하기 화학식 5'에 나타낸 바와 같이 항체일 수 있고, 상기 항체는 방사면역 치료 또는 진단에 사용될 수 있는 임의의 항체가 사용될 수 있으며, 이러한 항체의 예로는 리툭시맙, 트라스투주맙 (Herceptin), 세툭시맙, 파니투무맙, 베바시주맙, 사투모맙, 아크리투모맙, 이브리투모맙, 또는 토시투모맙 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 방사면역 치료 또는 진단의 종류는 사용되는 항체의 종류 및 방사성 할로겐 원소의 종류에 따라 달라질 수 있다.
또한 본 발명에 따른 상기 화학식 5로 표시되는 화합물과 아디보 (ADIBO)기가 도입된 결합성분이 결합된 복합체에서, 상기 결합성분은 하기 화학식 5″에 나타낸 바와 같이 세포투과성 펩타이드일 수 있다.
[화학식 5″]
Figure pat00028
상기 화학식 5b에서, 펩타이드는 세포투과성을 가지는 임의의 펩타이드가 사용될 수 있으며, 이러한 펩타이드의 예로는 주로 세포표면에 존재하는 수용체에 특이적으로 결합하는 것으로 소마토스타틴, 봄베신, Substance P, RGD 유도체, TAT 또는 뉴로텐신이 있고, 바람직하게는 TAT일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 사용되는 펩타이드는 사용목적 및 방사성 할로겐 원소의 종류에 따라 달라질 수 있다.
상기 항체 또는 세포투과성 펩타이드는 하기 화학식 6으로 표시되는 화합물과 결합함으로써, 아디보 (ADIBO)기가 도입될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 도입의 구체적인 반응 조건은 통상의 기술자가 적절한 조건을 선택할 수 있다.
[화학식 6]
Figure pat00029
상기 화학식 5의 화합물을 항체 또는 세포투과성 펩타이드의 아디보 (ADIBO)기와 결합시킨 상기 화학식 5' 또는 화학식 5″의 복합체의 제조는 하기 반응식 5 및 6에 나타낸 바와 같이 수행될 수 있으며, 구체적인 반응 조건은 통상의 기술자가 적절한 조건을 선택할 수 있다.
[반응식 5]
Figure pat00030
[반응식 6]
Figure pat00031
또한 본 발명은 상기 화학식 5a 화합물과 아디보 (ADIBO)기가 도입된 결합성분이 결합된 복합체를 제공한다. 보다 구체적으로, 상기 결합성분은 하기 화학식 5b에 나타낸 바와 같이 항체일 수 있다.
[화학식 5b]
Figure pat00032
상기 화학식 5b에서, X는 I-123, I-124, I-125, I-131, At-211 또는 Br-76이나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 화학식 5b에서, 항체는 방사면역 치료 또는 진단에 사용될 수 있는 임의의 항체가 사용될 수 있으며, 이러한 항체의 예로는 리툭시맙, 트라스투주맙 (Herceptin), 세툭시맙, 파니투무맙, 베바시주맙, 사투모맙, 아크리투모맙, 이브리투모맙, 또는 토시투모맙 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 방사면역 치료 또는 진단의 종류는 사용되는 항체의 종류 및 방사성 할로겐 원소의 종류에 따라 달라질 수 있다.
또한 본 발명에 따른 상기 화학식 5a 화합물과 아디보 (ADIBO)기가 도입된 결합성분이 결합된 복합체에서, 상기 결합성분은 하기 화학식 5b'에 나타낸 바와 같이 세포투과성 펩타이드일 수 있다.
[화학식 5b']
Figure pat00033
상기 화학식 5b'에서, X는 I-123, I-124, I-125, I-131, At-211 또는 Br-76이나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 화학식 5b'에서, 펩타이드는 세포투과성을 가지는 임의의 펩타이드가 사용될 수 있으며, 이러한 펩타이드의 예로는 주로 세포표면에 존재하는 수용체에 특이적으로 결합하는 것으로 소마토스타틴, 봄베신, Substance P, RGD 유도체, TAT 또는 뉴로텐신이 있고, 바람직하게는 TAT일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 사용되는 펩타이드는 사용목적 및 방사성 할로겐 원소의 종류에 따라 달라질 수 있다.
상기 항체 또는 세포투과성 펩타이드는 하기 화학식 6으로 표시되는 화합물과 결합함으로써, 아디보 (ADIBO)기가 도입될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 도입의 구체적인 반응 조건은 통상의 기술자가 적절한 조건을 선택할 수 있다.
[화학식 6]
Figure pat00034
상기 화학식 5a의 화합물을 항체 또는 세포투과성 펩타이드의 아지도 (Azido-, N3) 기와 결합시킨 상기 화학식 5b 또는 화학식 5b'의 복합체의 제조는 하기 반응식 7 및 8에 나타낸 바와 같이 수행될 수 있으며, 구체적인 반응 조건은 통상의 기술자가 적절한 조건을 선택할 수 있다.
[반응식 7]
Figure pat00035
[반응식 8]
Figure pat00036
본 발명자들은 실시예를 통해 본 발명에 따른 방사성 할로겐 표지용 링커화합물이 도입된 펩타이드가 혈액 내 백혈구를 효과적으로 표지할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 일실시예에서는, 3-(트리부틸스탄일)벤조산과 아디보-아민 (ADIBO-amine)을 반응시켜 방사성 할로겐이 표지된 복합체 제조용 링커화합물의 전구체 및 방사성 할로겐이 표지된 복합체 제조용 링커화합물를 합성하였다 (실시예 1 및 2 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 3-아디보-3-옥소프로필-3'-(트리부틸스탄일) 벤조아마이드와 azido-TAT를 클릭반응을 통해 결합시켜 방사성 할로겐이 표지된 세포투과성 링커화합물을 합성하였다 (실시예 3 및 4 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 본 발명에 따른 125I-TAT가 적절한 표지 효율을 달성하기 위해서는 정상인의 백혈구 3.5 ~ 11 x 106 개/mL에 표지되어야 함을 확인하였다. 이를 혈액의 양으로 환산하면 5 내지 10 mL의 혈액 내 백혈구를 표지해야 한다는 것인데, 이는 99mTc-HMPAO가 적절한 표지 효율을 달성하기 위해 백혈구 2 x 108 개/mL에 표지되어야 하는 것 (51 mL의 혈액 필요)과 비교 시 본 발명에 따른 125I-TAT가 백혈구에 대한 표지에 있어서 효율성이 우수함을 확인한 것이다 (실시예 5 참조).
이에, 본 발명은 상기 복합체를 포함하는, 방사면역 치료 또는 진단용 조성물을 제공한다.
상기 방사면역 치료 또는 진단용 조성물은 화학식 1', 화학식 1″, 화학식 1b 또는 화학식 1b'를 기준으로 각각 사용된 항체, 세포투과성 펩타이드, 방사성 할로겐의 종류, 치료 또는 진단하고 하는 질병의 종류에 따라 적절한 양을 투여할 수 있으며, 이는 통상의 기술자에게 공지된 지식 및 통상적인 실험으로 통해, 통상의 기술자가 적절히 결정할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 복합체를 포함하는, 조영제를 제공한다.
상기 본 발명에 따른 방사면역 치료 또는 진단용 조성물 및 조영제는 주사제로서 제제화될 수 있으며, 주사제로 제제화될 경우 혈액과 등장인 무독성 완충용액을 희석제로서 포함할 수 있으며, 예를 들어 pH 7.4의 인산완충용액 등이 있다. 상기 조영제는 완충용액 이외에 기타 다른 희석제 또는 첨가제를 포함할 수 있다. 이러한 주사제에 부가될 수 있는 부형제 및 첨가제는 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 널리 공지되어 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 화학식 1로 표시되는 화합물의 합성방법
Figure pat00037
도 1에 나타낸 화학식 1로 표시되는 3-아디보-3-옥소프로필-3'-(트리부틸스탄일) 벤조아마이드 [3-ADIBO-3-oxopropyl-3'-(tributylstannyl)benzamide]를 합성하는 방법은 하기와 같다.
Ar(g) 하에서 3-(트리부틸스탄일)벤조산 (3-(tributylstannyl)benzoic acid), (70 mg, 0.170 mmol), 아디보-아민 (ADIBO-amine) (56.5 mg, 0.204 mmol), TBTU (71 mg, 0.221 mmol) 그리고 HOBt (30 mg, 0.221 mmol)를 Rb에 넣고 무수 DMF (1 mL)과 DIEA (44.4 uL, 0.255 mmol)을 가해 상온에서 4시간 동안 교반하였다. 디클로로메탄 (dichloromethane)/NH4Cl 포화수용액으로 추출을 하여 유기층을 얻고 NaHCO3 포화수용액으로 씻어준 후 무수 Na2SO4 Pad에 통과시켜, 남은 수분을 제거한 후, 감압하였다. Silicagel Flash Column Chromatography (40% EtOAc/Hexane)를 수행하여 96 mg (yellow sticky oil, 84 %)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3); δ 7.88-7.77 (m, 1 H), 7.69 (d, 1 H, J = 7.6 Hz), 7.60-7.50 (m, 1 H), 7.42-7.28 (m, 7 H), 7.17 (dd, 1 H, J = 7.6, 1.2 Hz), 6.74 (t, 1 H, J = 6.0 Hz), 5.15 (d, 1 H, J = 14.0 Hz), 3.70 (d, 1 H, J = 14.0 Hz), 3.63-3.55 (m, 1 H), 3.47-3.39 (m, 1 H), 2.63-2.56 (m, 1 H), 2.09-2.02 (m, 1 H), 1.56-1.48 (m, 6 H), 1.38-1.29 (m, 6 H), 1.16-0.99 (m, 6 H), 0.89 (t, 9 H, J = 7.2 Hz) ); 13C NMR (100 MHz, CDCl3); δ 172.3, 167.8, 151.0, 147.9, 142.7, 139.3, 135.1, 133.8, 132.0, 129.0, 128.5, 128.4, 128.2, 127.7, 127.6, 127.2, 126.0, 125.6, 122.9, 122.6, 114.8, 107.7, 55.5, 35.6, 34.8, 29.0, 27.3, 13.7, 9.6; ESI-MS [M+H]+ = 671.3
프로토콜은 다음과 같다.
<Prep-HPLC condition>
1) Instrument: Varian Prostar LC
2) 유속: 10 mL/min
3) UV lamp: 214 nm
4) Column: YMC ODS-A, C18 250x20 mm, 5 μm particle size
5) 이동상:
Figure pat00038
6) 주입부피: 0.6 mL씩 5번 수행
7) 컬럼 체류시간 (Retention time): 7.0-8.2 min
< HPLC condition>
<순도 (HPLC)> : > 99.0% at 254 nm (t=4.7 min)
1) 시험 샘플 용액
시험 물질 1 mg을 칭량하여 물 1mL에 용해시켰다.
2) 이동상
아세토나이트릴 2 L 및 0.1 % TFA 물 2 L를 나일론 멤브레인 필터를 통해 여과하였으며 (0.2 m pore size), 30분에 걸쳐 탈기 (degassing)하였다.
3) 이동상 조건
Figure pat00039
4) 크로마토그래피 시스템
a) Instrument: Varian Prostar LC
b) Column: Waters, X-Bridge C18 (4.6 x 250 mm, 5 μm particle size)
c) Loop 크기: 25 μL
d) 검출기: UV, 214 nm
e) 유속: 1 mL/min
f) 주입 부피: 25 μL
실시예 2. 화학식 1a로 표시되는 화합물의 합성방법
Figure pat00040
상기 제조방법의 구체적인 반응조건은 유기화학에 관한 통상의 지식을 가진 자가 당해 기술분야에 공지된 기술에 기초하여 적절히 선택할 수 있으며, 상기 방사성 할로겐은 예를 들어, I-123, I-124, I-125, I-131, At-211, 또는 Br-76 등이 있다. 상기 화학식 1의 화합물은 3-(트리부틸스탄일)벤조산 (3-(tributylstannyl)benzoic acid), 아디보-아민 (ADIBO-amine)을 반응시키는 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있으며, 화학식 1a의 제조의 일 구현예에 따르면, 상기 반응은 실온에서 이루어질 수 있고 반응시간은 약 30 분 동안 수행할 수 있다.
실시예 3. 화학식 A로 표시되는 Bu 3 Sn-TAT의 합성방법
Figure pat00041
Azido-TAT (70 mg, 0.0483 mmol)와 3-아디보-3-옥소프로필-3'-(트리부틸스탄일) 벤조아마이드 (3-ADIBO-3-oxopropyl-3'-(tributylstannyl)benzamide) (64.7 mg, 0.0966 mmol)를 물 (1.5 mL)과 아세토나이트릴 (acetonitrile) (1.5 mL)에 녹여 4시간 동안 상온에서 교반 후 HPLC-Prep을 수행하여 생성물을 얻은 다음, 동결 건조하여 21 mg (pale yellow solid, 21%)을 얻었다.
ESI-MS : 707.7[M+3H]3+(100), 531.1[M+4H]4+(90), 1061.6[M+2H]2+(35)
프로토콜은 다음과 같다.
<Prep-HPLC condition>
1) Instrument: Varian Prostar LC
2) 유속: 10 mL/min
3) UV lamp: 214 nm
4) Column: YMC ODS-A, C18 250x20 mm, 5 μm particle size
5) 이동상:
Figure pat00042
6) 주입부피: 0.6 mL씩 5번 수행
7) 컬럼 체류시간 (Retention time): 7.0-8.2 min
프로토콜은 다음과 같다.
< HPLC condition>
<순도 (HPLC)> : > 99.0% at 254 nm (t=4.7 min)
1) 시험 샘플 용액
시험 물질 1 mg을 칭량하여 물 1mL에 용해시켰다.
2) 이동상
아세토나이트릴 2 L 및 0.1 % TFA 물 2 L를 나일론 멤브레인 필터를 통해 여과하였으며 (0.2 m pore size), 30분에 걸쳐 탈기 (degassing)하였다.
3) 이동상 조건
Figure pat00043
4) 크로마토그래피 시스템
a) Instrument: Varian Prostar LC
b) Column: Waters, X-Bridge C18 (4.6 x 250 mm, 5 μm particle size)
c) Loop 크기: 25 μL
d) 검출기: UV, 214 nm
e) 유속: 1 mL/min
f) 주입 부피: 25 μL
실시예 4. 화학식 B로 표시되는 125 I-TAT 펩타이드의 합성방법
Figure pat00044
먼저, 화학식 B로 표시되는 3-아디보-3-옥소프로필-3'-아이오도벤즈아이드 (3-ADIBO-3-oxopropyl-3'-iodobenzamide)는 Ar(g) 하에서 3-아이오도벤조산 (3-Iodobenzoic acid) (42.5 mg, 0.171 mmol), 아디보-아민 (ADIBO-amine) (43 mg, 0.156 mmol), TBTU (64.9 mg, 0.202 mmol) 그리고 HOBt (27.3 mg, 0.202 mmol)를 Rb에 넣고 무수 DMF (2 mL)와 DIEA (40.7 uL, 0.233 mmol)를 가해 상온에서 4시간 동안 교반하였다. 에틸아세테트 (Ethylacetate)/NH4Cl 포화수용액으로 추출을 하여 유기층을 얻고 NaHCO3 포화수용액으로 씻어준 후 무수 Na2SO4 Pad에 통과시켜, 남은 수분을 제거한 후, 감압하였다. Silicagel Flash Column Chromatography (60% EtOAc/Hexane)를 수행하여 50 mg (pale yellow foamy solid, 63%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3); δ 7.96 (t, 1 H, J = 1.2 Hz), 7.80-7.77 (m, 1 H), 7.69 (d, 1 H, J = 8.0 Hz), 7.43-7.28 (m, 7 H), 7.15 (dd, 1 H, J = 7.6, 1.2 Hz), 7.08 (t, 1 H, J = 7.8 Hz), 6.69 (t, 1 H, J = 5.8 Hz), 5.15 (d, 1 H, J = 13.6 Hz), 3.70 (d, 1 H, J = 14.0 Hz), 3.56-3.38 (m, 2 H), 2.57-2.50 (m, 1 H), 2.11-2.04 (m, 1 H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3); δ 172.1, 165.5, 150.9, 147.8, 140.0, 136.4, 136.0, 132.0, 129.9, 128.9, 128.5, 128.4, 128.2, 127.8, 127.2, 125.9, 125.5, 122.7, 122.5, 114.7, 107.6, 94.1, 55.5, 35.8, 34.6; ESI-MS [M+H]+ = 507.0 (detection 되긴 하나 Main peak로 나오지 않음)
그 다음으로, 화학식 C로 표시되는 I-TAT는 Azido-TAT (30 mg, 0.0207 mmol)와 3-아디보-3-옥소프로필-3'-아이오도벤조아마이드 (3-ADIBO-3-oxopropyl-3'-iodobenzamide (18.8 mg, 0.0372 mmol)를 물(0.5 mL)과 아세토나이트릴 (acetonitrile) (0.5 mL)에 녹여 4시간 동안 상온에서 교반 후 HPLC-Prep을 수행하여 생성물을 얻은 다음 동결 건조하여 20 mg (white solid, 49%)을 얻었다.
ESI-MS : 979.3[M+2H]2+(100), 653.2[M+3H]3+(80), 392.3[M+5H]5+(58)
프로토콜은 다음과 같다.
<Prep-HPLC condition>
1) Instrument: Varian Prostar LC
2) 유속: 10 mL/min
3) UV lamp: 214 nm
4) Column: YMC ODS-A, C18 250x20 mm, 5 μm particle size
5) 이동상:
Figure pat00045
6) 주입부피: 0.15 mL 씩 7 번 수행
7) 컬럼 체류시간 (Retention time): 6.3-6.9 min
< HPLC condition>
<순도 (HPLC)> : > 99.0% at 254 nm (t=10.40 min)
1) 시험 샘플 용액
시험 물질 1 mg을 칭량하여 물 1mL에 용해시켰다.
2) 이동상
아세토나이트릴 2 L 및 0.1 % TFA 물 2 L를 나일론 멤브레인 필터를 통해 여과하였으며 (0.2 m pore size), 30분에 걸쳐 탈기 (degassing)하였다.
3) 이동상 조건
Figure pat00046
4) 크로마토그래피 시스템
a) Instrument: Varian Prostar LC
b) Column: Waters, X-Bridge C18 (4.6 x 250 mm, 5 μm particle size)
c) Loop 크기: 25μL
d) 검출기: UV, 214 nm
e) 유속: 1 mL/min
f) 주입 부피: 20 μL
실시예 5. 125 I-TAT 펩타이드를 사용하여 백혈구의 표지 가능여부의 확인
5-1. I-TAT의 물 속 안정성을 확인
다양한 온도 조건 (-20℃, 4℃, 40℃)에서 I-TAT의 물 속 안정성을 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 상기 모든 온도 조건에서, 80일까지 안정도가 80 % 이상 유지되는 것을 확인하였다.
5-2. I-TAT의 세포독성 확인
I-TAT의 농도의존적 (1 내지 10000 nM) 세포독성을 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 효과적인 비교를 위해 독소루비신의 농도의존적 세포독성을 함께 측정하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 독소루비신이 100 nM 이상의 농도에서 absorbance가 급격히 감소함에 비해, 본 발명에 따른 I-TAT는 상기 모든 농도 조건에서 유사한 수준의 absorbance를 유지함을 확인하였다.
5-3. 125 I-TAT 펩타이드를 사용하여 백혈구의 표지
125I-TAT를 사용하여 백혈구를 표지하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 본 발명에 따른 125I-TAT가 적절한 표지 효율을 달성하기 위해 정상인의 백혈구 3.5 ~ 11 x 106 개/mL에 표지되어야 함을 확인하였다. 이를 혈액의 양으로 환산하면 5 내지 10 mL 의 혈액 내 백혈구를 표지 해야 한다는 것이다. 이는 99mTc-HMPAO가 적절한 표지 효율을 달성하기 위해 백혈구 2 x 108 개/mL에 표지되어야 하는 것 (51 mL의 혈액 필요)과 비교하면, 본 발명에 따른 125I-TAT가 99mTc-HMPAO와 비교하는 경우, 백혈구에 대한 현저한 표지효율의 차이를 나타냄을 확인할 수 있다.
실시예 6. 화학식 5로 표시되는 화합물의 합성방법
Figure pat00047
6-1. 3-(tributylstannyl)benzoic acid (d)의 합성
Ar(g) 하에서 3-Iodobenzoic acid (496 mg, 2.0 mmol)를 NMP (1-Methyl-2-pyroolidinone) 3 mL에 녹이고, Bis(triphenylphosphine)-palladium(II) dichloride (70 mg, 0.1 mmol) 와 KOAc (589 mg, 6.0 mmol)를 순차적으로 가하고 교반하였다. 10분 후 Bis(tributyltin) (2.52 mL, 5.0 mmol)을 적가하고 상온에서 16시간 동안 교반을 시켰다. Celite로 필터 후, 감압 하에서 용매를 제거하였다. 반응혼합물을 소량의 EtOAc를 가해 녹이고 2 M KF(aq.) 10 mL를 가하여 1시간 동안 교반 후, 생성된 고체를 Celite를 통과시켜 filter하여 제거하였다. EtOAc로 추출하고 유기층을 무수 Na2SO4로 수분을 제거한 후, 감압 하에서 용매를 제거하였다. Silica-gel Flash Column Chromatography (30% EtOAc/Hexane)를 수행하여 417 mg (Dark brown oil, 51 %) 의 상기 그림의 d 화합물을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3); δ 8.21 (s, 1 H, J Sn-C-C-H= 38.0 Hz), 8.04 (d, 1 H, J = 8.0 Hz), 7.71 (d, 1 H, J = 7.2 Hz, J Sn-C-C-H= 35.0 Hz), 7.43 (t, 1 H, J = 7.4 Hz), 1.64-1.45 (m, 6 H), 1.39-1.26 (m, 6 H), 1.19-1.02 (m, 6 H), 0.90 (t, 9 H, J = 7.4 Hz) ); 13C NMR (100 MHz, CDCl3); δ 172.3, 142.8, 141.8, 137.9, 129.8, 128.5, 127.8, 29.0, 27.3, 13.6, 9.7; ESI-MS [M-] = 411.2
6-2. 화학식 5로 표시되는 화합물의 합성방법 (N-(3-azidopropyl)-3-(tributylstannyl)benzamide (5))
Ar(g) 하에서 3-(tributylstannyl)benzoic acid(1) (345 mg, 0.84 mmol)과 TBTU (350 mg, 1.09 mmol), HOBt (147 mg, 1.09 mmol)를 Rb에 넣고 무수 dichloromethane (4 mL)과 DIEA (0.22 mL, 1.26 mmol)을 가해 10분 동안 상온에서 교반하였다. 3-Azidopropylamine (92.4 mg, 0.92 mmol)을 dichloromethane 1 mL에 녹인 용액을 적가하고 상온에서 5 시간 동안 교반하였다. Dichloromethane/sat. NaHCO3 추출을 하고 유기층 무수 Na2SO4로 수분을 제거한 후, 감압 하에서 용매를 제거한다. Silica-gel Flash Column Chromatography (30% EtOAc/Hexane)를 수행하여 350 mg (Colorless oil, 85%) 의 화합물 5를 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3); δ 7.86 (s, 1 H, J Sn-C-C-H= 38.0 Hz), 7.65-7.62 (m, 1 H), 7.59 (d, 1 H, J = 7.6 Hz), 7.39-7.35 (m, 1 H), 6.37 (brs, 1 H), 3.56 (q, 2 H, J = 6.4 Hz), 3.46 (t, 2 H, J = 6.4 Hz), 1.92 (quint, 2 H, J = 6.4 Hz), 1.60-1.46 (m, 6 H), 1.37-1.28 (m, 6 H), 1.17-1.02 (m, 6 H), 0.88 (t, 9 H, J = 7.4 Hz) ); 13C NMR (100 MHz, CDCl3); δ 168.2, 143.0, 139.6, 134.6, 133.6, 127.8, 126.2, 49.6, 37.8, 29.0, 28.7, 27.3, 13.6, 9.6; ESI-MS [M+H]+ = 495.3
< HPLC condition>
<순도 (HPLC)> : 99.6% at 254 nm (t=7.90 min)
1) 시험 샘플 용액
시험 물질 1 mg을 칭량하여 CH3CN 1 mL에 용해시켰다.
2) 이동상
아세토나이트릴 2 L 및 0.1 % TFA 물 2 L를 나일론 멤브레인 필터를 통해 여과하였으며 (0.2 m pore size), 30분에 걸쳐 탈기 (degassing)하였다.
3) 이동상 조건
Figure pat00048
4) 크로마토그래피 시스템
a) Instrument : Varian 920 LC)
b) Column SKY PACK C18 (4.6 x 250 mm, 5 μm particle size)
c) Loop 크기: 25 μL
d) 검출기: UV, 254 nm
e) 유속: 1 mL/min
f) 주입 부피: 20 μL
실시예 7. 화학식 5a로 표시되는 화합물의 합성방법
Figure pat00049
Ar(g) 하에서 3-Iodobenzoic acid (50 mg, 0.20 mmol), TBTU (83 mg, 1.30 mmol), HOBt (35 mg, 1.30 mmol)를 dichloromethane (7 mL)에 녹인 후, diisopropylamine (0.05 mL, 1.5 mmol)을 넣고 10분 동안 교반하였다. 3-Azidopropyamine (24 mg, 1.2 mmol)을 dichloromethane (1 mL)에 녹인 용액을 적가하고, 7시간 동안 교반하였다. 유기층을 sat. NaHCO3로 추출을 하고 유기층 무수 Na2SO4로 수분을 제거한 후, 감압 하에서 용매를 제거하였다. Silica-gel Flash Column Chromatography (20 내지 30% EtOAc/Hexane)를 수행하여 42 mg (White solid, 64%)의 화합물 5a를 얻었다.
1H NMR (CDCl3, 400 MHz); δ = 8.10-8.09 (m, 1 H) , 7.84-7.82 (m, 1 H), 7.72-7.69 (m, 1 H), 7.18 (t, J = 7.6 Hz, 1 H), 6.37 (br, 1 H), 3.55 (q, J = 6.4 Hz, 2 H), 3.45 (t, J = 6.8 Hz, 2 H), 1.91 (quint, J = 6.4 Hz, 2 H); ESI-MS [M+H]+ = 331.2
.
< HPLC condition>
<순도 (HPLC)> : 99.6% at 254 nm (t=14.56 min)
1) 시험 샘플 용액
시험 물질 1 mg을 칭량하여 CH3CN 1 mL에 용해시켰다.
2) 이동상
아세토나이트릴 2 L 및 0.1 % TFA 물 2 L를 나일론 멤브레인 필터를 통해 여과하였으며 (0.2 m pore size), 30분에 걸쳐 탈기 (degassing)하였다.
3) 이동상 조건
Figure pat00050
4) 크로마토그래피 시스템
a) Instrument : Varian 920 LC)
b) Column SKY PACK C18 (4.6 x 250 mm, 5 μm particle size)
c) Loop 크기: 25 μL
d) 검출기: UV, 254 nm
e) 유속: 1 mL/min
f) 주입 부피: 20 μL
실시예 8. ADIBO-Rituximab 항체의 합성
Rituximab 항체의 N-glycan을 제거하기 위해 PNGase F 효소로 제거 반응 후, LC-TOF를 이용 deglycosylated rituximab의 분자량을 분석하여 약 144,211임을 확인하였다. 상기 deglycosylated rituximab의 LC-TOF 스펙트럼을 도 5에 나타내었다.
상기 Rituximab 에 상기 화학식 6의 ADIBO-NHS를 1:24 몰비로 반응시킨 것을 PNGase F 처리하여 분자량을 측정하니, 항체에 ADIBO- 가 0~6개 까지 결합되었고, 평균적으로 2~3개가 결합된 것을 확인하였다. ADIBO-Rituximab 에 대해 측정한 LC-TOF 스펙트럼을 도 6에 나타내었다.
실시예 9. 125 I-azide 의 합성
실시예 6에서 제조한 Bu3Sn-azide에 125I 방사성 동위원소를 산화반응시켜 화학식 5a의 125I-azide를 만든 후, 방사선 검출기가 장착된 radio-HPLC로 분석 및 정제과정을 진행하였다. 정제된 125I-azide에 DMSO로 추출하여 하기 실시예 10의 표지반응에 사용하였다. 본 실시예에서 합성된 125I-azide의 방사선 검출 크로마토그램을 도 7에 나타내었다.
실시예 10. 125 I-Rituximab의 합성
실시예 8에서 합성한 ADIBO-Rituximab 을 0.1M PBS pH 7.2 상에서 실시예 9 에서 합성한 125I-azide와 37℃에서 4 시간까지 클릭 반응을 진행하며, 실리카겔이 도포된 ITLC 용지에 점적하여 시간 경과에 따른 표지 수율을 확인하였다. 시간은 30분, 1시간, 2시간, 4시간으로 각 시간 간격마다 n=3으로 진행하였다. 이렇게 측정한 표지 수율을 도 8에 나타내었다. 도 8에서 알 수 있듯이 37℃에서 2시간 반응부터는 90% 이상이었고, 4시간에서는 약 97%로 나타났다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.

Claims (13)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물:
    [화학식 1]
    Figure pat00051
  2. 하기 화학식 1a로 표시되는 화합물:
    [화학식 1a]
    Figure pat00052

    여기서, X는 방사성 할로겐이다.
  3. 하기 화학식 5로 표시되는 화합물:
    [화학식 5]
    Figure pat00053
  4. 하기 화학식 5a로 표시되는 화합물:
    [화학식 5a]
    Figure pat00054

    여기서, X는 방사성 할로겐이다.
  5. 제2항 또는 제4항에 있어서,
    상기 X는 I-123, I-124, I-125, I-131, At-211 또는 Br-76인, 화합물.
  6. 하기의 단계를 포함하는, 화학식 1a로 표시되는 화합물의 제조방법:
    1) 하기의 화학식 2의 3-(트리부틸스탄일)벤조산 (3-(tributylstannyl)benzoic acid)을 화학식 3와 반응시키는 단계; 및
    2) 상기 단계 1)의 생성물과 MX를 반응시키는 단계.
    여기서, M은 Na이고, X는 방사성 할로겐이다.
    [화학식 2]
    Figure pat00055

    [화학식 3]
    Figure pat00056
  7. 제6항에 있어서,
    상기 X는 I-123, I-124, I-125, I-131, At-211 또는 Br-76인, 화합물의 제조방법.
  8. 3-아이오도벤조산 (3-Iodobenzoic acid)과 3-아지도프로필아민 (3-Azidopropylamine)을 반응시키는 단계를 포함하는, 화학식 5a로 표시되는 화합물의 제조방법.
  9. 제2항에 따른 화학식 1a 화합물과 N3기가 도입된 결합성분이 결합된 복합체.
  10. 제4항에 따른 화학식 5a 화합물과 아디보 (ADIBO)기가 도입된 결합성분이 결합된 복합체.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    상기 결합성분은 항체 또는 세포투과 펩타이드인 것을 특징으로 하는, 복합체.
  12. 제9항 또는 제10항에 따른 복합체를 포함하는, 방사면역 치료 또는 진단용 조성물.
  13. 제9항 또는 제10항에 따른 복합체를 포함하는, 조영제.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN103239737A (zh) * 2013-04-27 2013-08-14 深圳先进技术研究院 荧光造影剂及其制备方法
KR20150042097A (ko) * 2013-10-10 2015-04-20 한국원자력의학원 방사면역접합체 또는 방사표지펩티드 제조용 링커 화합물 및 그 제조방법

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Organic & Biomolecular Chemistry, (2011) Vol 9, pp. 7393-7399* *

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