CN105106965A - 一种负载阿霉素的纳米钻石药物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种负载阿霉素的纳米钻石药物及其制备方法和应用，以及该药物在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明首先用H2N-PEG-COOH修饰纳米钻石，合成ND-PEG-COOH载体，其次在硼酸缓冲溶液中(0.1M、pH8.0)物理吸附阿霉素(DOX)制得目标药物纳米钻石-聚乙二醇/阿霉素(ND-PEG/DOX)。经过体外释药实验、MTT实验和流式细胞仪检测细胞摄取纳米药物实验，表明纳米钻石-聚乙二醇/阿霉素(ND-PEG/DOX)可诱导肿瘤细胞凋亡，其可在制备抗肿瘤药物中应用。
Description
技术领域
本发明涉及纳米药物，具体涉及一种负载阿霉素的纳米钻石药物及其制备方法，以及该药物在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
肿瘤是机体的细胞异常增殖形成的新生物，常表现为机体局部的异常组织产生肿块。肿瘤的形成，是在各种致瘤因素作用下，细胞生长调控发生严重紊乱的结果。过去十年里，全球癌症发病率增长了22％，未来还将以每年千分之一的比例递增，肿瘤已成为威胁人类健康乃至生命的头号杀手。化疗是治疗肿瘤的的主要手段，传统的抗肿瘤药物主要包括阿霉素、紫杉醇、喜树碱、顺铂等。但由于对这些药物对肿瘤细胞缺少特异选择性，大多数病人不得不忍受化疗药物带来的严重的毒副作用，生活质量的下降，以及反复的治疗疗程。为了有效提高化疗药物对肿瘤细胞的杀伤力，从而减轻患者的痛苦，研究一种理想的化疗模式即将化疗药物在准确的时间递送至准确的病灶部位，并保证药物具有足够长的作用时间成为亟需解决的问题。
纳米技术是在现代物理学、化学和工程技术相结合的基础上诞生的高技术学科，其核心是利用纳米材料的特殊性能，来实现普通材料所不能达到的功能和用途。纳米药物载体是指通过物理或化学的方式将药物分子包载在纳米材料载体上，形成药物-载体的复合体系，其具有显著提高靶区的药物浓度，从而改善药物的利用率和治疗效果，并降低不良反应等优点。本发明利用H2N-PEG-COOH修饰具有低毒性、高生物相容性和表面易修饰等特性的纳米钻石，合成纳米钻石-聚乙二醇载体，明显提高了纳米钻石的分散性，减弱了其易在人体组织中聚集的特性。最后通过静电作用使纳米钻石-聚乙二醇载体吸附阿霉素从而制备得到纳米钻石药物，并研究了该药物的抗肿瘤活性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种负载阿霉素的纳米钻石药物及其制备方法，以及该药物在制备抗肿瘤药物中的应用。所制备的纳米钻石药物分散性较好。
本发明提供的一种负载阿霉素的纳米钻石药物的制备方法，包括如下步骤：
(1)取真空干燥的羧基化纳米钻石，按每毫克羧基化纳米钻石加入1-1.5mL的浓度为0.1M、pH为5.8的MES缓冲溶液中，超声分散30min形成悬浊液，再按每毫克羧基化纳米钻石加入0.2mgEDC、0.25mgNHS，室温搅拌反应6h，反应完毕后以15000rpm高速离心5min弃除上清液，得到活化羧基的纳米钻石沉淀物；接着将活化的羧基化纳米钻石沉淀物迅速分散到浓度为0.1M、pH为8.4的硼酸缓冲溶液中，经过短暂超声分散形成悬浊液，再按每毫克活化的羧基化纳米钻石快速加入0.3mg聚乙二醇(H2N-PEG-COOH)，继续室温搅拌反应12h，待反应结束，以15000rpm高速离心5min吸除上清液，并用0.1M、pH8.4的硼酸缓冲溶液高速离心洗涤三次，获得纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG-COOH)沉淀物；
(2)取真空干燥的纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG-COOH)1mg，按每毫克ND-PEG-COOH加入1-1.5mL的浓度为0.1M、pH为8.0的硼酸缓冲溶液中，超声分散1小时形成悬浊液，再按每毫克ND-PEG-COOH加入0.1-0.2mg阿霉素(DOX)，避光于摇匀仪上反应6小时后，以15000rpm高速离心5min收集上清液，并用0.1M、pH为8.0的硼酸缓冲溶液继续以15000rpm高速离心5min洗涤三次，制得纳米钻石-聚乙二醇/阿霉素(ND-PEG/DOX)纳米药物，真空干燥，冷藏，避光保存。
与现有技术相比本发明的有益效果：本发明选用的纳米钻石材料具有生物相容性好、无毒、化学性质稳定、表面易修饰等诸多优点；PEG因其在水溶液和一些溶剂中具有极好的溶解性、无毒且具有低的免疫原性等优势，使制备过程具有灵活性。本发明所得到的纳米药物分散性较前期研究尤为突出，可以保持四天才沉降，而且随着时间的延长疗效也强于游离阿霉素。通过纳米载体ND-PEG与人肝癌细胞(HepG2)、人宫颈癌细胞(HeLa)、人乳腺癌细胞(MCF-7)作用，表明ND-PEG载体具有生物兼容性；将纳米载体纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG)在硼酸缓冲溶液作用下，物理吸附阿霉素，制备得到ND-PEG/DOX纳米药物，通过流式细胞仪检测细胞摄取ND-PEG/DOX实验，表明ND-PEG/DOX可以进入细胞，从而诱导细胞凋亡；经体外肿瘤细胞转运机制表明ND-PEG/DOX具有能量依赖，是网格蛋白决定机制进入细胞；经MTT实验检测药物对细胞的活性，表明该纳米药物不仅可以降低化疗药物对正常细胞的毒副作用，而且能提高化疗药物对肿瘤细胞的杀伤力，所以ND-PEG/DOX可在制备抗肿瘤药物中应用。
附图说明
图1各种纳米颗粒的紫外吸收光谱图
图2各种纳米颗粒的分散性照片图
图3不同pH对纳米药物ND-PEG/DOX体外释药的影响
图4A用流式细胞仪检测MCF-7细胞的散点图
图4B流式细胞仪检测MCF-7细胞摄取ND-PEG/DOX的散点图
图5A流式细胞仪检测MCF-7细胞的荧光强度图
图5B流式细胞仪检测MCF-7细胞摄取ND-PEG/DOX的荧光强度图
图6A不同浓度的纳米药物ND-PEG/DOX对体外培养HepG2细胞活性的影响
图6B不同浓度的纳米药物ND-PEG/DOX对体外培养HeLa细胞活性的影响
图6C不同浓度的纳米药物ND-PEG/DOX对体外培养MCF-7细胞活性的影响
图7A纳米药物ND-PEG/DOX对体外培养不同时间HepG2细胞活性的影响
图7B纳米药物ND-PEG/DOX对体外培养不同时间HeLa细胞活性的影响
图7C纳米药物ND-PEG/DOX对体外培养不同时间MCF-7细胞活性的影响
图8MCF-7细胞内吞纳米药物ND-PEG/DOX的机制
具体实施方式
以下为实施例中使用的材料：
纳米钻石(ND，元素六，直径大约140nm,Ireland)。
阿霉素(DOX)是盐酸多柔比星，分子式为C27H29NO11·HCl，分子量为579.99，深圳万乐药业有限公司，规格按C27H29NO11·HCl计算为10mg。
聚乙二醇(H2N-PEG-COOH，分子量为2000)为上海西宝生物有限公司生产。
硼酸(H3BO3，分子量为61.83)为天津市风船化学试剂科技有限公司生产。
氢氧化钠(NaOH，分子量为39.99)为北京北化精细化学品有限责任公司生产。
实施例1
(1)纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG-COOH)纳米粒子的制备
准确称取1.0mg羧基化纳米钻石，分别经过二甲基亚砜(DMSO)、无水乙醇(C2H5OH)、蒸馏水(H2O)洗涤后，置于1.0mLMES(0.1M、pH5.8)缓冲溶液中，超声分散30min形成悬浊液，接着加入0.2mgEDC、0.25mgNHS，室温搅拌反应6h，待反应结束后以15000rpm高速离心5min，除去上清液，得到活化羧基的纳米钻石沉淀物；
把活化羧基的纳米钻石沉淀物迅速分散到1.0mLBBS(0.1M、pH8.4)缓冲溶液中，超声分散10min形成悬浊液，接着加入0.3mg聚乙二醇(H2N-PEG-COOH)，继续室温搅拌反应12h，待反应完毕，以15000rpm高速离心5min收集上清液，并用蒸馏水继续以15000rpm高速离心5min洗涤三次，获得纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG-COOH)纳米粒子，置于真空干燥箱中保存备用。把未反应的H2N-PEG-COOH上清液小心移取到干净的烧杯中静置，待测定ND-PEG-COOH纳米颗粒上偶联H2N-PEG-COOH的质量。
精确称取1mgH2N-PEG-COOH，用BBS(0.1M，pH8.4)溶解并定容于10ml的比色管中，分别量取0.8ml、0.56mL、0.4ml、0.16ml、0.08mL置入2ml的EP管中，按摩尔比向其中入相应体积的荧光胺，再加入一定体积使溶液总体积为2mL,立即涡流10秒，放置5分钟,采用荧光分光光度法设激发波长为385nm，测485nm处的荧光强度，以H2N-PEG-COOH摩尔浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制H2N-PEG-COOH标准曲线。据标准曲线公式，用反应前加入H2N-PEG-COOH的总量减去反应后上清液中H2N-PEG-COOH质量，即得到每毫克ND粒子偶联H2N-PEG-COOH的量为0.15mg。
(2)纳米钻石-聚乙二醇/阿霉素(ND-PEG/DOX)纳米药物的制备
称取真空干燥的纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG-COOH)1mg，加入1mL硼酸缓冲溶液(BBS，0.1M，pH8.0)，超声分散1小时形成悬浊液，接着加入0.2mg阿霉素(DOX)，避光于摇匀仪上反应6小时，待反应完毕，以15000rpm高速离心5min收集上清液，并用硼酸缓冲溶液(BBS，0.1M，pH8.0)继续以15000rpm高速离心5min洗涤三次，获得纳米钻石-聚乙二醇/阿霉素(ND-PEG/DOX)纳米药物，置于真空干燥箱中保存备用。收集所有上清液到一小烧杯中于4℃冰箱静置过夜，待测定ND-PEG-COOH纳米颗粒上吸附DOX的质量。用紫外可见光分光光谱法检测阿霉素480nm峰位处的吸光度，计算DOX的吸附量，经计算可知每毫克ND-PEG-COOH吸附阿霉素质量约(99±1.04)微克。
实施例2
(1)纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG-COOH)纳米粒子的制备同实施例1
(2)纳米钻石-聚乙二醇/阿霉素(ND-PEG/DOX)纳米药物的制备
称取真空干燥的纳米钻石-聚乙二醇(ND-PEG-COOH)1mg，加入1mL硼酸缓冲溶液(BBS，0.1M，pH8.0)，超声分散1小时形成悬浊液，接着加入0.1mg阿霉素(DOX)，避光于摇匀仪上反应6小时，待反应完毕，以15000rpm高速离心5min收集上清液，并用硼酸缓冲溶液(BBS，0.1M，pH8.0)继续以15000rpm高速离心5min洗涤三次，获得纳米钻石-聚乙二醇/阿霉素(ND-PEG/DOX)纳米粒子，置于真空干燥箱中保存备用。收集所有上清液到一小烧杯中于4℃冰箱静置过夜，待测定ND-PEG-COOH纳米颗粒上吸附DOX的质量。用紫外可见光分光光谱法检测阿霉素480nm峰位处的吸光度，计算DOX的吸附量，经计算可知每毫克ND-PEG-COOH吸附阿霉素质量约(46±1.36)微克。
实施例3
纳米粒子的紫外吸收光谱图
配置一系列DOX、ND、ND-PEG、ND-PEG/DOX的稀溶液，且在测试前将ND、ND-PEG、ND-PEG/DOX在蒸馏水中超声分散，使其形成均一悬浊液，测定它们的紫外吸收曲线，以此判断纳米颗粒ND-PEG/DOX上是否存在化疗药物DOX。
图1为所制备纳米颗粒的紫外吸收光谱图，由图可知，纳米药物ND-PEG/DOX的吸收曲线与游离药物DOX的相比，前者虽因分散系中颗粒的散射而导致吸收强度增大，但仍出现了属于DOX的特征吸收峰，而纳米载体ND-PEG并没有DOX特征峰出现，说明ND-PEG/DOX纳米颗粒上确已负载化疗药物DOX。
实施例4
纳米粒子的分散性研究
在蒸馏水中分别配置2mL100μg/mL的ND、ND-PEG和ND-PEG/DOX悬浊液放于玻璃比色皿中，用封口膜封口，静置，避光保存并观察，分别于0、5、27、45、69、93h进行拍照记录其分散性的研究。
图2为所制备纳米颗粒的分散性研究照片图，由图可知，ND在45h以后已经几乎沉降，而ND-PEG却还未沉降，表明用H2N-PEG-COOH修饰ND后，可以明显提高其分散性。纳米药物ND-PEG/DOX在经过69h后也未沉降，而是在静置93h后才出现沉降，与前期研究作对比，发现该药物的分散性明显强于其它药物。
实施例5
不同pH对纳米药物ND-PEG/DOX体外释药的影响
纳米药物ND-PEG/DOX的体外释放实验在37℃下PBS(0.01M，pH5.0)、PBS(0.01M，pH6.5)、PBS(0.01M，pH7.4)三种条件下进行。分别取三分等量纳米药物ND-PEG/DOX悬浊分散于相应介质溶剂中并放入释放用透析袋中，透析袋分别浸入9mL上述三种缓冲溶液介质中，置于37℃恒温震荡仪中，在每个取样时间点，取走2mL溶液用于紫外测试，另外补加2mL对应的新鲜透析溶剂。取出的2mL溶液通过阿霉素(DOX)在485nm处的吸光度从而测定其含量。
图3为纳米药物ND-PEG/DOX在不同pH下体外释药曲线，结果可以看出，在酸性条件PBS(0.01M，pH5.0)、PBS(0.01M，pH6.5)下，纳米药物ND-PEG/DOX的释放率大于正常生理条件PBS(0.01M，pH7.4)下，且随着酸性的增加(pH值的减小)，阿霉素的释放速率越来越快，释药量也不断增多，当pH值接近肿瘤细胞溶酶体的pH环境(5.0)时，累积释药率达到约为65％。研究表明，人体的血液和正常组织的pH值为7.4，在此pH值下，纳米药物ND-PEG/DOX释放阿霉素的速率很缓慢，这就避免了ND-PEG/DOX在血液循环的过程中释放大量药物，从而减少正常组织对阿霉素(DOX)的摄取和吸收，降低药物对正常组织和细胞的毒副作用。表明纳米药物ND-PEG/DOX可以应用于肿瘤治疗。
实施例6
流式细胞仪检测体外MCF-7细胞摄取纳米钻石-聚乙二醇/阿霉素(ND-PEG/DOX)实验
取对数生长期的MCF-7细胞以2.0×105/dish的密度接种于35mm培养皿中，培养16h后，弃除上清液，PBS洗涤三次，本实验中用实施例1制备的ND-PEG/DOX纳米药物，加入ND-PEG/DOX(含5μg/mlDOX)纳米药物于37℃孵育2h，孵育完毕，收集细胞，加入buffer缓冲液，通过流式细胞仪测定其红色荧光强度(488nm激发波长)信号，以未做任何处理的细胞为对照。
图4A和图4B为MCF-7细胞的前向散射光强度(forwardscatterintensity，FSC)和侧向散射光强度(sidescatterintensity，SSC)的散点图，FSC反映细胞的相对大小，SSC反映细胞内颗粒物质的复杂程度，颗粒越多，SSC散射强度就越大。由图4B和图4A比较，观察到当ND-PEG/DOX纳米药物与细胞作用后的SSC信号明显强于细胞本身的SSC强度，表明细胞内的颗粒物增多，这是由于纳米药物ND-PEG/DOX大量进入细胞内导致，说明了ND-PEG/DOX纳米药物可以进入MCF-7细胞。而两者FSC的强度没有明显差异，表明细胞的大小基本未发生变化，说明纳米药物对细胞本身性质不会产生影响。由于DOX以488nm为激发波长时，在500-700nm有荧光信号产生，因此通过检测细胞内ND-PEG/DOX的荧光强度，间接反映细胞摄取ND-PEG/DOX量的多少。图5A是未经处理的细胞所检测到的荧光信号强度，是细胞自发荧光，即细胞内部的荧光分子经光照射后所产生的荧光；图5B是含5μg/mlDOX的ND-PEG/DOX与细胞作用2h后所检测到的荧光信号强度图，可以看到，用ND-PEG/DOX处理细胞的荧光强度明显大于细胞本身的荧光强度，再次表明ND-PEG/DOX已进入细胞，与图4结果一致。
实施例7
不同浓度ND-PEG/DOX纳米药物对人肝癌细胞(HepG2)、人宫颈癌细胞(HeLa)、人乳腺癌细胞(MCF-7)活性的影响
将处于对数生长期的人肝癌细胞(HepG2)、人宫颈癌细胞(HeLa)、人乳腺癌细胞(MCF-7)细胞(10％FBS/DMEM培养基，5％CO2，37℃)按每孔5×103个接种于96孔培养板，细胞贴壁后，换200μL10％FBS/DMEM培养基配制的各实验组(A：ND-PEG10μg/mL、ND-PEG/DOX10μg/mL(含DOX1μg/mL)；B:ND-PEG30μg/mL、ND-PEG/DOX30μg/mL(含DOX3μg/mL)；C：ND-PEG50μg/mL、ND-PEG/DOX50μg/mL(含DOX5μg/mL)；D：ND-PEG70μg/mL、ND-PEG/DOX70μg/mL(含DOX7μg/mL)；E：ND-PEG90μg/mL、ND-PEG/DOX90μg/mL(含DOX9μg/mL)，每组均以未处理的HepG2、HeLa、MCF-7细胞为空白对照组，每组设置6个复孔，培养72h后每孔加入20μL5mg/mLMTT的PBS溶液，继续培养4h，然后弃除孔内旧培养液，每孔加入150μLDMSO，均匀振摇10min，进行酶标仪上机检测。
图6A为各药物组对体外HepG2细胞增殖的影响，图6B为各药物组对体外HeLa细胞增殖的影响，图6C为各药物组对体外MCF-7细胞增殖的影响。与空白细胞组对照，发现纳米材料载体ND-PEG在不同浓度条件下，对HepG2、HeLa、MCF-7三种细胞活性几乎没有影响，表明ND-PEG载体具有生物兼容性；而纳米药物ND-PEG/DOX对HepG2、HeLa、MCF-7三种细胞均表现出不同程度的杀伤作用，对HepG2细胞和MCF-7细胞的杀伤性较敏感，均表现为随着浓度逐渐增大，杀伤力逐渐增强，当浓度增大到9μg/mL时，HepG2细胞存活率降低到约15％，MCF-7细胞存活率低到约10％；相对而言，对HeLa细胞的杀伤力比上述两种细胞稍弱，表现为在低浓度(1μg/mL)时杀伤力不强，随着浓度逐渐增大，杀伤力不断增强，在浓度高达到9μg/mL时，细胞死亡率约为25％。表明ND-PEG/DOX药物可以有效杀死肿瘤细胞，且对不同的肿瘤细胞具有不同的杀伤力，其强弱顺序依次表现为MCF-7>HepG2>HeLa,即对HeLa细胞杀伤力最弱，MCF-7细胞杀伤力最强。
实施例8
ND-PEG/DOX纳米药物对人肝癌细胞(HepG2)、人宫颈癌细胞(HeLa)、人乳腺癌细胞(MCF-7)培养不同时间活性的影响
将处于对数生长期的人肝癌细胞(HepG2)、人宫颈癌细胞(HeLa)、人乳腺癌细胞(MCF-7)细胞(10％FBS/DMEM培养基，5％CO2，37℃)按每孔5×103个接种于96孔培养板，细胞贴壁后，换200μL10％FBS/DMEM培养基配制的各实验组(A：ND组，50μg/ml；B:ND-PEG组50μg/ml；C：ND-PEG/DOX组，50μg/mlND-PEG+5μg/mlDOX；D：DOX组，5μg/mlDOX)，每组均以未处理的HepG2、HeLa、MCF-7细胞为空白对照组，分别培养24h、48h和72h后每孔加入20μl5mg/mlMTT溶液，继续培养4h，然后弃除孔内旧培养液，接着每孔加入150μLDMSO，振摇10min，进行MTT检测。
图7A为各药物组对体外HepG2细胞增殖的影响，图7B为各药物组对体外HeLa细胞增殖的影响，图7C为各药物组对体外MCF-7细胞增殖的影响。与空白细胞组对照，A和B药物组在选定浓度条件下，对HepG2、HeLa、MCF-7细胞增值基本没有影响，表明ND-PEG载体具有生物兼容性；加药24h后，C组对细胞活性的影响与对照组相比基本上没有明显差异，但随着时间的延长，C组对细胞的毒性明显大于对照组，表明ND-PEG/DOX药物能够有效杀死肿瘤细胞，在相同时间(小于72h)与相同阿霉素浓度条件下，D组药物对细胞的杀伤力均大于C组药物对细胞的杀伤力，表明ND-PEG/DOX具有缓释药物特性，但达到72h时，C组药物对HepG2细胞和MCF-7细胞的杀伤力均大于D组药物，但是对HeLa细胞的杀伤力却略微有点小于D组药物，更进一步表明ND-PEG/DOX对HepG2细胞和MCF-7细胞的杀伤性较敏感。且表现为对HepG2细胞和MCF-7细胞杀伤力最大，对HeLa细胞稍弱。这与实施例7得到的结论一致。
实施例9
通过定量检测体外MCF-7细胞对ND-PEG/DOX摄取，分析细胞对该纳米药物的转运机制。
取对数生长期的MCF-7细胞以2.0×105/dish的密度接种于35mm培养皿中，培养16h后，弃除旧培养基液，用PBS洗涤3次，本实验中用实施例1制得ND-PEG/DOX纳米颗粒。
为了证明ND-PEG/DOX纳米颗粒进入细胞是否为能量依赖、网格蛋白决定或小窝蛋白决定途径，设计了五个实验。向其中一个细胞培养皿中加入ND-PEG/DOX(5μg/mLDOX)置于4℃孵育4h；再向另外三个细胞培养皿中分别加入NaN3(5mg/ml)、Sucrose(450mM)和β-CD(10mM)预处理细胞30min，之后加入ND-PEG/DOX(5μg/mLDOX)继续孵育4h；以ND-PEG/DOX(5μg/mLDOX)与细胞在37℃孵育4h为对照组。最后，将上述处理的细胞用胰酶消化成细胞悬液，冷PBS洗涤3次，再重悬于冷PBS中，立即进行流式细胞仪检测(激发波长488nm)，以未做任何处理的MCF-7细胞作为上述五组的空白对照。结果如图7所示
图8显示的是低温(4℃)和各种抑制剂对ND-PEG/DOX进入MCF-7细胞的影响。由于4℃下细胞膜脂流动性会降低，外源性物质与细胞膜的相互作用会受到影响，导致细胞对外源性物质的摄取效率降低，从图可看出4℃时ND-PEG/DOX的细胞摄取量比37℃明显降低；NaN3可抑制细胞色素氧化酶阻断线粒体呼吸链，从而阻断细胞内ATP的形成，用NaN3预处理细胞时发现细胞对ND-PEG/DOX摄取量下降了86％，说明ND-PEG/DOX进入细胞是一个主动的能量依赖的内吞过程。为进一步探讨ND-PEG/DOX以何种内吞方式进入MCF-7细胞，选用抑制剂蔗糖(Sucrose)和M-β-CD环糊精预处理细胞。Sucrose可扰乱网格蛋白包被小泡(clathrin-coatedvesicles)的形成，影响clathrin介导的内吞途径，M-β-CD环糊精可破坏细胞膜上的胆固醇成分，从而影响小窝蛋白介导的内吞途径。从图8可以看出Sucrose对MCF-7细胞摄入ND-PEG/DOX的抑制率达60％，而M-β-CD环糊精对MCF-7细胞摄入ND-PEG/DOX几乎没有影响。结果表明ND-PEG/DOX的细胞摄取具有温度能量依赖性，以clathrin介导的内吞途径进入MCF-7细胞的。
综上所述，通过聚乙二醇对纳米钻石加以修饰，形成低毒性纳米钻石-聚乙二醇载体，再将阿霉素物理吸附到其表面从而成功制得ND-PEG/DOX纳米药物。通过体外释药实验，发现该纳米药物在人体的血液和正常组织的pH值条件下，释放阿霉素的速率很缓慢，表明该纳米药物可以有效降低对正常组织和细胞的毒副作用；用MTT测试ND-PEG-DOX与HepG2、MCF-7、HeLa三种细胞作用，表明该纳米药物可以有效杀死肿瘤细胞，与游离阿霉素对细胞的杀伤力相比，ND-PEG/DOX具有缓释药物特性，且随着时间的延长，杀伤力大于游离的阿霉素。因此ND-PEG/DOX既能降低化疗药物对正常细胞的毒副作用，又能提高化疗药物对肿瘤细胞的杀伤力，可在制备抗肿瘤药物中应用。
Claims (3)
1.一种负载阿霉素的纳米钻石药物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)称取真空干燥的羧基化纳米钻石，按每毫克羧基化纳米钻石加入1-1.5mL的浓度为0.1M、pH为5.8的MES缓冲溶液中，超声分散30min形成悬浊液，再按每毫克羧基化纳米钻石加入0.2mgEDC、0.25mgNHS，室温搅拌反应6h，反应完毕后以15000rpm高速离心5min弃除上清液，得到活化羧基的纳米钻石沉淀物；接着将活化羧基的纳米钻石沉淀物迅速分散到浓度为0.1M、pH为8.4的硼酸缓冲溶液中，经过短暂超声分散形成悬浊液，再按每毫克活化的羧基化纳米钻石沉淀物快速加入0.3mgH2N-PEG-COOH，继续室温搅拌反应12h，待反应结束，以15000rpm高速离心5min吸除上清液，并用0.1M、pH8.4的硼酸缓冲溶液高速离心洗涤三次，获得ND-PEG-COOH沉淀物；
(2)称取真空干燥的ND-PEG-COOH，按每毫克ND-PEG-COOH加入1-1.5mL的浓度为0.1M、pH为8.0的硼酸缓冲溶液中，超声分散1h形成悬浊液，再按ND-PEG-COOH与DOX质量比为5∶0.1-0.2加入DOX，避光摇匀反应6h，以15000rpm离心5min，用浓度为0.1M、pH为8.0的硼酸缓冲溶液洗涤3次，制得纳米钻石药物ND-PEG/DOX，真空干燥，冷藏，避光保存。
2.如权利要求1所述方法制备得到的负载阿霉素的纳米钻石药物。
3.如权利要求2所述的负载阿霉素的纳米钻石药物在制备抗肿瘤药物中的应用。
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