CN103245789B - 用于肿瘤病理诊断的试剂盒及对组织切片进行染色的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于肿瘤病理诊断的试剂盒，包括用于肿瘤病理诊断的探针；探针包括金纳米簇、肿瘤特异性标志物的抗体及考马斯亮蓝，金纳米簇与肿瘤特异性标志物的抗体通过点击化学方式连接，考马斯亮蓝与连接有肿瘤特异性标志物的抗体的金纳米簇通过静电方式结合；其中，金纳米簇、肿瘤特异性标志物的抗体及考马斯亮蓝的摩尔比为1～10:1～100:1～100。该试剂盒对肿瘤病理诊断具有较高准确性。此外，本发明还提供一种对组织切片进行染色的方法。

Description

用于肿瘤病理诊断的试剂盒及对组织切片进行染色的方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种用于肿瘤病理诊断的试剂盒及采用用于肿瘤病理诊断的试剂盒对组织切片进行染色的方法。

背景技术

近廿年来，肿瘤死亡率急剧上升。在35至59岁的中壮年人群中，肿瘤已列居各类死因之首。有数据显示：我国肿瘤发病率约为200/10万人，每年新发病例约220万人以上，在治疗的患者约600万人以上。肿瘤已成为造成我国最佳劳动力损失、医疗费用上涨的一大原因。尽管已经研究出了一些预防肿瘤的化学药物，但至今仍没有一种有效控制肿瘤的一级预防措施。所以，当前乃至将来相当长一段时间内，早期诊断仍是肿瘤防治的一项基本策略。

肿瘤特异性标志物检测是临床上检查肿瘤的重要手段之一，主要包括非常成熟的免疫组织化学染色(immunohistoehemicalstaining，IHC)、免疫荧光技术（Immunofluorescence technique，IF）、荧光原位杂交(fluoreseeneeinsituhybridization，FISH)和显色原位杂交(ehromogenieinsitu hybridiZation，CISH)。IHC和IF检测的是细胞膜上肿瘤特异性标志物的表达情况，而FISH和CISH则是通过检测HERJZ基因扩增的水平来对癌症进行检测。这些方法对离体肿瘤组织及细胞特异性标志物的检测已经得到广泛的认可，在某种程度上较好的满足了乳腺癌等肿瘤的临床诊疗需求。但是，由于这些方法要用到天然的过氧化物酶和有机荧光染料，而天然的过氧化物酶容易变性和失活，且提纯困难、价格昂贵，储藏和使用不便，成本高。有机荧光染料的荧光容易萃灭，导致检测结果易出现假阴性等不准确的诊断结果。

发明内容

基于此，有必要提供一种对肿瘤病理诊断具有较高准确性的用于肿瘤病理诊断的试剂盒。

一种用于肿瘤病理诊断的试剂盒，包括用于肿瘤病理诊断的探针；所述探针包括金纳米簇、肿瘤特异性标志物的抗体及考马斯亮蓝，所述金纳米簇与所述肿瘤特异性标志物的抗体通过点击化学方式连接，所述考马斯亮蓝与所述连接有所述肿瘤特异性标志物的抗体的金纳米簇通过静电方式结合；其中，所述金纳米簇、所述肿瘤特异性标志物的抗体及所述考马斯亮蓝的摩尔比为1～10:1～100:1～100。

在其中一个实施例中，所述点击化学方式连接为所述金纳米簇表面修饰的叠氮基与所述肿瘤特异性标志物的抗体表面修饰的炔基发生点击化学反应而连接。

在其中一个实施例中，所述金纳米簇的粒径为0.5～2nm。

在其中一个实施例中，所述肿瘤特异性标志物的抗体为乳腺癌的抗HER2蛋白抗体、乳腺癌的抗P53蛋白抗体、乳腺癌的抗p185蛋白抗体、肺癌的CEA单克隆抗体或抗人肺癌单克隆抗体(McAb)N-35。

在其中一个实施例中，所述试剂盒中还包括封闭剂、过氧化氢及核染剂。

在其中一个实施例中，所述封闭剂为正常的山羊血清、牛血清白蛋白或牛奶粉。

在其中一个实施例中，所述核染剂为DAPI或Hoechst。

由于金纳米簇具有近红外荧光特性，而且还具有尺寸小、生物相容性好等特性，从而金纳米簇可以作为生物荧光探针。而考马斯亮蓝具有肉眼可视化的特性，可以用于免疫组化检测中。将肿瘤特异性标志物的抗体通过点击化学方式连接到金纳米簇上，而考马斯亮蓝通过静电方式结合到连接有肿瘤特异性标志物的抗体的金纳米簇上，从而得到上述用于肿瘤病理诊断的探针。该探针具有优异的化学和物理性能，粒径小，比表面积大，悬浮稳定性好，对肿瘤具有很强的靶向性。

将上述试剂盒用于肿瘤病理诊断时，由于金纳米簇具有近红外荧光特性，在激发光的作用下发荧光，实现对肿瘤细胞的荧光定位。而由于考马斯亮蓝具有肉眼可视化的特性，上述探针通过抗原抗体特异性结合到肿瘤细胞上，并洗涤掉没有结合的探针，即可通过肉眼得出结果，不要使用仪器设备，即可实现对肿瘤细胞的可见光定位。从而上述试剂盒能实现对肿瘤细胞的双重共定位，不仅增加了单张切片的信息含量，还可初步判断由污点造成的非特异性荧光着色，更利于综合的分析判断实验结果，可增加实验的可信度和说服力，从而有助于及时、正确地做出病理诊断。而且上述试剂盒中不需要包含一抗、酶（荧光染料）标二抗及显色剂等，从而将上述试剂盒用于肿瘤病理诊断时，具有操作更简便，工作量更少等特点，能有效节约成本。更为免疫组化和免疫荧光的相互转化与衔接提供技术和思维平台。

一种使用上述试剂盒对组织切片进行染色的方法，包括如下步骤：

将冰冻组织切片或预先经脱蜡水化处理后的石蜡组织切片依次浸泡于无水乙醇、质量分数为95%的乙醇溶液以及质量分数为70%的乙醇溶液中，每次5分钟，然后用PBS洗涤；

在组织切片上滴加体积分数为3%的过氧化氢溶液，室温静置10分钟，并经PBS洗涤；

将组织切片放入至95℃枸橼酸钠缓冲溶液中恒温浸泡10～15分钟，并经PBS洗涤，其中，枸橼酸钠缓冲溶液的浓度为0.01mol/L；

在组织切片上滴加封闭剂，于室温下封闭20分钟后，甩去多余液体；

在组织切片上滴加所述用于肿瘤病理诊断的探针，室温下静置1小时、4℃过夜或者37℃下静置1小时，并经PBS洗涤，其中，所述探针的终浓度为0.01～10mmol/L；

在组织切片上滴加核染剂，然后于37℃下孵育7～10分钟，使核染剂的终浓度为0.1～10μg/ml，并经PBS或自来水洗涤；

封片，然后镜检。

上述染色的方法具有操作更简便，工作量更少等特点，能有效节约成本，且能快速检测肿瘤组织切片。

附图说明

图1为实施例1中制备得到的用于肿瘤病理诊断的探针的表征图，其中，图1a为可见光下的表征图，图1b为紫外灯下的表征图；

图2为实施1中的可见光定位的镜检图；

图3为实施1中的荧光定位的镜检图；

图4为实施1的对比例1中的镜检图；

图5为实施1的对比例2中的镜检图；

图6为实施2中的可见光定位的镜检图；

图7为实施2中的荧光定位的镜检图；

图8为实施2的对比例1中的镜检图；

图9为实施2的对比例2中的镜检图。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例对用于肿瘤病理诊断的试剂盒及染色的方法进行进一步的说明。

一实施方式的用于肿瘤病理诊断的试剂盒，包括用于肿瘤病理诊断的探针。探针包括金纳米簇、肿瘤特异性标志物的抗体及考马斯亮蓝。金纳米簇与肿瘤特异性标志物的抗体通过点击化学方式连接，考马斯亮蓝与连接有肿瘤特异性标志物的抗体的金纳米簇通过静电方式结合。其中，金纳米簇、肿瘤特异性标志物的抗体及考马斯亮蓝的摩尔比为1～10:1～100:1～100。

在本实施方式中，金纳米簇是采用牛血清白蛋白（Albumin from bovineserum，BSA）可控合成的。合成的金纳米簇由2～30个金原子构成，粒径为0.5～2nm，尺寸均一，近似球形，具有蛋白外壳，且具有高度分散性的纳米材料。因此，上述金纳米簇具有良好的生物相容性，且具有近红外荧光特性。从而金纳米簇可以作为生物荧光探针。在其他实施方式中，也可以采用人血清白蛋白来合成金纳米簇。

其中，金纳米簇的摩尔数根据BSA的摩尔数来确定。采用紫外分光光度法来确定BSA的摩尔数，具体过程如下：

配制浓度为1.0mg/mL的BSA溶液，并于280nm处测定紫外吸收。绘制标准曲线：取6支试管，并给每支试管标号，分别为试管1、试管2……试管6，并在6支试管中分别加入配制好的BSA溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL。往体积不足5.0mL的试管中加入蒸馏水使得每支试管中含有5.0mL溶液，然后混合均匀。以试管1为空白对照，测定其他5支试管吸光度。以吸光度为纵坐标，各管的BSA浓度或BSA质量为横坐标作图，即得到标准曲线。然后采用同样的方法测定合成的金纳米簇溶液的吸光度，即可得到合成的金纳米簇溶液中的BSA的浓度或BSA的质量，从而得到BSA摩尔数，进而得到金纳米簇的摩尔数。

在本实施方式中，肿瘤特异性标志物的抗体可以是乳腺癌的抗HER2蛋白抗体、乳腺癌的抗P53蛋白抗体、乳腺癌的抗p185蛋白抗体、肺癌的CEA单克隆抗体或抗人肺癌单克隆抗体(McAb)N-35。可以理解，在其他实施方式中，肿瘤特异性标志物的抗体也可以是其他种类肿瘤的抗体。

肿瘤特异性标志物的抗体通过点击化学方式连接到金纳米簇上，得到用于肿瘤病理诊断的探针。在本实施方式中，肿瘤特异性标志物的抗体的表面修饰有炔基，而金纳米簇的表面修饰有叠氮基，从而通过点击化学的代表反应叠氮-炔基环加成反应，得到上述用于肿瘤病理诊断的探针。而且点击化学反应条件简单、反应时间短，符合原子经济。

考马斯亮蓝与连接有肿瘤特异性标志物的抗体的金纳米簇通过静电方式结合。考马斯亮蓝具有肉眼可视化的特性，可以用于免疫组化检测中，且考马斯亮蓝的结构中含有磺酸的钠盐，由于磺酸酸性较强，如果控制适当的酸性环境可以让蛋白质带上大量的正电荷，而考马斯亮蓝以负离子形式出现。基于正负电荷的相互作用从而使得蛋白质的表面得以吸附大量的考马斯亮蓝成份。而连接有肿瘤特异性标志物的抗体的金纳米簇在适当的酸性环境带正电荷，从而考马斯亮蓝可以通过静电方式与连接有肿瘤特异性标志物的抗体的金纳米簇连接。

由于可以在肿瘤特异性标志物的抗体的表面修饰多个炔基，也可以在金纳米簇的表面修饰多个叠氮基。而金纳米簇与肿瘤特异性标志物的抗体需要满足一定的摩尔比，从而使得连接有肿瘤特异性标志物的抗体的金纳米簇上有足够量的肿瘤特异性标志物的抗体与肿瘤细胞结合，有足够量的金纳米簇用于荧光成像。而考马斯亮蓝的用量会直接影响肉眼观察诊断结果。因此，金纳米簇、肿瘤特异性标志物的抗体及考马斯亮蓝的摩尔比对上述探针非常重要。在本实施方式中，金纳米簇、所述肿瘤特异性标志物的抗体及所述考马斯亮蓝的摩尔比为1～10:1～100:1～100。

本实施方式还提供一种用于肿瘤病理诊断的探针的制备方法，包括如下步骤：

步骤S110，将浓度为1～100mmol/L的氯金酸溶液与浓度为1～500mg/mL的牛血清白蛋白或人血清白蛋白溶液混合均匀，然后加入浓度为0.1～10mol/L的NaOH溶液，并于摇床中于0～100℃下温育3～100小时，得到金纳米簇，其中，NaOH与氯金酸的摩尔比为1:1～1:100。

在本实施方式中，优选牛血清白蛋白来制备金纳米簇，因为牛血清白蛋白具有无毒，生物相容性好，价格相对便宜等优点。

步骤S120，将金纳米簇与经NHS预处理的叠氮化试剂按照摩尔比为1:1～1:100的比例混合，得到表面修饰有叠氮基的金纳米簇。

在本实施方式中，叠氮化试剂为N₃-PEG₈-CH₂CH₂NH₂、6-TET Azide或6-HEX Azide。购买于Click Chemistry Tools公司，货号分别为AZ103-25、50-2005-92、50-2006-92。

NHS处理的目的是活化叠氮化试剂。

步骤S130，将肿瘤特异性标志物的抗体与炔基化试剂按照摩尔比为1:1～1:100的比例混合均匀并反应0.5小时，反应液经纯化处理后，得到表面修饰有炔基的肿瘤特异性标志物的抗体。

在本实施方式中，炔基化试剂为DBCO-sulfo-NHS Ester或DBCO-PEG₄-NHS ester。购买于Click Chemistry Tools公司，货号分别为50-1941-23、10-1941-90。

纯化处理的具体过程为：将反应液转入透析袋中，在室温下，与10～5000mLPBS（Phosphate Buffered Saline，磷酸盐缓冲液）内透析1～300小时，每1～12小时换液一次。然后于10～5000mL双蒸馏水内透析1～12小时。

步骤S140，将表面修饰有叠氮基的金纳米簇与表面修饰有炔基的肿瘤特异性标志物的抗体按照摩尔比为1:1～1:100的比例混合均匀，并孵育0.5小时，得到连接有肿瘤特异性标志物的抗体的金纳米簇。

步骤S150，将考马斯亮蓝与连接有肿瘤特异性标志物的抗体的金纳米簇混合，并并孵育0.5小时，反应液经纯化处理后，得到用于肿瘤病理诊断的探针，其中，考马斯亮蓝与金纳米簇的摩尔比为1:100～1:1。

纯化处理的具体过程为：将反应液转入透析袋中，在室温下，与10～5000mLPBS内透析1～300小时，每1～12小时换液一次。然后于10～5000mL双蒸馏水内透析1～12小时。

在本实施方式中，上述试剂盒中还包括封闭剂、过氧化氢及核染剂。封闭剂为正常的山羊血清，核染剂为DAPI（4',6-diamidino-2-phenylindole，4',6-二脒基-2-苯基吲哚）。可以理解，在其他实施方式中，封闭剂还可以为牛血清白蛋白或牛奶粉。核染剂还可以为Hoechst。

将上述试剂盒用于肿瘤病理诊断时，由于金纳米簇具有近红外荧光特性，在激发光的作用下发荧光，实现对肿瘤细胞的荧光定位。而由于考马斯亮蓝具有肉眼可视化的特性，上述探针通过抗原抗体特异性结合到肿瘤细胞上，并洗涤掉没有结合的探针，即可通过肉眼得出结果，不要使用仪器设备，即可实现对肿瘤细胞的可见光定位。从而上述试剂盒能实现对肿瘤细胞的双重共定位，不仅增加了单张切片的信息含量，还可初步判断由污点造成的非特异性荧光着色，更利于综合的分析判断实验结果，可增加实验的可信度和说服力，从而有助于及时、正确地做出病理诊断。而且上述试剂盒中不需要包含一抗、酶（荧光染料）标二抗及显色剂等，从而将上述试剂盒用于肿瘤病理诊断时，具有操作更简便，工作量更少等特点，能有效节约成本。更为免疫组化和免疫荧光的相互转化与衔接提供技术和思维平台。

此外，本实施方式还提供一种使用上述试剂盒对组织切片进行染色的方法，包括如下步骤：

将冰冻组织切片或预先经脱蜡水化处理后的石蜡组织切片依次浸泡于无水乙醇、质量分数为95%的乙醇溶液以及质量分数为70%的乙醇溶液中，每次5分钟，然后用PBS洗涤；

将组织切片放入至95℃枸橼酸钠缓冲溶液中恒温浸泡10～15分钟，并经PBS洗涤，其中，枸橼酸钠缓冲溶液的浓度为0.01mol/L；

在组织切片上滴加封闭剂，于室温下封闭20分钟后，甩去多余液体；

在组织切片上滴加上述用于肿瘤病理诊断的探针，室温下静置1小时、4℃过夜或者37℃下静置1小时，并经PBS洗涤，其中，上述探针的终浓度为0.01～10mmol/L；

在组织切片上滴加核染剂，然后于37℃下孵育7～10分钟，使核染剂的终浓度为0.1～10μg/ml，并经PBS或自来水洗涤；

封片，然后镜检。

上述染色的方法具有操作更简便，工作量更少等特点，能有效节约成本，且能快速检测肿瘤组织切片。

以下为具体实施例部分：

实施例1

抗体为抗HER2蛋白抗体，石蜡肿瘤组织切片为人乳腺癌细胞MCF7

一、用于肿瘤病理诊断的探针的制备

1、金纳米簇的制备：于37℃下，将0.5mL浓度为50mmol/L的氯金酸溶液加入到0.5mL浓度为200mg/mL的BSA溶液中，混合均匀；然后加入0.2mL浓度为1mol/L的NaOH溶液，得到混合液；将混合液置于摇床中，于37℃下温育10小时，即得到金纳米簇。

2、金纳米簇的叠氮基修饰：将上述金纳米簇与叠氮化试剂按照摩尔比为1:1的比例混合，得到表面修饰有叠氮基的金纳米簇，其中，叠氮化试剂预先经NHS处理过。

3、抗HER2蛋白抗体的炔基修饰：将DBCO-sulfo-NHS Ester炔基化试剂加入抗HER2蛋白抗体中，反应30分钟，其中，DBCO-sulfo-NHS Ester炔基化试剂与抗HER2蛋白抗体的摩尔比为10:1；将反应液转入透析袋中，在室温下，于2000mLPBS内透析24小时，每12小时换液一次，然后于2000mL双蒸馏水内透析12小时，得到表面修饰有炔基的抗HER2蛋白抗体。

4、点击化学反应：将表面修饰有炔基的抗HER2蛋白抗体与表面修饰有叠氮基的金纳米簇混合并于室温下孵育半小时，得到连接有抗HER2蛋白抗体的金纳米簇。其中，表面修饰有炔基的抗HER2蛋白抗体与表面修饰有叠氮基的金纳米簇的摩尔比为1:1。

5、用于肿瘤病理诊断的探针的制备：将1mL浓度为0.5mol/L的考马斯亮蓝溶液加入到步骤4中的溶液中于室温下孵育半小时。然后将反应液转入透析袋中，在室温下，于1000mL PBS内透析24小时，每12小时换液一次，然后于1000mL双蒸馏水内透析12小时，得到上述探针。

如图1所示，图1a为上述制备得到的探针在可见光下的照片；图1b为上述制备得到的探针在紫外灯下的照片。其中，仪器为普通照相机，条件分别为室温。从图中可以看出，按上述方法制备得到的探针在可见光下为亮绿色，可实现对肿瘤细胞的可见光定位；在紫外灯下具有较强的红色荧光，可实现对肿瘤细胞的荧光定位。

二、组织切片染色步骤：

含人乳腺癌细胞MCF7的石蜡组织切片，于60℃恒温箱中烘烤20分钟。然后浸泡于二甲苯中脱蜡2次，每次10分钟。然后依次浸泡于无水乙醇、95%的乙醇、70%的乙醇中，每次5分钟。再用pH=7.4的PBS洗3次，每次5分钟。

在组织切片上滴加体积分数为3%的过氧化氢溶液，室温静置10分钟，并经PBS洗涤3次，每次5分钟。

将组织切片放入至95℃枸橼酸钠缓冲溶液中恒温浸泡10～15分钟，并用pH=7.4的PBS洗3次，每次5分钟。

在组织切片上滴加正常的山羊血清封闭液，于室温下封闭20分钟后，甩去多余液体。然后在组织切片上滴加50μL上述探针，使探针的终浓度为1mmol/L，并于37℃下静置1小时，然后用pH=7.4的PBS洗3次，每次5分钟。

在组织切片上滴加DAPI，使其终浓度为1μg/mL，然后于37℃下孵育10分钟。

采用中性树胶封片，然后采用CRI公司多光谱显微成像系统进行镜检。图2为可见光定位的镜检图，其中，发射波长为450～750nm；图3为荧光定位的镜检图，其中，激发波长为365nm，发射波长为400～750nm。

实施例1的对比例1

含人乳腺癌细胞MCF7的石蜡组织切片，于60℃恒温箱中烘烤20分钟。然后浸泡于二甲苯中脱蜡2次，每次10分钟。然后依次浸泡于无水乙醇、95%的乙醇、70%的乙醇中，每次5分钟。再用pH=7.4的PBS洗3次，每次5分钟。

在组织切片上滴加体积分数为3%的过氧化氢溶液，室温静置10分钟，再用pH=7.4的PBS洗3次，每次5分钟。然后将组织切片放入至95℃枸橼酸钠缓冲溶液中恒温浸泡10～15分钟，并用pH=7.4的PBS洗3次，每次5分钟。

在组织切片上滴加正常的山羊血清封闭液，于室温下封闭20分钟后，甩去多余液体。然后在组织切片上直接滴加第一抗体，于37℃下静置2小时后，用pH=7.4的PBS洗3次，每次5分钟。在组织切片上滴加那根过氧化物酶记的二抗，于37℃下静置40分钟后，用pH=7.4的PBS洗3次，每次5分钟。

在组织切片上滴加DAB和过氧化氢溶液，显色5分钟，在显微镜下掌握染色程度，然后用pH=7.4的PBS冲洗10分钟。

采用中性树胶封片，然后采用CRI公司多光谱显微成像系统进行镜检。图4为镜检结果图，其中，发射波长为450～750nm。

实施例1的对比例2

含人乳腺癌细胞MCF7的石蜡组织切片，于60℃恒温箱中烘烤20分钟。然后浸泡于二甲苯中脱蜡2次，每次10分钟。然后依次浸泡于无水乙醇、95%的乙醇、70%的乙醇中，每次5分钟。再用pH=7.4的PBS洗3次，每次5分钟。

将组织切片放入至95℃枸橼酸钠缓冲溶液中恒温浸泡10～15分钟，并用pH=7.4的PBS洗3次，每次5分钟。

在组织切片上滴加正常的山羊血清封闭液，于室温下封闭20分钟后，甩去多余液体。然后在组织切片上直接滴加第一抗体，于37℃下静置2小时后，用pH=7.4的PBS洗3次，每次5分钟。在组织切片上滴加荧光染料标记的二抗，于37℃下静置40分钟后，用pH=7.4的PBS洗3次，每次5分钟。

在组织切片上滴加DAPI，使其终浓度为1μg/mL，然后于37℃下孵育10分钟。

采用甘油封片，然后采用CRI公司的多光谱显微成像系统进行镜检。图5为镜检结果图。

实施例1、实施例1的对比例1及实施例1的对比例2的镜检图表明，实施例1中的探针对肿瘤细胞具有双重定位的效果，且双重定位的结果基本相同，说明采用用于肿瘤病理诊断的探针来检测肿瘤细胞的结果比采用传统的检测方法获得的结果的准确性高。

实施例2

抗体为抗HER2蛋白抗体，石蜡肿瘤组织切片为人肝癌细胞HepG2。

实验步骤同实施例1。图6为可见光定位的镜检图，其中，发射波长为450～750nm；图7为荧光定位的镜检图，其中，激发波长为365nm，发射波长为400～750nm。

实施例2的对比例1

实验步骤同实施例1的对比例1。图8为镜检结果图。

实施例2的对比例2

实验步骤同实施例1的对比例2。图9为镜检结果图。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种用于肿瘤病理诊断的试剂盒，其特征在于，包括用于肿瘤病理诊断的探针；所述探针包括金纳米簇、肿瘤特异性标志物的抗体及考马斯亮蓝，所述金纳米簇与所述肿瘤特异性标志物的抗体通过点击化学方式连接，所述考马斯亮蓝与所述连接有所述肿瘤特异性标志物的抗体的金纳米簇通过静电方式结合；其中，所述金纳米簇、所述肿瘤特异性标志物的抗体及所述考马斯亮蓝的摩尔比为1～10:1～100:1～100。

2.根据权利要求1所述的用于肿瘤病理诊断的试剂盒，其特征在于，所述点击化学方式连接为所述金纳米簇表面修饰的叠氮基与所述肿瘤特异性标志物的抗体表面修饰的炔基发生点击化学反应而连接。

3.根据权利要求1所述的用于肿瘤病理诊断的试剂盒，其特征在于，所述金纳米簇的粒径为0.5～2nm。

4.根据权利要求1所述的用于肿瘤病理诊断的试剂盒，其特征在于，所述肿瘤特异性标志物的抗体为乳腺癌的抗HER2蛋白抗体、乳腺癌的抗P53蛋白抗体、乳腺癌的抗p185蛋白抗体、肺癌的CEA单克隆抗体或抗人肺癌单克隆抗体(McAb)N-35。

5.根据权利要求1所述的用于肿瘤病理诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括封闭剂、过氧化氢及核染剂。

6.根据权利要求5所述的用于肿瘤病理诊断的试剂盒，其特征在于，所述封闭剂为正常的山羊血清、牛血清白蛋白或牛奶粉。

7.根据权利要求5所述的用于肿瘤病理诊断的试剂盒，其特征在于，所述核染剂为DAPI或Hoechst。

8.一种使用如权利要求5所述的试剂盒对组织切片进行染色的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将冰冻组织切片或预先经脱蜡水化处理后的石蜡组织切片依次浸泡于无水乙醇、质量分数为95%的乙醇溶液以及质量分数为70%的乙醇溶液中，每次5分钟，然后用PBS洗涤；

在组织切片上滴加体积分数为3%的过氧化氢溶液，室温静置10分钟，并经PBS洗涤；

将组织切片放入至95℃枸橼酸钠缓冲溶液中恒温浸泡10～15分钟，并经PBS洗涤，其中，枸橼酸钠缓冲溶液的浓度为0.01mol/L；

在组织切片上滴加封闭剂，于室温下封闭20分钟后，甩去多余液体；

在组织切片上滴加所述用于肿瘤病理诊断的探针，室温下静置1小时、4℃过夜或者37℃下静置1小时，并经PBS洗涤，其中，所述探针的终浓度为0.01～10mmol/L；

在组织切片上滴加核染剂，然后于37℃下孵育7～10分钟，使核染剂的终浓度为0.1～10μg/ml，并经PBS或自来水洗涤；

封片，然后镜检。