CN109276712A - 纳米合成酶在细胞中促进高分子透明质酸合成的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于滑液技术领域，具体涉及一种纳米合成酶在细胞中促进高分子透明质酸合成的应用。所述纳米合成酶为纳米颗粒‑透明质酸合成酶负载体系，所述应用为将纳米颗粒‑透明质酸合成酶负载体系注射入关节腔内，纳米颗粒‑透明质酸合成酶负载体系进入滑膜细胞，从而促进滑膜细胞分泌高分子量透明质酸。本发明通过将装载透明质酸合成酶的纳米颗粒转入滑膜细胞中，使滑膜细胞分泌更多高分子量的透明质酸，本发明所产生的内源性、自身合成的高分子量透明质酸非常具有好的开发和应用前景，通过动物实验证实关节腔内注射纳米颗粒‑透明质酸合成酶负载体系对于高效化治疗骨性关节炎提供了新的手段，为临床治疗提供新的方法和思路。

Description

纳米合成酶在细胞中促进高分子透明质酸合成的应用

技术领域

本发明属于滑液技术领域，具体涉及一种纳米合成酶在细胞中促进高分子透明质酸合成的应用。

背景技术

透明质酸(hyaluronic acid，HA)，是Meyer和Palmer于1934年最先从牛眼玻璃体中分离出来的一种高粘性物质。

人体中关节滑液是由关节滑膜细胞分泌，滑液覆盖在关节表面。HA是构成关节滑液的主要成分，对关节生理功能的发挥起着至关重要的作用。当发生骨性关节炎(OA)、类风湿性关节炎(RA)等疾病时，HA在关节内的产生和代谢发生异常，滑液中HA的浓度和相对分子质量(Mr)明显降低，软骨发生降解和破坏，导致关节生理障碍。目前临床上应用透明质酸进行关节病的关节腔内注射治疗，旨在通过补充外源性HA，恢复滑液的润滑功能，促进软骨的修复，改善关节功能。

迄今为止，大量的临床研究使用结果表明，HA对OA、RA等关节疾病治疗效果明确、安全，具有很好的临床应用前景。但是，外源性的HA在体内降解速度比较快，通常在注射进入关节腔后12到24小时内就会被透明质酸酶所降解。HA的降解物会启动信号级联反应，引导血管生成，促进炎症反应。

骨性关节炎(osteoarthritis,OA)是关节退行性疾病，研究已证实与炎症密切相关，透明质酸合成酶合成的透明质酸(hyaluronic acid,HA)分子量降低是其重要的改变之一。临床上关节腔内注射高分子HA被广泛应用于治疗OA，能够起到缓解疼痛以及润滑关节的作用。由于外源性HA降解速度快，且短期多次注射HA增加患者身心痛苦。随着材料学和纳米科技的发展，特制的纳米颗粒由于其具有生物相容性好、较好的药物缓释控制，孔径尺寸可调以及表面易于有机基团改性等优点,被认为是最有前景的药物载体之一，现已被广泛应用于抗肿瘤、药学等方面的研究中，但在关节疾患领域尚无报道。

目前，HA原料普遍采用的生产方法主要有两种一种是从动物组织中提取；另一种是微生物发酵法。提取法主要利用鸡冠、人脐带、牛眼的玻璃体等为原料进行生产，而且组织必须是新鲜采集，但动物组织来源困难，且价格昂贵，成本高，这给HA的生产带来了一定的困难；发酵法生产HA，是利用链球菌将廉价的葡萄糖转化为HA，该方法不依赖于动物器官，产量不受限制，但HA的产量不高，生物相容性不如前者。

发明内容

本发明针对外源性透明质酸的来源、生物相容性、理化性能及产量等方面的不足，目的在于提供一种纳米合成酶在细胞中促进高分子透明质酸合成的应用。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种纳米合成酶在细胞中促进高分子透明质酸合成的应用，所述纳米合成酶为纳米颗粒-透明质酸合成酶负载体系，所述应用为将纳米颗粒-透明质酸合成酶负载体系注射入关节腔内，纳米颗粒-透明质酸合成酶负载体系进入滑膜细胞，促进滑膜细胞分泌高分子量透明质酸。

上述方案中，所述纳米颗粒-透明质酸合成酶负载体系的制备方法包括如下步骤：1)将纳米颗粒进行表面聚乙烯亚胺改性修饰处理，随后将其配制成纳米颗粒溶液；2)将纳米颗粒溶液与透明质酸合成酶溶液混合，轻柔震荡培养一段时间，然后离心分离，收集沉淀物，即得到负载透明质酸合成酶的纳米颗粒负载体系。

上述方案中，所述纳米颗粒的粒径为100～200nm，孔径为10～60nm。

上述方案中，所述纳米颗粒为介孔硅无机纳米颗粒。

上述方案中，所述改性修饰处理为：所述改性处理的步骤为：将纳米颗粒分散到水中，调节pH＝10，然后将3-(三羟基硅基)丙甲基磷酸酯加入到溶液中，在40℃下搅拌4小时，通过离心法分离得到固体颗粒，然后将固体颗粒重悬于聚乙烯亚胺溶液中，常温搅拌4小时，采用离心法分离得到表面改性修饰处理的纳米颗粒。

上述方案中，所述震荡培养的温度为37℃，震荡培养的时间为2～12h；所述离心分离的转速为20000rpm，时间为15分钟。

上述方案中，所述透明质酸合成酶溶液为透明质酸合成酶PBS溶液。

上述方案中，所述纳米颗粒溶液为浓度为纳米颗粒DMEM溶液。

上述方案中，所述纳米颗粒溶液与透明质酸合成酶溶液的体积比为1:1，所述纳米颗粒溶液的浓度为100ug/ml，所述透明质酸合成酶溶液的浓度为100ug/ml。

上述方案中，所述纳米颗粒-透明质酸合成酶负载体系中透明质酸的负载率为42％。

本发明的有益效果如下：

1)本发明首先将纳米颗粒进行改性处理，大大提高了纳米颗粒对大分子透明质酸合成酶的载药能力，且将纳米颗粒-透明质酸合成酶负载体系转入滑膜细胞及关节盘细胞内，功能测试结果表明该大分子透明质酸合成酶在细胞内依然具有较好的生物学活性；

2)本发明所述改性后的纳米颗粒能有效装载透明质酸合成酶，并将蛋白运送到滑膜细胞内部，纳米颗粒-透明质酸合成酶负载体系能通过促进靶蛋白向质膜迁移，使滑膜细胞中HA含量提高，并且HPLC证实高分子量的HA分泌增多，通过WB实验发现主要参与其合成的透明质酸合成酶的表达大大增加；

3)本发明通过将装载透明质酸合成酶的纳米颗粒转入滑膜细胞中，使滑膜细胞分泌更多的透明质酸，本发明所产生的内源性、自身合成的高分子量透明质酸非常具有好的开发和应用前景，可以使得临床上注射外源性透明质酸的次数大大减少，大大减轻患者的焦虑并节约了诊疗次数；本发明动物实验证实关节腔内注射纳米颗粒-透明质酸合成酶负载体系对于高效化治疗骨性关节炎提供了新的手段，为临床治疗提供新的方法和思路。

附图说明

图1为滑膜细胞HE染色。

图2为Fibronectin单克隆抗体免疫荧光标记滑膜细胞。

图3为纳米颗粒高效的进入滑膜细胞(A)、关节盘细胞(B)、MCF-7细胞(C)的内部图，其中1为RITC标记的聚乙烯亚胺表面修饰介孔硅纳米颗粒。

图4为纳米颗粒有效装载透明质酸合成酶后随时间的蛋白释放曲线图。

图5为经过纳米颗粒有效装载透明质酸合成酶进入的滑膜细胞后提取的上清，通过高效液相色谱检测提取的HA图，图中纵坐标表示信号大小，横坐标表示时间。

图6为表面聚乙烯亚胺改性修饰的介孔硅纳米颗粒透射电镜图像。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1

一、滑膜细胞的分离、培养及鉴定

1、取人或动物一侧关节盘的滑膜组织，组织块法培养。

2、单细胞克隆法对滑膜细胞进行分型。

(1)单细胞克隆

收集适应性培养基培养滑膜细胞至半汇合状态，吸出所有培养液离心，直径0.22μm滤孔的滤膜过滤，取一瓶处于对数生长期的细胞常规消化、离心、计数。细胞稀释成每100μL含45～50个细胞，打匀，点种。在倒置显微镜下观察96孔板，将只有单个细胞的序号记录下来，然后仅给单个细胞孔加培养液150～200μL，置CO₂培养箱培养。培养86～96小时后进行观察。挑选生长良好的单细胞克隆孔，先吸除旧培养液，用Hanks洗1～2次，用少许胰蛋白酶消化。置于倒置显微镜下观察，当细胞离开底物悬浮后，一并吸入管中，移入另瓶中，再补加一定量克隆培养液，置CO₂温箱中继续培养、增量，使之形成新的细胞群体。

(2)滑膜细胞的鉴定

光镜观察常规HE染色，显微镜下观察细胞形态，倒置显微镜下观察细胞的形态及生长状况，结果如图1所示。

细胞免疫化学1:100的鼠抗人Fibronectin单克隆抗体免疫反应，显微镜下观察细胞形态，结果如图2所示。

图1和图2的结果显示:HE染色与Fibronectin免疫荧光表明通过以上方法可成功分离培养出滑膜成纤维细胞。

实施例2研究RITC标记的聚乙烯亚胺表面修饰介孔硅纳米颗粒体外转入滑膜成纤维细胞的效率

一、制备聚乙烯亚胺表面改性修饰的介孔硅纳米颗粒，并采用RITC荧光标记：

(1)将合成好的多孔道的纳米颗粒(10～100毫克)分散到10～200毫升的水中，将pH调节到10左右，然后将0.1ml～5ml 3-(三羟基硅基)丙甲基磷酸酯(3-(Trihydroxysilyl)propylmethylphosphonate)加入到溶液中，在40℃下搅拌4小时，通过离心法分离(3700转/分钟离心十分钟)获得纳米颗粒；而后固体颗粒重悬于含50～500毫克聚乙烯亚胺(Polyethylenimine，PEI，分子量5000～5万Da)溶液中，常温搅拌4小时。至于高速离心机内20000转/分钟离心十分钟，采用离心法分离获得聚乙烯亚胺表面改性修饰的介孔硅纳米颗粒；介孔硅纳米颗粒投射电镜图像如图6所示，所述介孔硅纳米颗粒的粒径为100～200nm，孔径为10～60nm；

(2)采用RITC荧光标记聚乙烯亚胺表面改性修饰的介孔硅纳米颗粒。

二、研究RITC标记的聚乙烯亚胺表面修饰介孔硅纳米颗粒体外转入滑膜成纤维细胞的效率

将RITC标记的聚乙烯亚胺表面改性修饰的介孔硅纳米颗粒体外转入滑膜成纤维细胞，具体的操作过程为：

1)将滑膜成纤维细胞以2×10⁵/孔接种于12孔板内；

2)将0.5mg RITC标记的聚乙烯亚胺表面改性修饰的介孔硅纳米颗粒用1.5mlDMEM溶液溶解，震荡混匀；

3)弃去12孔板内原细胞培养液，加入步骤2)中含RITC标记的聚乙烯亚胺表面改性修饰的介孔硅纳米颗粒的DMEM溶液1.5ml，并在细胞培养箱中培养4h；培养结束后，倒置显微镜观察细胞生长情况。

本实施例中采用荧光显微镜观察细胞生长情况，具体操作步骤为：1)将细胞用PBS冲洗两遍，每孔用1ml 4％多聚甲醛固定15min；2)准备Alexa 488 Phalloidin，将Alexa 488 Phalloidin冻干粉溶于1.5ml纯甲醇中，用PBS 1：20稀释(100μl体积PBS中加入5μl Alexa 488 Phalloidin的甲醇溶液)；3)PBS清洗细胞三次，每次五分钟，将稀释好的Alexa 488 Phalloidin液体加入细胞中，在室温下敷育15min后，用PBS清洗三次，每次5分钟；4)DAPI染核2min，用PBS清洗三次，每次5分钟，防荧光猝灭剂封片，上机检测；乳腺癌细胞系MFC-7细胞作为对照。

结果显示：成功将聚乙烯亚胺表面改性修饰的介孔硅纳米颗粒转运进入TMJ滑膜细胞及关节盘细胞中，见图3，纳米颗粒高效的进入滑膜成纤维细胞、关节盘细胞内部(MCF-7细胞作为对照)；荧光显微镜检测RITC(红色)标记的纳米颗粒转入滑膜细胞(A)，关节盘细胞(B)和MCF-7细胞(C)后的表达。DAPI(蓝色)和Alexa 488 Phalloidin染料(绿色)分别染色细胞核和细胞质。该材料为将透明质酸合成酶(HAS2)高效的转入细胞中提供了最佳的途径。

实施例3建立纳米颗粒-透明质酸合成酶负载体系

一、制备介孔硅纳米颗粒-透明质酸合成酶负载体系，具体包括如下步骤：

(1)取10ug的透明质酸合成酶，加入PBS溶解并扩容至100ul，即得100ug/ml的透明质酸合成酶溶液；

(2)将10uL的100ug/ml透明质酸合成酶溶液与10uL的100ug/ml RITC标记的聚乙烯亚胺表面改性修饰的介孔硅纳米颗粒DMEM溶液混合，轻柔震荡24h，然后离心分离，收集离心后的上清液和沉淀物。

计算纳米颗粒-透明质酸合成酶负载体系的载药量，载药量(％)＝(透明质酸合成酶的投入量(ug)-上清液中透明质酸合成酶含量(ug))/纳米粒子的质量×100％；

检测透明质酸合成酶的释放量，并绘制释放曲线：将上述离心后的沉淀物纳米颗粒-透明质酸合成酶负载体系分散于10uL PBS中，以100rpm于37℃恒温振荡，进行体外释放试验，分别于震荡后2、4、6、8、10、12h时离心，取上清1ul，加入1ul新鲜的PBS于原溶液，用Nanodrop检测浓度，并根据标准曲线计算透明质酸合成酶的累积释放量。

结果显示：纳米材料携带透明质酸合成酶组成的体系，在PBS溶液中的释放曲线经三次以上的可重复实验，绘制如图4，体系在进入溶剂后的前2～4小时，释放蛋白速度较快，4小时后能达到60％的释放量，随后呈缓释状态，6～12小时过程中缓慢释放，最终70％以上的蛋白量可完成材料携带后释放，这为材料携带蛋白进入细胞后有效的释放提供实验基础，保证较高活性状态的蛋白在12小时内携带并进入细胞释放。

实施例4装载透明质酸合成酶的介孔硅纳米颗粒转入滑膜成纤维细胞后HA的表达

一、将装载透明质酸合成酶的RITC标记的聚乙烯亚胺表面改性修饰的介孔硅纳米颗粒转入滑膜成纤维细胞

1)将滑膜成纤维细胞以1.5×10⁶/孔接种于10cm皿内；

2)将1mg装载透明质酸合成酶的RITC标记的聚乙烯亚胺表面改性修饰的介孔硅纳米颗粒用3ml DMEM溶液溶解，震荡混匀；3)弃去10cm皿内原细胞培养液，加入步骤2)中含纳米颗粒的DMEM溶液3ml，并在细胞培养箱中培养4h；培养结束后，倒置显微镜观察细胞生长情况。

二、检测装载透明质酸合成酶的RITC标记的聚乙烯亚胺表面改性修饰的介孔硅纳米颗粒对滑膜成纤维细胞的毒性以及对产生高分子透明质酸的影响，具体的检测方法如下：

1、CCK8试剂盒检测纳米颗粒细胞毒性：

1)实验前准备：8个96孔板，枪一套(主要是1000ul，200ul和20ul)，CCK8试剂盒，蓝枪头、黄枪头；

2)注意：设空白对照，设三个复孔；

3)步骤：

①在96孔板中接种1*10⁴细胞悬液(100μL/孔)，每板27个孔(三个孔为不加细胞的空白对照此时不加，三个为滑膜细胞，其他为滑膜细胞+纳米颗粒组)，将培养板在培养箱预培养(在37℃，5％CO²的条件下)；

②将3mg的RITC标记的聚乙烯亚胺表面改性修饰的介孔硅纳米颗粒溶于300ul的DMEM，得到10mg/ml的RITC标记的聚乙烯亚胺表面改性修饰的介孔硅纳米颗粒DMEM溶液；取150ul RITC标记的聚乙烯亚胺表面改性修饰的介孔硅纳米颗粒溶液加入150ul的DMEM，得到5mg/mlRITC标记的聚乙烯亚胺表面改性修饰的介孔硅纳米颗粒DMEM溶液，以此类推，设置浓度梯度为10，5，2.5，1.25，0.625，0.313，0.156，0mg/ml的纳米颗粒DMEM溶液；将以上溶解好的纳米颗粒DMEM溶液加入细胞中，并于常氧条件下避光孵育6小时；

③避光孵育6小时后，再在对照孔内加入空白对照，并向孔板中每孔加入10ulCCK-8溶液(贴着孔壁加，注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数，可以预先混匀)；

④将培养板在原条件下培养箱内孵育2小时；

⑤用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

2、提取细胞培养上清液，通过HPLC检测HA的分子量。

用已知高分子量的单分散性的透明质酸标准品作标样(分子量：1600kDa),在实验条件下，流动相流速：1.0mL/min，温度：35℃，进样量：10μL，测出对应的保留时间RT值，透明质酸标准品的出峰时间：8±0.5min。将被测试样相同条件下观察在相同保留时间RT时的出峰情况，测定高分子透明质酸的含量。

结果显示：如图5示，样品准确加入400ul流动相(0.05M硫酸钠水溶液)溶解，过0.22um滤膜后测定。经过高效液相色谱示差折光检测器检测细胞培养的上清液，发现在7.421分钟时出峰，根据对比透明质酸标准品的出峰时间，标准品的出峰时间：8±0.5min，确定透明质酸的分子量大小分布为1600kDa，这说明了透明质酸合成酶通过多孔纳米材料携带进入滑膜成纤维细胞可以促进高分子透明质酸合成和分泌。

实施例5

将纳米颗粒-透明质酸合成酶负载体系注射进大鼠关节腔内，注射一周后，抽取关节滑液，通过前面述高效液相色谱方法检测关节滑液中透明质酸的分子量大小。结果显示：透明质酸的分子量大小分布为1600～1800kDa，说明透明质酸合成酶通过多孔纳米材料携带进入关节腔内的滑膜细胞，能促进高分子透明质酸合成和分泌。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种纳米合成酶在细胞中促进高分子透明质酸合成的应用，所述纳米合成酶为纳米颗粒-透明质酸合成酶负载体系，所述应用为将纳米颗粒-透明质酸合成酶负载体系注射入关节腔内，纳米颗粒-透明质酸合成酶负载体系进入滑膜细胞，从而促进滑膜细胞分泌高分子量透明质酸。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述纳米颗粒-透明质酸合成酶负载体系的制备方法包括如下步骤：1）将纳米颗粒进行表面聚乙烯亚胺改性修饰处理，随后将其配制成纳米颗粒溶液；2）将纳米颗粒溶液与透明质酸合成酶溶液混合，轻柔震荡培养一段时间，然后离心分离，收集沉淀物，即得到负载透明质酸合成酶的纳米颗粒负载体系。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述纳米颗粒的粒径为100~200nm，孔径为10~60 nm。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述纳米颗粒为介孔硅无机纳米颗粒。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述改性处理的步骤为：将纳米颗粒分散到水中，调节pH=10，然后将3-(三羟基硅基)丙甲基磷酸酯加入到溶液中，在40℃下搅拌4小时，通过离心法分离得到固体颗粒，然后将固体颗粒重悬于聚乙烯亚胺溶液中，常温搅拌4小时，采用离心法分离得到表面改性修饰处理的纳米颗粒。

6.根据权利要求1所述的应用，所述震荡培养的温度为37℃，震荡培养的时间为2~12h；所述离心分离的转速为20000rpm，时间为15分钟。

7.根据权利要求1所述的应用，所述透明质酸合成酶溶液为透明质酸合成酶PBS溶液。

8.根据权利要求1所述的应用，所述纳米颗粒溶液为浓度为纳米颗粒DMEM溶液。

9.根据权利要求1所述的应用，所述纳米颗粒溶液与透明质酸合成酶溶液的体积比为1:1，所述纳米颗粒溶液的浓度为100ug/ml，所述透明质酸合成酶溶液的浓度为100ug/ml。

10.根据权利要求1所述的应用，所述纳米颗粒-透明质酸合成酶负载体系中透明质酸的负载率为42%。