CN102145177B - 叶酸分子靶向磁性纳米药物载体及靶向基因药物的制备方法 - Google Patents
叶酸分子靶向磁性纳米药物载体及靶向基因药物的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种叶酸分子靶向磁性纳米药物载体的制备方法,:其包括以下步骤:1)醛基化海藻酸钠(ASA)溶液的制备:将海藻酸钠(SA)溶于水中,加入强氧化剂,反应24-36h,加入乙醇终止反应;2)磁性纳米粒子MNPs溶液的制备:将亚铁盐、铁盐溶于水中,调节pH至9-10,搅拌,直至溶液颜色变为深黑色,取上清液,备用;3)醛基化海藻酸钠改性磁性纳米粒子ASAMNPs的制备:将步骤1)中的ASA溶液与步骤2)中的磁性纳米粒子MNPs溶液混合,80-90℃下反应30-50min,取上清液,备用;4)叶酸-氨基聚乙二醇FA-PEG-NH2的制备;5)FA-PEG-ASAMNPs的制备。本发明制作的载体FA-PEG-ASAMNPs对肿瘤细胞具有很好的主动响应性能,由于载体上连接磁性粒子,其又具备较好的磁响应性能。
Description
技术领域
本发明涉及一种叶酸分子靶向磁性纳米药物载体及靶向基因药物的制备方法。
背景技术
叶酸(folic acid,FA)又称蝶酰谷氨酸、维生素B11,是一种人体必需的维生素,在细胞内可还原为四氢叶酸,后者是一碳单位转移酶的辅酶,参与一碳单位代谢和嘌呤、胸腺嘧啶的合成,是细胞代谢、DNA合成及修复的基本组成成分。肿瘤细胞的快速生长需要充足的叶酸以维持DNA的合成。动物细胞内缺少合成叶酸的酶,细胞的生长和增殖依赖从外界环境获得叶酸。叶酸受体(folate receptor, FR)是细胞膜表面糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定的糖化多肽,包括三种异构体:α-FR、β-FR和γ-FR。β-FR是细胞膜相关蛋白,通过GPI锚定在细胞膜上,二者具有约70%的同源性。α-FR和γ-FR缺少修饰GPI锚附着的羧基末端信号肽,,组成上属于分泌型蛋白。叶酸受体有三个显著特点:1.FR与游离叶酸的亲和力非常高,解离常数Kd<1nmol/L;2.FR对叶酸分子通过化学键与其他大分子物质连接形成的复合物的亲和力和胞吞效应与游离叶酸相当,具有良好的入胞转运潜能;3.FR对叶酸及其衍生物的结合、转运是特异的受体-配体结合,并能被游离叶酸竞争抑制。叶酸与受体结合,通过内化方式穿过细胞膜,是叶酸进入细胞内的主要途径。已有研究发现叶酸受体在卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌、头颈癌等多种上皮源性恶性肿瘤细胞表面过表达,已证实喉癌和鼻咽癌高表达叶酸受体。而在正常组织细胞除脉络丛、胎盘、肺、胸腺、肾低水平表达外,均高度保守。叶酸受体表达分布的肿瘤特异性、高效的转运潜能和与叶酸的高亲和力,为叶酸分子靶向药物载体的制备及抗肿瘤分子靶向治疗提供了基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种叶酸分子靶向磁性纳米药物载体及靶向基因药物的制备方法。
本发明所采取的技术方案是:
一种叶酸分子靶向磁性纳米药物载体的制备方法,其包括以下步骤:
1)醛基化海藻酸钠(ASA)溶液的制备:将海藻酸钠(SA)溶于水中,加入强氧化剂,反应24-36h,加入乙醇终止反应;其中,海藻酸钠的质量:强氧化剂的质量:水的体积:乙醇的体积=1g:0.2-0.3g:20-30ml:1-2ml;
2)磁性纳米粒子MNPs溶液的制备:将亚铁盐、铁盐溶于水中,调节pH至9-10,搅拌,直至溶液颜色变为深黑色,取上清液,备用;其中,Fe2+的物质的量:Fe3+的物质的量:水的体积=1mol:0.4-0.6mol:80-120L;
3)醛基化海藻酸钠改性磁性纳米粒子ASAMNPs的制备:将步骤1)中的ASA溶液与步骤2)中的磁性纳米粒子MNPs溶液混合,80-90℃下反应30-50min,取上清液,备用;
4)叶酸-氨基聚乙二醇FA-PEG-NH2的制备:将叶酸(FA)、二环己基碳二亚胺(DCC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合于非质子有机溶剂中,反应4-8h,加入PEG2000(NH2)2,反应8-10h,加水,过滤除去不溶物得FA-PEG-NH2溶液;其中,叶酸(FA)的质量:二环己基碳二亚胺(DCC)的质量:N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的质量:非质子有机溶剂的体积:水的体积=1g:1.2-1.5g:0.3-0.5g:40-60ml:180-240ml;
5)FA-PEG-ASAMNPs的制备:将步骤3)中的得到的ASAMNPs与步骤4)中得到的FA-PEG-NH2溶液在0.3-0.6mol/L的硼酸钠溶液中混合,再加入硼氢化钠,室温下反应8-10h,得到产物,其中,ASAMNPs质量:FA-PEG-NH2溶液中的FA-PEG-NH2质量:硼酸钠溶液体积:硼氢化钠质量=1g:0.5-1g:30-50ml:0.3-0.5g。
步骤1)中所述的强氧化剂为NaIO4。
步骤1)中,反应温度为4-8℃。
所述的亚铁盐为FeSO4·4H2O。
所述的铁盐为FeCl3·6H2O。
步骤2)中,调节pH是通过加入25%(w/w)NH3·H2O来调节的。
步骤3)中,ASA溶液与MNPs溶液体积比为1:1-2。
步骤4)中,所述的非质子化有机溶剂为乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、六甲基磷酰三胺、苯、乙醚、四氯化碳中的一种。
步骤5)中,所得产物在蒸馏水中透析3-5天,干燥。
上述制备方法中,步骤1)的反应方程式示意如式子(Ⅰ):
步骤4)所涉及的方程式示意如(Ⅱ):
步骤5)所涉及的方程式示意如(Ⅲ):
一种靶向基因药物的制备方法,其包括以下步骤:
1)醛基化海藻酸钠(ASA)溶液的制备:将海藻酸钠溶于水中,加入强氧化剂NaIO4,反应24-36h,加入乙醇终止反应;其中,海藻酸钠的质量:强氧化剂的质量:水的体积:乙醇的体积=1g:0.2-0.3g:20-30ml:1-2ml,反应温度为4-8℃;
2)磁性纳米粒子MNPs溶液的制备:将亚铁盐、铁盐溶于水中,调节pH至9-10,搅拌,直至溶液颜色变为深黑色,取上清液,备用;其中,Fe2+的物质的量:Fe3+的物质的量:水的体积=1mol:0.4-0.6mol:80-120L;
3)醛基化海藻酸钠改性磁性纳米粒子ASAMNPs的制备:将步骤1)中的ASA溶液与步骤2)中的磁性纳米粒子MNPs溶液混合,80-90℃下反应30-50min,取上清液,备用;
4)叶酸-氨基聚乙二醇FA-PEG-NH2的制备:将叶酸(FA)、二环己基碳二亚胺(DCC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合于非质子有机溶剂中,反应4-8h,加入PEG2000(NH2)2,反应8-10h,加水,过滤除去不溶物得FA-PEG-NH2溶液;其中,叶酸(FA)的质量:二环己基碳二亚胺(DCC)的质量:N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的质量:非质子有机溶剂的体积:水的体积=1g:1.2-1.5g:0.3-0.5g:40-60ml:180-240ml;
5)MMP-9-ASODN的合成:根据人MMP-9基因cDNA序列,选择含起始密码子及上游的6个碱基及后续的11个碱基,共20个碱基作为靶序列的反义寡核苷酸(ASODN),MMP-9反义序列如下:5’-TGCCAGAGGCTCATGGTGAG-3’ (SEQ ID NO.1),无义序列为:5’-CGTCCCTATACGACC-3’ (SEQ ID NO.2),上述寡核苷酸碱基均采用硫代修饰,5’氨基(NH2)修饰;
6)FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN磁性纳米复合物的制备:取ASAMNPs、FA-PEG-NH2、硫代及氨基修饰的MMP-9-ASODN,搅拌均匀,于4-8℃下避光反应24-36小时,加入一定量的硼氢化钠溶液,使体系中硼氢化钠的浓度为0.5-0.7mol.l-1,体系继续反应3-6小时后,充分离心沉淀,沉淀物用0.01mol/L的PBS溶液重新分散均匀,制备成FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN的磁性纳米复合物;
步骤6)中,ASAMNPs溶液体积:FA-PEG-NH2溶液体积:硫代及氨基修饰的MMP-9-ASODN溶液体积=1:0.25-0.35:0.15-0.25,硫代及氨基修饰的MMP-9-ASODN溶液中,MMP-9-ASODN的浓度为95-105μmol.l-1。
本发明的有益效果是:叶酸受体在肿瘤中高度表达,而叶酸受体同叶酸衍生物及游离叶酸的亲和力均很高,叶酸衍生物与受体结合,并可通过内化方式穿过细胞膜。因此,本发明制作的载体FA-PEG-ASAMNPs对肿瘤细胞具有很好的主动响应性能,由于载体上连接磁性粒子,其又具备较好的磁响应性能。载体FA-PEG-ASAMNPs载MMP-9-ASODN后形成的FA-PEG-ASAMNPS-MMP-9-ASODN的复合物具有良好的叶酸分子特异靶向性。
附图说明
图1为FA-PEG-ASAMNPs中铁含量标准曲线。
图2为CDDP-FA-PEG-ASAMNPs中顺铂含量标准曲线。
图3为SAMNPs、ASAMNPs及CDDP-FA-PEG-ASAMNPs的流体力学粒径分布示意图。
图4为SAMNPs、ASAMNPs及CDDP-FA-PEG-ASAMNPs的zeta电位拟合曲线。
图5为透射电镜下CDDP-FA-PEG-ASAMNPs的分布图。
图6为CDDP-FA-PEG-ASAMNPs的粒径分布直方图。
图7为SA、ASA、SAMNPs及ASAMNPs的红外光谱图。
图8为FA、ASAMNPs及FA-ASAMNPs的紫外光谱图。
图9为ASAMNPs的磁化曲线图。
图10为FA的紫外光谱图。
图11为FA-PEG- NH2的紫外光谱图。
图12为FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN的紫外光谱图。
图13为叶酸含量标准曲线。
图14为叶酸靶向磁性纳米载体FA-PEG-ASAMNPs与MMP-9-ASODN结合凝胶电泳图(1:DNA marker;2:MMP-9-ASODN;3:FA-PEG-ASAMNPs;4:FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN;5:未醛基化海藻酸钠改性Fe3O4、FA-PEG-NH2与MMP-9-ASODN混合物。)
图15为鼻咽癌细胞铁染色的图片(a:未经染色的鼻咽癌细胞HNE-1;b:经过染色的鼻咽癌细胞HNE-1(纳米复合物FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN浓度按铁含量计为10μg/mL);c:经过染色的鼻咽癌细胞HNE-1(纳米复合物FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN浓度按铁含量计为40μg/mL);e:未经染色的鼻咽癌细胞CNE-2;f:经过染色的鼻咽癌细胞CNE-2(纳米复合物FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN浓度按铁含量计为10μg/mL);g:经过染色的鼻咽癌细胞CNE-2(纳米复合物FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN浓度按铁含量计为40μg/mL)。)
图16为鼻咽癌细胞HNE-1经叶酸封闭后与磁性纳米复合物FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN共培养行铁染色的图片(a纳米复合物FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN浓度按铁含量计为10μg/mL:b:纳米复合物FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN浓度按铁含量计为40μg/mL。)
图17为HNE-1细胞透射电镜图片。
图18 为CNE-2细胞透射电镜图片。
图19为种植HNE-1和CNE-2瘤块裸鼠。
图20 为叶酸靶向纳米复合物处理前MRI。
图21 为叶酸靶向纳米复合物处理后MRI。
图22静脉给叶酸靶向纳米复合物FA-PEG-ASAMNPS-MMP-9-ASODN处理后鼻咽癌瘤块的铁染色结果(×400)(a:种植了HNE-1瘤块的铁染色结果;b:种植了CNE-2瘤块的铁染色结果。)
图23为HNE-1瘤块透射电镜图片。
图24为CNE-2瘤块透射电镜图片。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明:
实施例1:
一种叶酸分子靶向磁性纳米药物载体的制备方法,其包括以下步骤:
1)醛基化海藻酸钠(ASA)溶液的制备:将海藻酸钠溶于水中,加入强氧化剂NaIO4,反应24h,加入乙醇终止反应;其中,海藻酸钠的质量:强氧化剂的质量:水的体积:乙醇的体积=1g:0.2g:20ml:1ml,反应温度为5℃;
2)磁性纳米粒子MNPs溶液的制备:室温下,将FeCl3·6H2O、FeSO4·4H2O溶于水中,加入25%(w/w)NH3·H2O调节pH至9-10,搅拌,直至溶液颜色变为深黑色,取上清液,磁洗至上清液电导率值<50μs,超声振荡1-2h,备用;其中,Fe2+的物质的量:Fe3+的物质的量:水的体积=1mol:0.4mol:80L;
3)醛基化海藻酸钠改性磁性纳米粒子ASAMNPs的制备:将步骤1)中的ASA溶液与步骤2)中的磁性纳米粒子MNPs溶液混合,80-90℃下反应30-50min,4000-5000rpm离心后取上清液超滤除去游离的SA,直至滤出液电导率值<50μs,产物冷冻干燥后备用;其中,ASA溶液与MNPs溶液体积比为1:1;
4)叶酸-氨基聚乙二醇FA-PEG-NH2的制备:将叶酸(FA)、二环己基碳二亚胺(DCC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合于无水二甲基亚砜(DMSO)中,反应6h,加入PEG2000(NH2)2,反应9h,加水,过滤除去不溶物得FA-PEG-NH2溶液,冷冻干燥;其中,叶酸(FA)的质量:二环己基碳二亚胺(DCC)的质量:N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的质量:非质子有机溶剂DMSO的体积:水的体积=1g:1.2g:0.3g:40ml:180ml;
5)FA-PEG-ASAMNPS的制备:将步骤3)中的得到的ASAMNPs与步骤4)中得到的FA-PEG-NH2溶液在0.3mol/L的硼酸钠溶液中混合,再加入硼氢化钠,室温下反应9h,产物在蒸馏水中透析4天,冷冻干燥;ASAMNPs质量:FA-PEG-NH2溶液中的FA-PEG-NH2质量:硼酸钠溶液体积:硼氢化钠质量=1g:0.5g:30ml:0.3g。
实施例2:
一种叶酸分子靶向磁性纳米药物载体的制备方法,其包括以下步骤:
1)醛基化海藻酸钠(ASA)溶液的制备:将海藻酸钠溶于水中,加入强氧化剂NaIO4,反应36h,加入乙醇终止反应;其中,海藻酸钠的质量:强氧化剂的质量:水的体积:乙醇的体积=1g:0.3g:30ml:2ml,反应温度为8℃;
2)磁性纳米粒子MNPs溶液的制备:室温下,将FeCl3·6H2O、FeSO4·4H2O溶于水中,加入25%(w/w)NH3·H2O调节pH至9-10,搅拌,直至溶液颜色变为深黑色,取上清液,磁洗至上清液电导率值<50μs,超声振荡1-2h,备用;其中,Fe2+的物质的量:Fe3+的物质的量:水的体积=1mol:0.6mol:120L;
3)醛基化海藻酸钠改性磁性纳米粒子ASAMNPs的制备:将步骤1)中的ASA溶液与步骤2)中的磁性纳米粒子MNPs溶液混合,80-90℃下反应30-50min,4000-5000rpm离心后取上清液超滤除去游离的SA,直至滤出液电导率值<50μs,产物冷冻干燥后备用;其中,ASA溶液与MNPs溶液体积比为1:2;
4)叶酸-氨基聚乙二醇FA-PEG-NH2的制备:将叶酸(FA)、二环己基碳二亚胺(DCC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合于无水二甲基亚砜(DMSO)中,反应4h,加入PEG2000(NH2)2,反应10h,加水,过滤除去不溶物得FA-PEG-NH2溶液,冷冻干燥;其中,叶酸(FA)的质量:二环己基碳二亚胺(DCC)的质量:N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的质量:非质子有机溶剂DMSO的体积:水的体积=1g:1.5g:0.5g:60ml:240ml;
5)FA-PEG-ASAMNPS的制备:将步骤3)中的得到的ASAMNPs与步骤4)中得到的FA-PEG-NH2溶液在0.6mol/L的硼酸钠溶液中混合,再加入硼氢化钠,室温下反应10h,产物在蒸馏水中透析5天,冷冻干燥;ASAMNPs质量:FA-PEG-NH2溶液中的FA-PEG-NH2质量:硼酸钠溶液体积:硼氢化钠质量=1g:1g:50ml:0.5g。
实施例3:
一种叶酸分子靶向磁性纳米药物载体的制备方法,其包括以下步骤:
1)醛基化海藻酸钠(ASA)溶液的制备:将海藻酸钠溶于水中,加入强氧化剂NaIO4,避光反应24h,加入乙醇终止反应;其中,海藻酸钠的质量:强氧化剂的质量:水的体积:乙醇的体积=1g:0.25g:25ml:1.25ml,反应温度为4℃;
2)磁性纳米粒子MNPs溶液的制备:室温下,将FeCl3·6H2O、FeSO4·4H2O溶于水中,加入25%(w/w)NH3·H2O调节pH至9-10,搅拌,直至溶液颜色变为深黑色,取上清液,磁洗至上清液电导率值<50μs,超声振荡1-2h,备用;其中,Fe2+的物质的量:Fe3+的物质的量:水的体积=1mol:0.5mol:100L;
3)醛基化海藻酸钠改性磁性纳米粒子ASAMNPs的制备:将步骤1)中的ASA溶液与步骤2)中的磁性纳米粒子MNPs溶液混合,80-90℃下反应30-50min,4000-5000rpm离心后取上清液超滤除去游离的SA,直至滤出液电导率值<50μs,产物冷冻干燥后备用;其中,ASA溶液与MNPs溶液体积比为1:1.5;
4)叶酸-氨基聚乙二醇FA-PEG-NH2的制备:将叶酸(FA)、二环己基碳二亚胺(DCC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合于无水二甲基亚砜(DMSO)中,反应4h,加入PEG2000(NH2)2,反应8h,加水,过滤除去不溶物得FA-PEG-NH2溶液,冷冻干燥;其中,叶酸(FA)的质量:二环己基碳二亚胺(DCC)的质量:N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的质量:非质子有机溶剂DMSO的体积:水的体积=1g:1.4g:0.4g:50ml:200ml;
5)FA-PEG-ASAMNPS的制备:将步骤3)中的得到的ASAMNPs与步骤4)中得到的FA-PEG-NH2溶液在0.4mol/L的硼酸钠溶液中混合,再加入硼氢化钠,室温下反应8h,产物在蒸馏水中透析3天,冷冻干燥;ASAMNPs质量:FA-PEG-NH2溶液中的FA-PEG-NH2质量:硼酸钠溶液体积:硼氢化钠质量=1g:0.6g:40ml:0.4g。
叶酸受体在肿瘤中高度表达,而叶酸受体同叶酸衍生物及游离叶酸的亲和力均很高,叶酸衍生物与受体结合,并可通过内化方式穿过细胞膜。因此,本发明制作的载体FA-PEG-ASAMNPS对肿瘤细胞具有很好的主动相应性能,由于载体上连接磁性粒子,其又具备较好的磁相应性能。
应用例1:
CDDP-FA-PEG-ASAMNPs的制备:
按照实施例1的方法制备FA-PEG-ASAMNPS,将叶酸修饰醛基化海藻酸钠改性磁性纳米粒(FA-PEG-ASAMNPs)悬液(Fe含量10mg)与一定量顺铂(10mg)在恒温摇床中37℃下反应24小时,利用海藻酸钠侧链上丰富的羧基(-COO-)取代顺铂分子中的Cl-形成配位络合,得到载顺铂的叶酸修饰纳米药物(CDDP -FA–PEG-ASAMNPs),0.22μm灭菌滤器过滤除菌后避光保存。
对比例1:
SAMNPs的制备:
制备方法与实施例1中步骤3)一样,只是将ASA溶液换成SA溶液。
测试部分:
测试例1:
邻二氮菲法测定铁含量:
该方法的测定原理是:以盐酸羟胺将Fe3+还原为Fe2+, 在pH=2~9的范围内,与邻二氮菲反应生成稳定的橙红色配合物[(C12H8N2)3Fe]2+,最大吸收峰在510nm 处。
(1)试剂:配制标准Fe溶液:准确称取0.8634 克 NH4Fe(SO4)2·12H2O,加入20 ml 1∶1的浓HCl和少量水,溶解后,定量转移至1L容量瓶中,稀释至刻度,摇匀。每毫升含Fe3+ 100μg;邻二氮菲(0.15%水溶液,临时配制);盐酸羟胺(10%水溶液,临时配制);醋酸钠溶液(1mol·L-1)。
(2)标准曲线的绘制:分别准确吸弃0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml标准Fe溶液(含Fe3+100μg/ml)于6只已编号的50 ml容量瓶中,各加入1ml 10%盐酸羟氨溶液,充分摇动后加入2ml 0.15%邻二氮菲溶液和5ml 1mol/L NaAc溶液,以水稀释到刻度,摇匀。在在UVIKON 923紫外-可见光分光光度计上,用1cm比色皿,以空白溶液为参比溶液,在510nm波长下,分别测定各溶液的吸光度。以Fe2+的组成量度(μg/ml)为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。
(3)FA-PEG-ASAMNPs中Fe含量的测定:取1ml FA-PEG-ASAMNPs样品,加入一定量的浓HCl,使Fe3O4转化成Fe3+离子,然后稀释至含Fe3+浓度为10~100μg/ ml,并保证溶液pH在2~9的范围内。用1 ml吸量管吸弃1ml上述Fe3+浓度为10~100μg/ ml的溶液置于50 ml容量瓶中,依次加入1ml 10%盐酸羟氨溶液、2ml 0.15%邻二氮菲溶液和5ml 1mol/L NaAc溶液,以水稀释至刻度,摇匀。在510nm波长下测定其吸光度,再对比标准曲线及稀释倍数计算样品中Fe的含量。
邻二氮菲法测定铁含量标准曲线如图1所示,其回归方程为:Y= 0.218X + 0.0027,R2=0.999。利用此方程可算出FA-PEG-ASAMNPs中铁含量约为1.305±0.41mg/ml,其浓度随着样品的浓度变化而发生变化。
测试例2:
包封率及载药量的测定:
采用邻苯二胺(o-phenylenediamine,OPDA)比色法测定CDDP-FA-PEG-ASAMNPs中顺铂的含量。即OPDA通过配位络和作用与CDDP结合,发生显色反应,在一定的CDDP浓度范围内,溶液在703nm处的吸光度与浓度成线性关系,可用于CDDP的定量分析。由于OPDA对CDDP的亲和性与DNA相似,将载体上可与OPDA反应的CDDP视为可逆释放的CDDP。测定原理如下式(Ⅳ)所示:
测定步骤和方法:
(1)标准曲线的绘制
配置1.2 mg/ml OPDA/DMF溶液100 ml(溶液a),10mg/250ml CDDP溶液(溶液b),取六支大试管,按表1数据配制一系列溶液。
表1 CDDP标准曲线溶液配制表
将上述各试管浸于沸水浴中,煮沸10分钟后取出,迅速冷却后在703nm波长下比色。以标准CDDP溶液的浓度(μg/ml)为横坐标,以吸光度值为纵坐标,作标准曲线。吸光度测定在UVIKON 923紫外-可见光分光光度计上进行。
(2)样品测试:
将样品稀释至CDDP含量在0~30μg/ml范围内,吸弃6毫升已稀释的样品,加入6ml 1.2mg/ml OPDA/DMF溶液,浸于沸水浴中,煮沸10分钟后取出,迅速冷却后在703nm波长下比色,记录吸光度,对比标准曲线得出CDDP的含量。
(3)载药率及包封率的计算
收集透析滤出液并以邻苯二胺分光光度法测量滤出液中CDDP的含量,以式(Ⅱ)计算包封率(drug encapsulation efficiency,DEE)。将CDDP-FA-PEG-ASAMNPs冷冻干燥后以式(Ⅴ)计算载药量(drug loading efficiency,DLE):
包封率(%)=100%×(理论药物含量-滤出液药物含量)/理论药物含量(Ⅳ)
载药量(%)=(微球内药物质量/微球的总质量)×100% (Ⅴ)
邻苯二胺法测定顺铂含量的标准曲线如图2所示,其回归方程为Y=0.1129X-0.1871,R2=0.9861。表2即为不同CDDP/Fe配比的CDDP-FA-PEG-ASAMNPs经过充分透析后用此法测得的包封率及载药量,由表可知,随着CDDP/Fe的降低,包封率(drug encapsulation efficiency,DEE)增高,即CDDP的利用率增高,说明随着药物载体的增加,可有充分的位点与CDDP进行连接。但与此同时载药率(drug loading efficiency,DLE)降低,即说明随着CDDP浓度的降低,单位药物载体上搭载的药物也随之降低。在实际应用中,不仅需要考虑到载药量的大小,也要考虑顺铂的利用率以及药物稳定性,以选择最佳的配比。综合考虑包封率及载药量,可知最佳配比为CCDP:Fe为2:1,此时包封率为49.05±1.58%,载药量为14.31±0.49%。
表2 不同CDDP/Fe配比的CDDP-FA-PEG-ASAMNPs包封率及载药量
测试例3:
ASA中醛基浓度测定:
采用盐酸羟胺-电位滴定法测定氧化后海藻酸钠表面的醛基浓度。此方法是利用盐酸羟胺与ASA上的醛基进行反应生成HCl,并用NaOH对其进行滴定,从而根据滴定所用NaOH的体积,计算出醛基含量。其反应式如式(Ⅵ)所示:
SA-(CHO)n+n(H2N-OH-HCl)=SA-(CH=N-OH)n+nH2O+n HCl (Ⅵ)
ΔV×0.001×nNaOH=nCHO (Ⅶ)
OD=(nCHO/2)/(wSA/198.11) (Ⅷ)
具体步骤:将1.75g盐酸羟胺溶于水中后,加入质量含量为0.5%的甲基橙水溶液0.6ml,稀释至100ml,配成0.25mol/L的盐酸羟胺溶液。取0.1g干燥后 ASA加入25ml盐酸羟胺溶液中,充分溶解后,以0.1mol/L的氢氧化钠溶液滴定,颜色由红色变为黄色后停止,此时pH约为5。由计算所得醛基量进一步可由式(Ⅶ)、(Ⅷ)推出海藻酸钠的氧化程度(oxidation degree,OD):被氧化的海藻酸钠单体数目与总的海藻酸钠单体数目之比,nCHO 为醛基的摩尔量,wSA为起始海藻酸钠的质量,海藻酸钠单体分子量为198.11。以上过程均在不同时间重复数遍取平均值。最后得到海藻酸钠的氧化程度为21.78±0.98%,即每5个海藻酸钠单体中约有一个生成了2,3-CHO。
测试例4:
流体力学直径与Zeta电位的测定:
粒径及Zeta电位的测量在高分辨Zeta电位及激光粒度分析仪(ZetaPALS Brook Haven Instruments Co. USA)上进行,测试之前将CDDP-FA-ASAMNPs稀释到一定浓度,用0.1 mol/L 的HCl 或NaOH调节待测液pH为7.4,并用0.45μm的滤器过滤。测试参数为:散射角90°,温度25℃ ,测试数遍取平均值。
最后得到SA-MNPs、ASAMNPs及CDDP-FA-PEG-SAMNPs平均流体力学粒径分别为45.3±2.3nm、48.7±1.7nm及66.5±1.5nm。后者与前两者相比,其流体力学粒径略大,一方面证明叶酸及顺铂均连接在聚合物表面,另一方面说明连接了靶向配体叶酸及抗肿瘤药物顺铂之后,其粒径仍然符合靶向载药系统对粒径的要求(<200nm)。SA-MNPs、ASAMNPs及CDDP-FA-SAMNPs的流体力学粒径均呈正态对称分布(图3所示)。
表3给出了和图4分别给出了SA-MNPs、ASAMNPs及CDDP-FA-SAMNPs的zeta电位值及拟合曲线,可以看出ASAMNPs的Zeta电位最高,SA-MNPs及CDDP-FA-PEG-SAMNPs的Zeta电位相当。CDDP-FA-PEG-SAMNPs的Zeta电位值低于ASAMNPs,估计与顺铂替代了表面阴性电荷有关。由图4的Zeta电位曲线可知,SAMNPs的稳定性较差,ASAMNPs和CDDP-FA-PEG-ASAMNPs稳定性相当。
表3 SAMNPs、ASAMNPs及CDDP-FA-PEG-ASAMNPs的Zeta电位测定
由图4的Zeta电位值可知,ASAMNPs的稳定性非常好,SAMNPs和CDDP-FA-PEG-ASAMNPs稳定性也很满意,表明海藻酸钠醛基化后可提高改性产物的稳定性。
测试例5:
磁核粒径、形状及分散度的测定:
图5为透射电镜下CDDP-FA-PEG-ASAMNPs的分布情况及形状,可以看出其表面形状为圆形,基本为单颗粒分散,但因其粒径小,且表面含有多种活性基团,故镜下可见轻微聚集现象。从中随机选取100个纳米颗粒,利用软件测量其粒径,可得平均粒径8.116±0.24nm,并绘制成直方图如图6所示,由图可知其分布为正态对称分布。
测试例6:
傅里叶变换红外光谱测定:
取1~2mg的样品在玛瑙研钵中与干燥的溴化钾粉末(A. R.级)混合并研磨成细粉末,装入模具内,在压片机上压制成片后在NEXVS 670 FTIR(美国Nicolet公司)上测试。
SA及ASA:图7显示, 3700~3100cm-1为0-H的伸缩振动,1600cm-1附近的吸收峰为羧酸盐(―COO-)基团的非对称伸缩振动;1410cm-1附近的吸收峰为羧酸盐(―COO-)基团的对称伸缩振动;1030 cm-1 附近的吸收峰为C-O 伸缩振动;均为海藻酸钠的典型吸收峰。与SA相类似,ASA上1603cm-1及1411cm-1附近的深宽吸收峰为海藻酸钠羧酸盐(―COO-)基团的非对称及对称伸缩振动,说明海藻酸钠氧化后并未改变表面的羧基基团,为表面修饰Fe3O4及偶联CDDP提供了条件。但醛基的C=O无明显的峰出现,与2,3-CHO之间形成半缩醛有关。
SAMNPs及ASAMNPs: SAMNPs及ASAMNPs分别在609及615 cm-1附近出现了Fe-O键的伸缩振动,由此可以证明,SA及ASA都成功的吸附在Fe3O4的表面。
测试例7:
紫外光谱测定:
紫外光谱显示,与ASAMNPs相比, FA-PEG-ASAMNPs在350nm及366nm各出现了一个明显的吸收峰,而叶酸也在360nm附近出现了明显的吸收峰,故FA-PEG-ASAMNPs的吸收峰应该为叶酸上的苯环上的共轭键所产生(图8),由此表明叶酸已连接在ASAMNPs上。
测试例8:
饱和磁化强度测定:
ASAMNPs的磁化曲线显示(图9),最大饱和磁化强度为56.2emu/g,矫顽力为零,表明具有良好的磁强度及超顺磁性。
下面应用例及测试例中可能涉及到溶液配置方法如下:
(1) 0.01mol/L的PBS缓冲液:1000ml蒸馏水中加入氯化钠8g,氯化钾0.2g,Na2HPO4.H2O 1.56g,KH2PO4 0.2g,搅动至充分溶解,配成PH7.2-7.4的PBS溶液。
(2) 细胞冻存液:按新生牛血清和DMSO体积比为9:1配置细胞冻存液。
(3) 4%多聚甲醛:称多聚甲醛4g加入100mlPBS缓冲液中,充分搅拌溶解。
(4) 1%中性红染液:配置1%中性红水溶液20ml,加入冰醋酸0.22ml,染液置棕色瓶内避光保存。
(5) 普鲁士蓝染液:临时配置2%亚铁氰化钾水溶液和2%盐酸,将两者等体积混匀避光静置10分钟使用。
应用例2:
FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN的制备:
(1)MMP-9-ASODN的合成:根据人MMP-9基因cDNA序列,选择含起始密码子及上游的6个碱基及后续的11个碱基,共20个碱基作为靶序列的反义寡核苷酸(ASODN),经Genbank计算机网上检索证实与MMP-9以外的己知人类基因无同源性;无义寡核苷酸(NSODN)序列经计算机网上检索证实与己知人类基因无同源性。MMP-9反义序列如下:5’-TGCCAGAGGCTCATGGTGAG-3’ (SEQ ID NO.1),无义序列为:5’-CGTCCCTATACGACC-3’ (SEQ ID NO.2)。上述寡核苷酸碱基均采用硫代修饰,5’氨基(NH2)修饰,修饰后的MMP-9-ASODN的总分子量为6682.4,双蒸水稀释至100μmol.l-1,-20℃保存备用;
(2)FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN磁性纳米复合物的制备:按照实施例1的步骤1)、2)、3)的方法制备ASAMNPs,按照实施例1的步骤4)制备FA-PEG-NH2,取100μL的ASAMNPs、30μL的FA-PEG-NH2、20μL的100μmol.l-1的硫代及氨基修饰的MMP-9-ASODN,搅拌均匀,于4℃下避光反应24小时,加入一定量的硼氢化钠溶液,使体系中硼氢化钠的浓度为0.5mol.l-1,体系继续反应3小时后,于4℃、13000rpm的条件下离心分离20分钟,沉淀物用清水洗涤3次,最后用100μl PBS重新分散。制备成MMP-9-ASODN浓度为20μmol.l-1的FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN的磁性纳米复合物。
应用例3:
FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN的制备:
(1)MMP-9-ASODN的合成:根据人MMP-9基因cDNA序列,选择含起始密码子及上游的6个碱基及后续的11个碱基,共20个碱基作为靶序列的反义寡核苷酸(ASODN),经Genbank计算机网上检索证实与MMP-9以外的己知人类基因无同源性;无义寡核苷酸(NSODN)序列经计算机网上检索证实与己知人类基因无同源性。MMP-9反义序列如下:5’-TGCCAGAGGCTCATGGTGAG-3’ (SEQ ID NO.1),无义序列为:5’-CGTCCCTATACGACC-3’ (SEQ ID NO.2)。上述寡核苷酸碱基均采用硫代修饰,5’氨基(NH2)修饰,修饰后的MMP-9-ASODN的总分子量为6682.4,双蒸水稀释至100μmol.l-1,-20℃保存备用;
(2)FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN磁性纳米复合物的制备:按照实施例2的步骤1)、2)、3)的方法制备ASAMNPs,按照实施例2的步骤4)制备FA-PEG-NH2,取100μL的ASAMNPs、25μL的FA-PEG-NH2、15μL的105μmol.l-1的硫代及氨基修饰的MMP-9-ASODN,搅拌均匀,于8℃下避光反应36小时,加入一定量的硼氢化钠溶液,使体系中硼氢化钠的浓度为0.7mol.l-1,体系继续反应6小时后,于8℃、13000rpm的条件下离心分离20分钟,沉淀物用清水洗涤3次,最后用100μl PBS重新分散。制备FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN的磁性纳米复合物。
应用例4:
FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN的制备:
(1)MMP-9-ASODN的合成:根据人MMP-9基因cDNA序列,选择含起始密码子及上游的6个碱基及后续的11个碱基,共20个碱基作为靶序列的反义寡核苷酸(ASODN),经Genbank计算机网上检索证实与MMP-9以外的己知人类基因无同源性;无义寡核苷酸(NSODN)序列经计算机网上检索证实与己知人类基因无同源性。MMP-9反义序列如下:5’-TGCCAGAGGCTCATGGTGAG-3’ (SEQ ID NO.1),无义序列为:5’-CGTCCCTATACGACC-3’ (SEQ ID NO.2)。上述寡核苷酸碱基均采用硫代修饰,5’氨基(NH2)修饰,修饰后的MMP-9-ASODN的总分子量为6682.4,双蒸水稀释至100μmol.l-1,-20℃保存备用;
(2)FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN磁性纳米复合物的制备:按照实施例3的步骤1)、2)、3)的方法制备ASAMNPs,按照实施例2的步骤4)制备FA-PEG-NH2,取100μL的ASAMNPs、35μL的FA-PEG-NH2、25μL的95μmol.l-1的硫代及氨基修饰的MMP-9-ASODN,搅拌均匀,于5℃下避光反应27小时,加入一定量的硼氢化钠溶液,使体系中硼氢化钠的浓度为0.6mol.l-1,体系继续反应4小时后,于5℃、13000rpm的条件下离心分离20分钟,沉淀物用清水洗涤3次,最后用100μl PBS重新分散,制备成FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN的磁性纳米复合物。
下面测试例中所用到的FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN来自应用例2。
测试例9:
FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN中的叶酸成分及含量测定:
由于叶酸分子包含高度共轭的苯环结构,在363nm处存在特征性的强吸收峰,利用这个特点可采用紫外光分光光度计法分析该磁性纳米复合物中的叶酸成分结构及测定含量,先称取适量叶酸于蒸馏水稀释溶解充分混匀,得到含叶酸1mg.ml-1的标准溶液,分别吸弃0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml标准FA溶液于8只50ml的容量瓶中,分别加入蒸馏水至50ml,摇匀后,用1cm比色杯,以蒸馏水作空白对照,在紫外-可见分光光度计363nm波长测定各浓度的吸光度(OD值)。根据叶酸的不同浓度和相对应的363nm波长下吸光度绘制标准曲线。以吸光度OD值为横坐标,叶酸浓度为纵坐标。测定磁性纳米复合物稀释10倍后的吸光度值,重复5次,根据标准曲线来得出其叶酸浓度。
从图10、11、12可以看出,叶酸有个特征峰在363nm处,连上叶酸的FA-PEG- NH2及FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN磁性纳米复合物都可检测到这处特征峰,可见均连上了叶酸。
由图13可见,在0~100μg.ml-1范围内FA的含量与OD值有良好的线性关系(回归公式Y=112.08X-0.3832;R2=0.9996)。FA-PEG-ASAMNPS-MMP-9-ASODN磁性纳米稀释10倍后的吸光度值为0.8508±0.0013,按此方法测得该纳米复合物中叶酸的浓度为0.9498±0.0014mg.ml-1。
测试例10:
FA-PEG-ASAMNPs与MMP-9-ASODN的结合分析:
按以下方法制成四组不同溶液:
1组: 取10μl浓度为100μmo1.l-1的MMP-9-ASODN,加入40μl高纯水,涡旋均匀后的混合物。
2组: FA-PEG-ASAMNPs磁性纳米复合物(实施例1制备的)。
3组: FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN磁性纳米复合物。
4组: 取未经醛基化的Fe3O4-海藻酸钠磁性纳米颗粒100μl(即未用NaIO4进行醛基化处理,即SAMNPs),加入30μL FA-PEG-NH2溶液(0.04mg.μl-1)和20μL 浓度为100μmol.l-1的MMP-9-ASODN,最后制成混合物溶液100μl。
四组各取6μl进行琼脂糖凝胶电泳,步骤基本如下:取6μl溶液加1μl含溴酚蓝的Loading Buffer,标准分子量采用500bp的DNA Ladder Marker,在2%琼脂糖(含1.0pg.ml-1 EB)凝胶上,100V恒压,电泳20min,紫外灯下观察结果。并用IS1000凝胶数字成像系统摄影保存。
琼脂糖凝胶电泳显示,该磁性纳米载体通过氨基及醛基化学偶联作用有良好的RNA结合能力。图14显示第1道为DNA marker,第2道对照的RNA已泳动出孔,第3道未见RNA条带;第4道点样孔中RNA条带未出孔,可见明显RNA条带。第5道RNA条带出孔,在点样孔中未见RNA条带。
测试例11:
鼻咽癌HNE-1细胞(FR表达阳性)及CNE-2细胞(FR表达阴性)培养:
取冻存于液氮中的HNE-1及CNE-2细胞株置37℃恒温水浴锅中快速解冻复苏后培养于含10%新生牛血清和1%青、链霉素双抗的RPMI-1640培养基中,培养条件为温度37℃、CO2浓度5%、饱和湿度。观察细胞生长情况,但单层生长至80%~90%密度时吸弃培养基,用0.25%胰蛋白酶消化、倒置显微镜下观察并判断消化情况,用含血清的全培养基终止消化后轻柔吹打成均匀单细胞悬液,HNE-1及CNE-2分别按1:2及1:3比例传代扩增,取对数生长期细胞用于测试。
测试例12:
细胞铁染色:
(1) 叶酸靶向吞噬实验:
1) 取生长状态良好的HNE-1和CNE-2细胞,消化离心后用无叶酸RPMI-1640全培养基制成单细胞悬液,调整细胞浓度至2×104个.ml-1接种于24孔板内,每孔体积500μl;
2) 贴壁生长24小时后,吸弃所有孔内的培养基,加入以无叶酸RPMI-1640稀释的FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN共培养2小时,纳米复合物浓度按铁含量计依次为0,2.5,5,10,20,40μg.ml-1;
3) 吸弃全部培养液体,PBS液充分洗涤去除未被摄取的纳米粒子;
4) 4%多聚甲醛溶液室温下固定10分钟,双蒸水充分洗涤;
5) 加入普鲁士兰液染色室温避光作用30分钟,双蒸水洗涤后加中性红染液复染;
6) 倒置显微镜下观察并拍照。
随着铁的浓度增加,如图15,CNE-2细胞浆内未见蓝染的铁吞噬颗粒,在较高铁浓度40μg.ml-1时,仅见少量粒子分布在细胞膜表面,细胞浆内未见。而HNE-1细胞随着铁浓度的增加,胞浆内吞噬的蓝染颗粒逐渐增多,在铁浓度组大于10μg.ml-1以上时,可见绝大部分细胞均吞噬纳米颗粒。
(2) 叶酸封闭实验:
1) 取生长状态良好的HNE-1细胞,消化离心后用无叶酸RPMI-1640全培养基制成单细胞悬液,调整细胞浓度至2×104个.ml-1接种于24孔板内,每孔体积500μl;
2) 贴壁生长24小时后,每孔加入50μl叶酸PBS溶液(使孔内游离叶酸终浓度为1mmol.l-1),作用30分钟;
3) 吸弃所有孔内的培养基,加入以无叶酸RPMI-1640稀释的磁性纳米复合物FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN共培养2小时,纳米复合物浓度按铁含量计依次为0,2.5,5,10,20,40μg.ml-1;
4) 吸弃全部培养液体,PBS液充分洗涤去除未被摄取的纳米粒子;
5) 4%多聚甲醛溶液室温下固定10分钟,双蒸水充分洗涤;
6) 加入普鲁士兰液染色室温避光作用30分钟,双蒸水洗涤后加中性红染液复染;
7) 倒置显微镜下观察并拍照。
预先给予游离叶酸(浓度为1mmol.l-1)作用30分钟后,如图16,随着铁的浓度增加,HNE-1细胞内未观察到明显的蓝染磁性纳米粒子,当铁浓度达到40μg.ml-1时,仅见少量粒子分布在细胞膜表面,细胞浆内未见。
测试例13:
体外细胞透射电镜观察:
将HNE-1细胞和CNE-2细胞与FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN共培养后通过透射电镜观察细胞摄取纳米粒子的情况。具体步骤如下:
(1) 取生长状态良好的HNE-1和CNE-2细胞,消化离心后用无叶酸RPMI-1640全培养基制成单细胞悬液,调整细胞浓度至5×104个.ml-1接种于6孔板内,每孔体积2ml;
(2) 贴壁生长24小时后,吸弃孔内的培养基,加入以无叶酸RPMI-1640稀释的FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN共培养2小时,药物浓度按Fe含量计依次为0, 2.5,5,10,20,40μg.ml-1;
(3) 培养结束后吸弃全部培养液体,PBS液充分洗涤去除未被摄取的药物粒子, 各孔内用细胞刮刀刮除培养细胞,轻柔吹打成单细胞悬液,1500rpm离心5分钟后弃上清,小心收集沉淀的细胞团块加入2.5%戊二醛4℃固定;
(4) 低速离心弃去固定液后再用1%锇酸固定,梯度丙酮脱水,环氧树脂包埋,常规超薄切片,醋酸双氧铀及枸橼酸铅染色,透射电镜下观察细胞对纳米粒子的摄取吞噬作用。
如图17,可见HNE-1细胞吞噬了大量的纳米复合物颗粒,成团分布于细胞浆(箭头所示),而如图18,可见CNE-2细胞浆内未见纳米复合物颗粒分布。
测试例14:
MRI观察FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN纳米复合物在裸鼠种植瘤内的分布
根据MRI成像信号改变来检测肿瘤组织摄取纳米复合物的情况,具体步骤如下:
采用细胞悬液皮下接种法建立荷鼻咽癌裸鼠模型。选取5-7周龄BALB/c nu裸小鼠4只,在SPF环境(中山大学实验动物中心动物实验部,场地合格许可证号SYXK 粤2007-0081)中经适应性饲养1周后,将对数生长期的人鼻咽癌HNE-1细胞以10×107个/ml的密度0.2ml接种于每只裸鼠右侧腋后背部皮下,待两周成瘤后再将对数生长期的人鼻咽癌CNE-2细胞以5×107个/ml的密度0.2ml接种于该组裸鼠左侧腋后背部皮下。
接种HNE-1和CNE-2细胞的裸鼠肿瘤长至直径8-10mm左右后进行首次MR T2加权成像(T2 WI),以0.2ml 5%水合氯醛裸鼠腹腔注射麻醉后裸鼠取俯卧位,线圈置于背部,采用Philips Quasar Dual 3.0T MR Achieva磁共振仪行MRI检查。然后经尾静脉注射FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN 0.2ml,继续饲养24小时后再次行MRI横断面(轴位)扫描。成像参数T2WI TR/TE 2400/74.8ms,扫描矩阵320×224,层厚1mm,层间距0.5mm。
种植HNE-1和CNE-2瘤块的裸鼠(图19)行MR T2加权成像(T2 WI)(轴位)扫描后,经尾静脉注射FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN0.2ml继续饲养24小时行MR T2加权成像(T2 WI)(轴位)扫描。结果发现HNE-1瘤块在注药24小时后肿瘤区域不均匀信号降低(图20),而CNE-2瘤块在注药24小时后肿瘤区域信号无明显变化(图21)。
测试例15:
HNE-1及CNE-2种植肿瘤组织铁染色检测:
完成第二次MR成像后立即处死裸鼠,迅速解剖剥取HNE-1及CNE-2种植肿瘤,以4%多聚甲醛液固定,24小时内石蜡包埋,按4μm厚度连续切片铺于普通载玻片上,步骤基本如下:
(1) 组织切片蒸馏水漂洗;
(2) 等量混合氰亚铁酸盐和盐酸等量混合后滴在切片上,作用10分钟;
(3) 用蒸馏水清洗面板数次,每次5分钟;
(4) 中性红染料复染1分钟;
(5) 蒸馏水漂洗。快速用纯乙醇脱水、清洗并中性树胶封片。
(6) 在光学显微镜下观察HNE-1和CNE-2种植瘤中纳米复合物粒子分布的情况。
种植HNE-1和CNE-2瘤块同一裸鼠经尾静脉注射FA-PEG-ASAMNPS-MMP-9-ASODN 0.2ml,继续饲养24小时后瘤块的铁染色结果显示:HNE-1瘤块肿瘤细胞内有较多的蓝染的纳米复合物颗粒,而CNE-2瘤块肿瘤细胞内未见蓝染的纳米复合物颗粒分布(见图22)。
测试例16:
HNE-1及CNE-2种植肿瘤组织透射电镜观察:
取部分HNE-1及CNE-2种植瘤块加入2.5%戊二醛4℃固定;低速离心弃去固定液后再用1%锇酸固定,梯度丙酮脱水,环氧树脂包埋,常规超薄切片,醋酸双氧铀及枸橼酸铅染色,透射电镜下观察细胞对纳米粒子的摄取吞噬作用。
种植HNE-1和CNE-2瘤块同一裸鼠经尾静脉注射FA-PEG-ASAMNPS-MMP-9-ASODN 0.2ml继续饲养24小时后瘤块的电镜结果观察发现:HNE-1瘤块肿瘤细胞内吞噬了大量的纳米复合物颗粒,成团分布于细胞浆(图23箭头所示)。而CNE-2细胞浆内未见纳米复合物颗粒分布(见图24)。
本发明通过醛基与氨基缩合反应与MMP-9-ASODN偶联,成功构建了携带MMP-9-ASODN的叶酸分子靶向纳米复合物,紫外光谱分析及琼脂糖凝胶电泳结果显示叶酸及MMP-9-ASODN已连接在磁性纳米载体上,具有良好的稳定性及磁靶向性。采用铁染色、MR成像及透射电镜等技术,通过鼻咽癌HNE-1细胞和裸鼠种植瘤体内外实验,证实了FA-PEG-ASAMNPS-MMP-9-ASODN磁性纳米复合物具有良好的叶酸分子特异靶向性。HNE-1细胞对于FA-PEG-ASAMNPS-MMP-9-ASODN的摄取是通过叶酸受体途径实现的,并具有浓度依赖性和与叶酸的竞争性。
Claims (10)
1.一种叶酸分子靶向磁性纳米药物载体的制备方法,其特征在于:其包括以下步骤:
1)醛基化海藻酸钠溶液的制备:将海藻酸钠溶于水中,加入强氧化剂,反应24-36h,加入乙醇终止反应;其中,海藻酸钠的质量:强氧化剂的质量:水的体积:乙醇的体积=1g:0.2-0.3g:20-30ml:1-2ml;
2)磁性纳米粒子MNPs溶液的制备:将亚铁盐、铁盐溶于水中,调节pH至9-10,搅拌,直至溶液颜色变为深黑色,取上清液,备用;其中,Fe2+的物质的量:Fe3+的物质的量:水的体积=1mol:0.4-0.6mol:80-120L;
3)醛基化海藻酸钠改性磁性纳米粒子ASAMNPs的制备:将步骤1)中的醛基化海藻酸钠溶液与步骤2)中的磁性纳米粒子MNPs溶液混合,80-90℃下反应30-50min,取上清液,备用;
4)叶酸-氨基聚乙二醇FA-PEG-NH2的制备:将叶酸、二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺混合于非质子有机溶剂中,反应4-8h,加入PEG2000(NH2)2,反应8-10h,加水,过滤除去不溶物得FA-PEG-NH2溶液;其中,叶酸的质量:二环己基碳二亚胺的质量:N-羟基琥珀酰亚胺的质量:非质子有机溶剂的体积:水的体积=1g:1.2-1.5g:0.3-0.5g:40-60ml:180-240ml;
5)FA-PEG-ASAMNPs的制备:将步骤3)中的得到的醛基化海藻酸钠改性磁性纳米粒子ASAMNPs与步骤4)中得到的FA-PEG-NH2溶液在0.3-0.6mol/L的硼酸钠溶液中混合,再加入硼氢化钠,室温下反应8-10h,得到产物,其中,醛基化海藻酸钠改性磁性纳米粒子ASAMNPs质量:FA-PEG-NH2溶液中的FA-PEG-NH2质量:硼酸钠溶液体积:硼氢化钠质量=1g:0.5-1g:30-50ml:0.3-0.5g。
2.根据权利要求1所述的一种叶酸分子靶向磁性纳米药物载体的制备方法,其特征在于:步骤1)中所述的强氧化剂为NaIO4。
3.根据权利要求1所述的一种叶酸分子靶向磁性纳米药物载体的制备方法,其特征在于:步骤1)中,反应温度为4-8℃。
4.根据权利要求1所述的一种叶酸分子靶向磁性纳米药物载体的制备方法,其特征在于:所述的亚铁盐为FeSO4·4H2O。
5.根据权利要求1所述的一种叶酸分子靶向磁性纳米药物载体的制备方法,其特征在于:所述的铁盐为FeCl3·6H2O。
6.根据权利要求1所述的一种叶酸分子靶向磁性纳米药物载体的制备方法,其特征在于:步骤2)中,调节pH是通过加入25%(w/w)NH3·H2O来调节的。
7.根据权利要求1所述的一种叶酸分子靶向磁性纳米药物载体的制备方法,其特征在于:步骤3)中,醛基化海藻酸钠溶液与磁性纳米粒子MNPs溶液体积比为1:1-2。
8.根据权利要求1所述的一种叶酸分子靶向磁性纳米药物载体的制备方法,其特征在于:步骤4)中,所述的非质子化有机溶剂为乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、六甲基磷酰三胺、苯、乙醚、四氯化碳中的一种。
9.根据权利要求1所述的一种叶酸分子靶向磁性纳米药物载体的制备方法,其特征在于:步骤5)中,所得产物在蒸馏水中透析3-5天,干燥。
10.一种靶向基因药物的制备方法,其特征在于:其包括以下步骤:
1)醛基化海藻酸钠溶液的制备:将海藻酸钠溶于水中,加入强氧化剂NaIO4,反应24-36h,加入乙醇终止反应;其中,海藻酸钠的质量:强氧化剂的质量:水的体积:乙醇的体积=1g:0.2-0.3g:20-30ml:1-2ml,反应温度为4-8℃;
2)磁性纳米粒子MNPs溶液的制备:将亚铁盐、铁盐溶于水中,调节pH至9-10,搅拌,直至溶液颜色变为深黑色,取上清液,备用;其中,Fe2+的物质的量:Fe3+的物质的量:水的体积=1mol:0.4-0.6mol:80-120L;
3)醛基化海藻酸钠改性磁性纳米粒子ASAMNPs的制备:将步骤1)中的醛基化海藻酸钠溶液与步骤2)中的磁性纳米粒子MNPs溶液混合,80-90℃下反应30-50min,取上清液,备用;
4)叶酸-氨基聚乙二醇FA-PEG-NH2的制备:将叶酸、二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺混合于非质子有机溶剂中,反应4-8h,加入PEG2000(NH2)2,反应8-10h,加水,过滤除去不溶物得FA-PEG-NH2溶液;其中,叶酸的质量:二环己基碳二亚胺的质量:N-羟基琥珀酰亚胺的质量:非质子有机溶剂的体积:水的体积=1g:1.2-1.5g:0.3-0.5g:40-60ml:180-240ml;
5)MMP-9-ASODN的合成:根据人MMP-9基因cDNA序列,选择含起始密码子及上游的6个碱基及后续的11个碱基,共20个碱基作为靶序列的反义寡核苷酸,经Genbank计算机网上检索证实与MMP-9以外的己知人类基因无同源性;无义寡核苷酸序列经计算机网上检索证实与己知人类基因无同源性,MMP-9反义序列如下:5’-TGCCAGAGGCTCATGGTGAG-3’,无义序列为:5’-CGTCCCTATACGACC-3’,上述寡核苷酸碱基均采用硫代修饰,5’氨基修饰,修饰后的MMP-9-ASODN的总分子量为6682.4,用水稀释至100μmol.l-1,-20℃保存备用;
6)FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN磁性纳米复合物的制备:取醛基化海藻酸钠改性磁性纳米粒子ASMNPs、FA-PEG-NH2、硫代及氨基修饰的MMP-9-ASODN,搅拌均匀,于4-8℃下避光反应24-36小时,加入一定量的硼氢化钠溶液,使体系中硼氢化钠的浓度为0.5-0.7mol.l-1,体系继续反应3-6小时后,充分离心沉淀,沉淀物用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液重新分散均匀,制备成FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN的磁性纳米复合物;
步骤6)中,ASAMNPs溶液体积:FA-PEG-NH2溶液体积:硫代及氨基修饰的MMP-9-ASODN溶液体积=1:0.25-0.35:0.15-0.25,硫代及氨基修饰的MMP-9-ASODN溶液中,MMP-9-ASODN的浓度为95-105μmol.l-1。
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