CN106466488B - 具有肿瘤细胞靶向性的超细磁性核壳纳米材料及其制备和应用 - Google Patents
具有肿瘤细胞靶向性的超细磁性核壳纳米材料及其制备和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了具有肿瘤细胞靶向性的超细磁性核壳纳米材料及其制备和应用。本发明以超细磁性纳米Fe3O4材料为核，且所述的核被标记有异硫氰酸荧光素的二氧化硅层所包覆；以多孔二氧化硅为壳层，且所述壳层包覆所述的标记有异硫氰酸荧光素的二氧化硅层，同时，在所述壳层的表面修饰有肿瘤靶向分子LyP‑1。本发明材料具有肿瘤细胞靶向、荧光示踪、核磁成像的多功能。通过靶向分子和荧光分子，对肿瘤组织实现特异性识别，介导进入肿瘤组织，从而实现制备高效靶向功能的对肿瘤组织检测和治疗的药物的目的，具有极高的生物医学意义。
Description
技术领域
本发明属于纳米材料与生物医药的交叉领域，具体涉及具有肿瘤细胞靶向性的超细磁性核壳纳米材料及其制备和应用。
背景技术
磁共振成像(MRI)因其具有的无创性、无放射性、高组织分辨率、良好的信噪比、及可能三维成像的优势而成为实体肿瘤影像学诊断的优先选择。与此同时，为增加不同器官尤其是病变组织与正常组织的区别，可通过应用造影剂并改变附近的原子对外部磁场的响应缩短纵向弛豫时间(longitudinal relaxation time,T1)或横向弛豫时间(transverserelaxation time,T2)以增强灵敏度和组织对比度，从而提高疾病诊断的敏感性和特异性。据此，将MRI造影剂分为T1造影剂和T2造影剂。
T1造影剂是通过水分子中的氢核和顺磁性金属离子直接作用来缩短T1，从而增强信号，图像较亮；T1造影剂大部分使用镧系金属钆(Gd)或者其他衍生材料，目前在临床使用上较为广泛。但由于该类造影剂的组织分布缺乏特异性、磁豫效率低以及半衰期短等原因，其在临床应用仍有很大的局限性。因此，研究者现将目光转向于T2造影剂。
T2造影剂是通过对外部局部磁性环境的不均匀性进行干扰，使邻近氢质子在弛豫中很快产生相(diphase)来缩短T2，从而减弱信号，图像较暗。超顺磁铁氧化物颗粒具有使其所在区域质子信号降低并将图像转变为暗信号的特征，同时，超顺磁铁氧化物颗粒还具有灵敏度度高、易代谢、易修饰、生物相容性好、易调控磁学性质和弛豫效能的优势。体内MRI实验证明了其作为造影剂的良好效果。因此超顺磁铁氧化物颗粒，在MRI造影剂领域表现出诱人的应用前景。但是，纳米四氧化三铁由于尺寸小、比表面大，在水介质中容易聚集，对生物体器官、组织无特异性，无法准确的使造影材料进入肿瘤细胞，使得正常组织与肿瘤组织不能区分开来。
对此，最新的研究通过在超顺磁铁氧化物颗粒表面修饰特殊配体，例如维他命、抗体、多肽类、多糖类、核苷酸等，实现与肿瘤细胞相应的受体的特异性结合，赋予超顺磁铁氧化物颗粒以肿瘤靶向性。然而，目前报道的超顺磁性氧化物颗粒大多采用高分子进行修饰，其在酸性的肿瘤微环境内，不能较好的保护氧化铁核心不被降解。因此，发明一种对磁性氧化铁颗粒具有良好保护作用的新型靶向功能材料，通过靶向分子准确进入肿瘤细胞，对于正确诊断肿瘤组织、提高肿瘤治疗效果是十分有价值的。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种具有肿瘤细胞靶向性的超细磁性核壳纳米材料及其制备和应用，通过二氧化硅层保护超细磁性纳米Fe3O4内核并提供接枝位点，以接枝异硫氰酸荧光素而具有荧光性能，并通过在二氧化硅层的表面包覆多孔二氧化硅壳层而具有好的水溶性和生物相容性，进而在壳层表面修饰靶向分子，从而使得材料兼具肿瘤细胞靶向、荧光示踪、核磁成像的多功能，对肿瘤组织实现特异性识别，介导进入肿瘤组织，可用于制备高效靶向功能的对肿瘤细胞诊断和治疗的药物或药物载体。
本发明的一个方面在于提供具有肿瘤细胞靶向性的超细磁性核壳纳米材料，其中，以超细磁性纳米Fe3O4材料为核，且所述的核被标记有异硫氰酸荧光素的二氧化硅层所包覆；以多孔二氧化硅为壳层，且所述壳层包覆所述的标记有异硫氰酸荧光素的二氧化硅层，同时，在所述壳层的表面接枝修饰有肿瘤靶向分子LyP-1。
在本发明上述方面的一些实施方案中，所述超细磁性纳米Fe3O4材料是直径为5～10nm的磁性Fe3O4纳米颗粒。
在本发明上述方面的一些实施方案中，表面接枝修饰的所述肿瘤靶向分子LyP-1的重量占比为10～15％，接枝密度为1.5×1017/m2～3.0×1017/m2。
本发明的另一个方面在于提供所述具有肿瘤细胞靶向性的超细磁性核壳纳米材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)利用水热法合成尺寸均一的超细磁性Fe3O4纳米颗粒，分散于正己烷溶液中，得到浓度为10～25mg/mL的超细磁性Fe3O4纳米颗粒正己烷溶液；
(2)取一定体积的步骤(1)得到的超细磁性Fe3O4纳米颗粒的正己烷溶液，以其中超细磁性Fe3O4纳米颗粒的质量为100mg计，将所述超细磁性Fe3O4纳米颗粒的正己烷溶液分散于30～60mL的环己烷中，向其中加入8～15mL的辛基苯基聚氧乙烯醚并超声分散均匀后，加入0.3～0.8mL的质量百分浓度为20～30％的氨水溶液并持续搅拌0.5～1小时，形成稳定的微乳液；在不断搅拌的条件下，向上述微乳液中滴加0.02～0.05mL的正硅酸乙酯，反应8～24小时；然后，将预先混合的由3～6mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷和0.005～0.02g的异硫氰酸荧光素组成的溶液加入至上述体系中，避光反应6～12小时；最后，磁性分离并收集，经洗涤、干燥后得到Fe3O4@SiO2-FITC样品；
(3)将步骤(2)所得的Fe3O4@SiO2-FITC样品超声分散于35～50mL的浓度为0.003～0.01g/mL的十六烷基三甲基溴化铵水溶液中，同时向其中加入2～5mL正己烷，搅拌0.5～1小时后，向其中加入0.3～0.6mL质量百分浓度为20～30％氨水溶液，滴加0.1～0.4mL正硅酸乙酯，在25～35℃下避光反应8～24小时后，通过磁性分离收集到的反应产物，经洗涤后在乙醇中70～90℃回流12～24小时以脱除十六烷基三甲基溴化铵模板分子，最后，再次磁性分离并收集，经洗涤、干燥后得到Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2样品；
(4)将步骤(3)所得的Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2样品再分散于乙醇中，并加入0.01～0.04mL巯丙基三乙氧基硅烷，反应6～12小时后，通过磁性分离收集到反应产物，经洗涤后再次分散于乙醇中，再向其中加入由0.01～0.04g马来酰亚胺-LyP-1溶解于2～4mL乙醇所形成的溶液，反应6～12小时，然后，再次磁性分离并收集，经洗涤、干燥后得到最终产物Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2-LyP-1样品。
在本发明上述方面的一些实施方案中，所述具有肿瘤细胞靶向性的超细磁性核壳纳米材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)利用水热法合成尺寸均一的超细磁性Fe3O4纳米颗粒，分散于正己烷溶液中，得到浓度为20mg/mL的超细磁性Fe3O4纳米颗粒正己烷溶液；
(2)取5mL的步骤(1)得到的超细磁性Fe3O4纳米颗粒的正己烷溶液，将所述超细磁性Fe3O4纳米颗粒的正己烷溶液分散于50mL的环己烷中，向其中加入10mL的辛基苯基聚氧乙烯醚并超声分散均匀后，加入0.5mL的质量百分浓度为28％的氨水溶液并持续搅拌0.5～1小时，形成稳定的微乳液；在不断搅拌的条件下，向上述微乳液中滴加0.04mL的正硅酸乙酯，反应8～24小时；然后，将预先混合的由5mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷和0.01g的异硫氰酸荧光素组成的溶液加入至上述体系中，避光反应6～12小时；最后，磁性分离并收集，经洗涤、干燥后得到Fe3O4@SiO2-FITC样品；
(3)将步骤(2)所得的Fe3O4@SiO2-FITC样品超声分散于40mL的浓度为0.005g/mL的十六烷基三甲基溴化铵水溶液中，同时向其中加入3mL正己烷，搅拌0.5～1小时后，向其中加入0.4mL质量百分浓度为28％氨水溶液，滴加0.2mL正硅酸乙酯，在25～35℃下避光反应8～24小时后，通过磁性分离收集到的反应产物，经洗涤后在乙醇中70～90℃回流12～24小时以脱除十六烷基三甲基溴化铵模板分子，最后，再次磁性分离并收集，经洗涤、干燥后得到Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2样品；
(4)将步骤(3)所得的Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2样品再分散于乙醇中，并加入0.02mL巯丙基三乙氧基硅烷，反应6～12小时后，通过磁性分离收集到反应产物，经洗涤后再次分散于乙醇中，再向其中加入由0.01g马来酰亚胺-LyP-1溶解于2mL乙醇所形成的溶液，反应6～12小时，然后，再次磁性分离并收集，经洗涤、干燥后得到最终产物Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2-LyP-1样品。
在本发明上述方面的一些实施方案中，步骤(1)中，所述超细磁性Fe3O4纳米颗粒的直径为5～10nm。
在本发明上述方面的一些实施方案中，步骤(1)中所述的利用水热法合成尺寸均一的超细磁性Fe3O4纳米颗粒，可以采取以下步骤来实现：
将乙醇溶液、油酸溶液、浓度为0.08～0.15g/mL的氢氧化钠溶液混合均匀，再向其中滴加浓度为0.06～0.08g/mL的硫酸亚铁铵溶液，保持搅拌下混合均匀，得到混合溶液；将混合溶液转移至水热釜中，在170～190℃反应9～11小时，洗涤后即得；其中，以体积比计，所述氢氧化钠溶液：乙醇溶液：油酸溶液：硫酸亚铁铵溶液为1：(0.8～1.5)：(1～1.2)：(0.8～1.6)。
采用多种测试手段对上述方法制备的最终产物进行表征，如透射电子显微镜、扫描电子显微镜、傅里叶红外光谱仪等，鉴定所述最终产物为一种具有强的细胞靶向性和超顺磁性的超细核壳纳米材料。
本发明的再一个方面在于提供所述具有肿瘤细胞靶向性的超细磁性核壳纳米材料在制备靶向诊断肿瘤药物、治疗肿瘤药物或药物载体中的应用。
在本发明上述应用的一些实施方案中，所述具有肿瘤细胞靶向性的超细磁性核壳纳米材料用作肿瘤细胞靶向材料，尤其是是胰腺癌细胞靶向材料。
在本发明上述应用的另一些实施方案中，所述具有肿瘤细胞靶向性的超细磁性核壳纳米材料用作核磁共振材料，敏感度高，分辨率好。
在本发明上述应用的又一些实施方案中，所述具有肿瘤细胞靶向性的超细磁性核壳纳米材料用作生物荧光标记物。
本发明中，一方面，以超细磁性Fe3O4纳米颗粒为核，并在超细磁性Fe3O4纳米颗粒的表面包覆二氧化硅层，对磁性Fe3O4颗粒起到良好的保护作用；还在二氧化硅层的表面进行氨基修饰(APTES)，以提供荧光分子接枝位点，并接枝荧光染料(异硫氰酸荧光素，FITC)，经特定激光激发可发绿光，使纳米材料具有好的荧光性能；另一方面，在标记了异硫氰酸荧光素的二氧化硅层的表面包覆多孔二氧化硅壳层，使具有磁共振成像功能的超顺磁纳米粒子具有较好的水溶性和生物相容性，还提高了超细磁性Fe3O4纳米颗粒的分散性，使材料具有较大的比表面积，提供充足的接枝位点；进而，对多孔二氧化硅壳层材料表面进行巯基修饰，提供更多的靶向分子接枝位点，并接枝肿瘤细胞靶向分子LyP-1，提高肿瘤细胞靶向性；由此，实现了所合成的超细磁性核壳纳米材料的肿瘤细胞靶向、组织荧光示踪、核磁成像的多功能化。
本发明方法中，采用水热法合成超细磁性纳米材料(5～10nm)，在表面包裹二氧化硅层并修饰荧光分子FITC，进而再包裹多孔二氧化硅壳层，并在壳层表面修饰LyP-1作为肿瘤靶向分子，从而实现多功能化。本发明方法反应温和、操作简便、原料易得、效果突出，所制得的磁性多孔纳米材料修饰有肿瘤靶向分子和荧光分子，其具有粒径均一、分散性好、水溶性好、生物相容性高、靶向性强、荧光信号强、核磁成像分辨率高的优异性能。
本发明的超细磁性核壳纳米材料能够用作肿瘤细胞高效靶向材料、敏感度高的核磁共振成像材料和强荧光的生物荧光标记物，具有极高的生物医学意义。尤其是，本发明的超细磁性核壳纳米材料对胰腺癌细胞具有较高的靶向性、磁共振成像敏感度高、强荧光。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
(1)本发明的超细磁性核壳纳米材料具有高分辨率核磁成像和较高靶向性功能；肿瘤诊断准确；
(2)本发明的超细磁性核壳纳米材料尺寸小、粒径均一、降低因为粒径过大而被网状内皮系统吞噬的风险；
(3)本发明的超细磁性核壳纳米材料分散性、水溶性、生物相容性好；
(4)本发明的超细磁性核壳纳米材料在488mm激光激发下，可发射强信号的绿色荧光，可作为较好的生物荧光标记使用；
(5)本发明方法所采用的原材料简单易得，工艺简单，反应温和；
(6)本发明的超细磁性核壳纳米材料在医药和生物等领域应用前景广泛。
附图说明
图1是实施例1中步骤(一)制得的超细磁性Fe3O4纳米颗粒的透射电镜(TEM)照片。
图2a是实施例1中步骤(三)得到的Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2样品的透射电镜(TEM)照片。
图2b是实施例1中步骤(三)得到的Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2样品的扫描电镜(SEM)照片。
图2c是实施例1中步骤(一)制得的超细磁性Fe3O4纳米颗粒和步骤(三)得到的Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2样品的XRD对照图。
图2d是实施例1中步骤(一)制得的超细磁性Fe3O4纳米颗粒和步骤(三)得到的Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2样品的磁滞回线对照图。
图2e是实施例1中步骤(三)得到的Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2样品的氮气吸附-解吸测试结果。
图2f是实施例1中步骤(三)得到的Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2样品和步骤(四)得到的最终产物Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2-LyP-1样品的傅里叶红外光谱(FTIR)对照图。
图2g是实施例1中步骤(四)得到的最终产物Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2-LyP-1样品的结构的微球数据模拟图。
图3是实施例1中步骤(四)得到的最终产物Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2-LyP-1样品的荧光表征。
图4是实施例1中步骤(三)得到的Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2样品和步骤(四)得到的最终产物Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2-LyP-1样品的细胞毒性测试结果。
图5是将实施例1中步骤(三)得到的Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2样品和步骤(四)得到的最终产物Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2-LyP-1样品分别和肿瘤细胞小鼠胰腺癌细胞Pan02/非肿瘤细胞小鼠内皮细胞MS1体外结合的流式检测结果。
图6是将实施例1中步骤(三)得到的Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2样品和步骤(四)得到的最终产物Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2-LyP-1样品分别和肿瘤细胞小鼠胰腺癌细胞Pan02或非肿瘤细胞小鼠内皮细胞MS1共培养后磁共振T2加权影像对照图。
图7a为Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2-LyP-1经尾静脉注射C57BL/6原位胰腺癌小鼠后，绿色荧光的LyP-1-纳米材料在组织中的分布图。
图7b为Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2经尾静脉注射C57BL/6原位胰腺癌小鼠后，绿色荧光的纳米材料在组织中的分布图。
图8a是将小鼠放入小动物磁共振线圈的MR装置以及位置示意图。
图8b是LyP-1-磁性纳米材料(Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2-LyP-1)和磁性纳米材料(Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2)分别应用于小鼠体内的核磁共振成像对照图。
具体实施方式
为了更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细说明。应理解，下述的实施实例仅用于说明本发明，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
以下实施例中所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购得的常规产品。
实施例1：具有肿瘤细胞靶向性的超细磁性核壳纳米材料的制备
(一)超细磁性Fe3O4纳米颗粒的制备
将6mL氢氧化钠溶液(0.1g/mL)、6mL乙醇溶液、6mL油酸溶液在50mL烧杯中搅拌混合均匀，再向其中滴加6mL的浓度为0.078g/mL硫酸亚铁铵溶液，保持搅拌下混合均匀，得到混合溶液；将混合溶液转移至50mL的水热釜中，在180℃反应10小时；反应结束后，乙醇洗涤三遍，得到超细磁性Fe3O4纳米颗粒。
对其进行TEM测试的照片如图1所示，可见其颗粒尺寸均一，粒径大约为8nm，分散性好。
(二)Fe3O4@SiO2-FITC的制备
将步骤(一)制得的超细磁性Fe3O4纳米颗粒分散于30mL正己烷溶液中，得到浓度为20mg/mL超细磁性Fe3O4纳米颗粒的正己烷分散液；
取5mL的上述超细磁性Fe3O4纳米颗粒的正己烷分散液，分散于50mL环己烷中，同时，向该体系内加入10mL表面活性剂曲拉通X-100(辛基苯基聚氧乙烯醚)，以助于纳米粒子在氨水溶液中稳定的分散，超声分散均匀后，向该体系内加入0.5mL氨水溶液(28wt％)，不断搅拌0.5小时，形成稳定的微乳液；在不断搅拌的条件下，向上述微乳液中滴加0.04mL的正硅酸乙酯(TEOS)，反应24小时(制得Fe3O4@SiO2纳米颗粒)；
然后，在避光条件下(锡箔纸包裹)，将预先混合的由5mL有机硅烷3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)和0.01g FITC(异硫氰酸荧光素)组成的溶液加入至上述体系中，避光反应12h，磁性分离与收集样品，用乙醇及去离子水洗涤样品3遍，30℃真空干燥过夜，得到Fe3O4@SiO2-FITC样品。该样品中SiO2层的厚度为5nm左右；在固定波长激发下发出绿色荧光，且荧光信号强。
(三)Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2的制备
将步骤(二)得到的Fe3O4@SiO2-FITC样品超声分散于40mL浓度为0.005g/mL的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)水溶液中，同时向体系内加入3mL正己烷。机械搅拌30min后，加入0.4mL氨水(28wt％)，滴加0.2mL TEOS。在30℃下避光反应12h后，利用磁性分离和收集样品，用乙醇及去离子水洗涤样品3遍。避光条件下，80℃油浴12h，乙醇回流冷凝脱除CTAB模板分子，磁性分离与收集样品，用乙醇及去离子水洗涤样品3遍，30℃真空干燥过夜，得到Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2样品；
对该Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2样品进行SEM和TEM测试，透射电镜照片如图2a所示，扫描电镜照片如图2b所示，由图2a和图2b可见，该Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2样品的核壳结构清晰，黑色磁性核被灰色介孔二氧化硅壳层所包覆(图2a)，脱除模板后，介孔孔径在2nm左右(图2a)，颗粒尺寸均一，平均粒径为45nm，分散性好。采用荧光分光光度计观测该样品，发现其在固定波长激发下发出绿色荧光，且荧光信号强。XRD测试发现该Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2样品的相图与步骤(一)所得Fe3O4的相图相似，只是由于非磁性二氧化硅壳层的屏蔽作用使得强度有所降低，如图2c所示，其中a为步骤(一)所得Fe3O4的相图，b为该Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2样品的相图。可见，磁性核的晶体结构在前述的整个包覆过程中得到了完全的保护，未受到破坏。(由于二氧化硅为无定形状态，所以在XRD图上没有显示相应的衍射峰)进一步，采用MPMS(SQUID)VSM磁学测量系统对该Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2样品和步骤(一)所得Fe3O4进行磁饱和强度的对比测试，所得磁滞回线如图2d所示，其中，1为Fe3O4，2为该Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2样品。由图2d可知，该Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2样品与步骤(一)所得Fe3O4均具有较高的磁饱和强度，表现出超顺磁性，两者磁滞回线相同，可见磁性核被包裹多层后，样品磁性不受影响而仍然保持良好。对该Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2样品进行BET氮气吸附-解吸测试，其结果如图2e所示，显示模板剂脱除完全，该Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2样品的介孔尺寸均一，约为3.5nm，并具有318m2/g的高比表面积。
(四)Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2-LyP-1的制备
将步骤(三)制得的Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2样品再分散于30mL乙醇中，向体系内加入0.02mL巯丙基三乙氧基硅烷(MPTS)，在材料表面接枝巯基(-SH)，反应12h后，利用磁铁分离表面带有巯基的纳米材料，收集样品，用乙醇及去离子水洗涤样品3遍；
最后，将所制备的表面带有巯基的纳米材料再次分散于乙醇中，再向其中加入由0.01g马来酰亚胺-LyP-1溶解于2mL乙醇所形成的溶液，反应6h，将马来酰亚胺-LyP-1化合物接枝在材料表面。磁性分离与收集样品，用乙醇及去离子水洗涤样品3遍，30℃真空干燥过夜，获得最终产物样品。
通过傅里叶红外光谱仪(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)对最终产物样品和步骤(三)制得的Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2样品进行测试，如图2f。其中，a谱图为Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2样品的红外吸收曲线，b谱图为马来酰亚胺-LyP-1的红外吸收曲线，c谱图为最终产物样品的红外吸收曲线。由谱图曲线比较可知，最终产物样品在1660-1710cm-1处有较强吸收峰，该峰归属于马来酰亚胺-LyP-1的氨基基团(–C(NH2)＝O和–C(NH)＝O)。由此可证明，LyP-1被成功接枝在最终产物样品表面，最终产物样品为Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2-LyP-1。图2g显示了最终产物Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2-LyP-1样品的结构的微球数据模拟图：以超细磁性纳米Fe3O4材料为核，且该核被标记有异硫氰酸荧光素的二氧化硅层所包覆；以多孔二氧化硅为壳层，且该壳层包覆前述的标记有异硫氰酸荧光素的二氧化硅层，同时，在该壳层的表面修饰有肿瘤靶向分子LyP-1。换言之，以超细磁性纳米Fe3O4材料为核，标记有异硫氰酸荧光素的二氧化硅层包覆前述的核，继而，多孔二氧化硅作为壳层包覆前述的标记有异硫氰酸荧光素的二氧化硅层，且在该壳层的表面修饰有肿瘤靶向分子LyP-1。
通过对最终产物样品进行元素分析，计算得出接枝在样品表面的LyP-1约为12wt％(即，接枝在样品表面的LyP-1的量占最终产物样品重量的比例为12wt％)，接枝率高达2.0×1017/m2。采用荧光分光光度计观测最终产物样品，如图3所示，发现：在固定波长激发下，样品发出绿色荧光，且荧光信号强。
最终产物Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2-LyP-1样品尺寸均一，约为50nm，其中8nm的磁性内核受到二氧化硅层的良好保护，而荧光物质也受到多孔二氧化硅壳层的保护，并且壳层表面接枝的LyP-1密度高，同时，具有良好的生物相容性。
实施例2：细胞毒性实验
将肿瘤细胞小鼠胰腺癌细胞株Pan02和非肿瘤细胞小鼠内皮细胞MS1接种于96孔板，过夜培养待细胞贴壁后，去除上清，分别加入含不同浓度Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2或Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2-LyP-1(5,10,20,40,80，160，320μg/ml)的培养基，并以PBS作为阴性对照。作用24小时后，加入10μl CCK-8，作用3小时后酶标仪测定吸光值(A)。细胞增殖活性＝(A实验孔—A空白孔)/(A对照孔—A空白孔)×100％。测试结果如图4所示。由图4可知，Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2或Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2-LyP-1对胰腺癌细胞株Pan02和小鼠内皮细胞MS 1在所设定的浓度范围内(5-320μg/ml)没有明显的细胞毒性。
实施例3：流式检测
将肿瘤细胞小鼠胰腺癌细胞株Pan02和非肿瘤细胞小鼠内皮细胞MS1接种于6孔板，过夜培养待细胞贴壁后，去除上清，分别加入含不同浓度Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2或Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2-LyP-1(5,10,20,40,80μg/ml)的无血清培养基，并以PBS作为阴性对照。作用4小时后，去上清，并以PBS冲洗3遍，胰酶消化，以含2％多聚甲醛的PBS重悬细胞，流式检测各组细胞的平均荧光强度。结果如图5所示。图5中，1为小鼠胰腺癌细胞株Pan02与Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2-LyP-1共培养，2为小鼠胰腺癌细胞株Pan02与Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2共培养，3为小鼠内皮细胞MS1与Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2-LyP-1共培养，4为小鼠内皮细胞MS1与Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2共培养。
由图5可见，小鼠胰腺癌细胞株Pan02与Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2-LyP-1的共培养体系中，即使Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2-LyP-1的浓度仅为5μg/ml，Pan02平均荧光强度也有显著升高，随着Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2-LyP-1浓度的进一步升高，Pan02细胞的荧光也逐渐升高，并在40μg/ml时达到一个平台期。相对于此，小鼠胰腺癌细胞株Pan02与Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2共培养后，其相应的细胞平均荧光强度仅约为与Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2-LyP-1共培养后的一半。而小鼠内皮细胞MS1不管与Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2或与Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2-LyP-1共培养，其细胞平均荧光强度均较低。
以上实验结果可通过以下说明进行解释：
由于本发明实施例1所制得的最终产物的超细磁性核壳纳米材料表面接枝的LyP-1的主动靶向作用，使得具有LyP-1靶头的磁性纳米颗粒Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2-LyP-1能够特异性地结合到具有相应受体的胰腺癌细胞株Pan02细胞的表面，而包覆磁性纳米颗粒的二氧化硅中的荧光材料FITC可以定量与细胞结合的磁性纳米颗粒的量，从而通过流式细胞术加以检测。
LyP-1是从噬菌体展示肽库中筛选出来的环状九肽，最初被发现可以与人MDA-MB-435乳腺癌中的淋巴管特异性结合，后发现通过静脉注射后，环状九肽LyP-1可以在乳腺癌移植瘤中特异性聚集，而很少进入正常组织。近来，一个原定位于线粒体中的蛋白p32被证实为LyP-1的受体。在乳腺癌、肝癌、肺癌、胰腺癌中有过表达；并且，p32蛋白在肿瘤细胞，肿瘤淋巴管，肿瘤中髓系细胞膜上的异位表达是LyP-1多肽肿瘤靶向性的分子基础。
实施例4：体外磁共振成像
将肿瘤细胞小鼠胰腺癌细胞株Pan02和非肿瘤细胞小鼠内皮细胞MS1接种于6孔板，过夜培养待细胞贴壁后，去除上清，分别加入含不同浓度Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2或Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2-LyP-1(5,10,20,40,80μg/ml)的无血清培养基，并以PBS作为阴性对照。作用4小时后，去上清，并以PBS冲洗3遍，胰酶消化，以1％琼脂重悬细胞，磁共振扫描。参数设置如下：FOV＝120mm×120mm,matrix＝128×128,section thickness＝2mm,TE＝13.8ms,TR＝4000ms,number of averages＝1，结果如图6所示。图6中，1为小鼠胰腺癌细胞株Pan02与Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2-LyP-1共培养，2为小鼠胰腺癌细胞株Pan02与Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2共培养，3为小鼠内皮细胞MS1与Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2-LyP-1共培养，4为小鼠内皮细胞MS1与Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2共培养。
由图6可见，随着Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2-LyP-1浓度的升高，与之共培养的Pan02细胞T2加权下表现为明显的低信号，提示Pan02细胞结合了较多的磁性纳米颗粒(见1)；相对于此，当Pan02细胞与Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2共培养，Pan02细胞在T2加权下信号变化不明显(见2)。而没有靶头p32受体表达的内皮细胞MS1不管与有无靶头的磁性纳米材料共培养，其均无T2加权信号改变(见3和4)。
以上实验结果提示：LyP-1靶头可以介导磁性纳米颗粒主动特异地结合到有靶头相应受体表达的胰腺癌细胞表面，从而引起Pan02细胞在外加磁场的情况下发生信号的改变。
实施例5
C57BL/6小鼠腹腔内麻醉，剃毛，消毒，开腹，暴露胰腺，将Pan02重悬于Matrigel，注射于小鼠胰腺，关腹。三周后，经尾静脉分别注入含Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2-LyP-1或Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2的PBS溶液,经全身循环4小时后，处死小鼠，分别取小鼠的心、肝、脾、肺、肾、胰腺、肿瘤。经4％多聚甲醛、10％蔗糖和30％蔗糖序贯处理后，组织以OCT冰冻包埋，并切片，荧光显微镜下观察绿色荧光的材料的组织分布。观察前，各组织切片以兔来源的抗-p32抗体免疫荧光染色(红色)，以进一步明确纳米材料(绿色)的分布和受体p32(红色)的表达是否一致。
通过观察发现：
C57BL/6原位胰腺癌小鼠尾静脉注射Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2-LyP-1后，肿瘤组织中有较多的绿色荧光的LyP-1-纳米材料分布，而除了肝脏、脾脏中有少许粗颗粒的绿色荧光的LyP-1-纳米材料分布外，心、肺、肾脏都没有明显的绿色荧光的LyP-1-纳米材料分布；并且肿瘤中绿色荧光的LyP-1-纳米材料的分布与肿瘤组织中p32受体的分布高度一致。参见图7a。
相对于此，C57BL/6原位胰腺癌小鼠注射Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2后，肿瘤、心、肝、脾、肺、肾组织中均没有明显的绿色荧光的纳米材料的分布。参见图7b。
因此，C57BL/6原位胰腺癌小鼠尾静脉分别注射Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2和Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2-LyP-1后，绿色荧光的LyP-1-纳米材料的组织分布(见图7a)和绿色荧光的纳米材料的组织分布(见图7b)充分证明了LyP-1可以介导磁性纳米材料主动靶向进入肿瘤组织。
实施例6体内磁共振成像
C57BL/6原位胰腺癌荷瘤小鼠腹腔内麻醉，经尾静脉分别注入0.2ml含Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2或Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2-LyP-1的PBS。在图8a所示的装置和位置，放入小动物磁共振线圈，T2加权扫描成像，观察肿瘤区域信号的变化。
观察磁共振成像(如图8b所示)可见：C57BL/6原位胰腺癌小鼠静脉注射Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2-LyP-1后，T2加权磁共振成像显示肿瘤区表现为低信号，在尾静脉注射后4小时最为明显，并且可以维持24小时。相对于此，C57BL/6原位胰腺癌小鼠尾静脉注射Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2前后，肿瘤区信号改变不明显。
综上，上述实施例3～6通过体内外实验充分证明LyP-1靶头可以介导磁性纳米颗粒与肿瘤细胞的特异性结合，从而主动靶向进入肿瘤组织；并利用磁性纳米材料携带的荧光基团和超顺磁特性，定位磁性纳米材料的分布和磁共振显像肿瘤组织。其中，体外细胞学实验中利用流式细胞学实验和磁共振成像定量和半定量肿瘤细胞结合磁性纳米材料的量，从而证明LyP-1多肽靶头可以介导磁性纳米材料与有p32受体的肿瘤细胞的特异性结合；体内实验中，利用磁性纳米材料所携带的FITC荧光，可以准确定位的磁性纳米材料的组织分布。超顺磁性纳米材料在肿瘤组织中的特异性的聚集，使得肿瘤组织可以在磁共振成像中有特异性的信号改变，靶向性功能强，核磁成像分辨率高，从而得以识别和准确诊断。从而，上述的具有LyP-1靶头的超细磁性核壳纳米材料能够用于制备肿瘤靶向诊断和治疗的药物或药物载体，例如，用作肿瘤细胞高效靶向材料、敏感度高的核磁共振成像材料和强荧光的生物荧光标记物，具有极高的生物医学意义。
实施例7具有肿瘤细胞靶向性的超细磁性核壳纳米材料的制备
将6mL氢氧化钠溶液(0.1g/mL)、6mL乙醇溶液、6mL油酸溶液在50mL烧杯中搅拌混合均匀，再向其中滴加6mL的浓度为0.078g/mL硫酸亚铁铵溶液，保持搅拌下混合均匀，得到混合溶液；将混合溶液转移至50mL的水热釜中，在180℃反应10小时；反应结束后，乙醇洗涤三遍，得到超细磁性Fe3O4纳米颗粒。
将上述超细磁性Fe3O4纳米颗粒分散于24mL正己烷溶液中，得到浓度为25mg/mL超细磁性Fe3O4纳米颗粒的正己烷分散液；
取4mL的上述超细磁性Fe3O4纳米颗粒的正己烷分散液，分散于60mL环己烷中，同时，向该体系内加入15mL表面活性剂曲拉通X-100(辛基苯基聚氧乙烯醚)，以助于纳米粒子在氨水溶液中稳定的分散，超声分散均匀后，向该体系内加入0.8mL氨水溶液(28wt％)，不断搅拌1小时，形成稳定的微乳液；在不断搅拌的条件下，向上述微乳液中滴加0.05mL的正硅酸乙酯(TEOS)，反应24小时(制得Fe3O4@SiO2纳米颗粒)；
然后，在避光条件下(锡箔纸包裹)，将预先混合的由6mL有机硅烷3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)和0.02g FITC(异硫氰酸荧光素)组成的溶液加入至上述体系中，避光反应12h，磁性分离与收集样品，用乙醇及去离子水洗涤样品3遍，30℃真空干燥过夜，得到Fe3O4@SiO2-FITC样品。
将Fe3O4@SiO2-FITC样品超声分散于50mL浓度为0.008g/mL的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)水溶液中，同时向体系内加入5mL正己烷。机械搅拌1小时后，加入0.6mL氨水(28wt％)，滴加0.4mL TEOS。在30℃下避光反应12h后，利用磁性分离和收集样品，用乙醇及去离子水洗涤样品3遍。避光条件下，80℃油浴12h，乙醇回流冷凝脱除十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)模板分子，最后，再次磁性分离与收集样品，用乙醇及去离子水洗涤样品3遍，30℃真空干燥过夜，得到Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2样品；
将Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2样品再分散于30mL乙醇中，向体系内加入0.04mL巯丙基三乙氧基硅烷(MPTS)，在材料表面接枝巯基(-SH)，反应12h后，利用磁铁分离表面带有巯基的纳米材料，收集样品，用乙醇及去离子水洗涤样品3遍；
最后，将所制备的表面带有巯基的纳米材料再次分散于乙醇中，再向其中加入由0.04g马来酰亚胺-LyP-1溶解于4mL乙醇所形成的溶液，反应6h，将马来酰亚胺-LyP-1化合物接枝在材料表面。磁性分离与收集样品，用乙醇及去离子水洗涤样品3遍，30℃真空干燥过夜，获得最终产物样品。
经检测，本实施例所制得的各样品具有与实施例1相同的结构和性能。
由此可见，本发明的目的已经完整并有效的予以实现。本发明的方法以及原理已在实施例中予以展示和说明，在不背离所述原理的情况下，实施方式可作任意修改。所以，本发明包括了基于权利要求精神及权利要求范围的所有变形实施方式。
Claims (3)
1.具有肿瘤细胞靶向性的超细磁性核壳纳米材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)利用水热法合成尺寸均一的超细磁性Fe3O4纳米颗粒，分散于正己烷溶液中，得到浓度为10～25mg/mL的超细磁性Fe3O4纳米颗粒正己烷溶液，其中，所述超细磁性Fe3O4纳米颗粒的直径为5～10nm；
(2)取一定体积的步骤(1)得到的超细磁性Fe3O4纳米颗粒的正己烷溶液，以其中超细磁性Fe3O4纳米颗粒的质量为100mg计，将所述超细磁性Fe3O4纳米颗粒的正己烷溶液分散于30～60mL的环己烷中，向其中加入8～15mL的辛基苯基聚氧乙烯醚并超声分散均匀后，加入0.3～0.8mL的质量百分浓度为20～30％的氨水溶液并持续搅拌0.5～1小时，形成稳定的微乳液；在不断搅拌的条件下，向上述微乳液中滴加0.02～0.05mL的正硅酸乙酯，反应8～24小时；然后，将预先混合的由3～6mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷和0.005～0.02g的异硫氰酸荧光素组成的溶液加入至上述体系中，避光反应6～12小时；最后，磁性分离并收集，经洗涤、干燥后得到Fe3O4@SiO2-FITC样品；
(3)将步骤(2)所得的Fe3O4@SiO2-FITC样品超声分散于35～50mL的浓度为0.003～0.01g/mL的十六烷基三甲基溴化铵水溶液中，同时向其中加入2～5mL正己烷，搅拌0.5～1小时后，向其中加入0.3～0.6mL质量百分浓度为20～30％氨水溶液，滴加0.1～0.4mL正硅酸乙酯，在25～35℃下避光反应8～24小时后，通过磁性分离收集到的反应产物，经洗涤后在乙醇中70～90℃回流12～24小时以脱除十六烷基三甲基溴化铵模板分子，最后，再次磁性分离并收集，经洗涤、干燥后得到Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2样品；
(4)将步骤(3)所得的Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2样品再分散于乙醇中，并加入0.01～0.04mL巯丙基三乙氧基硅烷，反应6～12小时后，通过磁性分离收集到反应产物，经洗涤后再次分散于乙醇中，再向其中加入由0.01～0.04g马来酰亚胺-LyP-1溶解于2～4mL乙醇所形成的溶液，反应6～12小时，然后，再次磁性分离并收集，经洗涤、干燥后得到最终产物Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2-LyP-1样品；
其中，所述具有肿瘤细胞靶向性的超细磁性核壳纳米材料，是以超细磁性纳米Fe3O4材料为核，且所述的核被标记有异硫氰酸荧光素的二氧化硅层所包覆；以多孔二氧化硅为壳层，且所述壳层包覆所述的标记有异硫氰酸荧光素的二氧化硅层，同时，在所述壳层的表面接枝修饰有肿瘤靶向分子LyP-1，所述超细磁性纳米Fe3O4材料是直径为5～10nm的磁性Fe3O4纳米颗粒。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，表面接枝修饰的所述肿瘤靶向分子LyP-1的重量占比为10～15％，接枝密度为1.5×1017/m2～3.0×1017/m2。
3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，
(1)利用水热法合成尺寸均一的超细磁性Fe3O4纳米颗粒，分散于正己烷溶液中，得到浓度为20mg/mL的超细磁性Fe3O4纳米颗粒正己烷溶液，其中，所述超细磁性Fe3O4纳米颗粒的直径为5～10nm；
(2)取5mL的步骤(1)得到的超细磁性Fe3O4纳米颗粒的正己烷溶液，将所述超细磁性Fe3O4纳米颗粒的正己烷溶液分散于50mL的环己烷中，向其中加入10mL的辛基苯基聚氧乙烯醚并超声分散均匀后，加入0.5mL的质量百分浓度为28％的氨水溶液并持续搅拌0.5～1小时，形成稳定的微乳液；在不断搅拌的条件下，向上述微乳液中滴加0.04mL的正硅酸乙酯，反应8～24小时；然后，将预先混合的由5mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷和0.01g的异硫氰酸荧光素组成的溶液加入至上述体系中，避光反应6～12小时；最后，磁性分离并收集，经洗涤、干燥后得到Fe3O4@SiO2-FITC样品；
(3)将步骤(2)所得的Fe3O4@SiO2-FITC样品超声分散于40mL的浓度为0.005g/mL的十六烷基三甲基溴化铵水溶液中，同时向其中加入3mL正己烷，搅拌0.5～1小时后，向其中加入0.4mL质量百分浓度为28％氨水溶液，滴加0.2mL正硅酸乙酯，在25～35℃下避光反应8～24小时后，通过磁性分离收集到的反应产物，经洗涤后在乙醇中70～90℃回流12～24小时以脱除十六烷基三甲基溴化铵模板分子，最后，再次磁性分离并收集，经洗涤、干燥后得到Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2样品；
(4)将步骤(3)所得的Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2样品再分散于乙醇中，并加入0.02mL巯丙基三乙氧基硅烷，反应6～12小时后，通过磁性分离收集到反应产物，经洗涤后再次分散于乙醇中，再向其中加入由0.01g马来酰亚胺-LyP-1溶解于2mL乙醇所形成的溶液，反应6～12小时，然后，再次磁性分离并收集，经洗涤、干燥后得到最终产物Fe3O4@SiO2-FITC@nSiO2-LyP-1样品。
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