CN111544596B - 一种gsh响应型纳米钻石靶向药物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种GSH响应释药的靶向纳米钻石药物及其制备方法和应用。所述药物的制备：首先，通过叔丁氧羰基‑亚氨基‑聚乙二醇‑胺基(Boc‑NH‑PEG‑NH2，PEG)修饰纳米钻石(ND)，加入三氟乙酸除去叔丁氧羰基，接着通过酰胺化反应与叶酸(FA)偶联，最后通过二硫键偶联阿霉素(DOX)合成药物ND‑PEG‑FA/‑SS‑DOX(NPFSSD)。体外释药表明其为GSH响应释药、叶酸受体介导进入细胞；在肿瘤细胞内能被GSH调控释药，而正常细胞基本不释药；CCK‑8细胞活性测试证实体系对肿瘤细胞具有较大杀伤力，且具有缓释药物特性，但对正常细胞基本无毒性，表明NPFSSD具有对肿瘤细胞的识别和显著降低毒副作用。本发明的药物组分明确，质量易控，制备工艺简单，易于大规模工业化生产，对癌症潜在治疗具有重大意义。

Description

一种GSH响应型纳米钻石靶向药物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及纳米钻石药物，特别涉及GSH响应释药的纳米药物，具体属于一种以二硫键共价连接阿霉素的GSH响应型纳米钻石药物及其制备方法，以及该药物在抗肿瘤中的应用。
背景技术
据WHO《2020年世界癌症报告》统计，癌症已逐渐成为导致死因的最主要原因，癌症将成为本世纪预期寿命增加的最大障碍。然而在肿瘤的治疗中存在着诸多问题，主要归结为传统的化学疗法使用的小分子药物存在着严重的毒副作用，其在杀死肿瘤细胞的同时也杀死正常组织及细胞，且频繁用药会致使肿瘤细胞产生多药耐药性，导致疗效降低。因此，亟需研发一种低毒高效的新型药物。
纳米技术对于生物医学的发展产生了非常大的影响，近20年来靶向抗肿瘤纳米药物的研究最为活跃，其核心是利用纳米颗粒靶向输送药物到肿瘤部位，降低药物分子的毒副作用，提高药物利用率，这一策略为新型纳米药物的合成提供了契机。由于纳米钻石具有高化学稳定性、高生物相容性、对生物分子和药物高亲和力以及表面易于修饰等优点，使得纳米钻石在生物医药方面的应用越来越受到关注。目前，纳米钻石载药体系在设计上仍存在两个主要问题：首先，纳米钻石药物体系仅凭借EPR效应通路到肿瘤组织，使其在非靶标部位有累积；叶酸作为一种靶向药物常被用于抗肿瘤研究中，肿瘤细胞中存在大量的叶酸受体，通过负载叶酸可使得纳米载体具备肿瘤细胞主动靶向性；二硫键因其在正常生理组织(pH 7.4)及弱碱性的血液循环中可保持良好的稳定性，而肿瘤细胞内具有较强的还原环境，与正常细胞相比，肿瘤细胞中的谷胱甘肽(GSH)含量大约高出4倍。在富含GSH的肿瘤细胞环境中，由二硫键偶联的化疗药物可以由GSH调控发生断裂，使药物释放，从而明显降低药物的毒副作用。基于此，我们将纳米钻石(ND)作为载体，以化疗药物阿霉素(DOX)为药物模型，将DOX通过二硫键连接于其表面，制备得到了纳米钻石药物，并研究了该药物在肿瘤细胞内的释药及抗肿瘤效应。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以二硫键连接阿霉素的GSH响应型纳米钻石靶向药物及其制备方法，以及该药物在抗肿瘤中的应用。
本发明提供的一种GSH响应型靶向纳米钻石药物的制备方法，包括如下步骤：
(1)精密称取1.0mg真空干燥的羧基化纳米钻石(ND-COOH)，加入1-1.5mL浓度0.1M、pH 5.8的MES缓冲溶液并超声分散30min形成悬浊液，随后加入0.2mg EDC、0.25mgNHS，室温搅拌反应6h，反应完毕后以15000rpm高速离心8min弃除上清液，得到活化羧基的纳米钻石沉淀物；接着将活化羧基的纳米钻石沉淀物迅速分散到1-1.5mL浓度0.1M、pH 8.4的硼酸缓冲溶液中，经过短暂超声分散形成悬浊液，快速加入0.3mg Boc-NH-PEG-NH2，继续室温搅拌反应12h，待反应结束，以15000rpm高速离心8min移除上清液，并用去离子水高速离心洗涤3次，获得ND-PEG-NH-Boc沉淀物；将制备的ND-PEG-NH-Boc超声分散于1-1.5mL二氯甲烷中，滴入0.01mL三氟乙酸(TFA)，室温搅拌1h，反应结束后以15000rpm高速离心8min除去上清液，用二氯甲烷洗涤2-3次，真空干燥得到ND-PEG-NH2(NP)。
(2)称取1.0mg上述制备好的ND-PEG-NH2，加入1-1.5mL浓度0.1M、pH 8.4的硼酸缓冲溶液并超声分散30min，随后移取0.05mg叶酸活性酯(FA-NHS)缓慢加入ND-PEG-NH2反应液，常温下避光快速搅拌24h。等到反应结束，以15000rpm高速离心8min移除上清液，并用去离子水洗涤2-3次，真空干燥得到ND-PEG-FA(NPF)。
(3)称取1.0mg干燥的ND-PEG-FA沉淀物，加入1-1.5mL浓度0.1M、pH 8.4的硼酸缓冲溶液并超声分散30min形成悬浊液。精密称取0.05mg 3,3'-二硫代二丙酸酐(DTDPA)溶解到0.8-1.0mL DMF中，随后逐滴加入到ND-PEG-FA悬浊液中，并用三乙胺(TEA)调节pH至8.4，避光室温搅拌反应12h。待反应结束，以15000rpm高速离心8min移除上清液，并用去离子水高速离心洗涤3次，真空干燥得到ND-PEG-FA/-SS-COOH(NPFSS)。
(4)称取1.0mg干燥的ND-PEG-FA/-SS-COOH，加入1-1.5mL浓度0.1M、pH 5.8的MES缓冲溶液并超声分散30min，随后依次加入0.2mg EDC和0.25mg NHS，室温下搅拌反应6h。待反应完毕，以15000rpm高速离心8min移除上清液，并用去离子水高速离心洗涤3次，继续加入1-1.5mL浓度0.1M、pH 8.4的硼酸缓冲溶液中超声分散30min，随后逐滴加入0.12mg浓度为1.0mg/mL的盐酸阿霉素的DMSO溶液，滴入0.001mL TEA，继续反应24h。待反应结束，以15000rpm高速离心8min，并依次用去离子水和无水乙醇洗涤至上清液无色，真空干燥得到ND-PEG-FA/-SS-DOX(NPFSSD)，并收集上清液，测定DOX的偶联量。
将以上方法制备得到的靶向纳米钻石药物NPFSSD，用CCK-8法检测NPFSSD对人宫颈癌细胞(HeLa)、人肝癌细胞(HepG2)、小鼠成纤维细胞(3T3)活性的影响，表明该药物对肿瘤细胞具有较大的杀伤力，并具有药物缓释作用，且随着时间的延长其疗效与游离阿霉素相当；另一方面，该纳米药物对正常细胞基本无毒性作用，其可在制备抗肿瘤药物中应用。
与现有技术相比本发明的有益效果：
本发明以GSH敏感的二硫键将阿霉素连接于经过聚乙二醇和叶酸改性的纳米钻石表面而制备成靶向纳米药物纳米钻石-聚乙二醇-叶酸/-二硫代二丙酸-阿霉素(NPFSSD)，利用肿瘤细胞和正常细胞表面叶酸受体表达量以及GSH含量差异，NPFSSD体系能靶向到肿瘤细胞，在肿瘤细胞内GSH调控释药获得荧光信号，而在相同时间内正常细胞没有荧光信号出现，因此推动了对肿瘤细胞的识别；用CCK-8测试该药物与HeLa肿瘤细胞和3T3正常细胞作用，表明该纳米药物对肿瘤细胞具有较大的杀伤力，其与单独阿霉素对细胞杀伤力相比，NPFSSD具有缓释药物特性，且杀伤力随着时间延长与游离阿霉素效果接近；重要的是，NPFSSD对正常细胞几乎无毒副作用。因此，NPFSSD既能降低化疗药物对正常细胞的毒副作用，又能提高化疗药物对肿瘤细胞的杀伤力，在抗肿瘤治疗中具有广阔的应用前景，进而可在制备抗肿瘤药物中应用。
附图说明
图1纳米钻石(ND)、纳米药物NPFSSD和游离阿霉素(DOX)的紫外灯照射下的照片
图2纳米药物NPFSSD的马尔文粒径
图3各种纳米颗粒的红外光谱图
图4各种纳米颗粒的拉曼光谱图
图5不同GSH浓度对纳米药物NPFSSD体外释药的影响
图6流式细胞术定量检测不同浓度游离叶酸对细胞摄取NPFSSD的影响。(A)HeLa；(B)HepG2；(C)HeLa细胞和HepG2细胞摄取抑制率对比；(D)HeLa细胞和3T3细胞摄取NPFSSD能力对比
图7激光共聚焦显微镜观察人宫颈癌细胞(HeLa，肿瘤细胞)和小鼠成纤维细胞(3T3，正常细胞做对照)对NPFSSD摄取的靶向性及GSH响应释药
图8NPFSSD对人宫颈癌细胞(HeLa)、小鼠成纤维细胞(3T3)活性的影响。其中：A不同浓度的纳米药物NPFSSD对体外培养HeLa细胞活性的影响；B不同浓度的纳米药物NPFSSD对体外培养3T3细胞活性的影响；C同一浓度不同纳米颗粒对体外培养不同时间HeLa细胞活性的影响
具体实施方式
以下结合附图并通过具体实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例中所用的试剂和试剂的生产厂商：
载体为纳米钻石(ND，元素六，直径大约140nm,Ireland)。
聚乙二醇(H2N-PEG-NH2，分子量为2000)为上海西宝生物有限公司生产。
叶酸(FA，分子量为441.4)，北京索莱宝科技有限公司。
3,3’-二硫代(H2NN2H·H2O：分子量为210.27)上海阿拉丁试剂有限公司。
阿霉素(DOX)是盐酸多柔比星(C27H29NO11·HCl，分子量为579.99)，上海阿拉丁试剂有限公司。
其它所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买获得的常规产品。
实施例1：
(1)纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG)纳米粒子的制备
精密称取10.0mg真空干燥的羧基化纳米钻石(ND-COOH)，加入10.0mL浓度0.1M、pH5.8的MES缓冲溶液并超声分散30min形成悬浊液，随后加入2mg EDC、2.5mg NHS，室温搅拌反应6h，反应完毕后以15000rpm高速离心8min弃除上清液，得到活化羧基的纳米钻石沉淀物；接着将活化羧基的纳米钻石沉淀物迅速分散到10.0mL浓度0.1M、pH 8.4的硼酸缓冲溶液中，经过短暂超声分散形成悬浊液，快速加入3.0mg Boc-NH-PEG-NH2，继续室温搅拌反应12h，待反应结束，以15000rpm高速离心8min移除上清液，并用去离子水高速离心洗涤三次，获得ND-PEG-NH-Boc沉淀物；将制备的ND-PEG-NH-Boc超声分散于10.0mL二氯甲烷中，滴入0.1mL三氟乙酸(TFA)，室温搅拌1h，反应结束后以15000rpm高速离心8min除去上清液，用二氯甲烷洗涤3次，真空干燥得到ND-PEG-NH2(NP)。
(2)纳米钻石-聚乙二醇-叶酸(ND-PEG-FA)纳米粒子的制备
称取10.0mg上述制备好的ND-PEG-NH2，加入10.0mL浓度0.1M、pH 8.4的硼酸缓冲液并超声分散30min，随后移取0.5mg叶酸活性酯(FA-NHS)缓慢加入ND-PEG-NH2反应液，常温下避光快速搅拌24h。等到反应结束，以15000rpm高速离心8min移除上清液，并用去离子水洗涤3次，真空干燥得到ND-PEG-FA(NPF)。
(3)纳米钻石-聚乙二醇-叶酸/-二硫代二丙酸(ND-PEG-FA/-SS-COOH)纳米粒子的制备
称取10.0mg干燥的ND-PEG-FA沉淀物，加入5.0mL浓度0.1M、pH 8.4的硼酸缓冲溶液并超声分散30min形成悬浊液。精密称取0.5mg 3,3'-二硫代二丙酸酐(DTDPA)溶解到8.0mL DMF中，随后逐滴加入到ND-PEG-FA悬浊液中，并用三乙胺(TEA)调节pH至8.4，避光室温搅拌反应12h。待反应结束，以15000rpm高速离心8min移除上清液，并用去离子水高速离心洗涤三次，真空干燥得到ND-PEG-FA/-SS-COOH(NPFSS)。
(4)纳米钻石-聚乙二醇-叶酸/-二硫代二丙酸-阿霉素(ND-PEG-FA/-SS-DOX)纳米药物的制备
称取10.0mg干燥的ND-PEG-FA/-SS-COOH，加入10.0mL浓度0.1M、pH 5.8的MES缓冲溶液并超声分散30min，随后依次加入2.0mg EDC和2.5mg NHS，室温下搅拌反应6h。待反应完毕，以15000rpm高速离心8min移除上清液，并用去离子水高速离心洗涤三次，继续加入10.0mL浓度0.1M、pH 8.4的硼酸缓冲溶液中超声分散30min，随后逐滴加入1.2mg浓度为1.0mg/mL的盐酸阿霉素的DMSO溶液，滴入0.01mL TEA，继续反应24h。待反应结束，以15000rpm高速离心8min，并依次用去离子水和无水乙醇洗涤至上清液无色，真空干燥得到ND-PEG-FA/-SS-DOX(NPFSSD)，避光保存。洗涤的上清液移取到一个干净的烧杯中静置，待测定NPFSS纳米颗粒上连接DOX的质量。用紫外可见光分光光谱法检测DOX 480nm峰位处的吸光度，计算DOX的连接量，经计算可知每毫克NPFSS连接DOX质量约71.6±2.4μg。当DOX与NPFSS以共价键相连接时，其荧光发生猝灭，图1从左到右依次为ND、纳米药物NPFSSD、游离DOX在紫外灯照射下的样品示意图，由图可见游离DOX发橙红色荧光，而纳米药物NPFSSD不发荧光，表明DOX共价偶联到NPFSS上。
实施例2
纳米药物NPFSSD粒径表征
取少量纳米药物NPFSSD超声分散于去离子水中，利用马尔文激光粒度散射仪于25℃测定其粒径。如图2所示，其粒径大小为315.7±7.3nm。
实施例3
纳米粒子的红外光谱图表征
为了确认NPFSSD的成功合成，分别取少量干燥的纳米颗粒与干燥的KBr混合(质量比约为1：100)研磨压片，测定其红外光谱。
图3为所制备纳米颗粒的红外光谱图。羧基化的ND显示出四个特征峰吸收峰，分别是在3415cm-1处的O-H的伸缩振动，1765cm-1处的-C＝O的伸缩振动，1617cm-1处的-C＝C-的伸缩振动和1100cm-1处的C-O的伸缩振动。在ND-PEG-NH2(NP)中，1638cm-1和1618cm-1处分别代表酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带的特征峰，表明NP制备成功。与NP相比，在NPF光谱中，3220cm-1和1390cm-1处分别为酰胺键中N-H和C-N的伸缩振动峰，在1604cm-1处的新吸收峰代表FA中芳环的骨架伸缩振动，这与FA的光谱相似，表明FA确实共轭到NP的表面。在NPFSS光谱中，在450cm-1和555cm-1处的新吸收峰表明S-S的伸缩振动，这与DTDP的红外光谱相似，进一步证明NPFSS的成功合成。在NPFSSD中，1580cm-1代表DOX中苯环的C＝C伸缩振动，1730cm-1归因于DOX的C＝O伸缩振动，这也与DOX的FTIR光谱一致。此外，在1620cm-1处的吸收带是芳环骨架振动和酰胺键中C＝O的重叠吸收峰，这些结果均表明NPFSSD成功合成。
实施例4
纳米粒子的拉曼光谱图表征
为了进一步确认NPFSSD上二硫键的存在，取一定量制备好的纳米颗粒，测定其拉曼光谱图，确认目标产物是否制备成功(设置激发波长为532nm)。
如图4A所示，相比于ND-COOH与ND-PEG-NH2，ND-PEG-FA/-SS-DOX在475cm-1处存在明显的宽吸收带，此处代表了-S-S-的伸缩振动，进一步证实了ND-PEG-FA/-SS-DOX的合成。在图4B中，ND-COOH在1000-1800cm-1范围内有两个明显的吸收带，分别代表石墨(G波段，1580cm-1)和纳米钻石特征吸收峰(ND，1332cm-1)，其中，G波段的石墨信号峰是由于ND表面有部分覆盖的石墨层。在合成ND-PEG-NH2后，由于ND表面覆盖了一层PEG，因此，G带的石墨信号峰和纳米钻石特征吸收峰减弱。将GSH响应释完药的纳米载体ND-PEG-FA/-SH洗涤烘干后进行拉曼测试，与ND-COOH和ND-PEG-NH2相比，ND-PEG-FA/-SH在1329cm-1处有一个特别强的钻石吸收峰。此外，在图4C中，在2665cm-1左右，ND-PEG-FA/-SH有一个明显的-SH特征峰，进一步证实-SH的存在，表明药物释放是以GSH响应方式进行的。
实施例5
不同GSH浓度对纳米药物NPFSSD体外释药的影响
采用透析法研究ND-PEG-FA/-SS-DOX在37℃PBS缓冲液中体外释放DOX，首先取3份等量NPFSSD分别超声分散于PBS(0.01M，pH 7.4)溶液、PBS(0.01M，pH 5.0)溶液和含10mMGSH的PBS(0.01M，pH 5.0)溶液中，随后转移到透析袋(MWCO 3kDa)并进行密封处理。取三个50mL密封管，分别向其中加入10.0mL相对应的缓冲液，将处理好的透析袋浸没在密封管中于37℃进行震荡释药。在一定间隔时间段后，打开密封管各取出2.0mL透析液体，同时各加入2.0mL相应的新鲜缓冲溶液，一直到释药时间为70.5h时，停止操作。收集各密封管中的透析液，置于紫外分光光度计下测定其吸收曲线，并采用公式DOXε480nm＝11500cm-1·mol-1·L-1计算DOX的含量。
图5为纳米药物(NPFSSD)在体外模拟生理、细胞内微酸性环境和肿瘤细胞内GSH环境的药物释放曲线。结果可以看出，纳米药物(NPFSSD)中DOX的释放速率以及释放量与培养液的GSH含量和培养时间紧密相关。在pH 7.4条件(生理环境)下，NPFSSD几乎不释药，而当pH减小到5.0(肿瘤组织微酸环境)时，NPFSSD释药率仅为3.83％，证明纳米药物NPFSSD几乎不受pH影响。而向PBS(pH 5.0)缓冲溶液中加入10mM GSH(肿瘤细胞内GSH环境)时，经过70.5h的累积释放，NPFSSD释药率可达58.05％，这是由于在高浓度GSH条件下纳米药物NPFSSD中连接阿霉素的二硫键断裂缘故，表明纳米药物NPFSSD受GSH影响释放药物，暗示NPFSSD在药物可控释放中具有潜在应用。
实施例6
流式细胞术研究纳米药物NPFSSD靶向性
通过流式细胞仪对纳米药物NPFSSD靶向性进行了定量分析。以HeLa和HepG2细胞为肿瘤细胞模型，采用流式细胞术检测NPFSSD的细胞摄取情况，以进一步研究NPFSSD的叶酸靶向性。将处于对数生长期的HeLa细胞和HepG2细胞分别以2.0×105个/盘接种于35mm的细胞培养皿中，待细胞贴壁后，分别用1.0mL含FA浓度为0、0.1、0.5、1.0和2.5mmol/L的DMEM培养液对细胞预处理30min，随后加入含NPFSSD(69.8μg/mL，含DOX 5μg/mL)的DMEM培养液继续孵育3h，未经过任何处理的细胞为对照组。待孵育完毕，用PBS(pH7.4)洗涤2次，无EDTA胰酶消化收集细胞，采用流式细胞仪上机检测，设置激发波长为488nm。此外，以叶酸受体量高表达的HeLa细胞和叶酸受体量低表达的3T3细胞为模型，进一步研究NPFSSD的细胞摄取量与细胞中叶酸受体表达量的关系。分别将处于对数生长期的HeLa细胞和3T3细胞以2.0×105个/盘接种于35mm的细胞培养皿中，等到细胞贴壁后，分别用NPFSSD(69.8μg/mL，含DOX5μg/mL)处理3h，收集细胞，操作步骤同上。
如图6(A-B)所示，随着预处理FA浓度的增大，HeLa细胞和HepG2细胞对NPFSSD的摄取量均逐渐减少。图6C显示了最大浓度FA预处理对HeLa和HepG2的最大抑制率，分别为44.4％和38.14％。图6D对比了HeLa肿瘤细胞和3T3正常细胞对NPFSSD的摄取能力，相同条件下，NPFSSD进入3T3细胞量仅为HeLa细胞的33.57％，这些结果进一步证明了NPFSSD是以叶酸受体介导内吞的机制进入细胞，且细胞摄取量与细胞表面叶酸受体的表达量有很大关系，对于肿瘤细胞有更好的靶向作用。
实施例7
激光共聚焦显微镜检测NPFSSD纳米药物在HeLa细胞和3T3细胞内释放阿霉素以及靶向的分析
以叶酸受体量高表达的HeLa细胞和叶酸受体量低表达的3T3细胞为模型，进一步研究NPFSSD的细胞摄取量与细胞中叶酸受体表达量的关系，以及由于GSH含量差异对释放DOX的影响。将处于对数生长期的HeLa细胞和3T3细胞以1.0×105个/盘接种于35mm的激光共聚焦培养皿中，待细胞贴壁后进行实验。向HeLa细胞中加入含NPFSSD(58.8μg/mL，含5μg/mL DOX)的DMEM培养液，并分别孵育0.5h和3h；向3T3细胞中加入含NPFSSD(58.8μg/mL，含5μg/mL DOX)的DMEM培养液孵育3h；此外，采用游离FA预处理HeLa细胞30min，然后加入含NPFSSD(58.8μg/mL，含5μg/mL DOX)的DMEM培养液，继续孵育3h。孵育完毕后，用冷的PBS洗涤细胞，接着使用4％多聚甲醛固定细胞，Hoechst 33258染细胞核，置于激光共聚焦显微镜下观察NPFSSD在HeLa细胞和3T3中的阿霉素的绿色荧光信号。设置Hoechst 33258激发波长为405nm，DOX的激发波长为488nm。
如图7所示，NPFSSD在和HeLa细胞共同孵育0.5h后存在微弱的DOX绿色荧光；而当NPFSSD处理HeLa细胞3h时细胞质中出现了明显的绿色DOX信号；同时由游离FA预处理0.5h后与NPFSSD共孵育3h的HeLa细胞，其绿色荧光也极其微弱；作为对照，处理3h的3T3细胞中几乎观察不到DOX绿色荧光的存在。这些现象表明NPFSSD是以叶酸受体介导的内吞途径进入细胞，在细胞内GSH触发DOX释放并随着时间延长逐渐恢复阿霉素荧光，在正常细胞中几乎不释放DOX，表明NPFSSD体系具有靶向肿瘤以及肿瘤识别功能。
实施例8
NPFSSD纳米药物对人宫颈癌细胞(HeLa)、小鼠成纤维细胞(3T3)培养不同时间活性的影响
首先将处于对数生长期的HeLa和3T3细胞按5.0×103/孔的浓度分别接种于96孔板中，待细胞贴壁后，移去旧的培养液，加入200μL DMEM培养基配制的各实验组(A：NPFSS(14μg/mL)，NPFSSD(14μg/mL，含DOX 1μg/mL)；B：NPFSS(41.9μg/mL)，NPFSSD(41.9μg/mL，含DOX 3μg/mL)；C：NPFSS(69.8μg/mL)，NPFSSD(69.8μg/mL，含DOX 5μg/mL)；D：NPFSS(97.7μg/mL)，NPFSSD(97.7μg/mL，含DOX 7μg/mL)；E：NPFSS(125.6μg/mL)，NPFSSD(125.6μg/mL，含DOX 9μg/mL)，设置三个平行组，每组均以未处理的HeLa和3T3细胞作为对照组，分别培养24h、36h和48h后，加入CCK-8(20μL/孔)，孵育1h后上机检测。此外，为了研究纳米药物NPFSSD和游离药物DOX对肿瘤细胞在不同时间的作用效果，将处于对数生长期的HeLa以5.0×103/孔的浓度接种到96孔板中，待细胞完全贴壁之后，除去旧培养液，用PBS(pH 7.4)洗涤2-3次，并分别加入200μL含不同药物的新鲜DMEM培养液(NPFSSD(69.8μg/mL，含DOX 5μg/mL)、游离DOX(5μg/mL))。设置三个平行组，每组均6个复孔，分别培养24h，36h，48h后，加入CCK-8(20μL/孔)，孵育1h后上机检测。
从图8A可以看出在对NPFSS作用48h后，观察到随着NPFSS浓度的增大，细胞存活率呈缓慢下降趋势，在NPFSS作用浓度最大时其细胞存活率为84.48％，这里可能是NPFSS上的FA与HeLa细胞中的FR受体结合，从而靶向到细胞中，NPFSS上的二硫键被HeLa细胞中富含的GSH裂解，从而消耗HeLa细胞中的GSH，破坏了HeLa细胞微环境，抑制了其增殖。在同一作用时间时，细胞存活率均随着NPFSSD的浓度的增大而减小，且DOX浓度在3-5μg/mL范围内作用效果就已经很明显。通过CCK-8法研究不同纳米材料对3T3细胞作用48h的毒性影响发现(图8B)，NPFSS对3T3细胞几乎无毒，有趣的是，NPFSSD对3T3细胞的作用效果也不是很明显，即使是用含DOX浓度为9μg/mL的NPFSSD处理48h，其存活率依然分别可以达到83.76％，证明纳米药物NPFSSD对正常细胞无毒且具有良好的抗肿瘤效应，表明GSH调控是纳米药物NPFSSD释药的决定性因素。
从图8C中可以看出，随着时间的延长，NPFSSD和游离DOX对HeLa细胞的毒性逐渐增大，且作用效果DOX>NPFSSD，但随着时间延长到48h时，它们的作用效果逐渐接近。这是由于NPFSSD具有缓释药物的功效，因而在前期游离DOX的作用效果要比其作用效果更明显。综上所述，NPFSSD是一种兼具叶酸靶向和GSH调控释药的纳米药物，在肿瘤治疗中有很好的应用前景。此外，对比不同的NPFSS在不同时间下对HeLa细胞的作用效果，结果发现24h与36h时，纳米载体均无细胞毒性，直到作用到48h时细胞存活率才略有下降，但存活率仍达到90％，证明NPFSS纳米载体无毒副作用，具有较高的生物相容性。
以GSH敏感的二硫键将阿霉素连接于经过聚乙二醇和叶酸改性的纳米钻石表面而制备成靶向纳米药物纳米钻石-聚乙二醇-叶酸/-二硫代二丙酸-阿霉素(NPFSSD)，用CCK-8测试该药物与HeLa肿瘤细胞和3T3正常细胞作用，表明该纳米药物对肿瘤细胞具有较大的杀伤力，其与单独阿霉素对细胞杀伤力相比，NPFSSD具有缓释药物特性，且杀伤力随着时间延长与游离阿霉素效果接近；重要的是，NPFSSD对正常细胞几乎无毒副作用。因此，NPFSSD既能降低化疗药物对正常细胞的毒副作用，又能提高化疗药物对肿瘤细胞的杀伤力，在抗肿瘤治疗中有较大的应用前景。

Claims (3)

1.一种GSH响应释药的纳米钻石靶向药物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)精密称取1.0mg真空干燥的羧基化纳米钻石(ND-COOH)，加入1-1.5mL的浓度0.1M、pH 5.8的MES缓冲溶液，并超声分散30min形成悬浊液，随后加入0.2mg EDC、0.25mg NHS，室温搅拌反应6h，反应完毕后以15000rpm高速离心8min弃除上清液，得到活化羧基的纳米钻石沉淀物；接着将活化羧基的纳米钻石沉淀物迅速分散到1-1.5mL的浓度0.1M、pH 8.4的硼酸缓冲溶液中，经过短暂超声分散形成悬浊液，快速加入0.3mg Boc-NH-PEG-NH2，继续室温搅拌反应12h，待反应结束，以15000rpm高速离心8min移除上清液，并用去离子水高速离心洗涤3次，获得ND-PEG-NH-Boc沉淀物；将制备的ND-PEG-NH-Boc超声分散于1-1.5mL二氯甲烷中，滴入0.01mL三氟乙酸(TFA)，室温搅拌1h，反应结束后以15000rpm高速离心8min除去上清液，用二氯甲烷洗涤2-3次，真空干燥得到ND-PEG-NH2，简写为 NP ；
(2)称取1.0mg上述制备好的ND-PEG-NH2，加入1-1.5mL的浓度0.1M、pH 8.4的硼酸缓冲溶液并超声分散30min，随后移取0.05mg叶酸活性酯FA-NHS缓慢加入ND-PEG-NH2反应液中，常温下避光快速搅拌24h；等到反应结束，以15000rpm高速离心8min移除上清液，并用去离子水洗涤2-3次，真空干燥得到ND-PEG-FA沉淀物，简写为 NPF ；
(3)称取1.0mg干燥的ND-PEG-FA沉淀物，加入1-1.5mL的浓度0.1M、pH 5.8的硼酸缓冲溶液并超声分散30min形成悬浊液；精密称取0.05mg 3,3'-二硫代二丙酸酐(DTDPA)溶解到0.8-1.0mL DMF中，随后逐滴加入到ND-PEG-FA悬浊液中，并用三乙胺(TEA)调节pH至8.4，避光室温搅拌反应12h；待反应结束，以15000rpm高速离心8min移除上清液，并用去离子水高速离心洗涤3次，真空干燥得到ND-PEG-FA/-SS-COOH，简写为 NPFSS ；
(4)称取1.0mg干燥的ND-PEG-FA/-SS-COOH，加入1-1.5mL的浓度0.1M、pH 5.8的MES缓冲溶液并超声分散30min，随后依次加入0.2mg EDC和0.25mg NHS，室温下搅拌反应6h；待反应完毕，以15000rpm高速离心8min移除上清液，并用去离子水高速离心洗涤3次，接着加入1-1.5mL浓度0.1M、pH 8.4的硼酸缓冲溶液超声分散30min，随后逐滴加入0.12mg浓度为1.0mg/mL的盐酸阿霉素的DMSO溶液，滴入0.001mL TEA，继续反应24h；待反应结束，以15000rpm高速离心8min，并依次用去离子水和无水乙醇洗涤至上清液无色，真空干燥得到ND-PEG-FA/-SS-DOX，简写为 NPFSSD 。
2.如权利要求1所述方法制备得到的GSH响应型靶向纳米钻石药物。
3.如权利要求2所述的GSH响应型靶向纳米钻石药物在制备抗肿瘤药物中的应用。
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