CN112198036A - 一种改良的猪脑组织石蜡切片免疫组化染色方法 - Google Patents
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Abstract
本发明生物医学技术领域，公开了一种改良的猪脑组织石蜡切片免疫组化染色方法，在有效降低了抗原修复液成本的情况下利于抗原的表达，同时也解决了修复方式不当引起修复过程中的掉片现象，是一种有效的猪脑组织石蜡切片免疫组化染色方法，应用前景广泛，值得大力推广。
Description
技术领域
本发明属于医学化工技术领域，具体涉及一种改良的猪脑组织石蜡切片免疫组化染色方法。
背景技术
免疫组化在病理组织学实验中应用广泛，具有确定组织细胞内特定抗原，对其进行定位、定性及相对定量的研究的作用。在进行免疫组化实验中，封闭方法的选择，封闭液的种类、使用方法都对结果有很大的影响，抗原修复液的选择和使用方式都是决定了组化质量的关键因素。组织在制作过程中，由于化学试剂的作用封闭了抗原，又由于热的作用致使部分抗原的肽链发生扭曲，致使在免疫组化的染色过程中不能将其显示出来，为了解决上述的问题，利用化学试剂和热的作用将这些抗原重新暴露出来或修正过来的过程称为抗原修复。
常规的猪脑组织免疫组化染色方法包括如下步骤：
1)石蜡切片，脱蜡与水化；
2)0.3％或3％H2O2去离子水(无色液体)孵育10-30min，以灭活内源性过氧化物酶活性；
3)蒸馏水冲洗，PBS浸泡5min3次
4)抗原修复：微波(建议30min内4次中火)、高压、酶修复方法；自然冷却，再用PBS冲洗3min×3次.
5)血清封闭：室温15-30min，尽可能与第二抗体来源一致；倾去，勿洗；
6)滴加适当比例稀释的第一抗体，37℃孵育2～3小时或4℃过夜(最好复温处理)；PBS冲洗，3min×5次；
7)滴加生物素标记的第二抗体，室温或37℃孵育30min-1h；
8)PBS冲洗，3min×5次；
9)滴加SP(链霉亲和素-过氧化物酶)，室温或37℃孵育30min-1h；10)PBS冲洗，3min×5次；
10)显色剂显色；
11)自来水充分冲洗；
12)可进行复染，脱水，透明；
13)选择适当的封片剂，封片。
但由于猪脑组织属于容易掉片的组织，抗原修复时间过长或者温度不适，易造成组织的脱落；抗原修复液通常使用柠檬酸盐修复缓冲液，只能一次性使用，因此大大增加了免疫组化的成本；在滴加第一抗体前未将细胞进行破膜，也不利于抗体的进入。
发明内容
本发明提出一种改良的猪脑组织石蜡切片免疫组化染色方法，以解决现有技术中存在的一个或多个技术问题，至少提供一种有益的选择或创造条件。
为了克服上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种改良的猪脑组织石蜡切片免疫组化染色方法，包括脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与贴片、脱蜡、染色和封片。
作为上述方案的进一步改进，所述脱水过程中采用的脱水剂为无水乙醇。
作为上述方案的进一步改进，所述无水乙醇的体积浓度为50-100％，优选为70-100％
作为上述方案的进一步改进，所述脱水试剂中还包括水，优选为蒸馏水。
作为上述方案的进一步改进，所述透明过程中采用的透明剂为石蜡。
作为上述方案的进一步改进，所述脱蜡过程中采用的脱蜡剂为二甲苯。
作为上述方案的进一步改进，所述猪脑组织石蜡切片免疫组化染色方法具体包括以下步骤：
其中，罗马数字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ等均表示第几次使用某试剂，例如，PBSⅢ即表示第3次使用PBS，其它同理。
同时，各步骤的作用如下：
步骤(1)-(3)是采用二甲苯进行脱蜡，组织只有脱蜡后才能进行染色；
步骤(4)-(8)是采用无水乙醇用来洗去步骤(1)-(3)的二甲苯；同时乙醇浓度梯度降低后再采用步骤(9)中的蒸馏水进行切片复水(复水就是使切片能放在水的环境中，但若直接放在水中会造成组织变脆脱落，不可取)；
步骤(10)-(12)是采用PBS清洗切片；
步骤(13)采用0.1％TritonX-100的PBS，可增加细胞膜的通透性，利于抗原抗体结合，增大实验成功几率；
步骤(14)-(15)是采用PBS清洗切片；
步骤(16)是消除内源性过氧化物酶，减少背景着色；
步骤(17)-(19)是采用PBS清洗切片；
步骤(22)是通过加入标记的一抗，与组织中的抗原结合；
步骤(26)是采用PBS清洗切片；
步骤(23)-(25)是通过二抗和带有标记的一抗结合，经步骤(30)的显色剂显色，检测组织中的抗原；
步骤(27)-(29)是采用PBS清洗切片；
步骤(34)-(38)是采用无水乙醇浓度梯度由低至高对组织进行脱水；
步骤(39)-(40)是采用二甲苯进行脱脂和透明，避免镜下观察组织结构模糊。
此外，步骤(20)中，采用生理盐水代替了现有技术中的抗原修复液(主要成分是柠檬酸纳缓冲液)，但也能与抗原修复液达到一样的效果，这样大大缩小了材料的成本投入。
步骤(21)中是通过将5单位的纯山羊血清溶于95单位的PBS溶液中，制成5％的山羊血清。
步骤(22)中第一抗体与PBS溶液按重量份比为1：(200-2000)，抗体稀释的浓度由组织中抗原的种类及组织状态决定。以1：2000为例，即1单位抗体溶液溶于2000单位PBS溶液中。
DAB为3,3′-diaminobenzidine，是一种显色剂，显色剂，有毒，所以操作是最好带口罩和手套。它主要和蛋白质的NH2或SH基团结合，形成稳定的nn键或ns键，然后DAB中的显色基团就能显示出颜色，标记到已经暴露的蛋白质上，从而显示我们目标细胞的蛋白质分布及种类等。试剂盒的成分根据各个公司有所不同，但一般包括DAB原液，稀释剂和信号放大剂。又叫DAB染色试剂盒，常应用在FMC流式细胞、免疫荧光IF、IP、ELISA等实验，或用于标记抗体，如胶体金标记抗体，红色罗丹明(RBITC)标记抗体，橙黄色PE标记抗体，绿色荧光素(FITC)标记抗体等。
本发明通过合理地更改酒精的梯度和处理时长，提高了脱水效果，同时有效防止脑组织变硬；使用微波高档10min、静置2min、微波低档10min、自然冷却的方法，在达到抗原修复所需温度的状态下，可使缓冲液进行有效的热交换和对流，保证缓冲液内部条件均一，防止爆沸现象，由此大大降低了脱片风险；抗原修复液通常使用柠檬酸盐修复缓冲液，且为一次性使用，免疫组化的成本较高，而本发明采用生理盐水作为抗原修复液，节约了成本；在加入一抗前使用0.1％TritonX-100的PBS做细胞破膜剂，可有效提高细胞膜的通透性，使抗体更容易进入细胞内，利于组织内抗原与抗体的结合。
作为上述方案的进一步改进，步骤(22)中，在37℃孵育2～3小时或4℃过夜以后，还包括进行复温处理处理过程。
作为上述方案的进一步改进，步骤(30)中，所述显色剂包括DAB。
所述的一种改良的猪脑组织石蜡切片免疫组化染色方法在生物医学领域中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种改良的猪脑组织石蜡切片免疫组化染色方法，在有效降低了抗原修复液成本的情况下利于抗原的表达，同时也解决了修复方式不当引起修复过程中的掉片现象，是一种有效的猪脑组织石蜡切片免疫组化染色方法，应用前景广泛，值得大力推广。
附图说明
图1是实施例1的猪脑组织在经放大40倍后的整体图；
图2是实施例1的猪脑组织在经放大400倍后的整体图；
图3是对比例1的猪脑组织在经放大40倍后的整体图；
图4是对比例1的猪脑组织在经放大400倍后的整体图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行具体描述，以便于所属技术领域的人员对本发明的理解。有必要在此特别指出的是，实施例只是用于对本发明做进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术熟练人员，根据上述发明内容对本发明所作出的非本质性的改进和调整，应仍属于本发明的保护范围。同时，下述所提及的原料未详细说明的，均为市售产品；未详细提及的工艺步骤或提取方法为均为本领域技术人员所知晓的工艺步骤或提取方法。
实施例1
一种改良的猪脑组织石蜡切片免疫组化染色方法，具体包括以下步骤：
图1是实施例1的猪脑组织在经放大40倍后的整体图。从图1可以看出，脑组织经抗原修复后不仅未产生掉片现象而且组织较为完整。
图2是实施例1的猪脑组织在经放大400倍后的整体图。从图2可以看出，经本发明处理后的抗原抗体结合明显，可见阳性细胞的表达。
对比例1
常规的猪脑组织免疫组化染色方法包括如下步骤：
(1)石蜡切片，脱蜡与水化；
(2)0.3％或3％H2O2去离子水(无色液体)孵育10-30min，以灭活内源性过氧化物酶活性；
(3)蒸馏水冲洗，PBS浸泡5min3次
(4)抗原修复：微波(建议30min内4次中火)、高压、酶修复方法；自然冷却，再用PBS冲洗3min×3次.
(5)血清封闭：室温15-30min，尽可能与第二抗体来源一致；倾去，勿洗；
(6)滴加适当比例稀释的第一抗体，37℃孵育2～3小时或4℃过夜(最好复温处理)；PBS冲洗，3min×5次；
(7)滴加生物素标记的第二抗体，室温或37℃孵育30min-1h；
(8)PBS冲洗，3min×5次；
(9)滴加SP(链霉亲和素-过氧化物酶)，室温或37℃孵育30min-1h；10)PBS冲洗，3min×5次；
(10)显色剂显色；
(11)自来水充分冲洗；
(12)可进行复染，脱水，透明；
(13)选择适当的封片剂，封片。
图3是对比例1的猪脑组织在经放大40倍后的整体图，从图3可以看出，组织在修复过程中因高温爆沸产生破裂。
图4是对比例1的猪脑组织在经放大400倍后的整体图，从图4可以看出，组织中抗原抗体结合不理想，未见阳性表达。
对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下还可以做出若干简单推演或替换，而不必经过创造性的劳动。因此，本领域技术人员根据本发明的揭示，对本发明做出的简单改进都应该在本发明的保护范围之内。上述实施例为本发明的优选实施例，凡与本发明类似的工艺及所作的等效变化，均应属于本发明的保护范畴。
Claims (10)
1.一种改良的猪脑组织石蜡切片免疫组化染色方法，其特征在于，包括脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与贴片、脱蜡、染色和封片。
2.根据权利要求1所述的猪脑组织石蜡切片免疫组化染色方法，其特征在于，所述脱水过程中采用的脱水剂为无水乙醇。
3.根据权利要求2所述的猪脑组织石蜡切片免疫组化染色方法，其特征在于，所述无水乙醇的体积浓度为50-100％，优选为70-100％。
4.根据权利要求1所述的猪脑组织石蜡切片免疫组化染色方法，其特征在于，所述脱水试剂中还包括水，优选为蒸馏水。
5.根据权利要求1所述的猪脑组织石蜡切片免疫组化染色方法，其特征在于，所述脱蜡过程中采用的脱蜡剂为二甲苯。
6.根据权利要求1所述的猪脑组织石蜡切片免疫组化染色方法，其特征在于，所述猪脑组织石蜡切片免疫组化染色方法具体包括以下步骤：
7.根据权利要求1所述的猪脑组织石蜡切片免疫组化染色方法，其特征在于，步骤(16)的处理条件为：在室温条件进行避光处理10-20min，优选为15min。
8.根据权利要求1所述的猪脑组织石蜡切片免疫组化染色方法，其特征在于，步骤(22)中，在37℃孵育2～3小时或4℃过夜以后，还包括复温处理。
9.根据权利要求1所述的猪脑组织石蜡切片免疫组化染色方法，其特征在于，步骤(30)中，所述显色剂包括DAB。
10.权利要求1-8任一项所述的一种改良的猪脑组织石蜡切片免疫组化染色方法在生物医学领域中的应用。
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| CN202010973955.0A CN112198036A (zh) | 2020-09-16 | 2020-09-16 | 一种改良的猪脑组织石蜡切片免疫组化染色方法 |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113720669A (zh) * | 2021-08-27 | 2021-11-30 | 吴鸿雁 | 基于动物器官或组织构建的免疫组化质控品 |
| CN116990101A (zh) * | 2023-09-27 | 2023-11-03 | 四川大学华西医院 | 一种易掉片组织的预处理方法及其多重免疫荧光染色方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN101042317A (zh) * | 2007-04-27 | 2007-09-26 | 孝感学院 | 一种骨骼肌横纹的切片染色方法 |
| CN103245789A (zh) * | 2013-04-27 | 2013-08-14 | 深圳先进技术研究院 | 用于肿瘤病理诊断的试剂盒及对组织切片进行染色的方法 |
| CN104620107A (zh) * | 2012-07-17 | 2015-05-13 | 通用电气公司 | 检测生物样品中dna、rna和蛋白质的方法 |
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-
2020
- 2020-09-16 CN CN202010973955.0A patent/CN112198036A/zh active Pending
Patent Citations (5)
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| CN116990101B (zh) * | 2023-09-27 | 2023-12-15 | 四川大学华西医院 | 一种易掉片组织的预处理方法及其多重免疫荧光染色方法 |
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