KR101898106B1

KR101898106B1 - 치올과 특이적으로 결합하는 dtpa 킬레이터 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101898106B1
Application number: KR1020170084166A
Authority: KR
Inventors: 최선주; 홍영돈; 정성희
Original assignee: 한국원자력연구원
Priority date: 2017-07-03
Filing date: 2017-07-03
Publication date: 2018-09-12

Abstract

본 발명은 시스테인(Cysteine, C) 잔기에 특이적인 DTPA 킬레이터 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게 본 발명은 하기 화학식(I)로 표현되는 DTPA 킬레이터, 이의 제조방법, DTPA 킬레이터가 단백체의 아미노산 서열 중 적어도 하나의 시스테인(Cysteine, C) 잔기에 접합된 단백체- DTPA 킬레이터 접합체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

상기 식에서, l은 0 내지 20의 정수이며,
R₁ 및 R₂는 수소 및 C_1- ₃알킬로 이루어진 그룹으로부터 각각 독립적으로 선택되거나,
R₁ 및 R₂는 함께 연결되어 시클로헥실을 형성한다.

Description

치올과 특이적으로 결합하는 DTPA 킬레이터 및 이의 제조방법{DTPA CHELATOR SPECIFIC FOR THIOL AND METHOD FOR PREPARING THE SAME}

본 발명은 시스테인(Cysteine, C) 잔기 등과 같은 치올(Thiol, SH)에 특이적으로 결합하는 DTPA 킬레이터 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 단백체를 구성하는 아미노산의 하나인 시스테인(Cysteine, C)을 단백체 내에 서열 선택적으로 도입하여 방사성 동위원소를 활용한 암 등 질환의 진단 및 치료에 적용될 수 있도록 하는 말레이미드(maleimide)기를 보유하고 있는 DTPA 킬레이터 및 이의 새로운 합성 방법에 관한 것이다.

항체, 항체 절편, 단백질 등과 같은 단백체에 방사성 동위원소 표지를 수행하기 위해 사용되는 킬레이터의 경우 단백체 내 존재하는 리신(Lysine)의 잔기에 있는 아민 등과 반응하기 쉬운 반응기를 갖는 킬레이터를 활용하여 접합하는 방법이 사용되고 있다.

예를 들어, 킬레이터는 항체 등과의 접합을 통한 암 등의 치료를 위하여 치료용 방사성동위원소인 Pb-212, Bi-213, Th-232 등의 알파 핵종과 Sc-47, Y-90, Sm-153, Ho-166, Lu-177, Re-188 등과 같은 베타 방출 핵종을 표지할 수 있으며, 또한 진단을 위한 진단용 방사성 동위원소인 Sc-44, Ga-68, Zr-89 등의 양전자 방출 핵종과 Ga-67, Tc-99m, In-111 등 같은 감마 방출 핵종을 표지할 수 있다.

그러나, 아민과 반응하는 킬레이터의 경우 단백체 내 선택적인 서열에 접합되는 것이 아니고, 단백체 내 존재하는 리신(Lysine) 등이 갖고 있는 아민(NH₂)에 무작위로 결합되어 분자 간 구조가 달라질 수 있고, 이에 따라 표적 선택적 물질의 표적과의 결합 활성이 떨어질 수 있으며 분자 간에 동일한 활성을 나타내지 않을 가능성이 있다.

특히, 활성부위 또는 활성부위의 결합을 방해하는 부위에 킬레이터가 결합되는 경우 단백체의 표적능을 상실할 수 있는 문제도 있다. 나아가, 동일한 방법으로 제조하더라도 제조된 각 배치(Batch) 또는 바이알 마다 다른 활성을 나타낼 가능성도 있다.

따라서, 단백체의 구성성분 중의 하나인 특정 아미노산을 단백체의 활성 부위에 영향을 주지 않는 곳에 선택적으로 킬레이터를 접합하여 방사성동위원소를 표지 할 수 있는 킬레이터가 개발되는 경우 단백체의 고유 표적능 등의 활성에 대한 저해 문제를 해결할 수 있으므로, 관련 분야에서 널리 적용될 수 있을 것으로 기대된다.

한국공개제2016-0088024호

본 발명의 한 측면은 아미노산 잔기 중 시스테인(Cysteine, C) 잔기와 같은 치올(Thiol, SH)에 특이적으로 결합하는 DTPA 킬레이터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 측면은 이와 같은 DTPA 킬레이터가 단백체에 접합된 단백체- DTPA 킬레이터 접합체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 이와 같은 단백체- DTPA 킬레이터 접합체의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 이와 같은 DTPA 킬레이터의 새로운 합성 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 DTPA 킬레이터가 접합된 물질로서 진단제 및 치료제를 제공하는 것이다.

본 발명의 일 견지에 의하면, 하기 화학식(I)로 표현되며,

상기 식에서, l은 0 내지 20의 정수이며,

R₁ 및 R₂는 수소 및 C_1- ₃알킬로 이루어진 그룹으로부터 각각 독립적으로 선택되거나,

R₁ 및 R₂는 함께 연결되어 시클로헥실을 형성하는, DTPA 킬레이터가 제공된다.

본 발명의 다른 견지에 의하면, 본 발명의 DTPA 킬레이터가 아미노산 서열 중 적어도 하나의 시스테인(Cysteine, C) 잔기에 접합된, 단백체- DTPA 킬레이터 접합체가 제공된다.

본 발명의 또 다른 견지에 의하면, 단백체와 본 발명의 DTPA 킬레이터를 단백체 1 당량을 기준으로 DTPA 킬레이터를 1 당량 내지 3 당량의 비율로 혼합하여 4 내지 50℃의 온도에서 10분 내지 48시간 반응시키는 단계를 포함하는, 단백체- DTPA 킬레이터 접합체의 제조방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 견지에 의하면, 하기 화학식 (a) 화합물과 하기 화학식 (b1), (b2), (b3) 및 (b4) 중 적어도 하나의 (b) 화합물을 반응시키는 단계를 포함하는, 상기 화학식(I)의 DTPA 킬레이터를 제조하는 방법이 제공된다:

화학식 (b)

상기 화학식 (a) 및 화학식 (I)에서, l은 0 내지 20의 정수이며,

상기 화학식 (b) 및 화학식 (I)에서, R₁ 및 R₂는 수소 및 C_1- ₃알킬로 이루어진 그룹으로부터 각각 독립적으로 선택되거나, R₁ 및 R₂는 함께 연결되어 시클로헥실을 형성한다.

본 발명의 또 다른 견지에 의하면, 상기 단백체- DTPA 킬레이터 접합체를 포함하는 적어도 하나의 시스테인(Cysteine, C)을 포함하는 아미노산 서열을 포함하며, 적어도 하나의 시스테인에 본 발명의 DTPA 킬레이터가 접합된암 진단제 및 치료제가 제공된다.

본 발명에 의하면, 아미노산 잔기 중 시스테인(Cysteine, C) 잔기와 같은 치올(Thiol, SH)에 특이적으로 결합하는 DTPA 킬레이터 및 이의 새로운 합성 방법을 획득할 수 있다. 본 발명의 킬레이터는 생리활성 물질에 있어서 활성 저하를 최소화 할 수 있는 위치에 시스테인(Cysteine, C)을 도입하여 서열 선택적으로 DTPA 킬레이터를 접합할 수 있으므로, 본 발명의 DTPA 킬레이터는 펩타이드 및 이의 유사체, 기존 항체 치료제 및 이의 절편, E-Coli, 세포 등을 활용하여 제조된 단백체를 활용하여 새로운 방사성의약품을 개발하기 위한 연구 개발 등에 널리 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 Cck-2 수용체 표적 펩타이드 관련 펩타이드 접합 물질 제조 결과 HPLC(a) 및 질량분석(b) 결과를 나타낸 것이다.
도 2(a)은 6X-히스티딘 표지(Histidine tagged) Annexin V 단백체 서열정보와 본 발명의 DTPA 킬레이트가 결합된 6X-히스티딘 표지(Histidine tagged) Annexin V 단백체에 접합된 위치를 나타낸 것이다. 도 2(b)는 DTPA 킬레이트가 결합된 6X-히스티딘 표지(Histidine tagged) Annexin V 단백체에 접합된 물질의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다.
도 3(a)는 DTPA 킬레이트가 결합된 6X-히스티딘 표지(Histidine tagged) Annexin V 단백체, 도 3(b)는 DTPA 킬레이트가 결합된 6X-히스티딘 표지(Histidine tagged) Annexin V 단백체에 금속 방사성 동위원소를 표지된 것을 나타낸 것이다.
도 4는 킬레이터에 대한 방사성 동위원소 표지결과를 나타낸 것이다.
도 5는 킬레이터 접합 펩타이드에 대한 방사성 동위원소 표지결과를 나타낸 것이다.
도 6은 킬레이터 결합된 6X-히스티딘 표지(Histidine tagged) Annexin V 단백체에 대한 방사성 동위원소 표지 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 화합물 6(화학식 II 화합물)의 HPLC 데이터(a) 및 질량분석 데이터(b)를 나타낸 것이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시 형태를 설명한다. 그러나, 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 의하면 수용액 상 실온의 조건에서 이루어지는 반응에서도 용이하게 방사성 동위원소와 결합하며, 표지안정성이 향상될 수 있는, 말레이미드부를 갖는 DTPA계 킬레이터가 제공된다.

본 발명의 DTPA계 킬레이터는 아미노산 서열 중 시스테인(Cysteine, C) 잔기에 특이적으로 결합하는 특성을 갖는다.

보다 상세하게, 본 발명의 DTPA계 킬레이터는 하기 화학식(I)로 표현된다.

상기 식에서, l은 0 내지 10의 정수이다. 이때 l은 바람직하게는 1 내지 10, 보다 바람직하게는 2 내지 5, 예를 들어 3인 것이다. 상기 l이 11 이상의 정수인 경우에는 소수성이 증가하여 염의 형태가 아니면 오일형태로 존재하는 문제가 있다.

한편, 상기 식에서 R₁ 및 R₂는 수소 및 C_1- ₃알킬로 이루어진 그룹으로부터 각각 독립적으로 선택되거나, R₁ 및 R₂는 함께 연결되어 시클로헥실을 형성한다. 보다 바람직하게, 상기 R₁ 및 R₂는 수소 및 메틸로 이루어진 그룹으로부터 각각 독립적으로 선택되거나, R₁ 및 R₂는 함께 연결되어 시클로헥실을 형성한다.

바람직하게, 본 발명의 DTPA 킬레이터는 하기 화학식(IIa) 내지 화학식(IId) 중 어느 하나로 표현되는 것이다.

나아가, 본 발명에 의하면 상기 본 발명의 DTPA 킬레이터가 단백체의 아미노산 서열 중 적어도 하나의 시스테인(Cysteine, C) 잔기에 접합된 단백체- DTPA 킬레이터 접합체가 제공된다.

본 발명의 DTPA 킬레이터는 특히 말레이미드(Maleimide) 부를 포함하므로, 티올(Thiol)부에 특이적으로 결합할 수 있어 아미노산 서열의 구성 요소중 하나가 시스테인(Cysteine, C)을 보유하고 있는 펩타이드 및 단백체에 선택적으로 접합될 수 있다.

한편, 상기 본 발명의 킬레이터 구조와 관련한 화학식에서 명시하지 않았으나, 본 발명의 DTPA 킬레이터의 백본(Back-bone), 탄화수소 고리 등의 탄화수소 사슬에 존재하는 미치환 수소는 본 발명의 DTPA 킬레이터의 구조적 특성에 영향을 주지 않는 범위 내에서, 예를 들어 C_1-8의 알킬기 등으로 치환된 구조를 포함하는 것으로 의도된다.

한편 본 발명의 DTPA 킬레이터에 표지 할 수 있는 방사성 동위원소는 특히 제한되는 것은 아니며, 예를 들어 진단용 방사성 동위원소인 Sc-44, Ga-67, Ga-68, Zr-89, Tc-99m, In-111 등과 치료용 방사성 동위원소인 Sc-47, Y-90, Sm-153, Ho-166, Lu-177, Re-188, Pb-212, Bi-213, Th-232 등을 모두 포함하는 것으로, 특히 본 발명의 DTPA 킬레이터는 이들 방사성동위원소와 실온에서 결합되는 특성을 갖고 있다.

보다 상세하게, 본 발명의 DTPA 킬레이터는 방사성동위원소와 약산성 조건(pH 3~7)의 수용액 상에서 4 내지 50℃의 온도 범위로 5 내외로 반응시켜 방사성동위원소를 안정하게 결합시킬 수 있다.

본 발명의 DTPA 킬레이터는 방사성동위원소에 예를 들어 하기와 같은 화학식(III)의 구조로 표지될 수 있다.

본 발명에 의하면, 상기 본 발명의 DTPA 킬레이터가 단백체의 아미노산 서열 중 적어도 하나의 시스테인(Cysteine, C) 잔기에 접합된 단백체-DTPA 킬레이터 접합체가 제공된다.

본 발명의 DTPA 킬레이터는 시스테인(Cysteine, C) 잔기 등에 존재하는 치올(Thiol) 에 특이적으로 접합되는 것으로, 즉, 단백체 등에 존재하는 치올(Thiol) 1 당량을 기준으로 DTPA 킬레이터가 1 당량이 결합하게 된다.

한편, 여러 시스테인 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 단백체의 경우 화학식(IV)과 같이 시스테인 잔기 당 1개의 본 발명의 DTPA 킬레이터가 접합될 수 있다.

본 발명의 DTPA 킬레이터는 단백체 등의 서열에 시스테인을 생리활성에 영향을 주지 않는 위치에 접합됨으로써 화학식(V)와 같이 방사성 동위원소를 서열 선택적으로 표지할 수 있다.

이때 상기 단백체는 시스테인을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 항체, 항체 유래 단백체, 호르몬, 펩타이드 또는 이들의 조합인 것으로, 시스테인(Cysteine, C)과 같이 치올(Thiol)을 포함하는 물질이라면 특히 제한되지 않는다.

예를 들어, 상기 물질은 서열선택적으로 시스테인(Cysteine, C)을 도입한 아넥신 V, 에피바디(Affibody), 펩타이드 수용체 표적 펩타이드 등과 같이 분자에 치올(Thiol, SH)을 보유하고 있거나 보유할 수 있도록 화학적으로 결합시킨 단백체 및 펩타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다.

한편, 상기 단백체에 포함된 시스테인은 단백체의 활성에 영향이 없는 위치에 추가된 잔기일 수 있으며, DTPA 킬레이터의 접합을 의도하는 단백체의 활성에 영향을 주지 않는 위치에 시스테인 잔기를 추가한 후 본 발명의 DTPA 킬레이터와 접합하여 단백체- DTPA 킬레이터 접합체를 제조할 수 있다.

상기 단백체-DTPA 킬레이터 접합체의 제조방법은 단백체와 상기 본 발명의 DTPA 킬레이터를 혼합하여 4 내지 50℃의 온도에서 10분 내지 48시간 반응시키는 단계를 포함하여 수행된다. 상기 온도와 시간은 접합대상물질의 활성에 저하를 주지 아니하는 조건에서 수행할 수 있으며 반응의 진행을 점검하며 진행하여야 한다.

바람직하게는 상기 단백체와 본 발명의 DTPA 킬레이터를 혼합하여 4 내지 30℃의 온도에서 10분 내지 3시간 반응시키는 것이다.

상기와 같은 단백체-DTPA 킬레이터 접합체의 제조방법에 있어서, 상기 DTPA 킬레이터는 단백체가 보유하고 있는 시스테인(Cysteine, C) 1 당량을 기준으로 1 당량 내지 3 당량의 비율로 혼합되는 것이 바람직하다.

본 발명의 화학식(I)의 DTPA 킬레이터를 제조하는 방법은 하기 화학식 (a) 화합물과 하기 화학식 (b1), (b2), (b3) 및 (b4) 중 적어도 하나의 (b) 화합물을 반응시키는 단계를 포함한다.

화학식 (b)

상기 화학식 (a) 및 화학식 (I)에서, l은 0 내지 20의 정수이며,

상기 화학식 (b) 화합물은 하기 화학식 (b1), 화학식 (b2), 화학식 (b3) 및 화학식 (b4)로 표현되는 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.

상기 식에서, l은 0 내지 20의 정수이다. 따라서, 본 발명에 의하면 l의 탄소 수 조절을 통해 용이하게 접합 부의 길이를 조절할 수 있다.

나아가, 본 발명에 의하면 적어도 하나의 시스테인(Cysteine, C)을 포함하는 아미노산 서열을 포함하며, 적어도 하나의 시스테인(Cysteine, C)에 본 발명의 DTPA 킬레이터가 접합된 단백질 치료제가 제공된다.

예를 들어 상기 단백체- DTPA 킬레이터 접합체를 포함하는 암 치료제 및 상기 단백체- DTPA 킬레이터 접합체를 포함하는 암 진단제가 제공될 수 있다.

다만, 본 발명의 용도는 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 DTPA 킬레이터는 항체 등과의 접합을 통한 암 등의 치료, 진단용으로 사용되거나, 또는 E-Coli, 세포 등을 활용하여 제조된 단백체를 활용하여 새로운 방사성 의약품을 개발하기 위한 연구 개발에도 활용될 수 있다. 또한, 새로운 단백질 치료제의 체내 거동을 영상으로 확인하거나 다양한 임상적 적용을 위한 방사성 동위원소 표지용 킬레이터로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예

1. 본 발명의 DTPA 킬레이터의 합성

본 발명의 DTPA 킬레이터는 하기 스킴 1 내지 4 등에 의해 합성될 수 있다.

[스킴(Scheme) 1]

[스킴(Scheme) 2]

[스킴(Scheme) 3]

[스킴(Scheme) 4]

하기에서는 구체적인 합성 과정을 스킴 1에 기초하여 설명한다.

(1) 화합물 1의 제조

잘 건조된 라운드 플라스크(round flask)에 Ar(g) 하에서 데스마틴 퍼아이오디난 (Dess-Martin periodinane, 6.37 g, 15.0 mmol)을 칭량(weighing)하여 넣고 CH₂Cl₂(80mL), tert-부탄올(1.26mL, 13.2mmol)을 넣은 후 얼음물 배스(ice-water bath)로 냉각하였다. 여기에 εN-Cbz, N-Boc-라이신올(N-Boc-Lys(Cbz)-ol, 4.4 g, 12.0 mmol)을 디클로로메탄(10 mL)에 녹인 용액을 천천히 적가하였다. 얼음물 배스 하에서 1시간 동안 교반 후, Na₂S₂O₃ 수용액(15 mL, 13.3 g/H₂O 15mL)을 천천히 적가하여 반응을 종결하였다.

이어서, NaHCO₃수용액을 천천히 넣어가면서 반응물의 pH를 약 7 내지 8로 조절하였다. 디클로로메탄(DCM)으로 추출한 후, 유기층을 무수 Na₂SO₄Pad 에 통과시켜 남은 수분을 제거한 후, 용매를 Rotary Evaporator를 이용하여 제거하였다. 실리카 겔 플래시 컬럼 크로마토그래피(Silica-gel Flash Column Chromatography, 40% EtOAc/n-Hx)를 수행하여 3.14 g (흰색 고체형태, 72 %)의 1 번 물질을 얻었다.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) d = 9.57 (s, 1H), 7.38-7.30 (m, 5H), 5.15 (br s, 1H), 5.09 (s, 2H), 4.80 (br s, 1H), 4.26-4.18 (m, 1H), 3.28-3.16 (m, 2H), 1.94-1.82 (m, 1H), 1.66-1.48 (m, 3H), 1.44 (s, 9H); MS (ESI+) m/z 365.7 [M+H]⁺, 387.7 [M+Na]⁺.

(2) 화합물 2의 제조

Ar(g) 하에서 화합물 1 (3.14 g, 0.55 mmol), N-Boc-트랜스-1,2-디아미노시클로헥산(1.85 g, 0.55 mmol), 디클로로에탄(60 ml)을 혼합한 반응 혼합물을 10분간 교반 후, 소듐 트리아세톡시보로하이드라이드(2.56 g, 0.77 mmol)를 넣은 후, 1.5시간 더 교반하였다. 얼음물 배스로 냉각한 후, NaHCO₃ 수용액을 넣어 반응을 종결하였다.

디클로로메탄(DCM)으로 추출한 후, 유기층을 무수 Na₂SO₄Pad 에 통과시켜 남은 수분을 제거한 후, 용매를 Rotary Evaporator를 이용하여 제거하였다. 실리카 겔 플래시 컬럼 크로마토그래피(Silica-gel Flash Column Chromatography, 2 ~ 5% MeOH/ CH₂Cl₂)를 수행하여 4.56 g (흰색 고체형태, 94 %)의 2 번 물질을 얻었다.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) d = 7.38-7.30 (m, 5H), 5.08 (s, 2H), 5.20-4.50 (m, 3H), 3.70-3.50 (m, 1H), 3.20-3.05 (m, 3H), 2.75-2.48 (m, 2H), 2.30-2.10 (m, 1H), 2.10-1.90 (m, 2H), 1.85-1.55 (m, 7H), 1.55-1.30 (m, 18H), 1.30-1.00 (m, 5H); ¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)d = 156.61, 156.34, 156.25, 156.12, 136.78, 136.77, 128.62, 128.23, 128.17, 110.13, 79.33, 79.18, 66.67, 61.79, 60.08, 54.42, 50.44, 50.12, 49.84, 49.41, 40.88, 40.81, 33.42, 33.08, 32.98, 32.64, 31.95, 31.59, 29.63, 28.59, 28.57, 28.54, 25.05, 25.00, 24.83, 24.63, 23.08, 22.99; MS (ESI-) m/z 563.8 [M-H]⁺.

(3) 화합물 3의 제조

화합물 2 (4.76 g, 8.46 mmol)를 20% 트리플루오로아세트산(TFA)/디클로로메탄(DCM) (100 mL, v/v) 용액에서 1시간 동안 교반한 후, 감압 하에서 농축하였다. NaHCO₃수용액으로 pH를 7 내지 8로 맞춘 후, 디클로로에탄(CH₂Cl₂)으로 추출하였다. 유기층을 무수 Na₂SO₄Pad에 통과시켜, 남은 수분을 제거한 후, 용매를 Rotary Evaporator를 이용하여 감압 하에서 제거하였다. 이렇게 얻은 반응물을 Ar(g) 하에서 아세토니트릴(MeCN, 120 mL)에 녹인 후, 포타슘 카보네이트 (9.35 g, 67.7 mmol), tert-부틸 브로모아세테이트(6.88 mL, 46.6 mmol)를 넣은 후, 3일 동안 교반하였다. 필터하여 생성된 고체를 제거한 후, 용매를 Rotary Evaporator를 이용하여 감압 하에서 제거하였다. 여기에 물과 디클로로메탄(DCM)으로 추출한 후, 유기층을 무수 Na₂SO₄Pad에 통과시켜, 남은 수분을 제거한 후, 용매(디클로로메탄)를 용매를 Rotary Evaporator를 이용하여 감압 하에서 제거하였다. 실리카 겔 플래시 컬럼 크로마토그래피(Amino Silica-gel Flash Column Chromatography, 2 ~ 10% MeOH/DCM) 를 수행하여 4.13 g (노란색 오일형태, 52 %)의 3 번 물질을 이성질체 혼합물(isomer mixture)로 얻었다.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃)d = 7.38-7.30 (m, 5H), 5.60-5.50 (m, 1H), 5.08 (s, 2H), 3.60-3.14 (m, 14H), 2.96-2.20 (m, 6H), 2.10-1.50 (m, 6H), 1.50-1.36 (m, 45H), 1.30-1.00 (m, 5H); MS (ESI-) m/z 934.4 [M-H]⁺.

(4) 화합물 4의 제조

Ar(g) 하에서 화합물 3 (4.1 g, 4.39 mmol)을 메탄올(75 mL), 에틸아세테이트(25 mL)에 녹인 후, 활성 탄소 상의 팔라듐(palladium on activated carbon, 2.34 g, 1.1 mmol, 10% Pd, wet, Dugussa type)을 넣은 후, H₂(g)로 퍼징(purging)하였다. 실온에서 18시간 교반 후, 셀라이트(celite) 필터한 반응 혼합물을 Rotary Evaporator를 이용하여 감압 하에서 제거하였다. 3.5 g (노란색의 오일형태)의 4 번 물질을 얻고 추가의 정제 과정 없이 다음 단계로 진행하였다.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃)d = 3.60-3.14 (m, 10H), 3.00-1.86 (m, 14H), 1.84-1.50 (m, 4H), 1.50-1.36 (m, 45H), 1.30-1.00 (m, 5H); MS (ESI-) m/z 800.8 [M-H]⁺.

(5) 화합물 5의 제조

Ar(g) 하에서 화합물 4(2.758 g, 3.45 mmol)를 THF (80 mL)에 녹인 후, 말레산 무수물(406 mg, 4.14 mmol)을 넣고 40^oC에서 18시간 교반하였다. Rotary Evaporator를 이용하여 감압 하에서 농축한 후, 포타슘 아세테이트(805 mg, 13.8 mmol)와 아세트산 무수물(185 mL)을 넣고 90^oC에서 1시간 동안 가열 후, 실온에서 18시간 동안 더 교반하고, Rotary Evaporator를 이용하여 감압 하에서 농축하였다. 디클로로메탄(DCM)으로 추출 후, NaHCO₃ 수용액으로 씻어내고 분별깔때기를 이용하여 유기층을 추출한 후 무수 Na₂SO₄Pad에 통과시켜, 남은 수분을 제거한 후, 용매를 Rotary Evaporator를 이용하여 감압 하에서 제거하였다. 실리카 겔 플래시 컬럼 크로마토그래피(Silica-gel Flash Column Chromatography, 10% MeOH/DCM) 를 수행하여 649 mg (노란색 오일형태)의 5 번 물질을 얻었다.

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃)d = 6.67 (s, 2H), 3.80-1.00 (m, 31H), 1.52-1.40 (m, 45H); MS (ESI+) m/z 881.0 [M+2H]⁺,902.2 [M+Na]⁺.

(6) 화합물 6의 제조

화합물 5 (1.18 g)를 트리플루오로아세트산(TFA)/트리이소프로필실란(Triisopropylsilane, TIS)/물(100 mL, 95/2.5/2.5(v/v/v))에 녹인 후, 4시간 동안 실온에서 교반하였다. Rotary Evaporator를 이용하여 감압 하에서 농축 후, 디에틸에테르를 넣어 침천된 고체를 필터하였다. 이렇게 얻은 물질을 C18 실리카 겔 플래시 컬럼 크로마토그래피(Silica-gel Flash Column Chromatography, 10 ~ 15 % acetonitrile/water, 0.1% TFA)를 수행하여 649 mg의 흰색 고체형태의 6 번 물질을 얻었다.

MS (ESI+) m/z 599.7 [M+H]⁺.

HPLC 조건: 5 to 50% B for 20 min (A : 0.1% TFA in water, B : Acetonitrile), R_t= 12.86 min.

2. 본 발명의 DTPA 킬레이터와 단백체의 접합체 제조

(1)티올(Thiol) 함유 펩타이드와의 접합체의 제조

본 발명의 DTPA 킬레이터와 CCK-2를 표적할 수 있는 펩타이드 화합물과 결합된 물질의 제조하기 위하여 고체 상 지지체를 이용한 펩타이드 제조방법(Solid Phase Peptide Synthesis)을 적용하여 먼저 끝단에 시스테인(Cysteine, C) 함유 펩타이드를 제조한다.

이렇게 제조된 펩타이드를 PBS 등과 같은 염기성 버퍼에 녹인 후 본 발명의 DTPA 킬레이터를 2당량 추가하여 실온에서 1 내지 4시간 반응시켰다.

그 후 반응 용액을 HPLC를 이용하여 분리 정제하여, 하기와 같은 구조의 접합체를 제조하였다.

+

H-Cys[S-Mal-Lys-DTPA(CHX)]-Tyr-D-Nle-Gly-Trp-(N-Me-Nle)-Asp-Phe-NH2

MS (ESI+) m/z 1627.4 [M+H]⁺.

HPLC 조건: 5 to 50% B for 20 min (A : 0.1% TFA in water, B : Acetonitrile), R_t = 14.03 min.

(2) Annexin V 단백체와의 접합체의 제조

본 발명의 DTPA 킬레이터와 아포토시스(Appotosis)를 확인할 수 있는 Annexin V 단백체와 결합된 물질의 제조하기 위해, E-Coli를 이용하여 발현시켜 분리하여 6X-히스티딘 표지된(Histidine tagged) Annexin V 단백체를 제조하였다.

IMAC(immobilized Metal Affinity Chromatography)를 이용하여 단백체를 분리 하였고, 분리된 물질의 SDS-PAGE 분석 결과 일부 이황화 (Disulfide) 결합을 갖는 (Annexin-V)₂ 존재를 확인하였고, 나아가 이들이 시간이 지남에 따라 증가함을 확인하였다.

이에 HEPES 버퍼(pH 7.5)에 들어있는 이황화(Disulfide)결합을 갖는 (Annexin V)₂를 TCEP를 이용하여 환원(Reducing)한 후 본 발명의 DTPA 킬레이트를 첨가하여 실온에서 2시간 또는 4도 24시간 이상 반응시켜 접합체를 제조하였다.

10kDa의 분자량 컷오프 필터(molecular cut-off filter)를 이용하여 초원심분리(Ultra-Centrifuge)하여 반응에 참여하지 않은 본 발명의 DTPA 킬레이트를 제거하였다.

도 2(a)은 6X-히스티딘 표지(Histidine tagged) Annexin V 단백체 서열정보와 본 발명의 DTPA 킬레이트가 결합된 6X-히스티딘 표지(Histidine tagged) Annexin V 단백체에 접합된 위치를 나타낸 것이다. 도 2(b)는 DTPA 킬레이트가 결합된 6X-히스티딘 표지(Histidine tagged) Annexin V 단백체에 접합된 물질의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다. 6X-히스티딘 표지(Histidine tagged) Annexin V 단백체의 환원된 형태의 경우 시간경과에 따라 이황화 결합이 발생하여 분자량이 증가하는 반면, 본 발명의 DTPA 킬레이트가 결합된 6X-히스티딘 표지(Histidine tagged) Annexin V 단백체에 접합된 물질은 분자간 이황화결합을 할 수 없는 형태의 단분자 형태를 갖추고 있어 변화가 없음을 확인하였다.

3. 방사성동위원소 표지

(1) 본 발명의 킬레이터에 대한 방사성 동위원소 표지

20㎍의 DTPA 킬레이터를 아세트산완충액(50mM, pH 5, 100㎕) 에 녹여 바이알에 담는다. 여기에 50㎕의 0.05N HCl 용액에 들어있는 방사성동위원소 Y-90 1 mCi를 주사기를 이용하여 주입한 후 실온에서 10분간 천천히 교반하여 반응시킨다.

표지수율 평가를 위하여 상기 반응 후에 2㎕ 용액를 취하여 ITLC-SG 플레이트에 점적하고 75% 메탄올 용액(Methanolic solution)을 이용하여 전개하였다. 전개된 ITLC-SG 플레이트를 건조한 후 TLC 스캐너(SCAN-RAM, Radio-TLC Detector)를 이용하여 표지수율을 확인하였다.

확인한 결과 도 4에 나타난 바와 같이 98% 이상의 수율로 제조됨을 확인 확인할 수 있었다(Unlabeled Y-90, Rf= 0~0.1); Y-90- 킬레이터, Rf= 0.8~1.0).

(2) 본 발명의 킬레이터의 농도에 따른 방사성동위원소 표지

DTPA 킬레이터 1000 ㎍ 를 아세트산완충액(50mM, pH 5, 100㎕) 에 녹여 바이알에 담는다. 여기에서 일부를 취하여 DTPA 킬레이터 화합물의 량을 각각 0.1, 1, 5, 10, 50 ㎍ (0.11, 1.12, 5.63, 11.3, 56.3 nmol)이 되도록 취한 후에 아세트산완충액(50mM, pH 5)을 추가하여 총용액의 부피를 100㎕로 제조하였다. 여기에 50㎕의 0.05N HCl 용액에 들어있는 100 μCi 방사성동위원소 Y-90을 주사기를 이용하여 주입한 후 실온에서 10분간 천천히 교반하여 반응시킨다.

표지수율 평가를 위하여 상기 반응 후에 2㎕ 용액를 취하여 ITLC-SG 플레이트에 점적하고 75% 메탄올 용액(Methanolic solution)을 이용하여 전개하였다. 전개된 ITLC-SG 플레이트를 건조한 후 TLC 스캐너(Scan-RAM, RadioTLC Detector)를 이용하여 표지수율을 확인하였으며 그 결과는 표 1에 나타낸 바와 같다.

DTPA 킬레이터 화합물 량에 따른 표지수율

DTPA 킬레이터 화합물 량		표지수율 (%)
㎍	nmol	표지수율 (%)
0.1	0.11	-
1	1.12	5
5	5.63	85
10	11.3	92
20	22.6	98
50	56.3	98

(3) 본 발명의 킬레이터 접합 펩타이드에 대한 방사성동위원소 표지

DTPA 킬레이터와 CCK-2를 표적할 수 있는 펩타이드 화합물의 접합체 (20㎍)를 아세트산완충액(50mM, pH 5, 100㎕) 에 녹여 바이알에 담는다. 여기에 50㎕의 0.05N HCl 용액에 들어있는 방사성동위원소 Y-90 1 mCi를 주사기를 이용하여 주입한 후 실온에서 10분간 천천히 교반하여 반응시킨다.

표지수율 평가를 위하여 상기 반응 후에 1~2㎕ 용액를 취하여 ITLC-SG 플레이트에 점적하고 75% 메탄올 용액(Methanolic solution)을 이용하여 전개하였다. 전개된 ITLC-SG 플레이트를 건조한 후 TLC 스캐너(SCAN-RAM, Radio-TLC Detector)를 이용하여 표지수율을 확인하였다.

확인한 결과 도 5에 나타난 바와 같이 95% 이상의 수율로 제조됨을 확인 확인할 수 있었다.(Unlabeled Y-90, Rf= 0~0.1; Y-90- 킬레이터-펩타이드 접합체, Rf= 0.8~1.0)

(4) 본 발명의 킬레이터 접합 Annexin V 단백체에 대한 방사성동위원소 표지

100㎍의 DTPA 킬레이터 접합 Annexin V 단백체가 들어있는 아세트산완충액(50mM, pH 5, 500㎕) 을 바이알에 담는다. 여기에 50㎕의 0.05N HCl 용액에 들어있는 방사성동위원소 Y-90 0.1 mCi를 주사기를 이용하여 주입한 후 실온에서 10분간 천천히 교반하여 반응시킨다.

표지수율 평가를 위하여 상기 반응 후에 1~5㎕ 용액를 취하여 ITLC-SG 플레이트에 점적하고 소듐 시트르산용액(50 mM, Sodium Cirtate solution)을 이용하여 전개하였다.

전개된 ITLC-SG 플레이트를 건조한 후 TLC 스캐너(SCAN-RAM, Radio-TLC Detector)를 이용하여 표지수율을 확인하였다. 확인한 결과 도 6에 나타난 바와 같이 98% 이상의 수율로 제조됨을 확인할 수 있었다.(Y-90- 킬레이터-단백체 접합체, Rf= 0~0.1; Unlabeled Y-90, Rf= 0.8~1.0)

이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.

Claims

하기 화학식(I)로 표현되며,

상기 식에서, l은 0 내지 10의 정수이며,
R₁ 및 R₂는 함께 연결되어 시클로헥실을 형성하는, DTPA 킬레이터.
제1항에 있어서, 상기 DTPA 킬레이터는 하기 화학식(IIa)로 표현되는, DTPA 킬레이터.
제1항 또는 제2항의 DTPA 킬레이터가 단백체의 아미노산 서열 중 하나 이상의 시스테인(Cysteine, C) 잔기에 접합된, 단백체- DTPA 킬레이터 접합체.
제3항에 있어서, 상기 단백체는 시스테인(Cysteine, C)을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 항체, 펩터이드, 단백질, 항체 유래 단백체, 호르몬, 펩타이드 또는 이들의 조합인, 단백체-DTPA 킬레이터 접합체.
제4항에 있어서, 상기 단백체는 아넥신 V, 에피바디 및 펩타이드 수용체 표적 펩타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나인, 단백체- DTPA 킬레이터 접합체.
제4항에 있어서, 상기 단백체에 포함된 시스테인(Cysteine, C)은 단백체의 활성에 영향이 없는 위치에 추가된 잔기인, 단백체- DTPA 킬레이터 접합체.
시스테인(Cysteine, C)을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 단백체와 제1항 또는 제2항의 DTPA 킬레이터를 상기 단백체 1 당량을 기준으로 상기 DTPA 킬레이터를 1 당량 내지 3 당량의 비율로 혼합하여 4 내지 50℃의 온도에서 10분 내지 48시간 반응시키는 단계를 포함하는, 단백체- DTPA 킬레이터 접합체의 제조방법.
하기 화학식 (a) 화합물과 하기 화학식 (b1) 화합물을 반응시키는 단계를 포함하는,

하기 화학식(I)의 DTPA 킬레이터를 제조하는 방법:

상기 화학식 (a) 및 화학식 (I)에서, l은 0 내지 10의 정수이며,
상기 화학식 (I)에서, R₁ 및 R₂는 함께 연결되어 시클로헥실을 형성한다.
삭제
삭제
삭제