JP6194882B2 - 生体物質の検出方法 - Google Patents
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Description
特定の生体物質を特異的に認識する生体物質認識分子がその粒子表面に結合した蛍光体内包ナノ粒子を発色剤として使用する、特定の生体物質を検出する方法であって、該蛍光体内包ナノ粒子が特定の生体物質以外の生体物質に非特異的に吸着するのを防止するためのブロッキング剤として、蛍光体を内包しないナノ粒子を使用することを含む。
本発明は、特定の生体物質を特異的に認識する生体物質認識分子がその粒子表面に結合した蛍光体内包ナノ粒子を発色剤として使用する、特定の生体物質を検出する方法であって、該蛍光体内包ナノ粒子が特定の生体物質以外の生体物質に非特異的に吸着するのを防止するためのブロッキング剤として、蛍光体を内包しないナノ粒子を使用する。
本発明に係る特定の生体物質を検出する方法として、具体的には、従来公知であるイムノクロマト法、イムノアッセイ、ウエスタンブロティング法、ノーザンブロティング法、サザンブロッティング法、DNAアレイ(またはDNAマイクロアレイもしくはDNAチップ)を使用するハイブリダイゼーション法、免疫組織化学法、免疫細胞化学法などを例示できる。これらのうち、組織切片を蛍光染色する方法が好ましく、特に免疫組織化学法が好ましい。
本発明で用いられる蛍光体としては、蛍光有機色素および半導体ナノ粒子を包含する蛍光物質を挙げることができる。200〜700nmの波長範囲である紫外〜近赤外光により励起されたときに、400〜900nmの波長範囲である可視〜近赤外光の発光を示す蛍光体が好ましい。
有機蛍光色素としては、フルオレセイン系色素分子、ローダミン系色素分子、Alexa Fluor(インビトロジェン社製)系色素分子、BODIPY(インビトロジェン社製)系色素分子、カスケード系色素分子、クマリン系色素分子、エオジン系色素分子、NBD系色素分子、ピレン系色素分子、Texas Red系色素分子、シアニン系色素分子等を挙げることができる。
本発明に用いる半導体ナノ粒子とは、コア/シェル構造を有するものであり、後述する半導体を形成する材料(素材)を含有するナノサイズ(1〜1,000nm)の粒径を有する粒子であって、コア部(芯部)とそれを被覆するシェル部(被覆部)で構成される多重構造を有する粒子をいう。II−VI族化合物,III−V族化合物またはIV族元素を成分として含有する半導体ナノ粒子(それぞれ「II−VI族半導体ナノ粒子」「III−V族半導体ナノ粒子」「IV族半導体ナノ粒子」ともいう。)のいずれかを用いることができ、一種単独でも二種以上併用してもよい。
半導体ナノ粒子としては、例えば、CdSe/ZnS,CdS/ZnS,InP/ZnS,InGaP/ZnS,Si/SiO2,Si/ZnS,Ge/GeO2,Ge/ZnSなどが挙げられるが、本発明はこれらに限定されない。
本発明で用いる蛍光体内包ナノ粒子とは、蛍光体がナノ粒子の内部に分散されたものを言い、ナノ粒子を構成する材料(本発明において「母体」と称することがある。)と蛍光体とは、化学的に結合していても、していなくてもよい。一方、本発明でブロッキング剤として用いる蛍光体を内包しないナノ粒子とは、蛍光体をナノ粒子の内部に含まないナノ粒子、典型的には上記のような母体のみからなるナノ粒子を言う。
本発明で用いる生体物質認識分子とは、標的とする特定の生体物質を認識し、該生体物質に特異的に結合および/または反応する分子を言う。
本発明は、上述のとおり、特定の発色剤とブロッキング剤とを併用する検出方法であり、組織切片を蛍光染色する従来公知の方法に好適である。組織切片は生体物質から構成されるが、病理組織切片には限定されず、また、細胞染色にも適用することができる。
以下、本発明の検出方法に含まれる下記の工程を順に説明する。
キシレンを入れた容器に、組織切片を浸漬させ、パラフィン除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、3〜30分間であることが好ましい。また必要により浸漬途中でキシレンを交換してもよい。
公知の方法にならい、特定の生体物質の賦活化処理を行う。賦活化条件に特に定めはないが、賦活液としては、0.01Mのクエン酸緩衝液(pH6.0)、1mMのEDTA溶液(pH8.0)、5%の尿素、0.1Mのトリス塩酸緩衝液などを含有する溶液を用いることができる。加熱機器はオートクレーブ、マイクロウェーブ、圧力鍋、ウォーターバスなどを用いることができる。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。温度は50〜130℃、時間は5〜30分間で行うことができる。
この組織化学染色工程(3)において、まず、生体物質認識分子を結合した蛍光体内包ナノ粒子のリン酸緩衝液生理的食塩水〔PBS〕分散液を調整し、切片に乗せ、特定の生体物質との反応を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。反応時間は、5分間〜24時間であることが好ましい。特定の生体物質と生体物質認識分子との反応に適した環境を安定して維持するための溶媒として、上記ではPBSを例示したが、PBS以外に、リン酸緩衝液、Tris緩衝液、MES緩衝液、クエン酸-リン酸緩衝液なども用いることができる。
本発明において所要の固定処理工程は、上記の染色工程(3)により導入された標識化プローブ生体物質を、組織切片に固定化する工程である。
具体的には、このような固定処理溶液に、組織化学染色工程(3)により得られた染色組織切片を浸漬することにより行うことができる。例えば、稀パラホルムアルデヒド水溶液中に、組織化学染色工程(3)により得られた染色組織切片を数分から数時間程度浸漬することにより行うことができる。
このようにして得られる切片に対し蛍光顕微鏡を用いて、特定の生体物質の発現レベルを輝点数または発光輝度を基に計測することができる。用いた蛍光体の吸収極大波長および蛍光波長に対応した励起光源および蛍光検出用光学フィルターは、当業者であれば適宜選択することができる。
<ブロッキング剤の製造>
ブロッキング剤として「蛍光体を内包しないナノ粒子」を、以下のようにして数種類製造した。これらの粒子は、母体の組成・平均粒径・ポリエチレングリコール〔PEG〕で被覆されているか否かの点で種類が異なるものである。
工程(1-1):ポリスチレンナノ粒子(Micromod社製「micromer (登録商標) 01-01-102」;平均粒径:100nm)1mgに対して、エチレンジアミン四酢酸〔EDTA〕を2mM含有したリン酸緩衝液生理的食塩水〔PBS〕を用いて3nMに調整した。
工程(1-4):工程(1-3)の沈殿物に、EDTAを2mM含有したPBSを加え、分散させて、再度遠心分離を行い、上澄みを除去するという洗浄を行った。同様の手順による洗浄を、さらに二回行った。その後、500μLのPBSで再分散させた。その結果、PEGで被覆された、蛍光体を内包しないポリスチレンナノ粒子が得られた。
工程(2-1):メラミン15gと37%ホルマリン29gと28%アンモニア水溶液1.5gとを混合して、pH8に調整した。
工程(2-3):「ネオペレックスG-15」(花王(株)製)0.12mlを水22ml中に溶解して、90℃に昇温したサンプルを四本準備した。
であった。
製造例1において、ポリスチレンナノ粒子の代わりに、製造例2で得られた平均粒径が98nmのメラミンナノ粒子を用いた以外は、製造例1と同様にして、PEGで被覆されたメラミンナノ粒子を製造した。
工程(4-1):エタノール40mLと14%アンモニア水9.7mLとを混合した。
工程(4-2):工程(4-1)の混合液を室温で撹拌しているところに、テトラエトキシシラン400μL(1.796mmol)を添加した。添加開始から7時間撹拌を行った。
また、工程(4-1)において、14%アンモニア水の配合量を9.7mLから、それぞれ10mL、11.5mL、13mLに変更した以外は、工程(4-1)〜(4-3)と同様にして、それぞれ平均粒径の異なる三種類のシリカナノ粒子を製造した。得られたシリカナノ粒子の平均粒径(変動係数)はそれぞれ、79nm(10%)、88nm(12.6%)、99nm(11.3%)であった。
工程(5-1):製造例4で得られた平均粒径が99nmのシリカナノ粒子1mgを、純水5mLに分散させた。アミノプロピルトリエトキシシラン100μLを添加し、室温で12時間撹拌した。
工程(5-3):工程(5-2)の沈殿物にエタノールを加えて、分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールによる洗浄と純水による洗浄とをさらに一回ずつ行った。
以下、製造例1において、ポリスチレンナノ粒子の代わりに、工程(5-3)で得られたアミノ基修飾シリカナノ粒子を用いた以外は、製造例1と同様にして、PEGで被覆された、蛍光体を内包しないシリカナノ粒子を製造した。
発色剤として「特定の生体物質を特異的に認識する生体物質認識分子がその粒子表面に結合した蛍光体内包ナノ粒子」を四種類製造した。それらは、いずれもPEGで被覆され、その粒子表面に抗HER2抗体が結合しているが、蛍光体の種類・母体の組成・平均粒径の点で異なるものである。
工程(6-1):ポリスチレンナノ粒子(Micromod社製「micromer (登録商標) 01-01-102」;平均粒径:100nm)10gを、水:エタノール=2:8の混合溶媒中に分散し、室温で3時間撹拌した。
工程(6-3):工程(6-2)の反応混合物を10,000×gで60分間遠心分離を行い、上澄みを除去した。そこにエタノールを加え、沈降物を分散させ再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールによる洗浄と純水による洗浄をさらに一回ずつ行った。その結果、蛍光体内包ポリスチレンナノ粒子が得られた。
工程(6-5):工程(6-4)の溶液に、最終濃度10mMとなるよう「SM(PEG)12」を混合し、3時間反応した。
工程(6-7):工程(6-6)の沈殿物に、EDTAを2mM含有したPBSを加えて分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を三回行った。最後に500μLのPBSを用いて再分散させることによって、PEGで被覆されたポリスチレンナノ粒子の粒子分散液が得られた。
工程(6-9):工程(6-8)の反応混合物について、ゲルろ過カラムで過剰のDTTを除去し、還元化抗HER2抗体溶液を得た。
工程(6-11):工程(6-10)の反応液に、10mMメルカプトエタノール4μLを添加し、反応を停止させた。
工程(7-1):メラミン15gと37%ホルマリン29gと28%アンモニア水溶液1.5gとを混合して、pH8に調整した。
工程(7-3):「ネオペレックスG-15」を0.12mlと、Cy5を1mg(0.00126mmol)とを水22mL中に溶解して90℃に昇温した。
工程(7-5):工程(7-4)の反応混合物を10,000×gで60分間遠心分離を行い、上澄みを除去した。そこにエタノールを加え、沈降物を分散させ再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールによる洗浄と純水による洗浄をさらに一回ずつ行った。このようにして得られた蛍光体内包メラミンナノ粒子をSEMにより観察したところ、平均粒径が97nm、変動係数が10%であった。
工程(8-1):Cy5のN-ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体(GEヘルスケア・ジャパン(株)製)1mg(0.00126mmol)をテトラエトキシシラン420μL(1.796mmol)と混合した。
工程(8-3):工程(8-2)の混合液を室温下で撹拌しているところに、工程(8-1)の混合液を添加した。添加開始から12時間撹拌を行った。
工程(8-8):工程(8-7)の反応液に、10mMメルカプトエタノール4μLを添加し、反応を停止させた。
工程(9-1):発光波長655nmを有するCdSe/ZnSのデカン分散液(インビトロジェン(株)製「Qdot655」)10μLとテトラエトキシシラン40μLとを混合した。
工程(9-3):工程(9-2)の混合液を室温下で撹拌しているところに、工程(9-1)の混合液を添加した。添加開始から12時間撹拌を行った。
[比較例]ブロッキング剤としてBSAを使用
発色剤として、製造例6〜9で得られた発色剤〈A〉〜〈D〉それぞれを使用して、DAB染色により判定結果が既知のヒト乳房組織の隣接切片を用い、下記の工程に従って免疫組織染色を行った。該切片として、コスモ・バイオ(株)製の組織アレイスライド「CB-A712」を用いた。
工程(C-2):この切片を、エタノールを入れた容器に30分間浸漬させた。途中三回エタノールを交換した。
工程(C-4):この切片を、10mMクエン酸緩衝液(pH6.0)に30分間浸漬させた。
工程(C-6):PBSを入れた容器に、オートクレーブ処理後の切片を30分間浸漬させた。
工程(C-8):1%BSA含有PBSで0.05nMに希釈した発色剤〈A〉〜〈D〉それぞれを各切片に乗せて、3時間放置した。
工程(C-10):Merck Chemicals社製「Aquatex」を滴下後、カバーガラスを乗せ封入した。
比較例において、1%BSA含有PBSの代わりに、ポリスチレンナノ粒子(Thermo Fisher Scientific社製「3070A」;平均粒径:70nm)含有PBS分散液を用いた以外は、比較例と同様にして切片を免疫組織染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。
比較例において、1%BSA含有PBSの代わりに、ポリスチレンナノ粒子(Thermo Fisher Scientific社製「3080A」;平均粒径:80nm)含有PBS分散液を用いた以外は、比較例と同様にして切片を免疫組織染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。
比較例において、1%BSA含有PBSの代わりに、ポリスチレンナノ粒子(Thermo Fisher Scientific社製「3090A」;平均粒径:90nm)含有PBS分散液を用いた以外は、比較例と同様にして切片を免疫組織染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。
比較例において、1%BSA含有PBSの代わりに、ポリスチレンナノ粒子(Micromod社製「micromer (登録商標) 01-01-102」;平均粒径:100nm)含有PBS分散液を用いた以外は、比較例と同様にして切片を免疫組織染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。
比較例において、1%BSA含有PBSの代わりに、製造例2で得られたメラミンナノ粒子(平均粒径:72nm)含有PBS分散液を用いた以外は、比較例と同様にして切片を免疫組織染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。
比較例において、1%BSA含有PBSの代わりに、製造例2で得られたメラミンナノ粒子(平均粒径:83nm)含有PBS分散液を用いた以外は、比較例と同様にして切片を免疫組織染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。
比較例において、1%BSA含有PBSの代わりに、製造例2で得られたメラミンナノ粒子(平均粒径:91nm)含有PBS分散液を用いた以外は、比較例と同様にして切片を免疫組織染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。
比較例において、1%BSA含有PBSの代わりに、製造例2で得られたメラミンナノ粒子(平均粒径:98nm)含有PBS分散液を用いた以外は、比較例と同様にして切片を免疫組織染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。
比較例において、1%BSA含有PBSの代わりに、製造例3で得られたPEG被覆メラミンナノ粒子含有PBS分散液を用いた以外は、比較例と同様にして切片を免疫組織染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。
比較例において、1%BSA含有PBSの代わりに、製造例4で得られたシリカナノ粒子(平均粒径:69nm)含有PBS分散液を用いた以外は、比較例と同様にして切片を免疫組織染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。
比較例において、1%BSA含有PBSの代わりに、製造例4で得られたシリカナノ粒子(平均粒径:79nm)含有PBS分散液を用いた以外は、比較例と同様にして切片を免疫組織染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。
比較例において、1%BSA含有PBSの代わりに、製造例4で得られたシリカナノ粒子(平均粒径:88nm)含有PBS分散液を用いた以外は、比較例と同様にして切片を免疫組織染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。
比較例において、1%BSA含有PBSの代わりに、製造例4で得られたシリカナノ粒子(平均粒径:99nm)含有PBS分散液を用いた以外は、比較例と同様にして切片を免疫組織染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。
比較例において、1%BSA含有PBSの代わりに、製造例5で得られたPEG被覆シリカナノ粒子(平均粒径:99nm)含有PBS分散液を用いた以外は、比較例と同様にして切片を免疫組織染色し、蛍光顕微鏡下で観察した。
Claims (3)
- 特定の生体物質を検出する方法であって、
上記生体物質が、組織切片を構成するものであり、
上記方法が、発色剤として、特定の生体物質を特異的に認識する生体物質認識分子が表面に結合した蛍光体内包ナノ粒子を使用する蛍光染色を含み、
上記蛍光染色において、
該蛍光体内包ナノ粒子が特定の生体物質以外の生体物質に非特異的に吸着するのを防止す
るためのブロッキング剤が、蛍光体を内包しないナノ粒子であり、
上記蛍光体内包ナノ粒子および上記蛍光体を内包しないナノ粒子の粒子表面の少なく
とも一部が、それぞれ、生体物質に吸着しづらい同じ有機分子で被覆されており、
前記有機分子が、ポリエチレングリコール、ポリメチルメタクリレート、またはポリビニルアルコール(PVA)である、
検出方法。 - 上記蛍光体内包ナノ粒子の母体と、上記の蛍光体を内包しないナノ粒子の母体とが、同
じ組成を有する、請求項1に記載の検出方法。 - 上記蛍光体内包ナノ粒子の平均粒径と、上記蛍光体を内包しないナノ粒子の平均粒
径との差が、25%以内である、請求項1または2に記載の検出方法。
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