KR20120089913A - 다중영상화를 위한 금속 나노입자 및 그 용도 - Google Patents

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Abstract

글라이콜 키토산 (glycol chitosan)이 코팅된 금 나노입자, 펩타이드, 및 형광물질을 포함하는 단백질 분해 효소 검출용 나노센서, 이를 포함하는 컴퓨터 단층 촬영용 조영제, 이를 이용하는 진단 기술, 및 약물 전달 기술에 관한 것이다.

Description

다중영상화를 위한 금속 나노입자 및 그 용도{Metal Nano-particle for Multi-modal Imaging and Use thereof}
글라이콜 키토산 (glycol chitosan)이 코팅된 금 나노입자, 펩타이드, 및 형광물질을 포함하는 단백질 분해 효소 검출용 나노센서, 이를 포함하는 컴퓨터 단층 촬영용 조영제, 이를 이용하는 진단 기술, 및 약물 전달 기술에 관한 것이다.
단백질 분해효소는 비가역적인 펩타이드 결합의 가수분해를 통하여 단백질들의 활성이나 운명을 조절한다. 생리활성 물질의 분해를 통하여 넓은 범위에서 다양한 세포기능을 조절하는 역할을 하게 되기 때문에 모든 생명체의 생명현상에 대한 단백질 분해효소의 기능적 관련성은 매우 중요하다. 만약 시공간적으로 단백질 분해효소가 부족하거나 과다 발현될 경우 암, 관절염, 퇴행성 신경질환, 심혈관계 질환 같은 중대한 질환으로 나타날 수 있다. 예로, matrix metalloprotease(MMP)는 과거 세포 및 체내에서 extracellular matrix를 분해하는 인자로 인식되었지만, 다양한 연구를 통해 이들이 integrin 신호전달 과 pericellular matrix의 분해에 따른 세포 운동에 관련되어 있음이 밝혀졌다.
또한 MMP는 암세포의 침윤, 전이에 중요한 역할을 담당하고 있음이 밝혀져 MMP를 표적으로 한 신약 개발이 선진국 거대 제약회사를 중심으로 다양하게 이루어지고 있다. 따라서 단백질 분해 효소와 그의 기질 단백질은 신약개발의 주요 표적이며, 여기에 제약업계에서 지대한 관심을 가지고 있다. 그러나, 특이적인 단백질 분해효소의 활성 및 발현 양을 정량적으로 영상화하여 분석하거나, 생체 내에서 단백질 분해효소 발현 정도를 비침습적으로 영상화 하는 기법이 전무하여 관련 기술개발이 시급한 실정이다.
현재 이용되고 있는 대표적인 단백질 분해효소의 측정 방법은 2-D 젤과 다단계 액체 크로마토그래피 방법, The Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) 방법, 또는 단백질 분해효소에 특이적으로 분해되는 펩타이드기질에 형광물질을 결합하여 spectroscopy로 peak shift 정도를 측정하는 방법 등이 있다. 그러나 이러한 방법들은 다단계의 측정 프로토콜이 필요하여 신약개발과 같이 많은 약물을 스크리닝하는데 이용하기는 효율적이지 못하다.
또한, 위와 같은 방법은 특정 단백질 분해효소의 발현을 체내에서 탐지하거나 발현 양을 정량적으로 분석하여 질병 조기진단에 이용하기는 불가능 하다. 이러한 효소의 작용을 연구하는데 있어서 분자 수준의 영상화 기술이 필요한데 이 기술은 현재 연구개발 단계에 있으며 분자영상기술에 있어서 가장 중요한 것은 바로 분자영상 센서 물질의 개발이다. 하지만 이런 센서물질의 수가 턱없이 적기 때문에 효소의 작용을 연구하는데 한계가 있다.
또한 기존의 CT 영상화 기술은 저렴하고 3차원의 해부학적 이미지를 얻을 수 있는 장점이 있는 반면, X-ray를 이용하기 때문에 뼈와 같은 단단한 조직만 이미지 할 수 있을 뿐, 심장, 혈관 등의 장기 같은 연조직은 CT 조영제를 이용할 수 밖에 없다. 기존의 요오드를 사용하는 CT 조영제는 체내에서 빠르게 배출되고 장기에 잘 흡수되지 않아 연조직의 조영시간이 짧거나 조영효과가 없는 경우가 많으며 독성을 가지고 있는 한계가 있다. 또한 질병에 대한 표적성이 없기 때문에 CT를 이용해서 암 등의 원하는 질병을 선택적으로 이미지화하는 것은 더욱 불가능한 실정이다.
이에, 본 발명은 분자영상 기술을 이용한 효소의 작용을 영상화하는 방법을 제시하고, 기존의 CT 조영제가 가진 문제를 해결할 수 있는 새로운 조영제를 제시하는 동시에, 나아가 이 둘을 결합하여 시너지 효과를 창출함으로써 효소의 작용의 민감하게 측정하는 동시에 CT를 통해 정확한 해부학적 데이터를 얻을 수 있는 센서 물질을 개발하고자 한다.
본 발명의 일례는 글라이콜 키토산 (glycol chitosan)이 코팅된 금 나노입자, 펩타이드, 형광물질, 및 선택적으로 소광물질을 포함하는 단백질 분해 효소 검출용 나노센서를 제공한다.
또 다른 예는 상기 단백질 분해 효소 검출용 나노센서를 포함하는 컴퓨터 단층 촬영용 조영제를 제공한다.
또 다른 예는 상기 단백질 분해 효소 검출용 나노센서를 이용하는 단백질 분해 효소 검출 방법을 제공한다.
또 다른 예는 상기 단백질 분해 효소 검출용 나노센서를 이용하는 단백질 분해 효소 관련 질환의 진단에 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또 다른 예는 단백질 분해 효소 검출용 나노센서를 이용하는 암세포의 영상화 방법을 제공한다.
또 다른 예는 금염을 글라이콜 키토산과 반응시켜 환원시키는 단계를 포함하는 금 나노입자의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 예는 표면에 글라이콜 키토산이 코팅된 금 나노입자, 또는 상기 금 표면의 글라이콜 키토산에 펩타이드가 결합된 형태의 금 나노입자의 약물 전달체로서의 용도를 제공한다.
본 명세서에서, 특별한 언급이 없으면, 금 나노입자는 금염을 글라이콜 키토산과 반응시켜 환원시킴으로써 금 표면에 글라이콜 키토산이 코팅된 형태로 얻어지는 입자를 의미하며, 나노센서는 상기 금 나노입자에 펩타이드와 형광체, 선택적으로 소광체가 결합된 형태를 의미한다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
상기 단백질 분해 효소는 생체 내 또는 세포 내에서 발현되는 모든 종류의 단백질 분해 효소로부터 선택된 것일 수 있으며, 예컨대, 매트릭스 메탈로프로티나아제(matrix metalloproteinases, MMP), 카스파아제(caspase), 트롬빈 (Thrombin), 프로테아좀(proteasome) 카텝신 (cathepsin) 및 트립신 (trypsin) 등과 같이 생체 내 또는 세포 내에서 특정 펩타이드 기질을 분해할 수 있는 단백질 분해 효소일 수 있다. 상기 단백질 분해 효소는 척추동물, 바람직하게는 포유류로부터 유래하는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 구체예에 있어서, 상기 MMP는 (MMP-2 [EC 3.4.24.24] MMP-3 [EC 3.4.24.17], MMP-7 [EC 3.4.24.23] 및 MMP-9 [EC 3.4.24.35])로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있고, 상기 카스파아제는 (caspase-1 [EC 3.4.22.36], caspase-2 [EC 3.4.22.55], caspase-3 [EC3.4.22.56], caspase-4 [EC 3.4.22.57], caspase-5[EC 3.4.22.58], caspase-6 [EC 3.4.22.59], caspase-7 [EC 3.4.22.60], caspase-8 [EC 3.4.22.61], 및 caspase-9 [EC 3.4.22.62])로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으며, 상기 트롬빈은 (Thrombin [EC 3.4.21.5])로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있고, 상기 프로테아좀은 (proteasome endopeptidase complex [EC 3.4.25.1] 및 proteasome ATPase [EC 3.6.4.8])로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있고, 상기 카텝신은 (cathepsin B [EC 3.4.22.1], cathepsin D [EC 3.4.23.5], cathepsin G [EC 3.4.21.20]) 로 이루어진 군에서 선택된 것일 수도 있고, 상기 트립신은 (trypsin [EC 3.4.21.4], chymotrypsin [EC 3.4.21.1]) 로 이루어진 군에서 선택된 것일 수도 있다.
또한 펩타이드는 상기의 단백질 분해 효소에 의하여 특이적으로 분해되는 인식 부위 (절단 부위)를 갖는 모든 펩타이드일 수 있으며, 구체적으로, 검출 대상 단백질 분해 효소의 특이적인 인식 부위 (절단 부위)와 나노 입자의 표면에 결합할 수 있는 작용기 (예컨대, 티올기 (-SH), 카르복시기 (-COOH), 아민기 (-NH2), DOPA (3,4-dihydroxyphenylalanine) 등)를 포함할 수 있고, 9 내지 15 개의 아미노산 길이의 펩타이드일 수 있다. 상기 단백질 분해 효소의 특이적인 인식 부위는 본 발명이 속하는 기술 분야에 널리 알려진 사항이다. 예컨대, 검출하고자 하는 단백질 분해 효소가 MMP인 경우, 인식 부위는 (Pro-Leu-Gly↓Val-Arg) ('↓'는 끊어지는 부분임, 이하 동일함)일 수 있고, 카스파아제인 경우, 인식 부위는 (Gly-Asp-Glu-Val-Asp↓Ala-Pro)일 수 있고, 트롬빈인 경우, 인식 부위는 (Phe-Pip-Arg↓Ser) (Pip=pipecolic acid) 일 수 있고, 카텝신-B인 경우, 인식 부위는 (Gly-Gly-Arg-Arg↓Gly-Gly) 일 수 있고, 트립신인 경우, 인식부위는 (Arg↓, Lys↓)일 수 있다.
따라서, 본 발명에 사용되는 펩타이드는 Pro-Leu-Gly-Val-Arg(SEQ ID NO: 1), Gly-Asp-Glu-Val-Asp-Ala-Pro(SEQ ID NO: 2), Phe-Pip-Arg-Ser(Pip=pipecolic acid)(SEQ ID NO: 3), Gly-Gly-Arg-Arg-Gly-Gly(SEQ ID NO: 4), Arg, 또는 Lys를 포함하는 9 내지 15로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 길이의 펩타이드일 수 있으며, 예컨대, 검출 대상 단백질 분해 효소가 MMP인 경우, 상기 펩타이드는 'Gly-Pro-Leu-Gly-Val-Arg-Gly-Lys-Gly-Gly (SEQ ID NO: 5)'의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있고, 카스파아제인 경우 상기 펩타이드는 'Gly-Asp-Glu-Val-Asp-Ala-Pro-Lys-Gly-Gly (SEQ ID NO: 6)'일 수 있고, 트롬빈인 경우, 상기 펩타이드는 'Gly-Phe-Pip-Arg-Ser-Gly-Gly (Pip=pipecolic acid) (SEQ ID NO: 7)'일 수 있고, 카텝신-B인 경우, 상기 펩타이드는 'Gly-Gly-Arg-Arg-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 8)'일 수 있다. 또한 나노센서에 결합하는 작용기의 종류에 따라 펩타이드 말단 또는 중간에 시스테인 (Cysteine)이 포함될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 나노센서는 상기 펩타이드의 N 말단에 형광물질이 결합되어 있고 C 말단이 금 나노입자 표면에 코팅된 글라이콜 키토산과 결합되어 있는 구조를 갖는다 (형광물질-N-펩타이드-C-금 나노입자 표면의 글라이콜 키토산-금 나노입자).
상기 형광물질은 금 나노입자와 결합하여 소광효과를 나타낼 수 있는 모든 종류의 형광물질일 수 있으며, 예컨대, 시아닌 (Cyanine) 계열의 형광물질 (Cy2, Cy3, Cy5, Cy5.5 및 Cy7), Alexa 계열의 형광물질 (Alexa Fluor 350 ~ Alexa Fluor 790), DyLight 계열의 형광물질 (DyLight 350 ~ DyLight 800), 로드아민 (rhodamine) 계열의 형광물질 (Rhodamine B, rhodamine 6G, rhodamine 123, TMR, TAMRA, TRITC), 플루오레신 (fluorescein) 계열의 형광물질 (5-IAF, FITC), 보디피(BODIPY), 다피 (DAPI) 텍사스레드 (Texas Red) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 형광물질은 상기 펩타이드의 양 말단 중 금 나노입자 표면에 결합되어 있지 않은 말단에 결합될 수 있다.
본 발명의 나노센서는 형광물질에 대한 소광 효과를 보다 증진시키고 극대화시키기 위하여, 소광물질을 추가로 포함할 수 있다. 사용 가능한 소광물질은 사용된 형광물질에 따라서 적절하게 선택될 수 있는 것으로, 예컨대, BHQ (black hole quencher, BHQ-1, BHQ-2 및 BHQ-3) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 소광물질은 상기 펩타이드의 형광물질이 결합된 말단에 근접한 아미노산 잔기에 결합되어 있으며, 상기 소광물질이 결합된 아미노산 잔기는 상기 펩타이드 상의 단백질 분해 효소 인식 부위와 형광물질이 결합된 말단의 반대쪽 말단까지의 아미노산 중에서 선택된 것일 수 있다. 예컨대, 상기 소광물질은 상기 펩타이드 상에서 형광물질이 결합된 말단으로부터 3 내지 10개, 바람직하게는 3 내지 8개의 아미노산 개수만큼 떨어진 아미노산 잔기에 결합된 것일 수 있다.
한 구체예에서, 일반적으로 잘 알려진 Fmoc 합성 방법으로 제조된 protected 펩타이드에 EDC/NHS(1-Ethyl-3-[3-dimethyl amino propyl] carbodiimide hydrochloride/N-hydroxy succinimide)를 이용하여 형광체를 합성한 후 펩타이드를 deprotection 한다. 이후 마찬가지로 EDC/NHS를 이용해 소광체를 합성한다. 이렇게 제조된 펩타이드-형광체-소광체 합성물을 HPLC로 분리한 후 EDC/NHS 반응을 이용해서 금 나노입자 표면의 글라이콜 키토산에 결합시킬 수 있다.
상기 금 나노입자는 수용액 상에서 금염 (HAuCl4)을 글라이콜 키토산으로 환원하여 금 표면에 글라이콜 키토산으로 코팅된 입자 상태로 생성되는데, 이 때 글라이콜 키토산의 아민 작용기가 금 나노입자의 표면에 흡착되면서 금나노입자의 생성과 동시에 코팅이 되면서 제조된다. 이와 같이 생성된 금 나노입자는 평균 입경이 약 1 내지 50 나노미터, 바람직하게는 10 내지 30 나노미터, 예컨대 약 20 나노미터 정도인 안정한 상태의 금 나노입자일 수 있다.
본 발명의 나노센서는 세포 또는 조직 내의 분자수준의 영상을 획득하기 위하여, 금 나노입자을 특정 세포신호전달에 특이적 영상을 나타내는 특정 작용기로 화학적으로 개질하는 것을 특징으로 한다. 한 구체예에서, 이를 구현하기 위하여, 단백질 분해효소에 의해서 선택적으로 분해가 되는 인식 부위를 포함하는 펩타이드에 금 표면과의 소광현상을 발생시키는 형광물질을 화학적으로 결합시켜, 특정 단백질 분해효소에 특이적 분해성을 갖는 전구물질(펩타이드-형광물질)을 합성한다. 금 나노입자의 글라이콜 키토산에 펩타이드-형광물질이 결합된 물질은 최종적으로 도 1에 도시된 바와 같은 구조를 가질 수 있다.
본 발명에 사용된 글라이콜 키토산은 고분자 사슬 내에 양전자를 많이 함유하고 있어서, 이를 이용하여 나노입자를 제조할 경우, 검출 대상 단백질 분해효소가 존재하는 조직 또는 세포 (예컨대, 암세포 또는 암조직)에 축척 효율이 현저히 탁월하다는 이점이 있다. 또한 금 나노입자는 체내에 존재하는 염 (salt)에 의해 안정성이 떨어지면서 입자들이 뭉치는 현상(aggregation)이 생기는데 글라이콜 키토산은 금 나노입자의 안정성을 증가시켜서 체내에서도 안정성을 유지시켜주면서 체내에서 잘 순환되도록 하는 역할을 한다 (도 9 참조).
이 때 사용된 글라이콜 키토산의 분자량은 50,000 내지 500,000, 바람직하게는 50,000 내지 300,000인 것이 좋으며, 이보다 낮은 분자량을 사용하여 금 나노입자를 제조할 경우 금 나노입자가 불안정해지는 경향이 있다.
본 발명자들은 상기 나노센서가 특정 단백질 분해효소에 노출되면 표함되어 있는 펩타이드가 특이적으로 인식되고 절단되어, 소광(quenching) 되었던 형광이 복원되면서 상기 특정 단백질 분해효소와 관련된 질환을 광학분자영상 기술로 진단 가능하고, 같은 물질을 농축시켰을 경우 X-ray 흡수가 증가하여 CT 를 찍었을 때 조영제의 역할을 하여 특정 질환을 진단할 수 있음을 확인하였다 (도 1 참조).
본 발명의 나노센서는 기존의 CT로 영상화 할 수 없는 연조직(soft tissue)을 영상화 할 수 있게 하는 동시에 세포 및 체내의 조직에서 발현하는 단백질 분해효소를 선택적으로 영상화할 수 있다는 이점이 있다. 보다 상세하게는 글라이콜 키토산으로 코팅된 금 나노입자를 농축시켜 암에 선택적으로 축적되게 하여 CT 이미지가 가능하게 하며, 세포 및 체내에서 활성화되는 단백질 분해 효소에 특이적으로 반응이 일어나 형광을 나타내도록 상기 단백질 분해효소에 특이적인 인식부위를 포함하는 펩타이드 기질과 형광물질을 금 나노입자에 결합시켜 나노센서를 제조함으로써, 단백질 분해효소의 정량분석, 세포 영상 및 비침습적 암 진단에 유용한 기술이다.
본 발명의 나노센서를 이용하여, 세포 및/또는 생체 조직을 컴퓨터단층촬영(CT) 등의 영상 장비를 이용하여 영상화할 수 있다. 이러한 영상화를 통하여 세포 및/또는 조직에서의 특정 단백질 분해 효소의 존재를 가시화할 수 있다. 이와 같은 단백질 분해효소는 암세포에 특이적으로 존재하는 경우가 많아서, 본 발명의 나노센서는 CT를 이용하여 암을 영상화에 매우 유용할 수 있다. 즉, 본 발명의 나노센서는 특정 단백질 분해효소의 정량분석, 세포 영상 및 비침습적 암 진단에 유용하다.
따라서, 본 발명에 따른 단백질 분해효소 검출용 나노센서는 컴퓨터단층촬영용 조영제로서 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 단백질 분해효소 관련 질환, 예컨대 암의 진단용 조성물로서 사용될 수 있다.
또한, 상기 특정 단백질 분해효소에 특이적으로 인식되는 절단부위를 갖는 펩타이드를 포함하는 단백질 분해효소 검출용 나노센서를 시료와 반응시키고 발생하는 형광세기를 측정함으로써, 특정 단백질 분해효소를 검출하거나, 상기 단백질 분해 효소와 관련된 질환의 진단에 정보를 제공할 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명의 일례는 상기 단백질 분해 효소 검출용 나노센서를 생물 시료와 반응시키는 단계; 및 형광 세기를 측정하는 단계를 포함하는, 단백질 분해 효소 검출 방법을 제공한다.
또 다른 예는 상기 단백질 분해 효소 검출용 나노센서를 생물 시료와 반응시키는 단계; 및 형광 세기를 측정하는 단계를 포함하는, 상기 단백질 분해 효소 관련 질환의 진단에 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또 다른 예는 상기 단백질 분해 효소 검출용 나노센서를 생물 시료와 반응시키는 단계; 및 형광 세기를 측정하는 단계를 포함하는, 암세포의 영상화 방법을 제공한다.
또 다른 예는 상기 단백질 분해효소 검출용 나노센서를 이용하여 단백질 분해효소 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 상기 스크리닝 방법은
1) 상기 단백질 분해 효소 검출용 나노센서를 생물 시료와 반응시키고 형광 세기를 측정하는 단계;
2) 후보 화합물을 생물 시료와 반응시키는 단계; 및
3) 상기 단백질 분해 효소 검출용 나노센서를 상기 후보 화합물과 반응한 생물 시료와 반응시키고 형광 세기를 측정하는 단계
를 포함할 수 있다.
이 때, 후보 화합물과 반응한 단계 3)에서 측정된 형광세기가 후보 화합물과 반응하지 않은 단계 1)에서 측정된 형광세기보다 높은 경우, 상기 후보 화합물을 상기 단백질 분해효소의 억제제로 결정하는 것을 특징으로 한다.
단계 1)과, 단계 2) 및 3)은 동일 시료에 대하여 순차적으로 수행되거나, 배양된 생물 시료 (세포, 조직 또는 혈액 등)의 일부에 대하여 별개로 진행될 수 있다.
상기 시료는 단백질 분해효소 검출 대상 생물시료로서, 척추동물, 바람직하게는 포유류 (예컨대, 인간을 포함하는 영장류, 설치류 등)의 세포, 조직, 혈액, 체액, 분비물 등일 수 있으며, 이들 세포, 조직, 혈액, 체액, 분비물 등은 살아있는 동물의 생체 내의 것 또는 생체로부터 분리된 것일 수 있다. 생체에서 어떤 질병이나 질환이 발생할 경우 특정한 단백질 분해효소가 비정상적으로 과량으로 발현하거나 그 반대일 경우가 많은데 이러한 경우 검출 대상 시료에 존재하거나 그렇지 않은 분해효소의 존재여부를 조사함으로써 특정 질환의 유무를 판단할 수 있게 된다. 즉, 본 발명의 나노센서는 살아있는 동물의 생체에 직접 적용하거나, 이로부터 분리된 세포, 조직, 혈액, 체액, 분비물 등에 적용할 수 있다.
상기 단백질 분해효소의 작용을 억제하면 그에 관계된 질환의 진행을 막을 수 있는 경우가 있는데 이 분해효소의 억제제 (inhibitor)를 찾으면 그 질병에 대한 치료제를 개발할 수 있게 된다. 그러한 치료제를 찾아내는 스크리닝 방법에도 본 발명의 나노센서가 적용 가능하다. 단백질 분해효소가 발현된 세포 또는 조직에 억제제를 투여하고 분해효소의 작용을 본 발명의 나노센서로 스크리닝 하면 새로운 억제제를 개발하는데 활용할 수 있다.
상기 형광 세기 또는 형광 분포를 측정하는 단계는 본 발명이 속하는 기술 분야에 널리 알려진 모든 형광 분석법, 예컨대, 형광광도분도기, 형광현미경, 근적외선형광 영역단층촬영장비 등을 사용하여 수행할 수 있다. 또한, 컴퓨터단층촬영(CT) 등에 의하여 상기 나노센서가 암세포 또는 암조직에서의 축적된 것을 관찰할 수 있다.
상기 단백질 분해효소 관련 질환은 암, 관절염, 뇌졸중, 골다공증, 알츠하이머병, 각종 심혈관계 질환으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으며, 상기 암은 예컨대 대장암, 피부암, 직장암, 상피세포암, 폐암, 뇌종양, 전립선암, 유방암, 및 각종 전이암일 수 있다.
또 다른 예는 표면에 글라이콜 키토산이 코팅된 금 나노입자, 또는 상기 글라이콜 키토산에 펩타이드가 결합된 금 나노입자의 약물 전달체로서의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 글라이콜 키토산이 코팅된 금 나노입자, 또는 상기 글라이콜 키토산에 펩타이드가 결합된 금 나노입자를 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다. 상기 전달 가능한 약물은 항암제 및/또는 광감작제 등일 수 있다.
상기 글라이콜 키토산이 코팅된 금 나노입자는 상기한 바와 같이 금염을 글라이콜 키토산과 반응시켜 환원시킴으로써 금 표면에 글라이콜 키토산이 코팅된 형태로 얻어지는 입자를 의미한다. 또한, 상기 글라이콜 키토산이 코팅된 금 나노입자는 글라이콜 키토산에 결합된 펩타이드는 암세포에 특이적으로 발현하는 단백질 분해 효소, 예컨대, 매트릭스 메탈로프로티나아제(matrix metalloproteinases, MMP) 등으로 이루어진 군에서 선택된 단백질 분해 효소의 절단부위를 포함하는 펩타이드로서, 단백질 분해 효소의 특이적인 인식 부위 (절단 부위)와 나노 입자의 표면에 결합할 수 있는 작용기 (예컨대, 티올기 (-SH), 카르복시기 (-COOH), 아민기 (-NH2), DOPA (3,4-dihydroxyphenylalanine) 등)를 포함할 수 있고, 9 내지 15 개의 아미노산 길이의 펩타이드일 수 있다. 보다 구체적으로, MMP의 인식부위 (Pro-Leu-Gly↓Val-Arg)를 포함하는 9 내지 15 개의 아미노산 길이의 펩타이드일 수 있으며, 예컨대, 'Gly-Pro-Leu-Gly-Val-Arg-Gly-Lys-Gly-Gly (SEQ ID NO: 5)'의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 글라이콜 키토산은 암세포에 축적되는 특성을 가지므로 상기 글라이콜 키토산 표면을 갖는 금 나노입자는 암세포 표적화가 가능하며, 암세포로 항암제 또는 광감작제를 효과적으로 전달할 수 있다. 또한, 상기 펩타이드를 포함하는 금 나노입자의 경우, 상기 MMP 등의 단백질 분해 효소는 암세포에서 특이적으로 발현하므로, 이들의 인식부위를 포함하는 펩타이드는 암세포에서 특이적으로 절단될 것이며, 따라서 펩타이드에 항암제를 결합시키면 펩타이드의 암세포에서의 특이적인 절단에 인하여 암세포에서 특이적으로 방출되어 작용할 수 있다.
상기 약물 전달용 조성물은 상기 금 나노입자에 전달 대상 약물, 예컨대 항암제 및/또는 치료 효과를 가지는 광감작제(photosensitizer)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 항암제 또는 광감작제는 금 나노입자 표면의 글라이콜 키토산에 결합하거나, 펩타이드의 글라이콜 키토산과 결합하는 말단의 반대 말단에 결합하여 전달될 수 있다. 결합 가능한 항암제는 직접 또는 적절한 작용기를 통하여 글라이콜 키토산 또는 펩타이드의 말단에 결합할 수 있는 모든 종류의 항암제일 수 있으며, 예컨대, 독소루비신, 도세탁셀 (docetaxel), 파클리탁셀(paclitaxel), 캄토테신(camptothecin) 및 시스플라틴(cisplatin) 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으며 광감작제는 예컨데, 프로토포르피린(protoporphyrin)(예컨대, protoporphyrin IX (Ppix)), 클로라인 e6(chlorin e6, Ce6) 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 항암제 중 독소루비신, 도세탁셀, 파클리탁셀, 캄토테신 및 시스플라틴 등과 광감작제 중 Ppix, Ce6 등은 글라이콜 키토산 또는 펩타이드의 말단에 직접 결합할 수 있으며, 상기의 항암제나 광감작제는 적절한 작용기 (예컨대, 티올기, 카르복시기, 아민기 등)를 통하여 도입시킬 수 있다. 이와 같은 항암제 결합은 본 발명의 관련 기술 분야에 널리 알려진 통상의 방법에 따른다.
본 발명의 또 다른 예는 글라이콜 키토산을 금염(HAuCl4)과 혼합하여, 상기 금염을 글라이콜 키토산으로 환원시켜서 금 표면을 글라이콜 키토산으로 코팅하는 단계를 포함하는, 금 나노입자의 제조 방법을 제공한다. 본 제조방법을 통해 일정한 크기의 금 나노입자를 얻을 수 있다. 또한 기존의 금 나노입자의 표면을 개질하는 방법에 비해 간단하게 코팅하는 방법 제시하였다. 기존의 방법은 금염을 시트르산염(citrate)염으로 환원한 후에 고분자로 다시 코팅하는 과정을 거치지만 본 발명에서 제시한 제조방법에서는 환원과 코팅이 동시에 일어나므로, 보다 간단하고 효율적으로 금 나노입자를 제조할 수 있다는 이점이 있다.
이와 같은 방법으로 제조된 금 나노입자는 평균 입경이 약 1 내지 50 나노미터, 바람직하게는 10 내지 30 나노미터, 예컨대 약 20 나노미터 정도의 안정한 상태를 갖는다.
충분한 환원을 위하여, 환원제로 사용되는 글라이콜 키토산의 사용량은 금염 수용액 (100 ml, 1 mM)을 기준으로 300 내지 400 mg 를 300 ml의 물에 녹여 사용하는 것이 좋으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 나노센서는 특정 단백질 분해효소에 의하여 특이적으로 활성화 되어 강한 형광을 나타내기 때문에 광학분자영상 조영제로 활용 가능할 뿐만 아니라, X-ray를 흡수하여 CT 조영제로 활용하여 암과 같은 특정 질환을 진단하는 데 유용하다. 상기 나노센서는 형광물질에 대한 높은 소광 능력으로 형광이 발광하지 않은 상태로 있다가 특정 단백질 분해효소에 의하여 분해가 되어야만 강한 형광을 특이적으로 발광하는 특징을 갖는 동시에 암에 선택적으로 축적되면서 X-ray를 흡수하여 CT 같은 의료영상 이미지 장비에서 CT 조영제로 활용되어 기존의 CT 조영제가 가지고 있는 한계를 극복할 수 있다. 상기 나노센서는 단백질 분해효소 과다 발현을 억제하는 inhibitor와 같은 신약을 스크리닝하는 방법에 사용이 가능하다. 또한, 실험동물 모델이나 인체에 제조된 입자를 주입하여 암과 같은 특정 단백질 분해효소를 과다 발현하는 다양한 조직을 비침습적 방법으로 영상이 가능함으로써 암과 치매 등의 다양한 난치병 조기 진단에 사용될 수가 있다. 그리고 같은 질병에 대해 다중영상화가 가능하기 때문에 보다 정확한 질병의 진단이 가능하다.
도 1은 본 발명에 따른 나노센서의 구조 및 형광 과정을 모식적으로 보여주는 것이다.
도 2는 펩타이드에 형광물질 및 소광물질을 결합시키는 과정을 보여주는 반응식이다.
도 3a는 본 발명의 실시예에서 제조된 금 나노센서의 입자 모습을 보여주는 투과전자현미경 (transmission electron microcopy, TEM)사진이며, 도 3b는 상기 금 나노센서의 평균 입경을 광산란법 (Dynamic Light Scattering, DLS)으로 측정한 결과이고, 도 3c는 상기 금 나노센서 입자 고유의 자외선 흡수 특성을 보여주는 그래프이다.
도 4a는 금 나노센서를 MMP-2 및 MMP-9와 반응시켜서 얻어진 형광광도분도기로 측정한 형광 세기를 보여주는 것이고, 도 4b는 금 나노센서를 MMP-2 및 MMP-9와 반응물에서의 형광 발광 정도를 CCD (Charge Coupled Device) 카메라로 찍은 사진이다.
도 5a는 금 나노센서의 농도에 따른 X-ray 흡수 정도를 보여주는 사진이다. 도 5b는 금 나노센서의 농도에 따른 X-ray 흡수를 보여주는 그래프이다.
도 6은 금 나노센서를 암질환 마우스 모델에 투여한 후 형광을 관찰한 모습니다.
도 7a는 금 나노센서를 투여한 암질환 마우스의 CT 이미지를 미투여군과 비교하여 나타낸 것이고, 도 7b는 투여군에서의 시간 경과에 따른 CT 이미지 및 X-ray 흡수계수를 나타낸 것이다.
도 8은 실시예 2의 Cy5.5-펩타이드는 HPLC와 mass 분석 결과를 보여주는 그래프이다
도 9는 글라이콜 키토산 코팅된 금 나노입자(BCMG-AuNP)와 코팅하지 않은 금 나노입자의 안정성을 비교하여 보여주는 결과이다.
이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 금 나노입자의 제조
300 mg의 글라이콜 키토산 (분자량 250,000)을 300 ml의 물에 녹인 용액을 필터(pore size:0.45 μm)로 걸러서 필터를 통과한 불순물이 제거된 글라이콜 키토산 용액을 준비하였다. 금염 (HAuCl4?3H2O, 0.03 g)은 100 ml의 물에 녹여서 1 mM의 농도로 용액을 만든 후 70℃로 가열하여 금염 용액을 준비하였다. 상기 준비된 글라이콜 키토산 용액 300 ml을 상기 준비된 금염 용액 100 ml에 혼합하여 교반기에서 24시간 동안 반응시켜 금 나노입자를 제조하였다.
금 나노입자의 형태 및 크기는 금염 용액의 농도 및 글라이콜 키토산의 양을 조절하여 제어할 수 있으며, 본 실시예에서 제조된 금 나노입자의 평균 입경은 약 20 nm이었다.
실시예 2: Cy5 .5- 펩타이드 유도체의 제조
도 2의 반응식에 따라서 펩타이드에 근적외선 형광물질을 결합하는 반응을 수행하였다. 펩타이드는 고형상 합성(solid phase synthesis)방법을 따라 에프목 방법(Fmoc strategy)으로 Gly-Pro-Leu-Gly-Val-Arg-Gly-Lys-Gly-Gly (SEQ ID NO: 5) 서열로 제조하였다. 제조된 펩타이드 5 mg를 0.2 mL 디메틸포름아마이드(dimethylformamide, DMF)에 완전히 녹인 후, 근적외선 시아닌 형광물질 Cy5.5-NHS (N-hydroxysuccinimide) 에스테르 10 mg 를 첨가하고, 질소를 충전하여 실온에서 하루 동안 반응을 진행하였다. 반응이 종료되면, HPLC를 이용하여 Cy5.5-펩타이드를 분리하였다 (22 %(v/v) to 40 %(v/v) acetonitrile containing 0.1 %(v/v) TFA(trifluoroacetic acid) versus DW containing 0.1 %(v/v) TFA over 20 min at a flow rate of 4.0 ml/min.).
이렇게 분리된 펩타이드를 TFA (trifluoroacetic acid):증류수: anisole=95:2.5:2.5 (부피 기준)로 섞인 1ml의 용액에서 탈보호화(deprotection) 시키고, 다시 한번 같은 조건의 HPLC로 분리하였다. 분리된 Cy5.5-펩타이드를 동결 건조하여 3℃에서 냉장 보관하였다. 상기 제조된 Cy5.5-펩타이드는 HPLC와 mass 분석 (MALDI-TOF)을 통하여 확인하였다 (Mass: calculated/found, 1653.4/1655.5). 이와 같이 얻어진 결과를 도 8에 나타내었다.
제조된 형광물질이 결합된 Cy5.5-펩타이드를 Cy5.5-GPLGVRGKGG 이라고 명명하였다 (도 1). 이렇게 제조된 Cy5.5-GPLGVRGKGG 펩타이드 6.9 mg 에 black hole quencher-3(BHQ-3) succinimide ester 2.5 mg를 넣고 반응시켜, Cy5.5-펩타이드에 BHQ-3를 화학적으로 결합시켰다. 이렇게 제조된 Cy5.5-펩타이드 유도체를 Cy5.5-GPLGVRGK(BHQ)GG 로 명명하였다.
실시예 3: 금 나노센서의 제조
상기 실시예 2에서 제조한 Cy5.5-펩타이드 유도체(Cy5.5-GPLGVRGK(BHQ)GG)를 금 나노입자의 표면에 화학결합 시키기 위하여, Cy5.5-GPLG VRGK(BHQ)GG) 0.1 mg, 1-Ethyl-3-[3-dimethyl amino propyl] carbodiimide hydrochloride(EDC) 1 mg, NHS 0.5 mg을 0.1 ml의 Dimethyl sulfoxide(DMSO)와 0.3ml의 PBS 버퍼용액 (WelGENE, 한국) 에 넣고 15분 동안 잘 섞어서 녹인 후, 상기 실시예 1에서 제조된 금 나노입자 용액 150 mL에 첨가하여 16시간 동안 실온에서 반응시켰다. 반응 종료 후, 원심분리기를 이용하여 10000 rpm에서 10분 동안 원심분리하고, 10분 동안 침전 시킨 후, 증류수로 세척하는 과정을 3번 반복하여, 금 나노센서 (형광체-소광체-펩타이드-글라이콜 키토산 코팅된 금 나노입자)를 얻었다. 제조된 금 나노센서는 PBS 용액에 재분산 하여 3℃에서 냉장 보관하였다.
실시예 4: 금 나노센서의 입자 분석
투과전자현미경 (transmission electron microcopy, TEM)과 광산란법 (Dynamic Light Scattering, DLS)을 통하여 상기 실시예 3에서 제조된 금 나노센서를 관찰하여 평균 입경 크기를 구하였다. 상기 얻어진 결과를 도 3a-3c에 나타내었다. 도 3a는 금 나노센서의 투과전자 현미경 이미지로서, 상기 나노센서 입자가 구형을 나타냄을 확인할 수 있다. 도 3b는 DLS로 측정한 상기 나노센서 입자의 입도 분포를 보여주는 것으로, 상기 나노센서 입자의 평균 입경이 약 100 nm 정도임을 보여준다. 도 3c는 금 나노센서 입자 고유의 자외선 흡수 특성을 보여준다.
실시예 5: 금 나노센서의 형광 소광효과 및 MMP 효소 특이적 분해에 의한 광학 특성 변화
금 나노센서의 광학적 형광 소광효과를 관찰하기 위하여, 상기 실시예 3에서 제조된 PBS에 재분산된 금 나노센서 용액 (실시예 1에서 얻어진 금 나노센서 용액(물에 분산)과 동일한 농도로 조절)을 형광광도분도기 (spectrofluorometer, Hitachi F-7000)를 사용하여 스펙트럼을 관찰하였다. Excitation을 675 nm 로 고정한 후 emission 스펙트럼을 680에서 780 nm까지 측정하였다.
금 나노센서의 체내에서의 안정성을 측정하기 위해 금 나노센서 약 0.1 mg/ml을 PBS 용액 1ml에 분산한 후 스펙트럼을 관찰하였다. 그 후 MMP 특이적 금 나노센서의 MMP-2, MMP-9 효소에 대한 선택 특이성을 조사하기 위해 활성화된 MMP-2, MMP-9 및 그에 상응하는 inhibitor를 넣고 형광의 증가를 관찰하였다.
먼저, MMP-2 및 MMP-9을 활성화하기 위하여, MMP-2 [EC 3.4.24.24] 및 MMP-9 [EC 3.4.24.35] (R&D Systems (Minneapolis, MN, USA ) 각각 50 μL (135 nM)을 p-aminophenyl mercuric acid가 2.5 mmol/L의 양으로 첨가된 TCNB 반응액 (0.1 M Tris, 5 mM calcium chloride, 200 mM NaCL, 0.1 % (w/v) Brij) 0.45 mL에 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응하여 활성화시켰다. 활성화된 MMP-2와 MMP-9 0.5 ml를 같은 양의 금 나노센서 0.5 ml (0.1 mg/ml)와 섞은 후, 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 후 형광광도분도기로 형광을 측정하였다. 그 결과를 도 4a에 나타내었다. 도 4a는 금 나노센서의 MMP 효소 처리 전 후의 형광 스펙트럼을 나타내는 것으로, Y 축은 형광의 세기 (Photoluminescence(PL) intensity)를 나타낸다. "ctrl" 은 효소를 처리하기 전, "MMP-2"와 "MMP-9"은 각각 효소를 처리한 후의 형광의 세기 증가를 보여준다. 690 nm에서의 emission 측정값을 기준으로 약 6 배 정도의 형광 소광효과가 일어남을 관찰할 수 있다.
또한 상기 MMP-2와 MMP-9 용액 (0.5 ml) 에 각각 상응하는 억제제 (inhibitor)(4 μl, 14mM, R&D Systems (Minneapolis, MN, USA))를 함께 넣고 활성화 시킨 후에 같은 양의 상기 금 나노센서 0.5 ml에 넣고 37℃에서 2시간 동안 반응 후 효소 분해반응에 의한 형광 발현을 관찰하여 도 4a에 나타내었다 도 4 a 에서 "MMP-2(+inh.)" 와 "MMP-9(+inh.)"는 각각 MMP-2, MMP-9의 억제제를 첨가했을 경우의 형광의 증가를 나타내는데, 억제제로 인해 MMP의 효소작용이 방해되어 형광의 세기 증가가 줄어든 것을 알 수 있다.
위와 같은 방법으로, 활성화된 MMP-2와 MMP-9을 금 나노센서 또는 금 나노센서/inhibitor와 37℃에서 2시간 반응 한 후 96-well에 200 μL씩 반응액을 옮긴 후 형광 발광 정도를 CCD (Charge Coupled Device) 카메라가 장착된 Kodak Image Station 4000MM Digital Imaging System으로 관찰하여 그 결과를 도 4b에 나타내었다. 도 4b에 나타난 바와 같이, MMP-2 가 첨가되지 않은 상태(Ctrl)에서는 형광이 소광되어 있는 상태이지만, MMP-2나 MMP-9가 첨가 된 상태에서는 금 나노센서에 결합되어 있던 펩타이드가 MMP-2 또는 MMP-9에 선택적으로 분해되어 밝은 고유의 형광을 나타냄을 관찰 할 수 있다.
같은 조건에서 inhibitor가 첨가되었을 때 금 나노센서는 형광 발현이 거의 되지 않았는데 이는 inhibitor가 MMP 효소의 작용을 억제하여 기질의 분해가 이루어지지 않으므로 형광이 발현되지 않음을 확인 하였다. 이에 상기 실시예 3에서 제조된 MMP-2 선택적 금 나노입자는 MMP 효소에 선택적으로 반응하여 높은 형광을 발광함을 관찰할 수 있다.
실시예 6: 금 나노센서의 농도별 X- ray 흡수계수 분석
상기 실시예 3에서 제조한 금 나노센서를 1000배 농축시켜 사용하였다. 10000 rpm으로 50분간 원심분리하여 금 나노센서의 원래 부피를 1/1000로 줄여서 를 농축시켰다. 이 때 금 나노센서의 최종 농도는 60 mg/ml 이다.
60 mg/ml의 금 나노센서를 물로 희석시켜서 농도를 각각 60, 30, 15, 및 7 mg/ml 로 만든 후 지름 5 mm 의 튜브에 1 ml씩 넣어서 CT 촬영을 진행하였다. CT촬영은 동물용 CT 영상장비인 Skyscan 1076 microCT (Skyscan Inc., Belgium)를 사용하였다. 이 때 금 나노센서의 X-ray 흡수 정도를 비교하기 위해서 물과 상용화된 CT 조영제인 eXIATM 160 (Binitio Biomedical Inc, Canada) 도 같이 촬영하였다. 그 결과를 도 5a에 나타내었다. 도 5a에서, X-ray 흡수계수는 농도에 따라 달라지는 것을 알 수 있으며 상용화된 조영제인 eXIATM 160보다 우수한 X-ray 흡수계수를 나타내는 것을 증명하였다. 또한 도 5b에서 상용화된 조영제와 같은 세기의 X-ray 흡수를 갖는 금 나노센서의 농도는 37.7 mg/ml 임을 증명하였다.
실시예 7: 암 질환 동물모델에서 암조직의 실시간 영상화
대장암 세포(HT-29, obtained from ATCC, Rockville, MD)를 마우스 (Crlj-nu, 5-6 weeks, male, ㈜오리엔트 바이오)에 피하 이식하여 암 질환 마우스 모델을 만들고, 암 조직 크기가 5 mm 이상 되었을 때 상기 실시예 3에서 제조한 금 나노센서를 암 조직에 투여하여 암세포 영상화 가능성을 평가하였다. 대장암(HT-29)은 다량의 MMP-2와 MMP-9를 발현하는 암 세포로 알려져 있다.
상기 제조된 암 질환 마우스 모델과 암조직에 MMP-2 inhibitor 20 μl (14 mM, R&D Systems (Minneapolis, MN, USA))를 투여한 암 질환 마우스 모델에 상기 실시예 3에서 제조된 금 나노센서 (200 ul, 1 mg/mL)를 꼬리정맥으로 투여하고 eXplore Optix System (ART advanced Research Technologies Inc., Montreal, Canada) 장비를 이용하여 암에서의 형광을 관찰하였다. 상기 얻어진 결과를 도 6에 나타내었다 (도 6에서 각각 "-inh" (암질환 마우스 모델), "+inh"(암조직에 MMP-2 inhibitor를 투여한 마우스 모델)로 표시됨). 도 6에 나타난 바와 같이, 암 세포를 함유한 마우스(-inh)에서는 강한 형광이 시간이 지남에 따라 밝게 발광함을 관찰할 수 있다. 또한 MMP-2가 발현된 암 세포에서 나타난 강한 형광 발광 현상은 MMP-2의 활성을 억제하는 MMP-2 inhibitor 투여 시 나타나지 않았다(+inh). 결론적으로 MMP-2 금 나노센서는 생체 내 MMP-2가 과다 발현된 암 세포에 특이적으로 반응하여 강한 형광 발광을 나타내었고 이에 암 세포를 특이적으로 영상화 할 수 있음을 증명하였다.
실시예 8: 금 나노센서를 이용한 암 질환 동물모델에서의 암조직 CT 영상화
상기 실시예 7에서 사용한 암 질환 마우스 모델을 이용해서 CT를 이용한 암조직 영상화 실험을 진행하였다. 실험은 상기 실시예 3에서 제조된 금 나노센서를 투여한 암질환 마우스(200 ul, 300 mg/kg)와 투여하지 않은 암 질환 마우스의 CT 이미지를 통해 암을 관찰하였다. 그 결과를 도 7a 및 7b에 나타내었다 (각각 "GC-AuNP"(투여군), "ctrl"(미투여군)로 표시됨). 도 7a에서 금 나노센서를 주입한 경우 암 조직이 다른 조직에 비해 하얗게 대비되는 이미지를 얻을 수 있었다. 또한, 도 7b에서, 시간이 지남에 따라 조직에 축적되는 금 나노센서의 양이 증가하면서 암 조직에서의 X-ray 흡수계수(HU)가 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 결론적으로 본 발명에 따른 금 나노센서는 생체 내 MMP-2가 과다 발현된 암 세포에 특이적으로 반응하여 강한 형광 발광을 나타내는 동시에 X-ray를 흡수하여 CT 조영제로 활용 가능하므로 이에 암 세포를 특이적으로 다중 영상화가 가능함을 증명하였다.
실시예 9: 금 나노입자의 글라이콜 키토산 코팅 여부에 따른 안정성 비교
상기 실시예 1에서 제조된 글라이콜 키토산이 코팅된 금 나노입자(도 9에서 BCMG-AuNP로 표시) 0.1 mg과 글라이콜 키토산이 코팅되지 않은 금 나노입자 (AuNP, 제조사: Sigma(미국), 제품번호: G1652, 제품명: gold colloid solution, 20 nm) 0.1 mg 각각을 물 2mL, PBS (phosphate buffered saline, pH 3 및 pH 11) 2 mL에 각각 넣고 1일 및 45일 후의 상태를 관찰하여 도 9에 나타내었다.
도 9에서 확인되는 바와 같이, 코팅되지 않은 금 나노입자의 경우 시간이 지날수록 안정성을 잃고 침전되어 색이 투명해지는 반면, 글라이콜 키토산으로 코팅된 금 나노입자의 경우 45일 이상 금 나노입자 고유의 색을 유지하는 것으로 관찰되었다.
<110> Korea Institute of Science and Technology <120> Metal Nano-particle for Multi-modal Imaging and Use thereof <130> DPP-2010-5359-KR <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Restriction site for MMP <400> 1 Pro Leu Gly Val Arg 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Restriction site for caspase <400> 2 Gly Asp Glu Val Asp Ala Pro 1 5 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Restriction site for Thrombin, wherein 'Xaa is pipecolic acid(Pip) <400> 3 Phe Xaa Arg Ser 1 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Restriction site for cathepsin B <400> 4 Gly Gly Arg Arg Gly Gly 1 5 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide for detecting MMP <400> 5 Gly Pro Leu Gly Val Arg Gly Lys Gly Gly 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide for detecting caspase <400> 6 Gly Asp Glu Val Asp Ala Pro Lys Gly Gly 1 5 10 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide for detecting Thrombin, wherein 'Xaa is pipecolic acid(Pip) <400> 7 Gly Phe Xaa Arg Ser Gly Gly 1 5 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide for detecting cathepsin B <400> 8 Gly Gly Arg Arg Gly Gly Gly 1 5

Claims (16)

  1. 글라이콜 키토산 (glycol chitosan)이 코팅된 금 나노입자, 펩타이드, 및 형광물질을 포함하는 단백질 분해 효소 검출용 나노센서로서,
    상기 펩타이드는 상기 단백질 분해 효소의 절단 부위를 포함하는 9 내지 15 아미노산 길이의 펩타이드이고,
    상기 펩타이드의 한 쪽 말단에는 형광물질이 결합되어 있고, 다른 쪽 말단은 금 나노입자 표면의 글라이콜 키토산에 결합되어 있는,
    단백질 분해 효소 검출용 나노센서.
  2. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드의 형광물질이 결합된 말단으로부터 3 내지 10개 아미노산 떨어진 잔기에 결합된 소광물질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 단백질 분해 효소 검출용 나노센서.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단백질 분해 효소는 매트릭스 메탈로프로티나아제 (matrix metalloproteinases, MMP), 카스파아제(caspase), 및 트롬빈, 프로테아좀(proteasome)로 이루어진 군에서 선택된 것인, 단백질 분해 효소 검출용 나노센서.
  4. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 Pro-Leu-Gly-Val-Arg (SEQ ID NO: 1), Gly-Asp-Glu-Val-Asp-Ala-Pro(SEQ ID NO: 2), Phe-Pip-Arg-Ser(Pip=pipecolic acid)(SEQ ID NO: 3), Gly-Gly-Arg-Arg-Gly-Gly(SEQ ID NO: 4), Arg, 또는 Lys를 포함하는 9 내지 15로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 것인, 단백질 분해 효소 검출용 나노센서.
  5. 제1항에 있어서, 상기 형광물질은 시아닌 (Cyanine) 계열의 형광물질, Alexa 계열의 형광물질, DyLight 계열의 형광물질, 로드아민 (rhodamine) 계열의 형광물질, 플루오레신(fluorescein) 계열의 형광물질, 보디피(BODIPY), 다피 (DAPI), 및 텍사스레드 (Texas Red)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 단백질 분해 효소 검출용 나노센서.
  6. 제2항에 있어서, 상기 소광물질은 BHQ (black hole quencher)인, 단백질 분해 효소 검출용 나노센서.
  7. 제1항에 있어서, 상기 금 나노입자는 금염(HAuCl4)이 상기 글라이콜 키토산에 의하여 환원되어 금 표면이 글라이콜 키토산으로 코팅된 것인, 단백질 분해 효소 검출용 나노센서.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 단백질 분해 효소 검출용 나노센서를 포함하는 컴퓨터 단층 촬영용 조영제.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 단백질 분해 효소 검출용 나노센서를 생물 시료와 반응시키는 단계; 및
    형광 세기를 측정하는 단계
    를 포함하는, 단백질 분해 효소 검출 방법.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 단백질 분해 효소 검출용 나노센서를 생물 시료와 반응시키는 단계; 및
    형광 세기를 측정하거나 컴퓨터 단층 촬영하는 단계
    를 포함하는, 상기 단백질 분해 효소 관련 질환의 진단에 정보를 제공하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 단백질 분해 효소 관련 질환은 암, 관절염, 뇌졸중, 골다공증, 알츠하이머병, 및 심혈관계 질환으로 이루어진 군에서 선택된 것인, 단백질 분해 효소 관련 질환의 진단에 정보를 제공하는 방법.
  12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 단백질 분해 효소 검출용 나노센서를 생물 시료와 반응시키는 단계; 및
    형광 분포를 측정하는 단계
    를 포함하는, 암세포의 영상화 방법.
  13. 1) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 단백질 분해 효소 검출용 나노센서를 생물 시료와 반응시키고 형광 세기를 측정하는 단계;
    2) 후보 화합물을 생물 시료와 반응시키는 단계; 및
    3) 상기 단백질 분해 효소 검출용 나노센서를 상기 후보 화합물과 반응한 생물 시료와 반응시키고 형광 세기를 측정하는 단계
    를 포함하고,
    단계 3)에서 측정된 형광세기가 단계 1)에서 측정된 형광세기보다 높은 경우, 상기 후보 화합물을 상기 단백질 분해효소의 억제제로 결정하는 것을 특징으로 하는,
    단백질 분해효소 억제제의 스크리닝 방법.
  14. 글라이콜 키토산을 금염(HAuCl4)과 혼합하여, 상기 금염을 글라이콜 키토산으로 환원시키는 단계를 포함하는,
    금 나노입자의 제조 방법.
  15. 글라이콜 키토산 (glycol chitosan)이 코팅된 금 나노입자, 또는 상기 글라이콜 키토산에 펩타이드가 결합된 금 나노입자를 포함하고,
    상기 펩타이드는 매트릭스 메탈로프로티나아제(matrix metalloproteinases, MMP)의 절단 부위를 포함하는 9 내지 15 아미노산 길이의 펩타이드인,
    약물 전달용 조성물.
  16. 제15항에 있어서,
    독소루비신, 도세탁셀, 파클리탁셀, 캄토테신 및 시스플라틴으로 이루어진 군에서 선택된 항암제, 또는
    프로토포르피린 및 클로라인 e6(Ce6)로 이루어진 군에서 선택된 광감작제
    를 추가로 포함하는 약물 전달용 조성물.
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