KR20120092766A - 세포 사멸의 실시간, 고해상도 영상화를 위한 고분자 나노 입자의 제조 및 응용 - Google Patents

세포 사멸의 실시간, 고해상도 영상화를 위한 고분자 나노 입자의 제조 및 응용 Download PDF

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김광명
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Abstract

본 발명은 세포 사멸시 특이적으로 활성화되는 효소에 의하여 특이적으로 절단되는 임의의 펩타이드가 결합된 고분자 유도체 및 상기 고분자 유도체로 이루어진 나노 입자에 관한 것이다.
본 발명에 의한 고분자 나노 입자는 세포 또는 인체 내의 조직에서의 세포 사멸을 선택적으로 영상화할 수 있으므로, 암 등의 특정 질병 진단 등에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

세포 사멸의 실시간, 고해상도 영상화를 위한 고분자 나노 입자의 제조 및 응용 {Real Time, Hich Resolution Video Imaging of Apoptosis in Single Cells with a Plymeric Nanoprobe}
본 발명은 세포 사멸시 특이적으로 활성화되는 효소에 의하여 특이적으로 분해되는 임의의 펩타이드가 결합된 고분자 유도체 및 상기 고분자 유도체로 이루어진 나노 입자에 관한 것이다.
살아있는 세포 내에서의 세포 사멸을 직접적으로 가시화할 수 있는 실시간 영상 시스템은, 다양한 질병의 초기 진단과 발견, 그리고 세포 사멸과 관련된 신규한 약제의 평가에 사용될 수 있다. 세포 사멸은 조직 항상성을 유지하는 것이 위태로운 다세포 유기체 내에서 프로그램화된 세포 죽음 과정의 양상인데, 세포 사멸의 탈규제는 자가면역 및 신경변성 질환, 순환기 질환, 암 및 화학요법 또는 방사선 요법에 반응하는 종양 반응을 포함하는 수 개의 병적 측면을 초래하게 된다. 대부분의 효과적인 항암 치료는 세포 사멸을 개시하기 때문에, 단일 세포 수준에서의 세포 사멸 진행을 검출하기 위한 살아있는 영상화 방법은 분자 수준에서 세포 내 세포 자살 신호 메카니즘의 이해를 확연히 증가시키고, 세포 자살과 관련된 약 효능의 임상적 모니터링을 도울수 있다.
현재까지도 세포 죽음에 대한 기전이 완전하게 규명되지는 않았지만, TNF(tumor necrosis factor) 수용체의 일종인 CD95(Fas)와 같은 세포 사망 수용체의 활성화, 방사선이나 항암 약물등에 의한 DNA 손상, IL-3, 에리스로포이에틴 등과 같이 생존 신호를 전달하는 사이토카인(cytokine)의 결핍 등에 의하여 세포 사멸이 발생한다는 것은 알려져 있다. 이러한 세포 사멸은 개체의 세포 숫자와 조직의 크기를 일정하게 유지하고 체내의 항상성을 유지하는데 매우 중요하게 작용한다. 그러므로 부적절한 세포 사멸은 치매, 허혈, 파킨스병 등과 같은 퇴행성 질병, 자가면역 질환, 그리고 암의 유발 등과 밀접한 관계를 갖는다.
지금까지 세포 사멸을 영상화하는 방법으로는, 광학현미경/전자현미경을 이용하여 세포 사멸시의 세포의 형태학적인 변화를 관찰하는 방법, 프로피디움 아오다이드(propidium iodide, PI)로 염색하여 세포 사멸시 죽은 세포의 핵을 관찰하는 방법, 터널 염색법 (TUNEL staining)을 이용하여 세포 사멸시 핵내의 유전자 분쇄를 분석하는 방법이 있다. 그러나 이러한 방법들은 세포가 완전히 사멸한 후에 일어나는 세포의 형태를 관찰하거나, 죽은 세포 내로 형광 물질을 전달하여 염색하는 방법이므로, 실시간 세포 영상 또는 비침습적 조직 영상은 불가능하다. 최근, 세포 사멸 과정 진행시 세포 외벽으로 돌출되는 포스파티딜세린(phosphatidyl serine, PS)과 특이적으로 결합하는 포스파티딜세린 항체인 아넥신 V (Annexin V) (포스파티딜세린의 항체)를 이용하여, 세포 사멸이 진행된 세포와 그렇지 못한 세포를 영상화하는 방법이 이용되고 있다 (Schellenberger 외, 네오플라시아 Neoplsia, 5, 187-192, 2003). 상기 방법에서는, 보통 프로피디움 아오다이드 (PI), 터널 염색법과 아넥신 V를 동시에 사용하여 세포 사멸의 초기?말기를 영상화한다. 그러나 아넥신 V는 정상세포의 다른 지질에도 비특이적인 결합을 할 수 있으며, 항체 자체의 불안전성과 비특이성 때문에 실제로 조직을 영상화하는데 있어서는 문제가 된다. 또한, 세포 사멸을 평가하기 위하여 현재 사용되고 있는 금 표준 방법 (glod standard method)은 태그로 라벨링한 아넥신 V를 이용하는데, 포스파티딜세린에 대한 높은 친화성을 갖는 단백질 형광단은 세포 사멸의 후기 단계 동안 노출된다. 비록, 사멸 세포의 표면에 아넥신 V를 결합하는 것은 유의한 방법으로 증명되었지만, 이는 간접적 방법일 뿐 세포 사멸에 특이적인 것은 아니다. 기타 접근 방법으로는, 카스파아제 등과 같은 특정 세포 사멸 시그널링 분자를 모니터 하는 것이 있다. 이들 효소는 세포 사멸에 있어서 직접적이고 중요한 매개체이므로, 세포 사멸 이미지에 대한 명백한 표적 분자를 나타낸다. 형광 광학 영상에서의 수많은 발전과 나노 기술로 인하여, 생체 내 (in vivo) 또는 시험관 내 (in vitro)의 세포 단계에서의 카스파아제 활성을 실시간 모니터링할 수 있다. 그러나, 살아있는 세포 내에서의 세포 사멸을 높은 해상도 이미지로 제공하는 유효한 프로브는 아직 없는 실정이다.
한편, 선행 기술 중에는 근적외선을 이용한 생체 내 진단 방법에 대하여 기술하고 있는 것이 있으며 (출원번호 제1997-0703597호), 또한, 논문 장 (Zhang HZ.) 등의 문헌 [Bioconjugate Chem., 14, 458-463, (2003)]은 세포 사멸시 활성화되는 펩타이드 기질인 DEVD-로다민 유도체를 합성하여 세포 내의 세포 사멸 현상을 영상화하는 것에 대하여 기술하고 있고, 논문 [Weissleder, R. et al. (1999) Nat. Biotech. 17, 375-378]은, 암 조직 주변의 단백질 분해 효소인 MMP등에 의하여 분해되는 고분자-펩타이드-형광체 나노 입자의 제조에 관하여 기술하고 있다. 이와 같이, 생체 내 조직 등을 영상화하기 위한 방법과 관련된 종래 기술이 몇 있다. 그러나, 상기 종래 기술에서 개시하고 있는 생체 내 세포 진단 방법에 의하더라도, 세포 사멸 등을 선택적으로 영상화하는 것이 어렵다. 또한, 생체 내에서 진단하고자 하는 특정 부위로의 안정적인 이동이 보장되지 않는다는 문제점이 있다. 따라서, 살아있는 세포뿐 아니라 인체 내의 조직에서 발생하는 세포 사멸을 선택적으로 영상화할 수 있는 조영제의 개발이 중요하다. 세포 사멸을 선택적으로 영상화할 수 있는 조영제는, 세포 사멸이 일어나는 부위에 특이적으로 축적되는 것이 바람직하며, 축적된 부위에서의 세포 사멸을 실시간으로 영상화할 수 있어야 한다.
이에, 본 발명자는 살아있는 세포 또는 인체 조직 내에서 발생하는 세포 사멸을 선택적으로 영상화할 수 있는 조영제를 제공하기 위하여, 생체 적합성이 우수한 고분자와 세포 사멸시 특이적으로 활성화되는 효소에 의하여 특이적으로 분해되는 펩타이드를 결합시킨 나노 입자를 제공하되, 실시간 영상화가 가능하도록 특정 조건에서 형광을 나타낼 수 있는 형광체를 상기 나노 입자에 연결시켜, 고분자-소광체-펩타이드-형광체 복합체를 제조하였다.
본 발명은 상술한 바와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 살아있는 세포 또는 신체 내 조직에서도 세포 사멸을 선택적으로 영상화할 수 있는 조영제를 제공하는데 목적이 있다. 따라서, 본 발명이 이루고자하는 기술적 과제는 세포 사멸 현상을 분자적 수준에서 실시간/고해상도로 영상화하기 위한 고분자 나노 입자를 이용한 신규한 조영제의 제조방법 및 용도를 제공하는 것이다.
보다 상세하게는, 소수성과 친수성의 균형을 통해 나노크기의 자기조립체 (self-assemblｙ) 혹은 자기집합체 (self-aggregate)를 형성할 수 있고, 살아있는 세포에 효과적으로 흡수되며, 세포 내에 흡수된 후에는 세포 사멸시 활성화되는 단백질 분해효소 (카스파아제-3 등)에 민감하게 반응하여 세포 사멸시 형광을 나타낼 수 있는 신규한 나노 입자를 제공하는 것이다.
본 발명에서 제조한 고분자-소광체-펩타이드-형광체는 나노 입자의 형태를 가지며, 세포 투과 효율이 높으며, 세포 내에서 세포 사멸이 발생할 때 활성화되는 단백질 분해효소에 의하여 나노 입자 내에서는 소광 효과를 나타내는 소광체-펩타이드-형광체가 분해되어 형광을 나타내는 새로운 형태의 조영제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 세포 사멸 과정에서 핵심적인 역할을 하는 카스파아제에 의하여 선택적으로 분해되어 형광을 나타내는 고분자 나노 입자를 제공한다.
본 발명은, 세포 사멸시 활성화되는 단백질 분해효소에 의하여 선택적으로 분해되어 형광을 나타내는 고분자-펩타이드-형광체 복합체를 제공한다는 점에서 종래 발명과 차이가 있다. 또한, 본 발명에 의해 제공되는 고분자-펩타이드-형광체는 수용액에서는 나노 입자를 형성하며, 나노 입자내의 형광체는 소광 상태로 존재하다가 세포 사멸시의 카스파아제-3에 의해서는 나노 입자 내의 형광체가 분해되어 특이적으로 형광을 나타낸다. 따라서, 이러한 신규한 나노 입자형 프로브는 살아있는 세포를 영상화, 신약 검색, 생체 조직의 세포 사멸 현상을 영상화하는데 응용될 수 있다.
또한, 종래에 제공되었던 조영제 등은 형광 신호 증폭이 낮다는 것에 착안하여, 본 발명의 조영제로서 제공되는 고분자 나노 입자는 형광 증폭 효율을 증가시키기 위하여 이중 소광 포맷에 기초하여 고안된 것이 특징이다.
본 발명에 의한 고분자 나노 입자는 세포 사멸 현상과 관련되는 단백질 분해 효소에 의하여 선택적으로 분해되어 형광을 나타내므로, 살아있는 세포 또는 신체 내의 조직에서도 세포 사멸을 선택적으로 영상화할 수 있다. 따라서, 본 발명에 의한 고분자 나노 입자는 비침습적 질병 진단에도 유용하게 사용될 수 있다.
도 1: 정상세포에서는 소광 상태인 조영제로서의 나노 프로브가 세포 사멸이 유도된 세포에서는 카스파아제-3에 의하여 선택적으로 형광이 복원됨을 그림 및 사진으로 나타낸 것이다.
도 2: A는 카스파아제-3에 의하여 활성 가능한 나노 프로브 (Apo-NP)의 개략적 도해 및 화학적 구조를 나타낸 것이다. B는 PBS에서의 Apo-NPs의 크기 분포를 나타낸 것으로서, 삽도는 전달 전자 현미경으로 관찰된 영상을 나타낸 것이다.
도 3: A는 동일한 몰 농도의 해리 Cy5.5 염료 용액 (DIC)과 함께 활성 카스파아제-3을 첨가(+)하거나 첨가하지 않은(-) Apo-NP를 함유하는 바이알 (vial)의 NIR 형광 이미지를 사진으로 나타낸 것이다. B는 다양한 카스파아제 (카스파아제-3, 카스파아제-6, 카스파아제-9, 그리고 카스파아제-3 및 억제제 60 nml/L)의 존재 하에서 Apo-NPs의 형광 방출 강도를 그래프로 나타낸 것이다. C는 다양한 농도의 카스파아제-3의 존재 하에서 Apo-NPs를 함유하는 96-웰 마이크로플레이트의 형광 이미지 섹션 (0, 15, 30, 60, 120 nmol/L)을 나타낸 것이다. D는 HCT16 세포에 대한 시험관 내에서의 독성을 확립된 MTT 어세이로 측정하여 그래프로 나타낸 것이다. E는 소광되지 않은 FITC로 라벨화된 Apo-NPs와 함께 배양한 HCT 116 세포의 공초점 현미경 관찰 이미지를 나타낸 것이다. 37℃에서 30분 동안, RPMI1640 배지 내에서 각 시료 (0, 10, 20, 50 ㎍/mL)를 HCI116 종양 세포와 함께 배양하여 미분간섭관찰 (DIC) 및 FITC 이미지를 얻었다.
도 4: HCT116 세포 내에서의 카스파아제-3의 활성을, Apo-NPs를 사용하여 이미지화한 것이다. A는 세포를 Apo-NPs (20 ㎍/mL)와 함께 30분 동안 배양하고, TRAIL (100 ng/mL)와 FITC-아넥신 염료 (더 낮은 농도)로 처리하여 세포 사멸을 측정한 것, B는 버퍼를 처리하여 세포 사멸을 측정한 것, C는 카스파아제-3 억제제 (Z-DEVD-FMK)와 RTAIL를 처리한 후 세포 사멸을 측정한 것이다. 처리 후, 0시 시작 시점부터, 시간차 현미경으로 매 3분마다 2시간 동안 미분 간섭 관찰 (DIC) 및 Cy5.5 이미지를 얻은 것이다.
도 5: A는 독소루비신으로 전처리 하지 않은 Apo-NP를 종양 내로 주입한 후, 피하 SCC7 종양 관련 마우스의 시험관 내 NIR 형광 영상(상기 프로브 주입 24시간 전)을 나타낸 것이다. 세포 사멸 종양만 명확히 가시화하였다. B는 시간 함수 (n=5)로 Apo-NP로 치료된 조직 내에서의 총 광자를 계산하여 정량적으로 이미지 분석한 것이다. C는 도 5의 A의 종양 이미지의 2차원 슬라이스를 나타낸 것이다. D는 절단된 Apo-NP로 치료된 조직의 NIR 형광 이미지를 나타낸 것이다.
도 6: Apo-NPs의 FPLC 프로파일을 나타낸 것이다.
도 7: 다양한 농도의 다양한 농도의 카스파아제-3의 존재 하에서의 Apo-NP의 형광 방출 스펙트라를 나타낸 것이다. 카스파아제-3이 표준 곡선.
도 8: MP로 처리한 종양과 조직을 TUNEL로 염색한 것(왼쪽)과, 세포 사멸 지수를 계산한 것을 그래프로 나타낸 것(오른쪽)이다.
이하에서 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 세포 및 인체 내의 조직에서 발생하는 세포 사멸을 선택적으로 영상화하는 신규한 조영제로서의 고분자 나노 입자의 제조방법 및 용도에 관한 것이다. 보다 자세하게는, 세포 사멸시 특이적으로 활성화되는 단백질 효소에 의하여 특이적으로 분해되는 임의의 펩타이드가 결합된 고분자 유도체 및 상기 고분자 유도체로 이루어진 나노 입자에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 “세포 사멸(apoptosis)”이라는 용어는 세포의 죽음 기전 중에서 유전자에 의하여 조절되는 능동적 세포 죽음과정을 말하는 것으로서, 독성/상해와 같은 갑작스러운 외부환경의 변화에 의하여 유발되는 수동적 죽음인 괴사(necrosis)와는 구별되는 세포 죽음의 메카니즘을 의미한다.
본 발명에 의한 고분자 나노 입자는 세포 사멸시 특이적으로 활성화되는 효소에 의하여 특이적으로 분해되는 임의의 펩타이드가 결합되며, 상기 효소에 의하여 펩타이드가 분해시 형광을 발생할 수 있는 형광체를 포함하고, 펩타이드의 특정 부위가 절단되기 전에는 세포 또는 조직 내에서 형광을 발생하지 않도록 소광체를 포함하는 것이 특징이다.
즉, 조영제로서의 본 발명에 의한 고분자 나노 입자는 고분자와 세포 사멸시 특이적으로 활성화되는 효소에 의하여 특이적으로 분해되는 임의의 펩타이드, 형광체 및 소광체가 결합되어 제조되는 것이다. 이러한 고분자 나노 입자는, 폴리머 나노 입자 플랫폼을 기반으로 고안한 신규한 세포 사멸 나노 프로브 (Apo-NP)이다. 이에 의하면, 세포 내에서의 세포 사멸시 형광 시그널을 촉진할 수 있으며, 단일 세포와 생체 내에서의 세포 사멸을 실시간으로 영상화할 수 있다. 상기 Apo-NP는 세포 투과성이므로 화학적으로 라벨링되고, 세포 사멸시 특이적으로 활성화되는 단백질 분해효소에 특이적이면서 이중 소광된 형광 펩타이드를 세포 내로 효율적으로 전달할 수 있으며, 이로 인하여 사멸하는 세포 내에서 세포 사멸시 특이적으로 활성화되는 효소에 강하게 의존적인 형광 증폭이 실시간으로 높은 해상도로 영상화될 수 있도록 한다. 따라서, 본 발명에 의한 나노 입자 프로브는 세포 영상 및 비침습적 질병 진단 등에 사용될 수 있다. 상기 Apo-NP의 고안 플랫폼은 유동적인 것으로, 암 치료에 사용될 수 있는 세포 사멸 약제의 치료적 효능을 영상화하기 위한 용도 또는 병리학에서 카스파아제와 관련된 세포 사멸을 동정하기 위한 용도 등의 다양한 적용을 위하여 미세하게 조정될 수 있다.
구체적인 일 실시예에 의하면, 본 발명에 의한 세포 사멸 특이적 나노 프로브 (Apo-NP)는, 강력한 이중 소광체 (염료-다크 소광체 및 염료-염료 소광 메카니즘)와, 담체로서 히알루론산계 폴리머 나노 입자 (HA-NPs)의 표면에 카스파아제-3에 특이적인 NIR 형광 펩타이드로 구성되는데 (도 2A), 상기 나노 프로브는 NIR 다크 소광체, 블랙홀 소광체 (BHQ-3)등으로 소광될 수 있다. 상기와 같은 구성의 Apo-NPs는 세포계에서 세포 투과가 가능하므로 사멸하는 세포 내에서 카스파아제-3에 의한 의존적 형광 회복을 영상화하는 것이 가능하다. 더욱이, 본 발명에 의한 이중 소광 포맷에 의하면 배경 시그널을 낮은 농도까지 감소시킬 수 있으므로 사멸하는 세포 내에서의 전체적인 활성 형광 시그널을 증가시킬 수 있어, 세포 사멸을 실시간 추적하는 것이 가능하다. 또한, 병리 생리학 내에서의 세포 사멸의 역할을 조사하기 위하여 상기 Apo-NP를 사용할 수 있으며, 카스파아제 관련 세포 사멸의 동정 및 세포 사멸 약제의 치료적 효능을 모니터링하는 것이 가능하다.
상기 신규한 세포 사멸 특이적 나노 프로브의 구조는 하기와 같이 나타낼 수 있다.
A-B-C-D (A: 고분자, B: 소광체, C: 펩타이드, D: 형광체)
상기에서, A는 전하와 작용기를 가지는 고분자이다. 구체적으로는, 생체 적합성을 갖는 모든 고분자가 사용될 수 있으며, 특히 세포 흡수 효율이 높으면서 생체친화적인 고분자를 사용할 수 있다. 질병 조직에 축적 효율이 높고 약물전달체로 사용되는 생체고분자인 덱스트란 (dextran), 키토산 (chitosan), 글라이콜 키토산 (glycol chitosan), 알부민, 히알루론산이나 이들의 화학적 유도체들 중에서 양전하와 작용기를 동시에 가질 수 있는 있는 것들을 제한없이 사용할 수 있다. 합성 고분자로서는 PEI (Polyethylenimine), PLGA (poly lactic glycolic acid) 그리고 폴리-L-라이신 (poly-L-lysine) 등을 사용할 수 있으나 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 히알루론산계 폴리머를 사용하였다.
상기에서, C는 펩타이드로서, 세포 사멸 과정에 핵심적인 시스틴(cystein)계 단백질 분해효소인 카스파아제에 의하여 선택적으로 분해된다.
상기에서, B는 펩타이드가 분해되지 않을 시에는 형광을 나타내지 않도록 하는 소광체이며, D는 펩타이드 분해서 형광을 나타내는 형광체이다. B(소광체)와 D(형광체)는 상기 C(펩타이드)에 결합된 형태로 제공된다. 소광체와 형광체가 펩타이드에 결합되어 있으므로, 펩타이드가 분해시 선택적으로 형광을 나타내는 것이 가능하다. D(형광체)로서, 형광공명 에너지 전이 (fluorescence resonance energy transfer, FRET)가 발생하는 것을 사용할 수 있다. 이때, 적색이나 근적외선 (near-infrared)의 형광을 발광하며 양자 거듭율(quantum yield)이 높은 형광체를 사용할 수 있다. 시아닌, 플루오레신, 테트라메틸로드아민, 보다피 등과 같은 각 형광체들은 서로 근접하였을때 광소광 (photo quenching) 효과가 발생하므로 사용하기에 좋다. 특히, 시아닌계는 근적외선 빛을 방출 및 흡수하므로 세포, 혈액 및 생체 조직 등과 간섭 혹은 흡수가 최소화되므로 사용하기에 적합하다. B(소광체)는, 형광을 소광시킬 수 있는 블랙홀 소광체 (blackhole quencher), 블랙베리 소광체 (blackberry quencher) 및 이들의 유도체 등을 사용할 수 있다.
상기 구조에서 알 수 있는 바와 같이, C(펩타이드)는 세포 사멸 과정에 핵심적인 시스틴(cystein)계 단백질 분해효소인 카스파아제에 의하여 선택적으로 분해되고, D(형광체)는 C(펩타이드)가 분해시 형광을 나타내지만, 펩타이드가 분해되지 않았을 때에는 D(소광체)의 형광물질에 대한 높은 소광 능력으로 형광이 발광하지 않은 상태로 존재하므로, 이와 같은 소광체와 형광체가 결합된 펩타이드를 포함하는 본 발명에 의한 나노 입자 전달체를 사용하여 세포 사멸 현상이 있는 부위의 선택적인 영상화가 가능하다. 구체적으로, 세포 투과 가능한 나노 입자들의 표면에 화학적으로 라벨링된 다크 소광체 형광 펩타이드는 세포계 내에서 프로브의 높은 특이성 및 민감성을 유도하고, 상기 나노 입자들은 세포 내로 효율적으로 프로브를 전달하며, 펩타이드 기질-중재 나노 입자의 형광 라벨링은 강하게 염료-다크 소광체 및 NIR 염료-염료 자가 소광 메카니즘 둘 다에 의하여 이중 소광된다. 특이적 카스파아제에 대한 Apo-NPs의 노출에 따라, 세포 사멸 동안에 일어나는 카스파아제 활성 과정은 특이적 기질 인식으로 인한 NIR 염료-기질을 절단한다. 이들 활성화된 NIR 염료는 형광 시그널을 생성하고, 세포 사멸 과정의 실시간 영상을 제공한다.
상기와 같은 구조를 같는 나노 입자 프로브와 카스파아제-3이 접촉하면, 카스파아제-3에 의한 특정 기질 인식으로 소광된 프로브의 절단이 일어나는데, 이로 인한 염료의 탈소광 (dequenching)에 의하여 형광체의 형광이 발현된다. 본 발명의 일 실시예에 의하면, 소광체 (BHQ 3)의 효율적인 NIR 형광 소광 및 Cy 5.5 염료의 자가 소광으로 인하여, 자가 조립된 나노 입자의 표면에 화학적으로 결합된 펩타이드 프로브는 강하게 이중 소광 상태가 된다. 카스파아제-3에 의한 기질 절단 후, NIR 형광 염료는 Apo-NPs로부터 절단되어 형광 시그널을 증폭시킨다.
본 발명의 이중 소광 상태의 펩타이드의 카스파아제에 의한 선택적 절단으로 인한 선택적 영상화 개념을 증명하기 위하여, 본 발명자들은 여러 카스파아제 효소 중에서 하나의 예로서 카스파아제-3에 의하여 활성 가능한 다크 소광된 펩타이드로 라벨링한 HA-APs를 제작하였는데, 그 하나의 일 실시예로서의 HA-APs은, Cy5.5-Cas에 의하여 절단 가능한 기질 펩타이드-BHQ-3와 같은 구성을 가질 수 있다. NIR 염료로서는 Cy5.5를 포함할 수 있고 (여기 및 방출 파장은 각각 675 nm, 695 nm), Cy5.5 (흡수 파장이 650 nm)에 특이적인 NIR 다크 소광체로서는 BHQ-3를 포함할 수 있다. 카스파아제-3에 의하여 절단 가능한 기질 펩타이드로서는 Asp와 Ala 사이에 인식 부위로서의 절단 위치를 갖는 펩타이드를 사용할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는, Gly-Asp-Glu-Val-Asp-Ala-Pro-Lys-Gly-Cys 을 포함하는 펩타이드를 사용하였다 (도 2A, 실시예 2 참조). 그 외, 카스파아제-3 인식 아미노산 서열로서 DEVD, GLPGDEVD, KKRLGLPGDEVD 등, 카스파아제-8 인식 아미노산 서열로서는 IETD, LETD, LDCGLETD,RGTELDCGLETD 등을 사용할 수 있다. 하지만, 상기 카스파아제-3 인식 아미노산 서열 중 DEVD의 경우, E와 V를 다른 아미노산으로 변경한 펩타이드를 사용할 수도 있으며, 그 외에도 카스파아제 효소에 의하여 특이적으로 절단될 수 있는 펩타이드 부위를 가진 것이면 제한없이 사용할 수 있다. 시스테인 잔기는 HA-NPs 표면의 말레이미드기를 통하여 펩타이드와의 티올 반응에 의한 특정 결합이 가능하도록 통합시켰다. Cy5.5-Cas3-BHQ-3와 FITC-Cas3의 펩타이드 서열, 비소광체간의 합성은 종래의 표준 금-상 Fmoc 펩타이드 화학 반응 방법으로 합성하였다. HA-NPs는, 양친매성 HA 컨쥬게이트를 상기 기술한 바와 같이, 히알루론산 폴리머 (HA) (234kDa)의 주쇄에 소수성 5β-콜란산 (CA)를 화학적으로 결합하여 합성함으로써 제조할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 치환 정도 (DS: HA 폴리머의 100 당 잔기당 CA의 수)는 약 5.6이다. 컨쥬게이트는 초음파 파쇄 하에서 수용액에서 자발적으로 자가 조립되어 나노 입자를 형성할 수 있다. HA-NPs의 표면은 추가로 1-에틸-3-(-3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC)와 설포-N-히드록시숙신이미드 (설포-NHS)의 존재 하에서 비스말레이미드 아민으로 개질할 수 있다. 상기 재료는 증류수에서 반복적으로 투석하고 동결건조할 수 있다. 상기 동결건조된 HA 컨쥬게이트는 인산 버퍼 (pH 6.5)에서 재분산시키고, 다크 소광된 형광 펩타이드로 효율적인 티올말레이미드를 통하여 라벨링할 수 있다. 상기 반응 혼합물은 증류수에서 투석하고, 센트리온-30 (Amicon)으로 농축시킬 수 있다. 상기 NPs는 추가로 크기 배제 컬럼을 사용하는 빠른 수행 액체 크로마토 그래피로 정제하고, 동결건조시켰다. NPs는 반응 버퍼 (50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 0.1% CHAPS, 10 mN 디티오트레이톨, 1 mM EDTA, pH 7.5)에서 분산시킬 수 있다. 다이나믹 빛 스캐터링 및 트랜스미션 전자 마이크로스코피는 상기와 같은 일 실시예의 방법으로 제조된 Apo-NPs가 구 모양이고, 그 직경은 대략 270 nm임을 보여준다 (도 3B).
한편, Kodak Image Station 4000 MN으로 가시화할 때, NIR 형광 시그널은 동일한 몰랄 농도의 해리 Cy 5.5 염료에 비하여 완전히 소광되었지만, 형광 시그널은 카스파아제-3에 의해 강하게 회복되었음을 알 수 있다 (도 4A). 이로써, 카스파아제-3에 의하여 본 발명에 의한 나노 프로브 내의 펩타이드가 특이적으로 절단되어 형광을 나타냄을 알 수 있다.
또한, 반응 버퍼와 60 nmol/L의 카스파아제-3, -8, 및 -9, 및 카스파아제-3을 포함하는 억제제 (Z-DEVD-FMK)와 함께 큐벳 (cuvette) 내에서 NPs (2 ㎍/mL)를 37℃에서 60분 동안 배양하여 시험관 내에서 Apo-NPs의 카스파아제 선택성을 측정하였다. 이로써, 카스파아제에 의하여 발생한 상기 NIR 형광 시그널이 명백하게 회복되는 것을 발견하였다 (억제제를 갖는 카스파아제-3, -8, -9, 및 카스파아제-3에 있어서 각각 14.7, 1.1, 1.7, 및 0.1-배, 도 2B). 더욱이, Apo-NPs는 회복된 형광 시그널 및 활성 카스파아제-3의 농도 사이에 비례 관계가 성립함을 알 수 있었다 (7.5, 15, 30, 60, 120 nmol/L; r2 = 0.99) (도 7). 이들 관찰은 단순히 광 형광 영상을 통하여 간단히 가시화될 수 있다 (도 3C).
그 외, Apo-NP가 생물학적으로 독성을 가지는지 여부를 조사하기 위하여, 세포 생존능력에서의 상기 Apo-NP의 효과를 시험하였는데, 상기 Apo-NP는 100 mg/mL까지의 농도에서 독성을 나타내지 않음을 알 수 있었다 (도 3D).
활성화된 카스파아제-3은 보통 세포질이나 세포의 핵 주변에서 관찰되기 때문에, 유용한 프로브는 세포 내 구획에 접근할 수 있도록 세포막을 가로지를 수 있는 것이어야 한다. 본 발명에 의한 Apo-NPs가 유용한 프로브로서 제공될 수 있는지 알아보기 위하여, 상기 Apo-NPs의 세포 내로의 흡수 특성을 종양 세포에서 모니터링하였다. 서로 다른 농도(10, 25, 50 mg/mL)의 비소광된 FITC-펩티드로 라벨링된 소태아혈청 (FBS)이 부족한 RPMI 1640 배지 내에서, Apo-NPs를 HCT116 인간 콜론 암 세포와 함께 30분 동안 배양하고 공초점 현미경으로 모니터링하였다 (도 3E). 모니터링 결과, 상기 Apo-NPs는 농도 의존적 방식 (녹색 형광)으로 대부분의 나노 입자는 세포질에 위치하고, 부분적으로는 핵 주위 구획에 위치함을 발견하였다. 이로써, 상기 Apo-NPs가 세포 내로 스며드는 것을 알 수 있었다. 세포 흡수 및 독성 검사를 기반으로, 상기 Apo-NP의 최적 농도는 20 ㎍/mL임을 알 수 있었다. 이 시스템에서 나타낸 Apo-NPs의 시험관 내 (in vitro) 확인은 실시간으로 세포 내 카스파아제-3 활성을 정량적으로 그리고 이미지로 분석하기 위하여 사용될 수 있다.
본 발명자들은, 세포 내에서의 Cy 5.5 NIR 형광 시그널을 비디오로 영상화하기 위하여 살아있는 세포를 영상 현미경 관찰하여 상기 Apo-NPs의 잠재적 용도를 조사하였다. HCT116 세포를 30분 동안 37℃에서, 최종 농도가 20 mg/mL인 FBS-free RPMI 1640 내에서 Apo-NPs와 함께 배양하였다. 상기 세포를 FBS-free RPMI 1640로 부드럽게 세척하고, 카스파아제-3을 FBS와 함께 RPMI 1640 내의 리간드를 유도하는 종양 괴사 인자 관련 세포 자살 (TRAIL)-유도된 세포 자살 (100 ng/mL)으로 활성화시켰다. 상기 세포는 또한, TRAIL 없이 카스파아제-3 억제제 및 TRAIL과 함께 배양하였다. 일한 배경 농도로 맞추고, 상기 세포를 매 3분마다 2시간 동안 영상화하였다. 처리 전, 낮은 배경 NIR 형광 시그널이 제공되는 Apo-NPs와 함께 세포를 배양하는데, 이로 인하여 살아있는 단일 세포 내의 세포 자살의 실시간 영상이 가능하다. TRAIL-중재 카스파아제-3의 활성에 따라, 상기 Apo-NPs는 강한 NIR 형광 시그널을 생성하고, 카스파아제-3-의존 세포 자살 과정의 명확한 가시화를 가능하게 한다 (도 4A와 도 6 참조). 전체적 NIR 형광은 배양 시간과 형태적 변화와 관련된 세포 사멸에 따라 증가하였다. TRAIL로 2시간 처리하는 동안, 상기 세포는 최대 NIR 형광 시그널을 갖는 위축, 눈접 (budding) 및 세포 사멸 몸체 형성을 나타내는 세포 사멸을 수행한다. 대조적으로, 낮은 형광 시그널을 생성하는 상기 Apo-NPs는 TRAIL 없이 2시간 배양에 따라 세포 내에서 변화한다(도 4B, 도 7). 낮은 형광 시그널을 제공하는 상기 Apo-NPs는 또한 카스파아제-3 억제제와 TRAIL을 포함하는 배양에따라 세포 내에서 변화하였다 (도 4C와 도 8). 상기 Apo-NPs를 이용한 세포 사멸의 빠른 검출을 증명하기 위하여, TRAIL로 처리한 HCT116 세포를 세포 사멸과 아넥신 V-FITC와 Apo-NPs로 염색한 프로브 활성을 평가하였다. TRaIL로 치료된 세포는 1시간 배양에 따라 양성 아넥신 염료을 산출하고, 반면, 상기 Apo-NPs는 가능한 빠르게 15분 동안 TRAIL로 배양 후 강한 NIR 형광 시그널을 제공하였다 (도 4D). 이로써, 상기 카스파아제-3을 표적하는 Apo-NP가 세포 사멸에 더욱 민감하고, 아넥신-V보다 더 빠른 검출 방법임을 알 수 있다. 상기와 같은 실험 데이터는, 본 발명에 의한 Apo-NPs가 단일 세포 수준에서의 세포 사멸을 실시간으로 영상화하는데 사용할 수 있다는 사실을 뒷받침한다.
생체 내 모델에서의 세포 사멸을 영상화하기 위한 Apo-NP의 효용을 나타내기 위하여, 본 발명자들은 NIR 형광 검출 (여기 및 방출 파장은 각 670 nm, 700 nm)을 위한 작은 동물 형광 토모그래피를 사용하여, 독소루비신으로 치료된 SCC7 종양 관련 마우스 내에서의 세포 사멸을 모니터하였다. 빠른 세포 사멸 과정을 영상화하기 위하여, 독소루비신으로 치료되거나 치료되지 않은 마우스에서의 카스파아제 활성을 30분 동안 모니터링 하였다 (각 치료에 대하여 n=3). 본 발명에 의한 Apo-NP (마우스당 PBS내 50 mg/50)를, 독소루비신으로 치료된 (Apo-NPs 주입 전, 10 mg/kg, 24 시간) 마우스 내의 종양 내로 주입하였다. 도 4A는 Apo-NPs의 주입 후, 독소루비신으로 치료되거나 치료되지 않은 종양 관련 마우스의 일반적인 NIR 형광의 일련의 이미지를 30분 동안 얻어서 나타낸 것이다. Apo-NP는 독소루비신으로 치료된 마우스 내의 높은 NIR 형광을 제공하고, 종양 내 세포 사멸의 명확한 가시화를 가능하게 한다. 대조적으로, 담체(vehicle)로 치료된 종양과 정상 조직의 형광 시그널은 약했다 (도 5A). 각 케이스에 대한, 시간에 따른 종양과 정상 조직 내의 총 광자 계산을 도 5B에 나타냈다. 세포 사멸 종양 및 정상 조직 사이의 증가된 NIR 형광 강도비율은 Apo-NPs의 주입 후, 5분 뒤 검출하였다. 이 비율은 30분에 4± 1.3까지 증가하였지만, 비세포 사멸적 종양 조직은 정상 조직의 시그널에서와 같은 확연한 차이는 나타나지 않았다. 세포 사멸 종양 영역 내의 NIR 형광 시그널의 추가 측정을 위하여, 종양 및 정상 조직을 Kodak Image Station을 사용하여 생체 내 영상화 및 분석 후 즉시 절단하였다 (도 5C). 활성화된 신호는 특별히 세포 사멸 종양 내에서 특별히 검출되는데, 생체 외 이미지는 살아있는 마우스 내에서 획득한 이미지와 거의 일치하였다. 최종적으로, NIR 형광 시그널이 세포 사멸로 인한 것임을 명확히 하기 위하여, 세포 사멸을 감지하는 TUNEL 면역조직학 어세이에 의하여 조직을 수집 및 분석하였다. 예상한 바와 같이, TUNEL 시그널 (녹색 형광)은 독소루비신으로 치료된 마우스의 종양 내에서 강하게 발견되고, 높은 세포 사멸 지수 (AI)를 나타냈다 (AI는 총 세포 수에 사멸 세포 수를 나누어서 계산하였다, 종양/(+)DOX, 종양/(-)DOX, 정상 조직에 대한 AI는 각각 32.8 ± 11.7, 10.5 ± 1.9, 1.5 ± 1.2%이고, 보충 정보는 도 8에 나타냄). 또한, NIR 형광 현미경 관찰 영상은 생체내 영상과 일치하는 각 그룹 간의 확연한 차이를 나타냈다 (도 5D). 상기 실험 데이터는, 본 발명에 의한 Apo-NP가 단일 세포와 살아있는 동물 내의 세포 사멸의 실시간 NIR 형광 영상화에 사용될 수 있음을 나타낸다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 카스파아제는 세포 사멸을 위한 직접적인 마커로서 유용하며, 본 발명에 의한 Apo-NP에 따른 세포 사멸의 실시간 영상은 치료 전 및 치료 적용에 이용할 수 있음을 알 수 있다. 본 발명자들은, 상기에 기술한 바와 같이, 생체 적합성이 있고, 세포 투과성이며, 고분자 나노 입자계 및 세포 사멸의 이른 징후를 나타낼 수 있는 카스파아제-3에 민감한 나노 프로브를 발견하였다. TRAIL와 독소루비신으로 유도된 세포 사멸 시스템을 사용하여, 카스파아제-3-활성은 단일 세포 농도 및 마우스 모델 내에서 직접적으로 실시간 가시화될 수 있다. NIR 염색과 낮은 배경 및 강한 형광 시그널 증폭을 제공하는 이중 소광 메카니즘의 복합, 따라서, 세포 사멸 과정의 명확한 시각적 영상을 가능하게 한다. 이 시스템은 카스파아제 활성 내에서의 역학적 변화를 모니터 하는데 사용할 수 있고, 세포계 시스템과 생체 내 모델 내에서의 세포 자살 약제의 스크리닝을 용이하게 한다. 상기 Apo-NP 고안 플랫폼은 유연하고 카스파아제-cascade 반응의 실시간 영상을 위한 기타 특이적 카스파아제 프로브의 개발에 연장될 수 있다. 또한, 이 전략은 영상화 및 치료를 모두 가능하게 하기 위하여 NIR 염색을 갖는 화학치료 약제를 보충함으로써 카스파아제 활성가능한 치료진단제의 개발을 가능하게 한다. 생체 외 및 생체 내에서의 사용을 위한 이 나노 플랫폼의 개발에서의 연구의 다양성은 현재 진행중이다.
실시예 1. 세포 사멸 특이적 나노 프로브 (Apo-NP)에 포함되는 카스파아제-3에 의하여 활성화되는 펩타이드의 합성
NH2-Gly-Asp(tBu)-Glu(tBu)-Val-Asp(tBu)-Ala-Pro-Lys(Boc)-Gly-Cys(Trt)-OH인 펩타이드 서열은 표준 고체상 Fmoc 펩타이드 화학법으로 합성하였다. 그 후, 상기 펩타이드 레진 및 Cy5.5 숙신이미드 에스테르 (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ, USA)로부터 절단한 마지막 Fmoc 그룹을 N-말단 글리신에 결합하였다. TFA/EDT/TIPS/물 (90/5/2.5/2.5)을 사용하여 펩타이드를 탈보호한 후, 무수 DMF 내에서 BHQ-3 숙신이미드 에스테르 (Biosearch Technologies, Novato, CA, USA)를 밤새 반응시켰다. 소광되지 않은 형태를 위하여, FITC-헥사노익산 숙신이미드 에스테르 (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 상기 펩타이드에 결합시키고, 상기 기술한 바와 같이 제조하였다. 반조제용 역상 고속 액체 크로마토그래피 (semi-preparative reversed-phase high liquid chromatography; RP-HPLC)로 모든 펩타이드를 정제하고 분석 RP-HPLC와 MALDI-TOF 질량 분석기로 분석하였다.
Apo-NP: 히알루론산계 폴리머 나노 입자들 (HA-NPs)을 도 1에 나타낸 바와 같이, 카스파아제-3 활성 펩타이드와 함께 화학적으로 컨쥬게이트시켰다. 물에 용해되는 히알루론산 폴리머 (HA, Mw = 67 kDa, Lifecore Biomedical, Chaska, MN, USA)를 하이드로포빅 5β-콜란산으로 화학적으로 개질하였다 (참고문헌 14, 15 참조). 5β-콜란산은, 하기와 같이 HA의 카르복실산과 함께 반응할 수 있는 아미노에틸 5β-콜라노아미드 (EtCA)로 전환시켰다. 5 ml의 메탄올 내에 5β-콜란산 (1g, 2.8 mmol)을 용해시켜서, 농축된 히알루론산 (180 ㎕, 4.9 μ몰)에 첨가하였다. 상기 용액을 600C 환류 하에서 6시간 동안 교반하였다. 이어서, 냉각시키고 막 필터 (공극 크기: 0.45 μm, Millipore)로 정제하고, 차가운 메탄올로 세척하였다. 5β-콜란산 메틸 에스테르를 얻기 위하여 진공 하에서, 상기 생성물을 실온에서 건조시켰다. 이어서, 5β-콜란산 메틸 에스테르를 에틸렌디아민 내에 용해시키고 130C에서 6시간 동안 환류시켰다. 침전이 생성될 때까지 상기 용액을 실온에서 냉각시켰다. 흰색 침전물을 막 필터 (공극 크기: 0.45 μm, Millipore)로 정제하고, 물로 완전히 세척하고 진공 내에서 건조시켰다. 생성된 아미노에틸 5β-콜라노이미드 (EtCA)를 N0하이드록시숙신이미드 (NHS) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보이미드 하이드로콜로라이드 (EDAC)의 존재 하에서 HA의 백본에 화학적으로 결합(컨쥬게이트)시켰다. 친수성 HA 폴리머 (600 mg, 9 μmol)와 EtCA (133 mg, 309 μmol)를 100 ml의 에탄올/증류수(1:1) 내에 용해시켰다. NHS와 EDAC (EtCA의 4 등가물)를 첨가하여 화학 반응을 개시하였다. 상기 용액을 1일 동안 실온에서 교반하고, 이어서 3일 동안 먼저 메탄올로, 물/메탄올 그리고 마지막으로 증류수에서, 투석 튜브 (분자량 cut off ~ 10 kDa)를 사용하여 투석시켰다. 다음으로, 해리 EtCA를 제거하기 위하여 30분 동안 상기 용액을 10,000× g에서 원심분리하고, 이어서 고체 백색 분말이 생성되도록 감압하에서 동결 건조시켰다. 컨쥬게이트 내의 상기 EtCA 내용물은, D2O/CD3OD (1 v/ 1 v) 내의 1H NMR를 사용하여 측정하였다. 두 번째로, 상기 HA-EtCA 컨쥬게이트 (25 mg, 348 nmol)를 프로브형 소니케이터 (5분 동안 90 W에서, Ultrasonic Processor, GEX-600)를 사용하여 25 mL의 PBS 버퍼 (pH 5.0, 100 mM) 내에서 분산시키고, 생성된 HA-NPs를 비스-말레이미드 아민과, EDAC와 설포-NHS의 존재 하에서 티올-반응성 말레이미드기로 개질화시켰다. 요약하여, 인산 버퍼 (pH 5.0, 4mL)에서 용해시킨 HNPs (25mg, 348 nmol)를 인산버퍼 (pH 5.0, 0.5ml)에서 용해시킨 EDC (3 mg, 15.6 μmol) 에 첨가하였다. 30분 동안 상기 용액을 교반하고, 1N NaOH를 첨가하여 pH를 7로 조정하였다. 인산 버퍼 (pH 7.0, 0.5ml) 내에 용해시킨 설포-NHS (5 mg, 23 μmol)를 첨가하고, 이어서 인산 버퍼 (pH 5.0, 4ml) 내에 용해시킨 비스-말레이미드 아민 (8mg, 12.1 μmol)를 10분 후에 첨가하였다. 상기 용액을 2시간 동안 교반하고, 투석 튜브 (분자량 cut off ~ 10 kDa)를 사용하여 다량의 증류수로 투석하고, 이어서 HNP-비스-말레이미드 컨쥬게이트 (HA-NP-BisMal)를 얻기 위하여 감압하에서 동결건조시켰다. 마지막으로, 상기 카스파아제-3 활성화된 펩타이드를 HA-NP-bisMal 컨쥬게이트에 화학적으로 결합시켰다. 요약하여, 다크 소광된 플루오로제닉 펩타이드, Cy5.5-Cas3-BHQ-3 (3 mg, 1.23 μmol)를 PBS (pH 6.5) 내의 200 μL의 50% DMSO (v/v) 내에 용해시켰다. 상기 펩타이드를 나노 입자 용액에 첨가하고, 실온에서 6시간 동안 빛 없이 상기 반응을 수행하였다. 부산물과 반응하지 않은 펩타이드 분자를, 2일 동안 증류수 (분자량 cut off = 10 kDa, Spectrum)으로 투석하여 제거하고, Amicon Ultracell-10K (Millipore)으로 농축시켰다. 바람직한 세포 사멸 특이적 나노 프로브 (Apo-NP)를 고속 액체 크로마토그래피 (The GE AKTA Purifier System), Superdex TM200 10/300GL (용출 PBS, pH 7.4, 0.7 ml/분)를 사용한 크기 배제 크로마토그래피로 추가 정제하고, 감압하에서 동결 건조시켰다 (도 7). 폴리머 나노 입자 표면에 결합한 펩타이드 양을 적정하기 위하여 UV-Vis 스펙트로미터를 사용하여 흡수 적정 (absorption titration)을 수행하였다. BHQ-3 (650 nm)의 흡수 강도를 눈금을 매기고, 결합 펩타이드 기질의 농도를 표준 커브의 알려진 농도로부터 결정하였다. Apo-NPs의 FPLC 프로파일은 도 7에 나타냈다.
상기 Apo-NPs에 결합한 펩타이드 양을 적정하기 위하여 UV-Vis 스펙트로미터를 사용하여 흡수 적정 (absorption titration)을 수행하였다. 200 kV에서 작동하는 JEOL 200CX 마이크로스콥을 사용하여 TEM을 수행하였다. F-7000 형광 스펙트로광미터 (Hitach, Japan)로 형광 시그널을 검출하였다. 여기 파장을 675 nm에 고정시키고 방출 스펙트라를 37℃, 680 nm 내지 800 nm에서 기록하였다. Kodak Image Station 4000MM Digital Imaging System (Carestream Health, New Haven, CT)를 사용하여 시험관 내에서 NIR 형광 이미지를 얻었다. 상기 Apo-NP의 효소 특이성은 반응 버퍼 (50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 0.1% CHAPS, 10 mM 디티오트레이톨, 1 mM EDTA, pH 7.5) 내에서 억제제 (Z-DEVD-FMK, 100 mM)를 갖는 적절한 농도의 카스파아제-3, 카스파아제-8, 카스파아제-9와 함께 1 mL 큐벳 내에서, 1시간 동안 37℃에서 Apo-NP (2 mg/mL)와 공동 배양하여 시험하였다.
실시예 3. 시험관 내 효소 특이성
상기 Apo-NP는, 회복된 형광 시그널과 서로 다른 농도의 카스파아제-3 (0, 7.5, 15, 30, 60 및 120 nmol/L) (r2 = 0.99) 간의 비례 관계를 나타냈다 (도 8). 여기 파장은 675 nm으로 고정시키고, 방출 스펙트라는 680 내지 800에서 1mL 큐벳을 사용하여 37℃에서 기록하였다.
실시예 4. 세포 배양
HCT116 세포 (ATCC, Manassas, VA)를 10%의 FBS와 1%의 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 RPMI1640 배지 (Gibco, Grand Island, NY)에서, 37℃, 5%의 CO2에서 배양하였다. MTT (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드) 어세이로 세포 독성을 평가하였다. 요약하면, 96-웰 플레이트에 세포를 접종하고, 40분 동안 MTT로 배양하기 전에 다양한 농도의 Apo-NP (0 내지 100 mg/mL)를 24시간 동안 배양하였다. 디메틸 설폭시화물을 사용하여 포르마잔 생성물을 용출하고, 마이크로플레이트 리더기를 사용하여 흡광도를 570 nm에서 기록하였다. 세포 생존도는 대조군 세포 배양과 비교하여 %로 측정하였다.
실시예 5. 현미경으로 세포 사멸 관찰
현미경 가시화를 위하여, 세포를 12-웰 플레이트 (웰당 1× 105 세포) 내의 35 nm의 젤라틴으로 코팅된 커버 슬립 위에 접종하고, 80% 융합할 때까지 생장하도록 하였다. 시험관 내 연구 전, PBS로 2번 세포를 세척하였다. Apo-NPs의 세포 uptake를 평가하기 위해서, HCT116 안정한 세포 배양을 비소광된 FITC로 라벨링화된 NPs (10, 20 및 50 mg/mL)로 RPMI 1640 배지 w/o FBS 내에서, 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. 세포를 ice-cold PBS (pH 7.0)로 2번 세척하고, Fluoromount-GTM(SouthernBiotech, Birmingham, AL)로 계수한 뒤, 신선한 4%의 파라포름알데하이드로 5분간 고정시켰다. 상기 NPs의 세포 내 위치 추정은 여기 및 방출 파장이 각 673 nm과 692 nm인 IX81-ZDC 포커스 드리프트 보정 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)를 사용하여 가시화하였다. 카스파아제-3 중재 세포 사멸을 유도하기 위하여, HCT116 세포를 RPMI 1640 배지 w/ 10% FBS 내의 최종 농도가 100 ng/mL인 TRAIL (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN)에 두었다. 제조자의 프로토콜에 따라, 카스파아제-3 저해제를 100 mM의 Z-DEVD-FMK (R&D Systems Inc.)와 함께 공동 배양하였다. 살아있는 세포는 IX81-ZDC로 가시화하였다. 세포를 35 nm 유리바닥 디쉬에 접종하고, 온도와 CO2가 조절되는 현미경 챔버에 두었다. 냉각된 하전-결합 장치 비디오 카메라 (CoolSNAPTM fxCCD camera, Photometrics, Tucson, AZ)로 영상을 2시간 동안 3분 간격으로 수집하였다. 미분 간섭 (ifferential interference contrast; DIC) 이미지와 NIR 형광을 얻기 위하여, 각각 40ms와 5,000 nm에 세포를 노출시켰다. 아넥신으로 세포 사멸을 측정하기 위하여, PBS로 세포를 2회 세척하고 아넥신-V-FITC 형광 현미경 키트 (BD Bioscience, San Jose, CA)를 사용하여 0.5 mg/mL의 아넥신 V-FITC으로 15분간 암흑에서 배양하였다. binding buffer로 세척한 후, 세포를 IX81-ZDC 하에서 관찰하였다.
실시예 6. 동물 광학 이미징
10%의 소태아혈청을 함유하는 RPMI 1640 배지 내에서 배양한 SCC7 세포 (1 106 세포/mouse)를 비흉선 누드 마우스 (nu/nu, 7 주, 20-25g)의 등 피하에 주입하였다. 종양 부피가 대략 7mm2에 도달할 때, 종양이 이식된 마우스의 꼬리 정맥에 독소루비신 (10 mg/kg)을 주입하고, Apo-NP (50 mg/kg)를 종양 내로 주입하였다. eXplore Optix 시스템 (ART Advanced Research Technologies Inc., Montreal, Canada)으로 NIR 형광 이미지를 얻었다. Apo-NP의 주입 후, 30분 동안 이미징을 수행하고, Analysis Workstation (ART Advanced Research Technologies Inc.)로 이미지를 평가하였다. 20개의 슬라이드 이미지와 총 photon counts를 포함하는 모든 데이터를 analysis Workstation software의 관심 영역 (region of interest; ROI) 기능을 사용하여 계산하였다. 수치는 5개의 동물 그룹에 대하여 ± SD로 나타냈다.
실시예 7. 조직학적 분석 ( Histological analysis )
조직학적 분석을 위하여, 해부한 기관을 회수하고 완충시킨 4 % (v/v)의 포르말린 용액으로 고정시키고, 에탄올로 탈수시키고, 파라핀 내에 삽입 (embedded)시켰다. 파라핀 조직을 6 mm 두께로 절단하였다. 종양 세포 내의 사멸 세포를 DeadEnd Colorimetric Terminal Deoxynucleotidyl Transferase Mediated dUTP Nick-End Labeling (TUNEL) 시스템 (Promega, Corp., Madison, WI, USA)을 제조업자의 프로토콜에 따라 사용하여 평가하였다. 각 슬라이드의 4개의 높은 power fields와 각 동물의 3개의 슬라이드를 조사하였다. 세포 사멸 지수를 field 내의 세포의 총 수에 대하여 사멸 세포의 수를 나누어 계산하였다 (도 9).
형광 시그널을 관찰하기 위하여, 상기 기관들을 해부하고, 4% 포름알데하이드 용액에서 10분간, 실온에서 고정시키고, OCT 배지 (Miles Inc., Elkhart, IN, USA)에 삽입하였다. 아이스 배쓰오 ktprtus (두께 10 μm)에 의해 동결시킨 기관을 저온 유지 장치에서 절단하였다. 형광 현미경 (Axioskop2-FS, Carl Zeiss, Inc, Thornwood, NY, USA)을 사용하여 형광을 관찰 (여기: 673 nm, 방출: 692 nm)하였다 NP-처리된 종양 및 조직을 TUNEL 으로 염색하고, 사멸 세포 지수를 계산하였다 (도 9 참조).
상기에서 살펴본 바와 같이,“고분자-소광체-카스파아제-3의 인식 부위를 갖는 펩타이드-형광체”로 구성되는 본 발명에 의한 나노 입자 프로브는 수용액 상에서 나노 입자를 형성할 수 있으며, 세포 사멸이 일어나는 부위에서 특이적으로 형광을 나타낼 수 있으므로, 실시간으로 세포 사멸을 영상화하는 것이 가능하다.
따라서, 본 발명에 의한 나노 입자 프로브는 치매, 허혈 등과 같은 퇴행성 질병, 자가 면역 질환, 암의 진단 또는 상기 질병에 유용한 약물 등을 탐색하는데 있어서 적용할 수 있다는 장점이 있다.
참조문헌
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Claims (6)

  1. 고분자(A)와, 소광체(B)와 형광체(D)를 갖는 펩타이드(C)가 연결된 하기 구조의 고분자 세포 사멸 나노 입자 조영제로서, 상기 펩타이드(C)는 시스틴계 단백질 분해효소인 카스파아제에 의하여 선택적으로 절단되는 잔기를 포함하는 것인, 세포 사멸 특이적 나노 입자 조영제.
    A-B-C-D
    (상기에서, A는 고분자이고, B는 소광체, C는 펩타이드, D는 형광체이다)
  2. 제1항에 있어서, 상기 고분자 (A)는 키토산 (chitosan), 글라이콜 키토산 (glycol chitosan), 프로타민 (protamine), 폴리 라이신 (polylysine), 폴리 아르기닌 (polyarginine), 폴리에틸렌이민 (polyethylenimine) 고분자 및 그 유도체와; 덱스트란(dextran), 히알루론산(hyaluronic acid), 알부민(albumin)의 유도체들 중에서 양전하와 작용기를 동시에 가질 수 있는 고분자 중에서 선택된 것인, 세포 사멸 특이적 나노 입자 조영제.
  3. 제1항에 있어서, 펩타이드(C)는 카스파아제에 의하여 특이적으로 절단되는 것인, 세포 사멸 특이적 나노 입자 조영제.
  4. 제1항에 있어서, 상기 소광체(B)는 NIR 다크 소광체나 블랙홀 소광체 (BHQ-3)이고, 상기 형광체(D)는 시아닌, 플루오레신, 테트라메틸로드아민 및 보다핀 중에서 선택된 것이 사용되는 것인, 세포 사멸 특이적 나노 입자 조영제.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 세포 사멸 특이적 나노 입자 조영제는, 생체 내 세포의 사멸을 실시간으로 관찰하기 위하여 사용되는 것인 세포 사멸 특이적 나노 입자 조영제.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 세포 사멸 특이적 나노 입자 조영제를 포함하는 항암제.
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