CN103558170B - 叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料及其检测肿瘤细胞 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种<b>叶酸</b><b>-</b><b>多孔铂</b><b>-</b><b>氧化石墨烯复合纳米材料及其检测肿瘤细胞</b>，所述是<b>叶酸</b><b>-</b><b>多孔铂</b><b>-</b><b>氧化石墨烯复合纳米材料</b>以氧化石墨烯为基底，通过酰胺化反应交联叶酸分子，原位合成具有多孔结构的铂纳米粒子，制备一种叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料。叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料可特异识别细胞表面叶酸受体，同时具有模拟过氧化物酶特性，可催化过氧化氢氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色。利用显色反应可快速灵敏地检测肿瘤细胞数量，最低可检测至30个MCF-7细胞。也可催化二氨基联苯胺在细胞表面产生红棕色沉淀物，以实现靶向定位检测。

Description

叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料及其检测肿瘤细胞

技术领域

本发明涉及叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料的制备，及其用于快速灵敏地检测肿瘤细胞的方法，属于纳米技术和医学检验领域。

背景技术

尽管医学技术不断进步，癌症仍是世界上致死率最高的疾病。传统的对肿瘤的检测和定位，由于缺乏实现靶向定位的方式，很难达到预期的检测效果。用于癌症的早期诊断的新方法的研发对于成功治疗癌症和增加病人存活率具有关键性的作用。

叶酸是一种小分子维生素，自1986年科学家发现叶酸是由受体介导的内吞途径进入细胞以来，人们开始对叶酸作为靶向载体进行深入研究。现已证实在卵巢癌、子宫内膜癌、间皮组织癌、肾癌、头颈部肿瘤、肺癌、乳腺癌、结直肠癌等恶性上皮组织来源肿瘤、关节炎部位有过表达的叶酸受体。因此，将叶酸及其类似物与标记物（如放射性核素、染料等）偶联形成示踪剂，一旦注入人体内，就能与叶酸受体特异性结合，选择性浓集于叶酸受体表达丰富的组织，即各种肿瘤中。由于叶酸受体在靶组织和非靶组织分布的显著性差异，叶酸受体介导的显影剂可获得靶组织与正常组织高对比度的图像，故能对病变进行诊断、定位及治疗效果评价。与其他靶向分子如单克隆抗体相比，叶酸相对分子质量小、无免疫原性、价廉易得、稳定性好、与药物或载体之间的化学键合简单易行。

本发明提供了一种利用酰胺化反应将叶酸分子与氧化石墨烯共价结合，并原位还原负载多孔铂纳米粒子，制备叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料。该复合纳米材料具有模拟过氧化物酶活性并能与叶酸受体特异性结合，可用于快速灵敏地检测肿瘤细胞数量和进行肿瘤细胞定位。

发明内容

本发明的目的是提供一种叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料及其以氧化石墨烯为基底，通过酰胺化反应交联叶酸分子，并原位合成具有多孔结构的铂纳米粒子的制备叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料的方法。该复合纳米材料具有模拟过氧化物酶活性并能与叶酸受体特异性结合，可用于快速灵敏地检测肿瘤细胞数量和进行肿瘤细胞定位。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明所述的叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料，由以下方法制备而成：1）配制氧化石墨烯水溶液0.5mg/mL，加入聚烯丙基胺盐酸盐和氢氧化钾，混匀后置于70℃水浴加热24小时，将溶液收集再离心洗涤，去除多余的聚烯丙基胺盐酸盐和氢氧化钾；2）使用1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）为交联剂，叶酸上的羧基与聚烯丙基胺盐酸盐修饰氧化石墨烯上的氨基通过酰胺化交联，在室温下反应24小时后，将溶液收集再离心洗涤，去除多余的交联剂和叶酸，得到的叶酸功能化氧化石墨烯水溶液；3）将所得到的叶酸功能化氧化石墨烯水溶液与7.9mmol/L的氯铂酸水溶液以体积比为10:1混合均匀，80℃水浴加热24小时，得到的叶酸-多孔铂-氧化石墨烯水溶液呈黑色，4℃保存。

所使用的基底氧化石墨烯的制备方法为：称取325目鳞片石墨1.2g，加入到144mL浓度为18mol/L的浓硫酸和16mL浓度为15mol/L的磷酸的混合溶液中；充分搅拌后，置于在0℃冰浴中；将7.2g高锰酸钾以少量多次方式缓慢加入到以上混合溶液中；保持0℃冰浴，磁力搅拌3小时后，将所得墨绿混悬液转移至50℃温水浴中，控温12小时，得到的紫黑色混悬液缓慢加入到160mL冰水混合物中，剧烈搅拌1小时；继而往溶液中逐滴滴加4mL质量浓度为30%的过氧化氢溶液，溶液颜色突变为亮黄色，所得溶液经孔径为20-30微米的G1砂芯漏斗过滤，继而4000转每分钟离心30分钟，弃去上清液；加入80mL双蒸水充分振荡洗涤，4000转每分钟离心30分钟，弃去上清液，沉淀颜色呈土黄色；再加入80mL质量浓度为30%的盐酸充分振荡洗涤，经为孔径20-30微米的G1砂芯漏斗过滤去除不溶颗粒，滤液4000转每分钟离心30分钟，弃去上清液，沉淀颜色继续加深；接着多次用无水乙醇将沉淀物洗至pH值为中性，4000转每分钟离心30分钟，弃去上清液，沉淀呈棕黄色；最后用乙醚冲洗沉淀，经孔径为1.5-2.5微米的G5砂芯漏斗过滤，获得滤饼，滤饼在室温下过夜晾干，得到棕色的氧化石墨；取50mg棕色的氧化石墨溶解于100mL双蒸水，常温下超声3小时，充分剥离后得到0.5mg/mL透明澄清的棕黄色氧化石墨烯水溶液。

本发明所述的叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料模拟过氧化物酶，催化过氧化氢氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色，并识别细胞膜表面叶酸受体。

在3.290mLpH为5、浓度为20mmol/L的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液中依次加入0.5mL浓度为4mol/L的过氧化氢、0.2mL浓度为16mmol/L的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐，再加入10μL浓度为0.67mg/mL的叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料水溶液，混合后30℃温浴10分钟，溶液由无色变为蓝色，在652nm处有吸收峰，加硫酸终止反应，溶液变为黄色，在450nm处有吸收峰。

叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料与MCF-7（人乳腺癌细胞）、SGC-7901（人胃癌细胞）细胞膜上过度表达的叶酸受体特异性识别并结合形成结合体，而不与低表达叶酸受体的正常细胞HUVEC（人脐带静脉内皮细胞）结合，所述结合体通过催化过氧化氢氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐生成蓝色产物，该产物在652nm处有最大吸收峰，区别肿瘤细胞和正常细胞。

叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料与经过叶酸饱和的MCF-7（人乳腺癌细胞）极少量结合，3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐无明显颜色变化。

将MCF-7配制成不同梯度浓度的细胞悬液，利用叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料与其结合检测肿瘤细胞数量，肉眼可见颜色变化，经硫酸终止反应后，目视观察检测限为125个MCF-7细胞；利用酶标仪测定每个细胞孔在450nm处的吸光值，吸光度值随细胞数量增加而增大，检测限为30个MCF-7细胞。

8、根据权利要求3所述的叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料模拟过氧化物酶，其特征是叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料与肿瘤细胞表面过度表达的叶酸受体特异性识别并结合，在过氧化氢存在的情况下，使生色底物二氨基联苯胺失去电子形成红棕色不溶物，定位肿瘤细胞。

为了实现上述目的，本发明采用具体技术方案为：

（一）氧化石墨烯的制备：

称取325目鳞片石墨，加入到体积比为9:1的浓硫酸和磷酸混合溶液中。充分搅拌后，置于在0℃冰浴中。将高锰酸钾少量多次，缓慢加入到以上混合溶液中。保持0℃冰浴，磁力搅拌3小时后，将所得墨绿色混悬液转移至50℃温水浴中，控温12小时。得到的紫黑色混悬液缓慢加入到冰水混合物中，剧烈搅拌1小时。继而往溶液中逐滴滴加30%过氧化氢溶液，至溶液颜色突变为亮黄色。所得溶液经G1砂芯漏斗（孔径20-30微米）过滤，滤液4000转每分钟离心30分钟，分别经过水洗一次，酸洗一次，醇洗至中性，最后用乙醚冲洗后经G5砂芯漏斗（孔径1.5-2.5微米）过滤。滤饼在室温下过夜晾干，得到氧化石墨。氧化石墨溶解于双蒸水，常温下超声3小时，充分剥离后既得氧化石墨烯水溶液。

（二）叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料的制备：

配制0.5mg/mL氧化石墨烯水溶液，加入一定量的聚烯丙基胺盐酸盐和氢氧化钾，混匀后置于70℃水浴加热24小时。将溶液收集再超滤离心洗涤，去除多余的聚烯丙基胺盐酸盐和氢氧化钾。使用1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）交联剂，叶酸上的羧基与聚烯丙基胺盐酸盐修饰氧化石墨烯上的氨基通过酰胺化交联。在室温下反应24小时后，将溶液收集再超滤离心洗涤，去除多余的交联剂和叶酸。最后，所得到的叶酸修饰氧化石墨烯水溶液与7.9mmol/L的氯铂酸水溶液以体积比10:1混合均匀，80℃水浴加热24小时。得到的叶酸-多孔铂-氧化石墨烯水溶液呈黑色，4℃保存，能保持2个月以上的相对稳定。以上过程中使用的所有玻璃器皿均经过王水浸泡，并用双蒸水彻底清洗，晾干。

（三）叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料模拟过氧化物酶活性：

通过叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料催化过氧化物酶底物3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐产生蓝色底物，验证和比较其过氧化物酶活性。在磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液中依次加入过氧化氢、3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐和叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料水溶液，混合后温浴10分钟，肉眼观察颜色的变化或测定652nm波长处的吸光度值。根据溶液颜色或通过吸光度值标准曲线进行比较过氧化酶活性。

（四）基于叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料比色法检测肿瘤细胞数量：

细胞膜表面高表达叶酸受体的癌细胞为实验组：MCF-7（人乳腺癌细胞）、SGC-7901（人胃癌细胞）。细胞膜表面低表达叶酸受体的癌细胞为阴性对照组：HUVEC（人脐带静脉内皮细胞）。待不同数量的细胞在96孔板内完全贴壁后，每孔各加入5μg叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料与细胞孵育1.5小时。之后每个反应孔用磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液轻轻吹打冲洗3次，以去除非未结合的叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料。显色过程：每孔依次加入磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液、过氧化氢和3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐，充分振荡混匀后，室温下反应15分钟。待反应结束，立刻加入2mol/L浓硫酸终止反应，溶液颜色由蓝色变为黄色。利用酶标仪测定每个反应孔在450nm处的吸光值，根据颜色深浅或吸光值对肿瘤细胞进行定量。

（五）叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料定位肿瘤细胞

将细胞膜表面高表达叶酸受体的MCF-7（人乳腺癌细胞）在96孔板内完全贴壁后，每孔各加入5μg叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料与细胞孵育1.5小时。之后每个反应孔用磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液轻轻吹打冲洗3次，以去除非未结合的叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料。定位过程：每孔依次加入二氨基联苯胺和过氧化氢。反应十分钟后，显微镜下可见细胞表面出现红褐色沉淀物，表明叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料与细胞膜上的叶酸受体特异结合，可定位肿瘤细胞。

本发明的优点：

（1）本发明提出了叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料的绿色制备方法。

（2）本发明叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料具有良好的过氧化物酶活性。

（3）本发明叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料能特异性结合肿瘤细胞表达的叶酸受体，通过显色反应定位肿瘤细胞。

（4）本发明叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料模拟过氧化物酶，利用显色反应快速灵敏地检测肿瘤细胞数量，最低可检测125个癌细胞。

附图说明

图1为氧化石墨烯和叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料水溶液外观图，图中：透明澄清的棕黄色氧化石墨烯水溶液，叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料水溶液颜色是棕黑色。

图2为叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料催化过氧化氢氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色体系的外观图，从左到右颜色变化为：溶液由无色（左）变为蓝色（中），在652nm处有吸收峰，加硫酸终止反应，溶液变为黄色（右）。

图3为叶酸-多孔铂-氧化石墨烯纳米复合材料催化过氧化氢氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色体系的紫外吸收光谱图。

图4为不同比色条件下的吸收值对比：a)叶酸-多孔铂-氧化石墨烯纳米复合材料与无细胞的培养基；b)叶酸-多孔铂-氧化石墨烯纳米复合材料与MCF-7；c)叶酸-多孔铂-氧化石墨烯纳米复合材料与SGC-7901；d)叶酸-多孔铂-氧化石墨烯纳米复合材料与HUVEC；e)叶酸-多孔铂-氧化石墨烯纳米复合材料与叶酸封闭后的MCF-7；f)多孔铂-氧化石墨烯纳米复合材料与MCF-7。

图5为叶酸-多孔铂-氧化石墨烯纳米复合材料与不同数量MCF-7和HUVEC作用后，硫酸终止后的颜色对比图，图中：上方为：每孔依次加入140μL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（20mmol/L，pH5），50μL过氧化氢（4mol/L）和10μL3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐（16mmol/L），充分振荡混匀后，室温下反应15分钟，溶液呈不同深浅的蓝色。图中：下方为：反应结束，立刻加入50μL2mol/L浓硫酸终止反应，溶液颜色由蓝色变为黄色，目视观察检测限为125个MCF-7细胞。

图5-1为叶酸-多孔铂-氧化石墨烯纳米复合材料与不同数量MCF-7和HUVEC作用后，硫酸终止后的颜色对比和吸收值对比图。

图6为叶酸-多孔铂-氧化石墨烯纳米复合材料与MCF-7作用后，催化二氨基联苯胺原位染色的显微图。

具体实施方式

实例1：

称取325目鳞片石墨1.2g，加入到144mL浓度为18mol/L的浓硫酸和16mL浓度为15mol/L的磷酸的混合溶液中。充分搅拌后，置于在0℃冰浴中。将7.2g高锰酸钾少量多次，缓慢加入到以上混合溶液中。保持0℃冰浴，磁力搅拌3小时后，将所得墨绿色混悬液转移至50℃温水浴中，控温12小时。得到的紫黑色混悬液缓慢加入到160mL冰水混合物中，剧烈搅拌1小时。继而往溶液中逐滴滴加4mL30%（质量浓度）过氧化氢溶液，溶液颜色突变为亮黄色。所得溶液经G1砂芯漏斗（孔径20-30微米）过滤，滤液4000转每分钟离心30分钟，弃去上清液；加入80mL双蒸水充分振荡洗涤，4000转每分钟离心30分钟，弃去上清液，沉淀颜色呈土黄色；再加入80mL30%（质量浓度）盐酸充分振荡洗涤，经G1砂芯漏斗（孔径20-30微米）过滤去除不溶颗粒，滤液4000转每分钟离心30分钟，弃去上清液，沉淀颜色继续加深；接着多次用无水乙醇将沉淀物洗至pH值为中性，4000转每分钟离心30分钟，弃去上清液，沉淀呈棕黄色；最后用乙醚冲洗沉淀，经G5砂芯漏斗（孔径1.5-2.5微米）过滤。滤饼在室温下过夜晾干，得到棕色的氧化石墨，称取质量。取50mg上述棕色的氧化石墨溶解于100mL双蒸水，常温下超声3小时，充分剥离后既得0.5mg/mL透明澄清的棕黄色氧化石墨烯水溶液。

实例2：

160mg聚烯丙基胺盐酸盐和160mg氢氧化钾依次加入至80mL0.5mg/mL氧化石墨烯水溶液中，混合物置于70℃水浴中磁力搅拌24小时。将溶液收集再离心，双蒸水洗涤至中性，去除多余的聚烯丙基胺盐酸盐和氢氧化钾。将得到的产物用双蒸水补足至80mL，充分溶解。

实例3：

40mg的叶酸先溶于16mL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（pH5，20mmol/L），完全溶解后得到的0.0227mmol/L叶酸溶液，将其与8mL1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺水溶液（0.068mmol/L）和N-羟基琥珀酰亚胺（0.068mmol/L）混合水溶液相混合，在室温下避光放置过夜得以活化。继而与实例2得到的80mL聚烯丙基胺盐酸盐修饰后的氧化石墨烯水溶液充分混合，在室温下磁力搅拌24小时。反应结束后将溶液收集再超滤离心，双蒸水洗涤至中性，去除未结合的叶酸和未反应的交联剂。将得到的产物用双蒸水补足至80mL，充分溶解，得到叶酸-氧化石墨烯水溶液。

实例4：

往实例3得到的80mL叶酸-氧化石墨烯水溶液中加入8ml7.9mmol/L氯铂酸溶液，混匀后水浴80℃下反应24小时，所得的水溶液为叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料水溶液（见图1）。冷冻干燥后得到叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料粉末。

实例5：

在3.290mL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（pH5，20mmol/L）中依次加入0.5mL浓度为4mol/L的过氧化氢、0.2mL浓度为16mmol/L的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐，再加入10μL浓度为0.67mg/mL的实例4制得的叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料水溶液，混合后30℃温浴10分钟，溶液由无色变为蓝色，在652nm处有吸收峰，加硫酸终止反应，溶液变为黄色，在450nm处有吸收峰（见图2，3）。

实例6：

空白组使用6%（质量浓度）胎牛血清的RPMI-1640培养基，不含细胞，培养环境为恒温37℃的5%（体积百分数）二氧化碳培养箱。将培养基以每孔200μL加入至96孔板中，培养箱中培养24小时。每个培养基孔依次加入含5μg实例4制得的叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料水溶液，培养箱中孵育1.5小时。之后每个培养基孔孔用200μL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（10mmol/L，pH7.4）轻轻吹打冲洗3次，以去除未结合的叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料。显色过程，每孔加入140μL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（20mmol/L，pH5）后，再依次加入50μL过氧化氢（4mol/L）和10μL3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐（16mmol/L），充分振荡混匀后，室温下反应15分钟，溶液颜色无明显变化。待反应结束，立刻加入50μL2mol/L浓硫酸终止反应。利用酶标仪测定每个反应孔在450nm处的吸光值（见图4中的a柱）。

实例7：

MCF-7（人乳腺癌细胞）的培养基为含6%（质量浓度）胎牛血清的RPMI-1640，培养环境为恒温37℃的5%（体积百分数）二氧化碳培养箱。将贴壁的MCF-7用胰酶消化，加培养基吹打混匀，计算细胞数量。稀释成10000个/mL的细胞悬液，以每孔200μL加入至96孔板中，培养箱中培养24小时待完全贴壁。每个MCF-7孔依次加入含5μg叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料水溶液，培养箱中孵育1.5小时。之后每个MCF-7孔用200μL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（10mmol/L，pH7.4）轻轻吹打冲洗3次，以去除非未结合的叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料。显色过程：每孔再依次加入140μL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（20mmol/L，pH5），50μL过氧化氢（4mol/L）和10μL3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐（16mmol/L），充分振荡混匀后，室温下反应15分钟，溶液逐渐呈蓝色。待反应结束，立刻加入50μL2mol/L浓硫酸终止反应，溶液颜色由蓝色变为黄色。利用酶标仪测定每个反应孔在450nm处的吸光值（见图4中的b柱）。

实例8：

SGC-7901（人胃癌细胞）的培养基为含6%（质量浓度）胎牛血清的RPMI-1640，培养环境为恒温37℃的5%（体积百分数）二氧化碳培养箱。将贴壁的SGC-7901用胰酶消化，加培养基吹打混匀，计算细胞数量。稀释成10000个/mL的细胞悬液，以每孔200μL加入至96孔板中，培养箱中培养24小时待完全贴壁。每个SGC-7901孔依次加入含5μg叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料水溶液，培养箱中孵育1.5小时。之后每个SGC-7901孔用200μL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（10mmol/L，pH7.4）轻轻吹打冲洗3次，以去除非未结合的叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料。显色过程，每孔依次加入140μL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（20mmol/L，pH5），50μL过氧化氢（4mol/L）和10μL3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐（16mmol/L），充分振荡混匀后，室温下反应15分钟，溶液逐渐呈蓝色。待反应结束，立刻加入50μL2mol/L浓硫酸终止反应，溶液颜色由蓝色变为黄色。利用酶标仪测定每个反应孔在450nm处的吸光值（见图4中的c柱）。

实例9：

HUVEC（人脐带静脉内皮细胞）的培养基为含6%（质量浓度）胎牛血清的RPMI-1640，培养环境为恒温37℃的5%（体积百分数）二氧化碳培养箱。将贴壁的HUVEC用胰酶消化，加培养基吹打混匀，计算细胞数量。稀释成10000个/mL的细胞悬液，以每孔200μL加入至96孔板中，培养箱中培养24小时待完全贴壁。每个HUVEC孔依次加入含5μg叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料水溶液，培养箱中孵育1.5小时。之后每个HUVEC孔用200μL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（10mmol/L，pH7.4）轻轻吹打冲洗3次，以去除非未结合的叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料。显色过程，每孔依次加入140μL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（20mmol/L，pH5），50μL过氧化氢（4mol/L）和10μL3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐（16mmol/L），充分振荡混匀后，室温下反应15分钟，溶液颜色无明显变化。待反应结束，立刻加入50μL2mol/L浓硫酸终止反应。利用酶标仪测定每个反应孔在450nm处的吸光值（见图4中的d柱）。

实例10：

将MCF-7配成10000个/mL的细胞悬液，以每孔200μL加入至96孔板中，培养箱中培养24小时待完全贴壁。每个MCF-7孔先加入含40μg叶酸的水溶液，培养箱中孵育0.5小时，将培养基弃去以去除未结合的叶酸，再加入200μL新的1640培养基。依次加入含5μg叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料水溶液，继续培养箱中孵育1.5小时。之后每个MCF-7孔用200μL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（10mmol/L，pH7.4）轻轻吹打冲洗3次，以去除非未结合的叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料。显色过程，每孔依次加入140μL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（20mmol/L，pH5），50μL过氧化氢（4mol/L）和10μL3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐（16mmol/L），充分振荡混匀后，室温下反应15分钟，溶液颜色无明显变化。待反应结束，立刻加入50μL2mol/L浓硫酸终止反应。利用酶标仪测定每个反应孔在450nm处的吸光值（见图4中的e柱）。

实例11：

将MCF-7配成10000个/mL的细胞悬液，以每孔200μL加入至96孔板中，培养箱中培养24小时待完全贴壁。每个MCF-7孔依次加入含5μg多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料水溶液，继续培养箱中孵育1.5小时。之后每个MCF-7孔用200μL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（10mmol/L，pH7.4）轻轻吹打冲洗3次，以去除非未结合的多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料。显色过程，每孔依次加入140μL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（20mmol/L，pH5），50μL过氧化氢（4mol/L）和10μL3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐（16mmol/L），充分振荡混匀后，室温下反应15分钟，溶液颜色无明显变化。待反应结束，立刻加入50μL2mol/L浓硫酸终止反应。利用酶标仪测定每个细胞孔在450nm处的吸光值（见图4中的f柱）。

实例12：

将MCF-7配制成不同梯度浓度的细胞悬液，以每孔200μL（细胞个数125-8000个）加入至96孔板中，培养箱中培养24小时待完全贴壁。每个MCF-7孔依次加入含5μg叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料水溶液，培养箱中孵育1.5小时。之后每个MCF-7孔用200μL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（10mmol/L，pH7.4）轻轻吹打冲洗3次，以去除非未结合的叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料。显色过程，每孔依次加入140μL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（20mmol/L，pH5），50μL过氧化氢（4mol/L）和10μL3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐（16mmol/L），充分振荡混匀后，室温下反应15分钟，溶液呈不同深浅的蓝色。待反应结束，立刻加入50μL2mol/L浓硫酸终止反应，溶液颜色由蓝色变为黄色，目视观察检测限为125个MCF-7细胞（见图5）。利用酶标仪测定每个细胞孔在450nm处的吸光值，吸光度值随细胞数量增加而增大，检测限为30个MCF-7细胞（见图5-1）。

实例13：

将MCF-7配成10000个/mL的细胞悬液，以每孔200μL加入至96孔板中，培养箱中培养24小时待完全贴壁。每个MCF-7孔依次加入含5μg多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料水溶液，继续培养箱中孵育1.5小时。之后每个MCF-7孔用200μL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液（10mmol/L，pH7.4）轻轻吹打冲洗3次，以去除非未结合的多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料。显色过程，每孔依次加入190μL二氨基联苯胺显色液（0.5mg/mL）和10μL过氧化氢（4mmol/L）。反应10分钟后，显微镜下可见细胞表面出现红褐色沉淀物（见图6）。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料，由以下方法制备而成：1）配制氧化石墨烯水溶液0.5mg/mL，加入聚烯丙基胺盐酸盐和氢氧化钾，混匀后置于70℃水浴加热24小时，将溶液收集再离心洗涤，去除多余的聚烯丙基胺盐酸盐和氢氧化钾；2）使用1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）-碳化二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）为交联剂，叶酸上的羧基与聚烯丙基胺盐酸盐修饰氧化石墨烯上的氨基通过酰胺化交联，在室温下反应24小时后，将溶液收集再离心洗涤，去除多余的交联剂和叶酸，得到的叶酸功能化氧化石墨烯水溶液；3）将所得到的叶酸功能化氧化石墨烯水溶液与7.9mmol/L的氯铂酸水溶液以体积比为10:1混合均匀，80℃水浴加热24小时，得到的叶酸-多孔铂-氧化石墨烯水溶液呈黑色，4℃保存；所使用的基底氧化石墨烯的制备方法为：称取325目鳞片石墨1.2g，加入到144mL浓度为18mol/L的浓硫酸和16mL浓度为15mol/L的磷酸的混合溶液中；充分搅拌后，置于在0℃冰浴中；将7.2g高锰酸钾以少量多次方式缓慢加入到以上混合溶液中；保持0℃冰浴，磁力搅拌3小时后，将所得墨绿混悬液转移至50℃温水浴中，控温12小时，得到的紫黑色混悬液缓慢加入到160mL冰水混合物中，剧烈搅拌1小时；继而往溶液中逐滴滴加4mL质量浓度为30%的过氧化氢溶液，溶液颜色突变为亮黄色，所得溶液经孔径为20-30微米的G1砂芯漏斗过滤，继而4000转每分钟离心30分钟，弃去上清液；加入80mL双蒸水充分振荡洗涤，4000转每分钟离心30分钟，弃去上清液，沉淀颜色呈土黄色；再加入80mL质量浓度为30%的盐酸充分振荡洗涤，经为孔径20-30微米的G1砂芯漏斗过滤去除不溶颗粒，滤液4000转每分钟离心30分钟，弃去上清液，沉淀颜色继续加深；接着多次用无水乙醇将沉淀物洗至pH值为中性，4000转每分钟离心30分钟，弃去上清液，沉淀呈棕黄色；最后用乙醚冲洗沉淀，经孔径为1.5-2.5微米的G5砂芯漏斗过滤，获得滤饼，滤饼在室温下过夜晾干，得到棕色的氧化石墨；取50mg棕色的氧化石墨溶解于100mL双蒸水，常温下超声3小时，充分剥离后得到0.5mg/mL透明澄清的棕黄色氧化石墨烯水溶液。

2.使用权利要求1所述的叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料模拟过氧化物酶的方法，催化过氧化氢氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色，并识别细胞膜表面叶酸受体。

3.使用权利要求1所述的叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料模拟过氧化物酶的方法，其特征是在3.290mLpH为5、浓度为20mmol/L的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液中依次加入0.5mL浓度为4mol/L的过氧化氢、0.2mL浓度为16mmol/L的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐，再加入10μL浓度为0.67mg/mL的叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料水溶液，混合后30℃温浴10分钟，溶液由无色变为蓝色，在652nm处有吸收峰，加硫酸终止反应，溶液变为黄色，在450nm处有吸收峰。

4.使用权利要求1所述的叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料模拟过氧化物酶的方法，其特征是叶酸-多孔铂-氧化石墨烯复合纳米材料与经过叶酸饱和的MCF-7极少量结合，3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐无明显颜色变化。